專利名稱:用于抑制內(nèi)源性免疫球蛋白基因和生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因人獨特型抗體的組合物和方法
用于抑制內(nèi)源性免疫球蛋白基因和生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因人獨特型抗體的組合物和方法
本申請是申請日為2008年5月30日、申請?zhí)枮?00880101298. 8、發(fā)明名稱為“用于抑制內(nèi)源性免疫球蛋白基因和生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因人獨特型抗體的組合物和方法”的中國發(fā)明專利申請的分案申請。
相關(guān)申請的交叉參考
本申請要求2007年6月I日提交的 美國臨時專利申請系列號60/941，619和2008年4月11日提交的美國臨時專利申請系列號61/044，324的優(yōu)先權(quán)，在此將這兩篇美國臨時專利申請全部引入作為參考。
發(fā)明概述
本發(fā)明涉及具有一個或多個失活內(nèi)源性免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因動物及其制備方法。本發(fā)明還涉及使用該轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)人源化和完全人抗體的組合物和方法，以及由此生產(chǎn)的抗體。
發(fā)明背景
抗體是一類重要的藥品，已經(jīng)成功地用于各種人類疾病和病癥的治療中，包括傳染病、癌癥、過敏性疾病和移植物抗宿主疾病，以及用于預防移植排斥中。
與非人免疫球蛋白的治療應用相關(guān)的一個問題是該物質(zhì)在人患者中潛在的免疫原性。為了降低這類制劑的免疫原性，已經(jīng)研發(fā)了用于生產(chǎn)部分人(人源化)和完全人抗體的各種策略。在非人動物中產(chǎn)生具有人獨特型的轉(zhuǎn)基因抗體的能力是特別理想的，因為抗原結(jié)合決定簇位于獨特型區(qū)域內(nèi)，并且認為非人獨特型有助于目前的抗體治療的免疫原性。關(guān)于單克隆治療，人獨特型是尤其重要的考慮因素，與由多克隆抗體混合物以較低濃度遞送的多種獨特型相反其由以相對較高濃度遞送的單個獨特型組成。
盡管已經(jīng)描述了在非人動物中生產(chǎn)人源化轉(zhuǎn)基因抗體的多種方法，但是在許多這樣的方法中遇到的一個主要問題是宿主動物中內(nèi)源性抗體的產(chǎn)生，擇優(yōu)地或與轉(zhuǎn)基因抗體結(jié)合產(chǎn)生。已經(jīng)使用了各種重組克隆方案來嘗試破壞宿主動物中的內(nèi)源性免疫球蛋白產(chǎn)生，以解決這個問題。然而，在許多脊椎動物物種中，免疫球蛋白基因的功能失活存在許多障礙。
例如，盡管已經(jīng)使用同源重組成功地產(chǎn)生了 JH-基因座缺失的純合突變小鼠，但從大多數(shù)的脊椎動物物種不容易獲得其中可以進行同源重組以滅活內(nèi)源性基因座的ES或其他持續(xù)性多能細胞。
此外，干擾免疫球蛋白VDJ或VJ基因區(qū)段的細胞表面表達但不干擾其生產(chǎn)性重排的突變不足以完全滅活內(nèi)源性Ig表達。通過具有破壞的μ重鏈膜外顯子的純合突變小鼠(所謂UMT小鼠)不能產(chǎn)生IgM或IgG，但仍然產(chǎn)生顯著量的IgA的事實舉例說明了這一點(Macpehrson 等,Nature Tmmunol 2 (7) :625-631 (2001)。此外，純合突變小鼠的血清含有由兩個等位基因(野生型等位基因和突變的μ MT等位基因)編碼的IgM和IgG (Kitamura和Rajewky，Nature356:154-156(1992)。這歸因于以下事實B_細胞發(fā)育過程中的第一次重排是兩個同源染色體上的DH-和JH-基因區(qū)段的連接，生成前-B細胞。如果，在μ MT/+小鼠中，前-B細胞首先經(jīng)歷隨后在突變的IgH基因座中的VH-DH JH連接，并且該連接是符合讀框的(“生產(chǎn)性的”)，那么所得到的前-B細胞能夠表達分泌形式的μ鏈，但不能表達膜結(jié)合的U。因為膜結(jié)合的μ表達需要等位基因排斥，所以這樣的細胞仍然能夠在野生型IgH基因座中經(jīng)歷VH-DHJH連接；并且如果這種第二次重排也是產(chǎn)生性的，那么該細胞表達兩種不同的μ鏈，其中之一是膜結(jié)合的。該小鼠的血清含有源自兩個等位基因的IgM。此夕卜，可以在該小鼠的血清中發(fā)現(xiàn)源自兩個等位基因的IgG，因為在B細胞的兩個IgH基因座上常常伴隨地誘導轉(zhuǎn)換。
在帶有仍然可以生產(chǎn)性地重排V DJ或VJ基因區(qū)段的功能性轉(zhuǎn)基因免疫球蛋白基因座和突變的內(nèi)源性免疫球蛋白基因座的動物中也觀察到不完全的等位基因排斥。在一個或兩個突變的內(nèi)源性基因座中重排VH-DHJH的B細胞仍然可以生產(chǎn)性地重排轉(zhuǎn)基因免疫球蛋白基因座。這樣的B細胞表達膜結(jié)合的轉(zhuǎn)基因免疫球蛋白并發(fā)育成成熟的B細胞。在B細胞發(fā)育過程中，突變的內(nèi)源性基因座的同種型轉(zhuǎn)換可能形成表達內(nèi)源性免疫球蛋白的B細胞。因此，這樣的突變不足以使帶有轉(zhuǎn)基因免疫球蛋白基因座的動物中的內(nèi)源性免疫球蛋白表達完全滅活。
發(fā)明概述
與在非人動物中生產(chǎn)人源化轉(zhuǎn)基因抗體相關(guān)的主要問題是宿主中內(nèi)源性抗體的擇優(yōu)生產(chǎn)或共同生產(chǎn)。本發(fā)明通過提供帶有至少一個人工Ig基因座并缺乏產(chǎn)生內(nèi)源性免疫球蛋白能力的轉(zhuǎn)基因動物解決了這個問題。這些動物對于生產(chǎn)人源化和完全人轉(zhuǎn)基因抗體非常有用。用于生產(chǎn)這樣的轉(zhuǎn)基因動物的方法在許多物種中是有效的，包括目前從其不容易獲得ES細胞或持續(xù)性多能細胞和其中不容易進行同源重組和基因敲除的物種。
本發(fā)明部分源于以下發(fā)現(xiàn)大范圍核酸酶可以用于功能性地切除內(nèi)源性免疫球蛋白基因座，以生產(chǎn)用于生產(chǎn)人源化和完全人轉(zhuǎn)基因抗體的轉(zhuǎn)基因動物。此外，可以使用靶向不同基因組位點的兩種不同的大范圍核酸酶來有效地缺失大部分的免疫球蛋白基因座(高達幾kb)，由此確保該基因座的完全失活和進一步確保帶有種系突變的轉(zhuǎn)基因動物不產(chǎn)生任何能夠產(chǎn)生內(nèi)源性免疫球蛋白的B細胞。
因此，在一個方面中，本發(fā)明提供了含有至少一個人工Ig基因座并具有至少一個種系失活的內(nèi)源性Ig基因座的轉(zhuǎn)基因動物。用于本發(fā)明中的動物是小的實驗室動物，特別是禽類、嚙齒動物和鼬鼠。用于本發(fā)明中的人工基因座含有至少一個人V基因區(qū)段。在優(yōu)選的實施方案中，人工Ig基因座含有(i)具有至少一個編碼種系或超突變的人V-區(qū)氨基酸序列的人V基因區(qū)段的V區(qū)；(ii) 一個或多個J基因區(qū)段；和(iii) 一個或多個恒定區(qū)基因，其中人工Ig基因座是功能性的并且能夠在轉(zhuǎn)基因動物中經(jīng)歷基因重排和產(chǎn)生一組免疫球蛋白。
在一個實施方案中，轉(zhuǎn)基因動物含有失活的內(nèi)源性Ig重鏈基因座。在優(yōu)選的實施方案中，轉(zhuǎn)基因動物具有兩個失活的內(nèi)源性Ig重鏈基因座，因此不攜帶功能性的內(nèi)源性Ig重鏈基因座。
在一個實施方案中，轉(zhuǎn)基因哺乳動物含有失活的內(nèi)源性Ig輕鏈基因座。在優(yōu)選的實施方案中，轉(zhuǎn)基因動物具有兩個失活的內(nèi)源性Ig輕鏈基因座，因此不攜帶功能性內(nèi)源Ig輕鏈基因座。
在優(yōu)選的實施方案中，轉(zhuǎn)基因動物缺乏功能性的內(nèi)源性Ig重鏈基因座和功能性的Ig輕鏈基因座。
在一個實施方案中，轉(zhuǎn)基因動物含有至少一個人工Ig重鏈基因座。在一個實施方案中，轉(zhuǎn)基因動物缺乏功能性的Ig輕鏈基因座并含有至少一個人工Ig重鏈基因座。
在一個實施方案中，轉(zhuǎn)基因動物含有至少一個人工Ig輕鏈基因座。
在一個實施方案中，轉(zhuǎn)基因動物含有至少一個人工Ig重鏈基因座和至少一個人工Ig輕鏈基因座。
在優(yōu)選的實施方案中，人工Ig基因座是功能性的，并且能夠在轉(zhuǎn)基因動物中經(jīng)歷基因重排和產(chǎn)生一組免疫球蛋白，該組免疫球 蛋白包括具有人獨特型的免疫球蛋白。
在一個實施方案中，人工Ig基因座的一個或多個恒定區(qū)基因含有至少一個非人恒定區(qū)基因，并且是功能性的，能夠在轉(zhuǎn)基因動物中經(jīng)歷基因重排和產(chǎn)生一組嵌合免疫球蛋白，該組嵌合免疫球蛋白包括具有人獨特型的嵌合免疫球蛋白。
在一個實施方案中，人工Ig基因座的一個或多個恒定區(qū)基因含有至少一個人恒定區(qū)基因，并且功能性的，能夠在轉(zhuǎn)基因動物中經(jīng)歷基因重排和產(chǎn)生一組免疫球蛋白，該組免疫球蛋白包括具有人獨特型和人恒定區(qū)的免疫球蛋白。
在一個方面中，本發(fā)明提供本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物的后代。在優(yōu)選的實施方案中，后代含有至少一個人工Ig基因座并具有至少一個種系失活的內(nèi)源性Ig基因座。
在一個方面中，本發(fā)明提供能夠產(chǎn)生活的生殖細胞的轉(zhuǎn)基因動物，該生殖細胞具有至少一個失活的內(nèi)源性Ig基因座。
在一個實施方案中，這樣的轉(zhuǎn)基因動物含有基因組大范圍核酸酶表達構(gòu)建體，優(yōu)選具有可操作地連接大范圍核酸酶編碼核酸的誘導型表達控制區(qū)的構(gòu)建體，其中編碼的大范圍核酸酶識別存在于或接近于轉(zhuǎn)基因動物的內(nèi)源性Ig基因座的大范圍核酸酶靶序列。當轉(zhuǎn)基因動物性成熟并含有活的生殖細胞時，可以在體外或體內(nèi)將基因組大范圍核酸酶表達構(gòu)建體用來滅活這些生殖細胞中的靶向內(nèi)源性Ig基因座，而不損害其生存力，確?？梢詮钠洚a(chǎn)生在Ig基因座攜帶種系突變的Fl動物。
在一個實施方案中，轉(zhuǎn)基因動物進一步含有至少一個人工Ig基因座。
在一個方面中，本發(fā)明提供含有活的生殖細胞的轉(zhuǎn)基因動物，生殖細胞中至少一個內(nèi)源性Ig基因座是失活的。在一個實施方案中，轉(zhuǎn)基因動物進一步含有至少一個人工Ig基因座。
在一個方面中，本發(fā)明提供了產(chǎn)生本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物的方法。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的方法，該動物含有至少一個人工Ig基因座并具有至少一個種系失活的內(nèi)源性Ig基因座。在優(yōu)選的實施方案中，轉(zhuǎn)基因動物對于內(nèi)源性Ig輕鏈和/或內(nèi)源性Ig重鏈是失效合子的。
優(yōu)選，通過在其中表達大范圍核酸酶，內(nèi)源性Ig基因座在親本生殖細胞或前輩的生殖細胞中是失活的。該方法包括在生殖細胞中產(chǎn)生大范圍核酸酶，其中大范圍核酸酶識別存在于或接近于內(nèi)源性Ig基因座的大范圍核酸酶靶序列，并選擇性地滅活生殖細胞中的靶向Ig基因座，由此產(chǎn)生具有至少一個失活內(nèi)源性Ig基因座的活生殖細胞。將這樣具有至少一個失活內(nèi)源性Ig基因座的生殖細胞用于產(chǎn)生具有至少一個種系失活的內(nèi)源性Ig基因座的動物。在一個實施方案中，生殖細胞，或與其結(jié)合的生殖細胞，含有至少一個人工Ig重鏈基因座。在一個實施方案中，生殖細胞，或與其結(jié)合的生殖細胞，含有至少一個人工Ig輕鏈基因座。在一個實施方案中，生殖細胞，或與其結(jié)合的生殖細胞，含有至少一個人工Ig輕鏈基因座和至少一個人工Ig重鏈基因座。
在一個實施方案中，該方法包括將大范圍核酸酶表達構(gòu)建體或大范圍核酸酶編碼核酸引入生殖細胞中。
在優(yōu)選的實施方案中，生殖細胞含有基因組大范圍核酸酶表達構(gòu)建體，其含有可操作地連接大范圍核酸酶編碼核酸的表達控制區(qū)。在優(yōu)選的實施方案中，生殖細胞含有誘導型基因組大范圍核酸酶表達構(gòu)建體，并且該方法包括誘導大范圍核酸酶編碼核酸在生殖細胞中的表達。在一個實施方案中，該方法包括重復誘導大范圍核酸酶編碼核酸在生殖細胞中表達的步驟。在一個實施方案中，在體內(nèi)進行誘導。在另一個實施方案中，在體外進行誘導。在一個實施方案中，生殖細胞含有基因 組大范圍核酸酶表達構(gòu)建體，其含有呈現(xiàn)出生殖細胞特異性活性的表達控制區(qū)。
可以將所得到的生殖細胞用來產(chǎn)生具有至少一個種系失活的內(nèi)源性Ig基因座的Fl動物。該Fl動物可以含有一個或多個人工Ig基因座，或可以雜交，以產(chǎn)生含有至少一個人工Ig基因座的動物。
在備選的實施方案中，該方法包括將大范圍核酸酶表達構(gòu)建體或大范圍核酸編碼核酸引入到受精卵母細胞或胚胎中，并在所得到的建立者動物中產(chǎn)生具有至少一個失活Ig基因座的活生殖細胞。該建立者動物可以用來生產(chǎn)具有至少一個種系失活的內(nèi)源性Ig基因座的Fl動物。該Fl動物可以含有一個或多個人工Ig基因座，或可以雜交，以產(chǎn)生含有至少一個人工Ig基因座的動物。
在一個實施方案中，大范圍核酸酶靶序列存在于或接近于J基因區(qū)段。
在一個實施方案中，大范圍核酸酶靶序列存在于或接近于免疫球蛋白恒定區(qū)基因區(qū)段。在優(yōu)選的實施方案中，恒定區(qū)基因編碼免疫球蛋白μ。
在一個實施方案中，該方法包括為生存力和內(nèi)源性Ig基因座的失活而篩選生殖細胞。在一個實施方案中，該方法包括為人工Ig基因座的存在而篩選生殖細胞。
在在此的方法中，動物的雜交優(yōu)選在具有失活的內(nèi)源性基因座之間，以產(chǎn)生對于內(nèi)源性Ig輕鏈和/或內(nèi)源性Ig重鏈是失效合子的動物。
在優(yōu)選的實施方案中，該方法進一步包括使用第二個大范圍核酸酶。第二個核酸酶識別存在于或接近于內(nèi)源性Ig基因座的第二個大范圍核酸酶靶序列，并與第一個大范圍核酸酶一起選擇性地切割內(nèi)源性Ig基因座，但切割位點不同于第一個大范圍核酸酶的切割位點，由此滅活至少一個內(nèi)源性Ig基因座。
在優(yōu)選的實施方案中，生殖細胞含有第二個基因組大范圍核酸酶表達構(gòu)建體，其含有可操作地連接第二個大范圍核酸酶編碼核酸的表達控制區(qū)。在優(yōu)選的實施方案中，該表達控制區(qū)是誘導型表達控制區(qū)，并且該方法進一步包括誘導第二個大范圍核酸酶編碼核酸在生殖細胞中的表達，由此產(chǎn)生所編碼的第二個大范圍核酸酶，并且，與第一個大范圍核酸酶一起，在生殖細胞中選擇性地滅活靶向Ig基因座。在一個實施方案中，該方法包括重復誘導第二個大范圍核酸酶編碼核酸在生殖細胞中表達的步驟。在一個實施方案中，在體內(nèi)進行誘導。在一個實施方案中，在體外進行誘導。在一個實施方案中，第二個基因組大范圍核酸酶表達構(gòu)建體含有呈現(xiàn)出生殖細胞特異性活性的表達控制區(qū)。
在備選的實施方案中，該方法包括將第二個大范圍核酸酶表達構(gòu)建體或第二個大范圍核酸酶編碼核酸引入生殖細胞中。
在備選的實施方案中，該方法包括將第二個大范圍核酸酶表達構(gòu)建體或第二個大范圍核酸酶編碼核酸引入到受精卵母細胞或胚胎中，并在所得到的建立者動物中產(chǎn)生具有至少一個失活Ig基因座的活生殖細胞。建立者動物可以用來產(chǎn)生具有至少一個種系滅活的內(nèi)源性Ig基因座的Fl動物。Fl動物可以含有一個或多個人工Ig基因座，或可以雜交，以產(chǎn)生含有至少一個人工Ig基因座的動物。
在優(yōu)選的實施方案中，第一個和第二個大范圍核酸酶靶向J基因區(qū)段。在一個實施方案中，第一個和第二個大范圍核酸酶合起來的靶序列是內(nèi)源性Ig基因座內(nèi)的一個或多個J基因區(qū)段的上游和下游，并通過第一個和第二個編碼的大范圍核酸酶的切割來產(chǎn)生含有一個或多個J基因區(qū)段的基因組DNA區(qū)段的缺失。
在另一個實施方案中，第一個和第二個大范圍核酸酶靶向恒定區(qū)基因區(qū)段。在一
個實施方案中，第一個和第二個大范圍核酸酶靶向序列一起位于一個或多個免疫球蛋白恒定區(qū)基因區(qū)段的上游和下游，并且由第一個和第二個編碼的大范圍核酸酶的切割產(chǎn)生含有一個或多個免疫球蛋白恒定區(qū)基因區(qū)段的基因組DNA區(qū)段的缺失。在優(yōu)選的實施方案中，恒定區(qū)基因編碼免疫球蛋白μ。
在在此的方法中，所用的人工基因座含有至少一個人V基因區(qū)段。在優(yōu)選的實施方案中，人工Ig基因座含有(i )具有至少一個編碼種系或超突變的人V-區(qū)氨基酸序列的人V基因區(qū)段的V區(qū)；(ii) 一個或多個J基因區(qū)段；和(iii) 一個或多個恒定區(qū)基因，其中人工Ig基因座是功能性的，并且能夠在轉(zhuǎn)基因動物中經(jīng)歷基因重排和產(chǎn)生一組免疫球蛋白。
在一個實施方案中，將至少一個人工Ig重鏈基因座引入到本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物的基因組中。在一個實施方案中，轉(zhuǎn)基因動物缺乏功能性Ig輕鏈基因座。
在一個實施方案中，將至少一個人工Ig輕鏈基因座引入到本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物的基因組中。
在一個實施方案中，將至少一個人工Ig重鏈基因座和至少一個人工Ig輕鏈基因座引入到本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物的基因組中。
在優(yōu)選的實施方案中，人工Ig基因座是功能性的，并且能夠在轉(zhuǎn)基因動物中經(jīng)歷基因重排和產(chǎn)生一組免疫球蛋白，該組免疫球蛋白包括具有人獨特型的免疫球蛋白。
在一個實施方案中，人工Ig基因座的一個或多個恒定區(qū)基因含有至少一個非人恒定區(qū)基因，并且是功能性的，能夠在轉(zhuǎn)基因動物中經(jīng)歷基因重排和產(chǎn)生一組嵌合免疫球蛋白，該組嵌合免疫球蛋白包括具有人獨特型的嵌合免疫球蛋白。
在一個實施方案中，人工Ig基因座的一個或多個恒定區(qū)基因含有至少一個人恒定區(qū)基因并且是功能性的，能夠在轉(zhuǎn)基因動物中經(jīng)歷基因重排和產(chǎn)生一組免疫球蛋白，該組免疫球蛋白包括具有人獨特型和人恒定區(qū)的免疫球蛋白。
在一個實施方案中，制備本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物的方法包括將具有至少一個種系滅活的內(nèi)源性Ig基因座的轉(zhuǎn)基因動物與具有至少一個人工Ig基因座的第二個轉(zhuǎn)基因動物雜交，以產(chǎn)生Fl轉(zhuǎn)基因動物，該人工Ig基因座含有(i )具有至少一個編碼種系或超突變的人V-區(qū)氨基酸序列的人V基因區(qū)段的V區(qū)；(ii) 一個或多個J基因區(qū)段；和(iii) 一個或多個恒定區(qū)基因，其中Fl轉(zhuǎn)基因動物含有第二個轉(zhuǎn)基因動物的至少一個人工Ig基因座，并且其中來自第二個轉(zhuǎn)基因動物的人工Ig基因座是功能性的，能夠在Fl轉(zhuǎn)基因動物中經(jīng)歷基因重排和產(chǎn)生一組免疫球蛋白?？梢酝ㄟ^動物育種或通過其他結(jié)合配子來進行雜交，包括體外操作。
在一個實施方案中，第二個轉(zhuǎn)基因動物含有至少一個人工Ig重鏈基因座。
在一個實施方案中，第二個轉(zhuǎn)基因動物含有至少一個人工Ig輕鏈基因座。
在一個實施方案中，第一個和第二個轉(zhuǎn)基因動物缺乏功能性Ig輕鏈基因座，而第二個轉(zhuǎn)基因動物含有人工Ig重鏈基因座?？梢詫游镫s交，以產(chǎn)生缺乏功能性Ig輕鏈基因座但含有人工Ig重鏈基因座的Fl。
在一個實施方案中，第二個轉(zhuǎn)基 因動物含有至少兩個人工Ig基因座，包括至少一個人工Ig重鏈基因座和至少一個人工Ig輕鏈基因座。在一個實施方案中，第二個轉(zhuǎn)基因動物的人工Ig基因座是功能性的，并且能夠在Fl轉(zhuǎn)基因動物中經(jīng)歷基因重排和產(chǎn)生一組免疫球蛋白，該組免疫球蛋白包括具有人獨特型的免疫球蛋白。在一個實施方案中，第二個轉(zhuǎn)基因動物的人工Ig基因座的一個或多個恒定區(qū)基因含有至少一個非人恒定區(qū)基因并且是功能性的，能夠在Fl轉(zhuǎn)基因動物中經(jīng)歷基因重排和產(chǎn)生一組嵌合免疫球蛋白，該組嵌合免疫球蛋白包括具有人獨特型的嵌合免疫球蛋白。在一個實施方案中，第二個轉(zhuǎn)基因動物的人工Ig基因座的一個或多個恒定區(qū)基因含有至少一個人恒定區(qū)基因，并且是功能性的，能夠在Fl轉(zhuǎn)基因動物中經(jīng)歷基因重排和產(chǎn)生一組免疫球蛋白，該組免疫球蛋白包括具有人獨特型和人恒定區(qū)的免疫球蛋白。
相似地，在一個實施方案中，該方法包括將具有至少一個人工Ig基因座的第二個轉(zhuǎn)基因動物與本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物雜交，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物能夠產(chǎn)生具有至少一個失活的內(nèi)源性Ig基因座的活生殖細胞。在優(yōu)選的實施方案中，第二個轉(zhuǎn)基因動物含有至少兩個人工Ig基因座，包括至少一個人工Ig重鏈基因座和至少一個人工Ig輕鏈基因座。
在一個實施方案中，該方法包括將至少一個人工Ig基因座引入具有至少一個已經(jīng)或能夠通過一個或多個大范圍核酸酶的活性滅活的內(nèi)源性Ig基因座的生殖細胞中，其中至少一個人工Ig基因座含有(i)具有至少一個編碼種系或超突變的人V-區(qū)氨基酸序列的人V基因區(qū)段的V區(qū)；(ii)一個或多個J基因區(qū)段；和(iii)一個或多個恒定區(qū)基因，其中人工Ig基因座是功能性的，并且能夠在源自生殖細胞的轉(zhuǎn)基因動物中經(jīng)歷基因重排和產(chǎn)生一組人工免疫球蛋白。該方法進一步包括從由此產(chǎn)生的生殖細胞產(chǎn)生Fl轉(zhuǎn)基因動物，該Fl轉(zhuǎn)基因動物含有至少一個人工Ig基因座并具有至少一個種系滅活的內(nèi)源性Ig基因座，該滅活的內(nèi)源性基因座已經(jīng)通過一個或多個大范圍核酸酶的作用被滅活。
在一個實施方案中，至少一個人工Ig基因座包括至少一個人工Ig重鏈基因座。
在一個實施方案中，生殖細胞缺乏功能性Ig輕鏈基因座，并且引入到生殖細胞中的人工Ig基因座是Ig重鏈基因座。
在一個實施方案中，至少一個人工Ig基因座包括至少一個人工Ig輕鏈基因座。
在優(yōu)選的實施方案中，將至少兩個人工基因座引入到生殖細胞中，包括至少一個人工Ig重鏈基因座和至少一個人工Ig輕鏈基因座。在一個實施方案中，人工Ig基因座是功能性的，并且能夠在所產(chǎn)生的Fl轉(zhuǎn)基因動物中經(jīng)歷基因重排和產(chǎn)生一組免疫球蛋白，該組免疫球蛋白包括具有人獨特型的免疫球蛋白。在一個實施方案中，人工Ig基因座的一個或多個恒定區(qū)基因含有至少一個非人恒定區(qū)基因并且是功能性的，能夠在所產(chǎn)生的Fl轉(zhuǎn)基因動物中經(jīng)歷基因重排和產(chǎn)生一組嵌合免疫球蛋白，該組嵌合免疫球蛋白包括具有人獨特型的嵌合免疫球蛋白。在一個實施方案中，人工Ig基因座的一個或多個恒定區(qū)基因含有至少一個人恒定區(qū)基因并且是功能性的，能夠在所產(chǎn)生的Fl轉(zhuǎn)基因動物中經(jīng)歷基因重排和產(chǎn)生一組免疫球蛋白，該組免疫球蛋白包括具有人獨特型和人恒定區(qū)的免疫球蛋白。
在一個實施方案中，該方法包括為內(nèi)源性Ig基因座的生存力和失活而篩選生殖細胞。在一個實施方案中，該方法包括為人工Ig基因座的存在而篩選生殖細胞。
在一個實施方案中，該方法包括將至少一個人工Ig基因座引入到受精卵母細胞或胚胎，該卵母細胞或胚胎源自具有至少一個已經(jīng)或能夠通過一個或多個大范圍核酸酶的作用滅活的內(nèi)源性Ig基因座的生殖細胞，其中至少一個人工Ig基因座含有(i)具有至少一個編碼種系或超突變的人V-區(qū)氨基酸序列的人V 基因區(qū)段的V區(qū)；(ii )一個或多個J基因區(qū)段；和(iii)一個或多個恒定區(qū)基因，其中人工Ig基因座是功能性的，并且能夠在源自受精卵母細胞和胚胎的建立者轉(zhuǎn)基因動物或其后代中經(jīng)歷基因重排和產(chǎn)生一組人工免疫球蛋白。該方法進一步包括從受精卵母細胞或胚胎產(chǎn)生建立者轉(zhuǎn)基因動物及其任選的后代，以產(chǎn)生含有至少一個人工Ig基因座和具有至少一個已經(jīng)通過一個或多個大范圍核酸酶的作用滅活的種系滅活內(nèi)源性Ig基因座的轉(zhuǎn)基因動物。
在一個實施方案中，至少一個人工Ig基因座包括至少一個人工Ig重鏈基因座。
在一個實施方案中，至少一個人工Ig基因座包括至少一個人工Ig輕鏈基因座。
在一個實施方案中，受精卵母細胞或胚胎缺乏功能性Ig輕鏈基因座，并且引入到受精卵母細胞或胚胎中的人工Ig基因座是Ig重鏈基因座。
在優(yōu)選的實施方案中，將至少兩個人工基因座引入到受精卵母細胞或胚胎中，包括至少一個人工Ig重鏈基因座和至少一個人工Ig輕鏈基因座。在一個實施方案中，人工Ig基因座是功能性的，并且能夠在建立者轉(zhuǎn)基因動物或其后代中經(jīng)歷基因重排和產(chǎn)生一組免疫球蛋白，該組免疫球蛋白包括具有人獨特型的免疫球蛋白。在一個實施方案中，人工Ig基因座的一個或多個恒定區(qū)基因含有至少一個非人恒定區(qū)基因并且是功能性的，能夠在建立者轉(zhuǎn)基因動物或其后代中經(jīng)歷基因重排和產(chǎn)生一組嵌合免疫球蛋白，該組免疫球蛋白包括具有人獨特型的嵌合免疫球蛋白。在一個實施方案中，人工Ig基因座的一個或多個恒定區(qū)基因含有至少一個人恒定區(qū)基因并且是功能性的，能夠在建立者轉(zhuǎn)基因動物或其后代中經(jīng)歷基因重排和產(chǎn)生一組嵌合免疫球蛋白，該組免疫球蛋白包括具有人獨特型和人恒定區(qū)的免疫球蛋白。
在一個方面中，本發(fā)明提供了生產(chǎn)能夠產(chǎn)生活生殖細胞的轉(zhuǎn)基因動物的方法，在所述活生殖細胞中至少一個內(nèi)源性Ig基因座是失活的。在優(yōu)選的實施方案中，該方法包括生產(chǎn)具有基因組大范圍核酸酶表達構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因動物，其中表達構(gòu)建體含有可操作地連接大范圍核酸酶編碼核酸的表達控制區(qū)。在優(yōu)選的實施方案中，該構(gòu)建體是可以誘導以在生殖細胞中表達大范圍核酸酶編碼核酸的誘導型基因組大范圍核酸酶表達構(gòu)建體。
在一個方面中，本發(fā)明提供了生產(chǎn)具有活生殖細胞的轉(zhuǎn)基因哺乳動物的方法，在所述活生殖細胞中至少一個內(nèi)源性Ig基因座是失活的。該方法包括通過在其中表達大范圍核酸酶，使生殖細胞，或從其產(chǎn)生的親本生殖細胞或受精卵母細胞或胚胎中的內(nèi)源性Ig基因座失活。
在一個方面中，本發(fā)明提供了活的生殖細胞，其中至少一個內(nèi)源性Ig基因座能夠被滅活。在優(yōu)選的實施方案中，該生殖細胞含有基因組大范圍核酸酶表達構(gòu)建體，其中表達構(gòu)建體含有可操作地連接大范圍核酸酶編碼核酸的表達控制區(qū)。在優(yōu)選的實施方案中，構(gòu)建體是可以誘導以在生殖細胞中表達大范圍核酸酶編碼核酸的誘導型基因組大范圍核酸酶表達構(gòu)建體。
在一個實施方案中，生殖細胞含有至少一個人工Ig重鏈基因座。
在一個實施方案中，生殖細胞含有至少一個人工Ig輕鏈基因座。
在一個實施方案中，生殖細胞含有至少一個人工Ig重鏈基因座和至少一個人工Ig輕鏈基因座。
在一個方面中，本發(fā)明提供了活的生 殖細胞，其中至少一個內(nèi)源性Ig基因座是失活的。
在一個實施方案中，生殖細胞含有至少一個人工Ig重鏈基因座。
在一個實施方案中，生殖細胞含有至少一個人工Ig輕鏈基因座。
在一個實施方案中，生殖細胞含有至少一個人工Ig重鏈基因座和至少一個人工Ig輕鏈基因座。
在一個方面中，本發(fā)明提供生產(chǎn)具有至少一個失活的內(nèi)源性Ig基因座的活生殖細胞的方法。該方法包括在生殖細胞、受精卵母細胞或胚胎中表達至少一個大范圍核酸酶，以產(chǎn)生具有至少一個失活的內(nèi)源性Ig基因座的活生殖細胞。因此表達的大范圍核酸酶識別存在于或接近于所述內(nèi)源性Ig基因座的大范圍核酸酶靶序列。
在一個實施方案中，其中在生殖細胞中表達大范圍核酸酶，其中表達大范圍核酸酶的生殖細胞產(chǎn)生具有至少一個失活的內(nèi)源性Ig基因座的活生殖細胞?？商鎿Q地，具有至少一個失活的內(nèi)源性Ig基因座的活生殖細胞可以獲自如下的動物該動物源自其中表達大范圍核酸酶的生殖細胞。
在一個實施方案中，其中在受精卵母細胞或胚胎中表達大范圍核酸酶，具有至少一個失活的內(nèi)源性Ig基因座的活生殖細胞可以獲自如下的動物該動物源自其中表達大范圍核酸酶的受精卵母細胞或胚胎。
在一個實施方案中，在體外將至少一個內(nèi)源性Ig基因座滅活。在一個實施方案中，在體內(nèi)將至少一個內(nèi)源性Ig基因座滅活。
在一個實施方案中，生殖細胞進一步含有至少一個人工Ig基因座。在一個實施方案中，至少一個人工Ig基因座包括至少一個人工Ig重鏈基因座。在一個實施方案中，至少一個人工Ig基因座包括至少一個人工Ig輕鏈基因座。
在一個實施方案中，將至少兩個人工Ig基因座引入到生殖細胞中，包括至少一個人工Ig重鏈基因座和至少一個人工Ig輕鏈基因座。
本發(fā)明還提供了多克隆抗體、單克隆抗體、雜交瘤，及其制備方法和使用方法，其源于在本發(fā)明中公開的攜帶一個或多個人工基因座并具有一個或多個通過大范圍核酸酶活性滅活的內(nèi)源性Ig基因座的轉(zhuǎn)基因動物中抗體的產(chǎn)生。
在一個實施方案中，抗體是僅有重鏈的抗體，使用通過在此所述的方法獲得的缺乏功能性Ig輕鏈并含有人工重鏈基因座的轉(zhuǎn)基因動物來生產(chǎn)。
在一個方面中，本發(fā)明提供使用在此提供的轉(zhuǎn)基因動物來生產(chǎn)抗體的方法。該方法包括用免疫原來免疫本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物，如在此所述的，該動物具有至少一個失活的內(nèi)源性Ig基因座并攜帶至少一個人工Ig基因座。在優(yōu)選的實施方案中，轉(zhuǎn)基因動物對于內(nèi)源性Ig重鏈和/或內(nèi)源性Ig輕鏈是失效合子的，因此，不能產(chǎn)生內(nèi)源性免疫球蛋白。在一個實施方案中，轉(zhuǎn)基因動物缺乏功能性Ig輕鏈基因座并含有人工Ig重鏈基因座。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供如此生產(chǎn)的多克隆抗血清組合物。本發(fā)明的多克隆抗血清優(yōu)選含有具有人獨特型的抗體。在優(yōu)選的實施方案中，多克隆抗血清含有基本上由具有人獨特型的抗體組成的抗體。
在一個方面中，本發(fā)明提供生產(chǎn)單克隆抗體的方法。
在一個實施方案中，該方法包括(i)用免疫原來免疫本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物，如在此所述的，該動物具有至少一個失活的內(nèi)源性Ig基 因座并攜帶至少一個人工Ig基因座；
(ii)從轉(zhuǎn)基因動物中分離單克隆抗體生成細胞，其中單克隆抗體生成細胞產(chǎn)生特異性結(jié)合免疫原的單克隆抗體jP(iii)使用單克隆抗體產(chǎn)生細胞來生產(chǎn)特異性結(jié)合免疫原的單克隆抗體，或使用單克隆抗體產(chǎn)生細胞來生產(chǎn)能產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細胞，使用該雜交瘤細胞來生產(chǎn)單克隆抗體。
在一個實施方案中，該方法包括(i )用免疫原來免疫本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物，如在此所述的，該動物具有至少一個失活的內(nèi)源性Ig基因座并攜帶至少一個人工Ig基因座；
(ii)從轉(zhuǎn)基因動物中分離單克隆抗體生成細胞，其中單克隆抗體生成細胞產(chǎn)生特異性結(jié)合免疫原的單克隆抗體；(iii)從單克隆抗體產(chǎn)生細胞分離編碼特異性結(jié)合免疫原的單克隆抗體的單克隆抗體核酸jP(iv)使用單克隆抗體核酸來生產(chǎn)特異性結(jié)合免疫原的單克隆抗體。
在優(yōu)選的實施方案中，單克隆抗體具有人獨特型。
在一個方面中，本發(fā)明提供如此生產(chǎn)的單克隆抗體。
在一個方面中，本發(fā)明提供編碼該單克隆抗體的分離核酸。
在一個方面中，本發(fā)明提供了生產(chǎn)完全人單克隆抗體的方法。該方法包括(i)用免疫原來免疫本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物，如在此所述的，該動物具有至少一個失活的內(nèi)源性Ig基因座并攜帶至少一個人工Ig基因座；(ii)從轉(zhuǎn)基因動物中分離單克隆抗體生成細胞，其中單克隆抗體生成細胞產(chǎn)生特異性結(jié)合免疫原的單克隆抗體；(iii)從單克隆抗體產(chǎn)生細胞分離編碼特異性結(jié)合免疫原的單克隆抗體的單克隆抗體核酸；(iv)修飾單克隆抗體核酸來產(chǎn)生編碼完全人單克隆抗體的重組核酸；和(0使用編碼完全人單克隆抗體的重組核酸來生產(chǎn)所編碼的完全人單克隆抗體。
在一個方面中，本發(fā)明提供如此生產(chǎn)的完全人單克隆抗體。
在一個方面中，本發(fā)明提供編碼完全人單克隆抗體的重組核酸，及其生產(chǎn)方法。
在一個實施方案中，在此方法中所用的免疫原含有致病生物體或其抗原部分。
在一個實施方案中，在此方法中所用的免疫原是人內(nèi)源性的抗原。在備選的實施方案中，在此方法中所用的免疫原是人外源性的抗原。
在一個方面中，本發(fā)明提供了中和或調(diào)節(jié)人體組分中的抗原實體活性的方法。在一個實施方案中，該方法包括使身體部分與本發(fā)明的多克隆抗血清組合物接觸，其中多克隆抗血清組合物含有特異性結(jié)合并中和或調(diào)節(jié)抗原實體活性的免疫球蛋白分子。
在一個實施方案中，該方法包括將身體部分與本發(fā)明的單克隆抗體接觸，其中單克隆抗體特異性結(jié)合并中和或調(diào)節(jié)抗原實體活性。
在優(yōu)選的實施方案中，單克隆抗體是完全人單克隆抗體。[0106]在一個實施方案中，抗原實體來自引起傳染病的生物體。
在一個實施方案中，抗原實體是細胞表面分子。
在一個實施方案中，抗原實體是人細胞因子或人趨化因子。
在一個實施方案中，抗原實體是惡性腫瘤細胞上的細胞表面分子。
在一個方面中，本發(fā)明提供源自本發(fā)明轉(zhuǎn)基因動物的細胞。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供源自 本發(fā)明轉(zhuǎn)基因動物脾的細胞。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供源自本發(fā)明轉(zhuǎn)基因動物的B細胞，該B細胞能夠產(chǎn)生具有人獨特型的抗體。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供源自本發(fā)明轉(zhuǎn)基因動物的生殖細胞。
在一個方面中，本發(fā)明提供制備雜交瘤的方法，該雜交瘤能夠生產(chǎn)具有人獨特型的抗體。該方法包括使用源自本發(fā)明轉(zhuǎn)基因動物的細胞。
在一個方面中，本發(fā)明提供如此生產(chǎn)的雜交瘤。
在一個方面中，本發(fā)明提供具有人獨特型的抗體，該抗體是通過本發(fā)明的雜交瘤產(chǎn)生的。
在一個方面中，本發(fā)明提供含有本發(fā)明抗體的藥物組合物，該抗體具有人獨特型。
在一個方面中，本發(fā)明提供治療需要該治療的患者的方法，包括將治療有效量的本發(fā)明的藥物組合物給藥于患者。

附圖簡述
圖I顯示了人工重鏈的示意圖，該人工重鏈由人V_、D和J-區(qū)、大鼠內(nèi)含增強子和幾個人工恒定區(qū)基因組成。人工恒定區(qū)基因含有編碼人CHl結(jié)構(gòu)域和大鼠CH2、3和4結(jié)構(gòu)域的外顯子。大鼠外顯子編碼跨膜和胞質(zhì)多肽序列。
圖2. I-SceI和識別序列的3’端的DNA相互作用的圖示。
圖3. I-SceI識別序列的5’端與I-SceI相互作用的圖示。
圖4. I-CreI 的序列識別機制的圖不(來自 Nucleic Acids Res.，34，4791-4800)。
圖5.改變I-CreI識別序列的策略的示意圖。
圖6.在細胞中表達了針對編碼大鼠IgM的序列設計的鋅指蛋白(ZFP)，制備了染色體DNA，并且將IgM基因座的合適區(qū)域進行PCR擴增。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分析反應產(chǎn)物。該圖顯示了證明切割活性的典型實例。
發(fā)明詳述
“人工免疫球蛋白基因座”意指含有人和非人免疫球蛋白基因座的免疫球蛋白基因座，包括多個免疫球蛋白基因區(qū)段，其包括至少一個可變區(qū)(V)基因區(qū)段，一個或多個J基因區(qū)段，就重鏈基因座而言一個或多個D基因區(qū)段，和一個或多個恒定區(qū)基因區(qū)段。在本發(fā)明中，至少一個V基因區(qū)段編碼種系或超突變的人V-區(qū)氨基酸序列。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的人工免疫球蛋白基因座是功能性的并且能夠重排和產(chǎn)生一組免疫球蛋白。在優(yōu)選的實施方案中，至少一個D基因區(qū)段是人D基因區(qū)段。如在此所用的“人工Ig基因座”可以指的是未重排的基因座，部分重排的基因座和重排的基因座。人工Ig基因座包括人工Ig輕鏈基因座和人工Ig重鏈基因座。在一個實施方案中，人工Ig基因座含有非人C區(qū)基因并且能夠產(chǎn)生一組免疫球蛋白，包括具有非人C區(qū)的嵌合免疫球蛋白。在一個實施方案中，人工Ig基因座含有人C區(qū)基因并且能夠產(chǎn)生一組免疫球蛋白，包括具有人C區(qū)的免疫球蛋白。在一個實施方案中，人工Ig基因座含有“人工恒定區(qū)基因”，其意指含有源自人和非人恒定區(qū)基因的恒定區(qū)基因。例如，示例性人工C恒定區(qū)基因是編碼人IgG CHl結(jié)構(gòu)域以及大鼠IgG CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的恒定區(qū)基因。
在一些實施方案中，人工Ig重鏈基因座缺乏CH1，或使所得到的免疫球蛋白繞開典型的免疫球蛋白伴侶蛋白結(jié)合的等價序列。這樣的人工基因座提供了在轉(zhuǎn)基因動物中生產(chǎn)只有重鏈的抗體，該抗體缺乏功能性Ig輕鏈基因座并因此不表達功能性Ig輕鏈。將這樣的人工Ig重鏈基因座用于在此的方法中來產(chǎn)生缺乏功能性Ig輕鏈基因座并包含人工Ig重鏈基因座的轉(zhuǎn)基因動物，該動物能夠產(chǎn)生只有重鏈的抗體?；蛘?，可以在原位操作人工Ig基因座以破壞CHl或等價區(qū)，并產(chǎn)生人工Ig重鏈基因座，提供了生產(chǎn)只有重鏈的抗體。關(guān)于在輕鏈缺失小鼠中生產(chǎn)只有重鏈 的抗體，參見，例如，Zou等，JEM，204:3271-3283，2007。
“人獨特型”意指存在于人抗體上的由免疫球蛋白V-基因區(qū)段編碼的多肽序列。如在此所用的術(shù)語“人獨特型”包括天然存在的人抗體序列，以及合成的與天然存在的人抗體中發(fā)現(xiàn)的多肽基本上相同的序列?！盎旧稀币庵赴被嵝蛄型恍缘某潭葹橹辽偌s85%-95%。優(yōu)選，氨基酸序列同一性的程度高于90%，更優(yōu)選高于95%。
“嵌合抗體”或“嵌合免疫球蛋白”意指含有一部分人免疫球蛋白多肽序列(或由人Ig基因區(qū)段編碼的多肽序列)和一部分非人免疫球蛋白多肽序列的免疫球蛋白分子。本發(fā)明的嵌合免疫球蛋白分子是具有非人Fe-區(qū)或人工Fe-區(qū)和人獨特型的免疫球蛋白。這樣的免疫球蛋白可以分離自本發(fā)明已經(jīng)工程化來生產(chǎn)嵌合免疫球蛋白分子的動物。
“人工Fe-區(qū)”意指由人工恒定區(qū)基因編碼的Fe-區(qū)。
如在此所用的術(shù)語“l(fā)g基因區(qū)段”指的是編碼Ig分子各個部分的DNA區(qū)段，其存在于非人動物和人的種系中，并且在B細胞中合在一起形成重排的Ig基因。因此，如在此所用的Ig基因區(qū)段包括V基因區(qū)段、D基因區(qū)段、J基因區(qū)段和C區(qū)基因區(qū)段。
如在此所用的術(shù)語“人Ig基因區(qū)段”包括天然存在的人Ig基因區(qū)段的序列，天然存在的人Ig基因區(qū)段的簡并形式以及合成的編碼與通過天然存在的人Ig基因區(qū)段序列編碼的多肽基本上相同的多肽序列的序列?！盎旧稀币庵赴被嵝蛄型恍缘某潭葹橹辽偌s85%-95%。優(yōu)選，氨基酸序列同一性的程度高于90%，更優(yōu)選高于95%。
“大范圍核酸酶”意指識別DNA中長識別位點，優(yōu)選至少12，更優(yōu)選至少13，更優(yōu)選至少14,更優(yōu)選至少15,更優(yōu)選至少16,更優(yōu)選至少17,最優(yōu)選至少18個核苷酸長的內(nèi)切脫氧核糖核酸酶。大范圍核酸酶包括鋅指核酸酶，天然存在的歸巢內(nèi)切核酸酶和定制工程化的鋅指核酸酶和歸巢內(nèi)切核酸酶。本發(fā)明中的使用所需要的是大范圍核酸酶識別存在于或接近于主體動物中的內(nèi)源性Ig基因座的大范圍核酸酶靶序列，使得通過大范圍核酸酶的作用可以將功能性突變引入到Ig基因座中。對于大范圍核酸酶的更多討論，參見，例如，美國專利申請公開號 20060206949, 20060153826, 20040002092, 20060078552 和20050064474。
可以通過使各個鋅指與不同的三聯(lián)體靶結(jié)合來生產(chǎn)具有改變的特異性的鋅指核酸酶?？梢酝ㄟ^基于結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)工程化來改變天然存在的歸巢內(nèi)切核酸酶的特異性。例如，參見，Proteus 和 Carroll, nature biotechnology 23 (8) :967-97, 2005。
具有“種系失活的Ig基因座”或“種系失活的內(nèi)源性Ig基因座”或“內(nèi)源性Ig基因座的種系突變”的動物在每個細胞(即，每個體細胞和生殖細胞)中具有失活的內(nèi)源性Ig基因座。在本發(fā)明中，通過突變來產(chǎn)生具有種系失活基因座的動物，如通過生殖細胞中的大范圍核酸酶的作用來進行，該生殖細胞產(chǎn)生所得到的動物或其前輩。
具有失活的內(nèi)源性Ig基因座的活生殖細胞和轉(zhuǎn)基因動物的產(chǎn)生
在本發(fā)明中，使用大范圍核酸酶來滅活內(nèi)源性Ig基因座，使得產(chǎn)生具有至少一個失活的內(nèi)源性Ig基因座的活生殖細胞。該方法包括在生殖細胞、受精卵母細胞或胚胎中表達至少一個大范圍核酸酶，以產(chǎn)生具有至少一個失活的內(nèi)源性Ig基因座的活生殖細胞。因此表達的大范圍核酸酶識別存在于或接近 于主體動物中的內(nèi)源性Ig基因座的大范圍核酸酶靶序列。
在一個實施方案中，其中大范圍核酸酶在生殖細胞表達,其中表達大范圍核酸酶的生殖細胞產(chǎn)生具有至少一個失活的內(nèi)源性Ig基因座的活生殖細胞。或者，可以從源自其中表達大范圍核酸酶的生殖細胞的動物中獲得具有至少一個失活的內(nèi)源性Ig基因座的活生殖細胞。
在一個實施方案中，其中大范圍核酸酶在受精卵母細胞或胚胎中表達，可以從源自其中表達大范圍核酸酶的受精卵母細胞或胚胎的動物中獲得具有至少一個失活的內(nèi)源性Ig基因座的活生殖細胞。
本發(fā)明還提供生產(chǎn)含有至少一個種系失活的內(nèi)源性Ig基因座的轉(zhuǎn)基因動物的方法。該方法包括從根據(jù)在此的方法產(chǎn)生的具有至少一個失活的內(nèi)源性Ig基因座的活生殖細胞生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物。
在一個實施方案中，具有至少一個失活的內(nèi)源性Ig基因座的活生殖細胞進一步含有人工Ig基因座，并且如此產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因動物含有人工Ig基因座。
在一個實施方案中，該方法進一步包括將人工Ig基因座引入到具有至少一個失活的內(nèi)源性Ig基因座的活生殖細胞，或其生殖細胞后代或從其產(chǎn)生的受精卵母細胞或胚胎中，并且如此產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因動物含有人工Ig基因座。
在一個實施方案中，該方法包括將具有至少一個失活的內(nèi)源性Ig基因座的活生殖細胞，或其生殖細胞后代與含有人工Ig基因座的配子結(jié)合，并且如此產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因動物含有人工Ig基因座。
內(nèi)源性Ig基因座的滅活
使用對主體動物內(nèi)源性的重鏈和/或輕鏈基因座中的免疫球蛋白基因區(qū)段特異性的大范圍核酸酶來進行內(nèi)源性Ig基因座的滅活。在一個實施方案中，通過將大范圍核酸酶注射到生殖細胞、受精卵母細胞或胚胎中來誘導雙鏈斷裂?；蛘撸梢詫⒕幋a大范圍核酸酶并能夠在生殖細胞、受精卵母細胞或胚胎中表達的表達載體或核酸注入其中。
在一個實施方案中，該方法包括用大范圍核酸酶編碼核酸或表達構(gòu)建體在體外或在體內(nèi)轉(zhuǎn)染生殖細胞，其可以包括其前身，如精原干細胞。例如，參見，Ryu等，J. Androl.，28:353-360，2007 ;0rwig 等，Biol. Report,67:874-879,2002
在優(yōu)選的實施方案中，將大范圍核酸酶表達構(gòu)建體整合到主體動物的基因組中。編碼大范圍核酸酶的轉(zhuǎn)基因在生殖細胞中的表達將導致內(nèi)源性Ig基因座中的雙鏈斷裂，并導致隨后的限制性位點突變。這樣的轉(zhuǎn)基因動物的交配產(chǎn)生具有突變的/失活的免疫球蛋白基因座的后代。[0149]在本發(fā)明的非常優(yōu)選的實施方案中，將可調(diào)控的大范圍核酸酶表達構(gòu)建體整合到主體動物的基因組中，該可調(diào)控構(gòu)建體在生殖細胞中是可誘導的。這樣的構(gòu)建體提供了與特定大范圍核酸酶通過誘導型啟動子的受控表達的表達相關(guān)的細胞毒性作用的最小化，誘導型啟動子例如為熱誘導型啟動子、輻射誘導型啟動子、四環(huán)素操縱子、激素誘導型啟動子和通過反式激活蛋白的二聚作用可誘導的啟動子等。例如，參見，ViIaboa等,Current GeneTherapy,6:421-438，2006。
或者，可以在源自該生殖細胞的胚胎中誘導大范圍核酸酶表達。
在一個實施方案中，在生殖細胞中表達單個大范圍核酸酶，其中大范圍核酸酶識別在主體動物的生殖細胞內(nèi)源性的免疫球蛋 白基因座之中或附近的靶序列。在優(yōu)選的實施方案中，大范圍核酸酶靶序列在J基因區(qū)段之中或附近。在另一個優(yōu)選的實施方案中，大范圍核酸酶靶序列在免疫球蛋白恒定區(qū)基因之中或附近。在優(yōu)選的實施方案中，免疫球蛋白恒定區(qū)基因編碼免疫球蛋白μ。
在優(yōu)選的實施方案中，使用至少兩種具有不同靶序列的大范圍核酸酶。這至少兩種大范圍核酸酶在生殖細胞中表達，其中大范圍核酸酶識別在主體動物的生殖細胞內(nèi)源性的免疫球蛋白基因座之中或附近的不同靶序列。
在優(yōu)選的實施方案中，第一個和第二個大范圍核酸酶靶向J基因區(qū)段。在一個實施方案中，第一個和第二個大范圍核酸酶靶向序列一起位于內(nèi)源性Ig基因座內(nèi)的一個或多個J基因區(qū)段的上游和下游，并且由第一個和第二個編碼的大范圍核酸酶的切割產(chǎn)生含有一個或多個J基因區(qū)段的基因組DNA區(qū)段的缺失。
在另一個實施方案中，第一個和第二個大范圍核酸酶靶向恒定區(qū)基因區(qū)段。在一個實施方案中，第一個和第二個大范圍核酸酶靶序列一起位于一個或多個免疫球蛋白恒定區(qū)基因區(qū)段的上游和下游，并且由第一個和第二個編碼的大范圍核酸酶的切割產(chǎn)生含有一個或多個免疫球蛋白恒定區(qū)基因區(qū)段的基因組DNA區(qū)段的缺失。在優(yōu)選的實施方案中，恒定區(qū)基因編碼免疫球蛋白μ。
在一個實施方案中，從主體動物的基因組中缺失完整的內(nèi)源性Ig重鏈和/或Ig輕鏈基因座，或其大部分。這樣的動物也稱為含有已經(jīng)被滅活的內(nèi)源性基因座。
在一個實施方案中，使用至少一種大范圍核酸酶來破壞內(nèi)源性Ig重鏈基因座的CHl區(qū)，使剩余的基因座保持完整并能夠產(chǎn)生繞開了典型的免疫球蛋白伴侶蛋白結(jié)合的Ig重鏈。優(yōu)選，在缺乏功能性Ig輕鏈基因座的動物中進行這種CHl靶向。該動物中的這種靶向用于產(chǎn)生只有重鏈的抗體。
在一個實施方案中，使用超過一種的大范圍核酸酶來祀向Ig重鏈基因座內(nèi)的CHl。
在一個實施方案中，使用兩種識別鄰近位點的大范圍核酸酶。在一個實施方案中，該位點是回文序列的元件。在一個實施方案中，這兩種大范圍核酸酶通過連接物拴系。
在優(yōu)選的實施方案中，設計所用的育種策略來獲得對于內(nèi)源性Ig輕鏈和/或內(nèi)源性Ig重鏈為失效合子的動物。
含有可調(diào)控的基因組大范圍核酸酶表達構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因動物
在一個方面中，本發(fā)明提供含有至少一個可調(diào)控的基因組大范圍核酸酶表達構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因動物。[0162]從小的實驗室動物選擇轉(zhuǎn)基因動物，特別是禽類(雞、火雞、鵪鶉、鴨、雉或鵝等)、嚙齒動物(例如，大鼠、倉鼠和豚鼠)和鼬鼠(例如，白鼬)。
在優(yōu)選的實施方案中，可調(diào)控的基因組大范圍核酸酶表達構(gòu)建體含有可操作地連接大范圍核酸酶編碼核酸的誘導型表達控制區(qū)。該誘導型表達控制區(qū)在特定轉(zhuǎn)基因動物的生殖細胞中是可誘導功能性的，并且所編碼的大范圍核酸酶對于位于或接近于主體動物的內(nèi)源性免疫球蛋白基因座的大范圍核酸酶靶序列是選擇性的。
可調(diào)控大范圍核酸酶表達構(gòu)建體提供了與特定大范圍核酸酶通過誘導型啟動子的受控表達的表達相關(guān)的細胞毒性作用的最小化，誘導型啟動子例如為熱誘導型啟動子、輻射誘導型啟動子、四環(huán)素操縱子、激素 誘導型啟動子和通過反式激活蛋白的二聚作用可誘導的啟動子等。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物含有兩個可調(diào)控的基因組大范圍核酸酶表達構(gòu)建體，含有編碼識別兩個不同靶序列的兩種不同大范圍核酸酶的兩種不同核酸。這兩種大范圍核酸酶聯(lián)合起作用使內(nèi)源性Ig基因座的基因組DNA區(qū)段缺失并由此將其滅活。
可以通過本領域公知的方法來制造含有至少一個可調(diào)控的基因組大范圍核酸酶表達構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因動物。例如，將含有可操作地連接大范圍核酸酶編碼核酸的誘導型表達控制區(qū)的轉(zhuǎn)基因載體引入到一個或幾個受體細胞中，然后通過隨機整合或靶向整合將其整合到一個或幾個受體細胞的基因組中。
對于隨機整合，可以通過標準轉(zhuǎn)基因策略將這樣的轉(zhuǎn)基因載體引入到受體細胞中。例如，可以將轉(zhuǎn)基因載體直接注入受精卵母細胞的原核中。還可以通過在卵母細胞受精前將精子和轉(zhuǎn)基因載體共同培養(yǎng)來引入轉(zhuǎn)基因載體。轉(zhuǎn)基因動物可以從受精卵母細胞產(chǎn)生。另一種引入轉(zhuǎn)基因載體的方式是通過轉(zhuǎn)染胚胎干細胞或其他多能細胞(例如，原生殖細胞)并隨后將遺傳修飾的細胞注入發(fā)育中的胚胎中。或者，可以將轉(zhuǎn)基因載體(裸露的或與促進試劑結(jié)合)直接注入發(fā)育中的胚胎中。在另一個實施方案中，將轉(zhuǎn)基因載體引入到細胞的基因組中，并且通過核移植克隆從轉(zhuǎn)染的細胞產(chǎn)生動物。
對于靶向整合，可以將這樣的轉(zhuǎn)基因載體引入到合適的受體細胞，如胚胎干細胞或已經(jīng)分化的體細胞中。此后，可以通過標準方法來選擇通過同源重組已經(jīng)將轉(zhuǎn)基因在靶向的位點整合到動物基因組中的細胞。然后可以將選定的細胞與去核的核移植單位細胞(例如，卵母細胞或胚胎干細胞，全能性的并且能夠形成功能性新生兒的細胞)融合。按照完全確立的常規(guī)技術(shù)來進行融合。參見，例如，Cibelli等，Science (1998) 280:1256, Zhou等，Science (2003) 301:1179。也可以使用注射移液管通過顯微外科來進行卵母細胞的去核和核移植。(參見，例如，Wakayama等，Nature (1998)394:369)。然后將所得到的細胞在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并轉(zhuǎn)移至同步的受體中，用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物?；蛘撸梢詫⑦x定的遺傳修飾的細胞注入發(fā)育中的胚胎中。
在一個實施方案中，使用大范圍核酸酶來提高在靶位點通過雙鏈DNA切割的同源重組的頻率。
含有人工Ig基因座和能夠產(chǎn)生具有人獨特型的抗體的轉(zhuǎn)基因動物
在一個方面中，本發(fā)明提供能夠產(chǎn)生具有人獨特型的免疫球蛋白的轉(zhuǎn)基因動物，及其制備方法。[0172]所用的轉(zhuǎn)基因動物特別地選自禽類(雞、火雞、鵪鶉、鴨、雉或鵝等)、嚙齒動物(例如，大鼠、倉鼠和豚鼠)和鼬鼠(例如，白鼬)。
用于本發(fā)明的人源化抗體生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因動物在內(nèi)源性Ig基因座攜帶種系突變，該種系突變已經(jīng)通過一個或多個大范圍核酸酶的活性來實現(xiàn)。在優(yōu)選的實施方案中，轉(zhuǎn)基因動物對于內(nèi)源性Ig重鏈和/或內(nèi)源性Ig輕鏈是失效合子的。此外，這些動物攜帶至少一個人工Ig基因座，其是功能性的并且能夠在轉(zhuǎn)基因動物中產(chǎn)生一組免疫球蛋白分子。本發(fā)明中所用的人工Ig基因座包括至少一個人V基因區(qū)段。
在優(yōu)選的實施方案中，轉(zhuǎn)基因動物攜帶至少一個人工Ig重鏈基因座和至少一個人工Ig輕鏈基因座，各自都是功能性的并且能 夠在轉(zhuǎn)基因動物中產(chǎn)生一組免疫球蛋白分子，該組免疫球蛋白分子包括具有人獨特型的抗體。在一個實施方案中，使用了包括至少一個非人C基因的人工基因座，并且提供了能夠產(chǎn)生具有人獨特型和非人恒定區(qū)的嵌合抗體的動物。在一個實施方案中，使用了包括至少一個人C基因的人工基因座，并且提供了能夠產(chǎn)生具有人獨特型和人恒定區(qū)的抗體的動物。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，轉(zhuǎn)基因動物攜帶至少一個人工Ig重鏈基因座，并缺乏功能性Ig輕鏈基因座。這樣的動物在只有重鏈的抗體的生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)了用途。
這樣的轉(zhuǎn)基因動物的產(chǎn)生包括將一個或多個人工重量Ig基因座和一個或多個人工輕鏈Ig基因座整合到具有至少一個內(nèi)源性Ig基因座的轉(zhuǎn)基因動物的基因組中，該內(nèi)源性Ig基因座已經(jīng)或?qū)⒁ㄟ^一個或多個大范圍核酸酶的作用來滅活。優(yōu)選，轉(zhuǎn)基因動物對于內(nèi)源性Ig重鏈和/或內(nèi)源性Ig輕鏈是失效合子的，因此，不能夠產(chǎn)生內(nèi)源性免疫球蛋白。與染色體位置無關(guān)，本發(fā)明的人工Ig基因座具有經(jīng)歷基因重排并由此產(chǎn)生多樣的免疫球蛋白分子的能力。具有經(jīng)歷基因重排能力的Ig基因座在此也稱為“功能性” Ig基因座，通過功能性Ig基因座產(chǎn)生的具有不同組性的抗體也稱為“功能性”抗體或“功能性”組的抗體。
用于產(chǎn)生這樣的轉(zhuǎn)基因動物的人工基因座各自包括多個免疫球蛋白基因區(qū)段，其包括至少一個V區(qū)基因區(qū)段，一個或多個J基因區(qū)段，就重鏈基因座而言一個或多個D基因區(qū)段，和一個或多個恒定區(qū)基因。在本發(fā)明中，至少一個V基因區(qū)段編碼種系或超突變的人V區(qū)氨基酸序列。因此，這樣的轉(zhuǎn)基因動物具有產(chǎn)生不同組的免疫球蛋白分子的能力，其包括具有人獨特型的抗體。
在一個實施方案中，所用的人工基因座含有至少一個非人C區(qū)基因區(qū)段。因此，這樣的轉(zhuǎn)基因動物具有產(chǎn)生不同組的免疫球蛋白分子的能力，其包括具有人獨特型的嵌合抗體。
在一個實施方案中，所用的人工基因座含有至少一個人C區(qū)基因區(qū)段。因此，這樣的轉(zhuǎn)基因動物具有產(chǎn)生不同組的免疫球蛋白分子的能力，其包括具有人獨特型和人恒定區(qū)的抗體。
在一個實施方案中，所用的人工基因座含有至少一個人工恒定區(qū)基因。例如，示例性人工C恒定區(qū)基因是編碼人IgG CHl結(jié)構(gòu)域以及大鼠IgG CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的恒定區(qū)基因。因此，這樣的轉(zhuǎn)基因動物具有產(chǎn)生不同組免疫球蛋白分子的能力，其包括具有人獨特型和含有人和非人組分的人工恒定區(qū)的抗體。
將含有人工Ig基因座的轉(zhuǎn)基因載體引入到一個或多個受體細胞中，然后通過隨機整合或靶向整合將其整合到一個或多個受體細胞的基因組中。
對于隨機整合，可以通過標準的轉(zhuǎn)基因技術(shù)將含有人工Ig基因座的轉(zhuǎn)基因載體引入到受體細胞中。例如，可以將轉(zhuǎn)基因載體直接注入受精卵母細胞的原核中。還可以通過在卵母細胞受精前將精子和轉(zhuǎn)基因載體共同培養(yǎng)來引入轉(zhuǎn)基因載體。轉(zhuǎn)基因動物可以從受精卵母細胞產(chǎn)生。另一種引入轉(zhuǎn)基因載體的方式是通過轉(zhuǎn)染胚胎干細胞或其他多能細胞(例如，原生殖細胞)并隨后將遺傳修飾的細胞注入發(fā)育中的胚胎中?；蛘撸梢詫⑥D(zhuǎn)基因載體(裸露的或與促進試劑結(jié)合)直接注入發(fā)育中的胚胎中。最終，從含有整合到轉(zhuǎn)基因動物的至少一些體細胞的基因組中的人工Ig 轉(zhuǎn)基因的胚胎產(chǎn)生嵌合轉(zhuǎn)基因動物。在另一個實施方案中，將轉(zhuǎn)基因載體引入到細胞的基因組中，并且通過核移植克隆從轉(zhuǎn)染的細胞產(chǎn)生動物。
在優(yōu)選的實施方案中，將含有人工Ig基因座的轉(zhuǎn)基因隨機整合到受體細胞(如受精卵母細胞或發(fā)育中的胚胎)的基因組中。受體細胞源自具有至少一個內(nèi)源性Ig基因座已經(jīng)通過一種或多種大范圍核酸酶的作用滅活的動物?；蛘?，可以將攜帶人工免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因動物與具有至少一個內(nèi)源性Ig基因座已經(jīng)通過一種或多種大范圍核酸酶的作用滅活的轉(zhuǎn)基因動物雜交。與所用的特定方法無關(guān)，在優(yōu)選的實施方案中，獲得了對于內(nèi)源性Ig重鏈和/或Ig輕鏈為失效合子的并因此不能產(chǎn)生內(nèi)源性免疫球蛋白而能產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因免疫球蛋白的后代。
對于靶向整合，可以將轉(zhuǎn)基因載體引入到合適的受體細胞，如胚胎干細胞、其他多能細胞或已經(jīng)分化的體細胞中。此后，可以通過標準方法來選擇通過同源重組已經(jīng)將轉(zhuǎn)基因整合到動物基因組中并已經(jīng)替代對應的內(nèi)源性Ig基因座的細胞。然后可以將選定的細胞與去核的核移植單位細胞(例如，卵母細胞或胚胎干細胞，全能性的并且能夠形成功能性新生兒的細胞)融合。按照完全確立的常規(guī)技術(shù)來進行融合。參見，例如，Cibelli等，Science (1998) 280:1256 ;Zhou 等，Science (2003) 301:1179。也可以使用注射移液管通過顯微外科來進行卵母細胞的去核和核移植。(參見,例如,Wakayama等,Nature (1998)394:369)。然后將所得到的細胞在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并轉(zhuǎn)移至同步的受體中，用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物?；蛘撸梢詫⑦x定的遺傳修飾的細胞注入發(fā)育中的胚胎中，其隨后發(fā)育成嵌合動物。
在一個實施方案中，使用大范圍核酸酶來提高在靶位點通過雙鏈DNA切割的同源重組的頻率。為了整合到內(nèi)源性免疫球蛋白基因座中，可以使用位點特異性大范圍核酸酶。在一個實施方案中，使用靶向內(nèi)源性Ig基因座的大范圍核酸酶來提高同源重組的頻率和人工Ig基因座或其部分對內(nèi)源性Ig基因座或其部分的替代。
在一個實施方案中，轉(zhuǎn)基因動物缺乏功能性Ig輕鏈基因座，但含有人工Ig重鏈基因座。
人工Ig基因座
本發(fā)明進一步涉及人工Ig基因座及其在制造能夠產(chǎn)生具有人獨特型的免疫球蛋白的轉(zhuǎn)基因動物中的用途。
每個人工Ig基因座含有多個免疫球蛋白基因區(qū)段，其包括至少一個V區(qū)基因區(qū)段，一個或多個J基因區(qū)段，就重鏈基因座而言一個或多個D基因區(qū)段，和一個或多個恒定區(qū)基因。在本發(fā)明中，至少一個V基因區(qū)段編碼種系或超突變的人V區(qū)氨基酸序列。因此，這樣的轉(zhuǎn)基因動物具有產(chǎn)生不同組的免疫球蛋白分子的能力，其包括具有人獨特型的抗體。在重鏈基因座中，在人工Ig基因座中可以包括人或非人衍生的D-基因區(qū)段。在未重排構(gòu)象(或“種系構(gòu)象”)或部分或完全重排的構(gòu)象中，該基因座的基因區(qū)段是相互并列的。人工Ig基因座具有在主體動物中經(jīng)歷基因重排的能力(如果基因區(qū)段沒有完全重排)，并由此產(chǎn)生具有人獨特型的不同組的免疫球蛋白。
調(diào)控元件，如啟動子、增強子、轉(zhuǎn)換區(qū)、重組信號等，可以是人或非人來源的。所需要的是該元件在所涉及的動物物種中可操作，以賦予人工基因座功能性。
在一個方面中，本發(fā)明提供含有能夠在宿主動物中經(jīng)歷基因重排并由此產(chǎn)生不同組的具有人獨特型的重鏈的人工重鏈基因座的轉(zhuǎn)基 因構(gòu)建體。轉(zhuǎn)基因的人工重鏈基因座含有具有至少一個人V基因區(qū)段的V-區(qū)。優(yōu)選，V-區(qū)包括至少約5-100人重鏈V (或“VH”)基因區(qū)段。如上所述，人VH區(qū)段包括天然存在的人VH基因區(qū)段的序列，天然存在的人VH基因區(qū)段序列的簡并形式以及編碼與人重鏈V結(jié)構(gòu)域多肽基本上相同(B卩，至少約85%-95%)的多肽序列的合成序列。
在優(yōu)選的實施方案中，人工重鏈基因座含有至少一個或幾個大鼠恒定區(qū)基因，例如，C δ、C μ和C Y (包括任何C Y亞類)。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，人工重鏈基因座含有人工恒定區(qū)基因。在優(yōu)選的實施方案中，該人工恒定區(qū)基因編碼人CHl結(jié)構(gòu)域以及大鼠CH2CH3結(jié)構(gòu)域，或人CHl以及大鼠CH2、CH3和CH4結(jié)構(gòu)域。具有人CHl結(jié)構(gòu)域的雜交重鏈與全長人輕鏈有效地配對。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，人工重鏈基因座含有缺乏CHl結(jié)構(gòu)域的人工恒定區(qū)基因。在優(yōu)選的實施方案中，這樣的人工恒定區(qū)基因編碼缺乏CHl結(jié)構(gòu)域但含有CH2和CH3，或CH1、CH2、CH3和CH4結(jié)構(gòu)域的截短IgM和/或IgG。缺乏CHl結(jié)構(gòu)域的重鏈不能與Ig輕鏈有效配對，形成了只有重鏈的抗體。
在另一個方面中，本發(fā)明提供含有能夠在宿主動物中經(jīng)歷基因重排并由此產(chǎn)生不同組的具有人獨特型的輕鏈的人工輕鏈基因座的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體。轉(zhuǎn)基因的人工輕鏈基因座含有具有至少一個人V基因區(qū)段的V-區(qū)，例如，具有至少一個人VL基因和/或至少一個重排的人VJ區(qū)段的V-區(qū)。優(yōu)選，V-區(qū)包括至少約5-100人輕鏈V (或“VL”)基因區(qū)段。一致地，人VL區(qū)段包括天然存在的人VL基因區(qū)段的序列，天然存在的人VL基因區(qū)段序列的簡并形式以及編碼與人輕鏈V結(jié)構(gòu)域多肽基本上相同(即，至少約85%-95%)的多肽序列的合成序列。在一個實施方案中，人工輕鏈Ig基因座具有帶有至少一個大鼠C基因(例如，大鼠CA或C O的C-區(qū)。
本發(fā)明的另一個方面涉及制備含有人工Ig基因座的轉(zhuǎn)基因載體的方法。這樣的方法包括分離Ig基因座或其片段，并將其與一個或幾個含有編碼人V區(qū)元件的序列的DNA片段結(jié)合。通過連接或同源重組將一個或幾個Ig基因區(qū)段插入到人工Ig基因座或其部分中，以這樣的方式來保留基因座在主體動物中經(jīng)歷有效的基因重排的能力。
優(yōu)選，通過篩選從相同物種的基因組DNA制得的質(zhì)粒、粘粒、YAC或BAC等的文庫來分離非人Ig基因座。YAC克隆可以攜帶至多2個巨堿基的DNA片段，因此可以在一個YAC克隆中分離完整的動物重鏈基因座或其大部分，或?qū)⑵錁?gòu)建以包含于一個YAC克隆中。BAC克隆能夠攜帶較小大小(約50-500kb)的DNA片段。然而，可以分開改變含有Ig基因座重疊片段的多個BAC克隆，并隨后一起注射到動物受體細胞中，其中重疊片段在受體動物細胞中重新結(jié)合，以產(chǎn)生連續(xù)的Ig基因座。
可以通過各種方法將人Ig基因區(qū)段整合到載體(例如，BAC克隆)上的Ig基因座中，這樣的方法包括DNA區(qū)段的連接，或通過同源重組的DNA區(qū)段的插入。以這樣的方式進行人Ig基因區(qū)段的整合，使得人Ig基因區(qū)段可操作地連接宿主動物的轉(zhuǎn)基因序列來產(chǎn)生功能性人源化Ig基因座，即，能夠基因重排的Ig基因座，其導致產(chǎn)生不同組的具有人獨特型的抗體。可以在細菌、酵母和其他具有高頻率同源重組事件的細胞中進行同源重組。工程化的YAC和BAC可以容易地從細胞中分離出來并用于制備轉(zhuǎn)基因動物。
具有人獨特型的免疫球蛋白
一旦制得能夠產(chǎn)生具有人獨特型 的免疫球蛋白的轉(zhuǎn)基因動物，就可以通過用抗原免疫動物容易地獲得針對抗原的免疫球蛋白和抗體制劑。如在此所用的“多克隆抗血清組合物”包括親和性純化的多克隆抗體制劑。
各種抗原可以用來免疫轉(zhuǎn)基因動物。這樣的抗原包括，但不限于，活的、減毒的或死亡的微生物，例如，病毒和單細胞生物體(如細菌和真菌)，微生物的區(qū)段或從微生物分離的抗原性分子。
用于免疫動物的優(yōu)選細菌抗原包括從金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)純化的抗原，如5型和8型莢膜多糖，重組形式的毒力因子，如α -毒素，粘附素結(jié)合蛋白，膠原結(jié)合蛋白和粘連蛋白結(jié)合蛋白。優(yōu)選的細菌抗原還包括減毒形式的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、腸球菌、腸細菌和肺炎克雷伯桿菌(Klebsiellapneumoniae)，或來自這些細菌細胞的培養(yǎng)物上清液?？梢杂糜诿庖叩钠渌毦乖▉碜糟~綠假單胞菌、腸球菌、腸細菌和肺炎克雷伯桿菌的純化脂多糖(LPS)、莢膜抗原、莢膜多糖和/或重組形式的外膜蛋白、粘連蛋白結(jié)合蛋白、內(nèi)毒素和外毒素。
用于產(chǎn)生抗真菌抗體的優(yōu)選抗原包括減毒形式的真菌或其外膜蛋白，該真菌包括，但不限于，白假絲酵母(Candida albicans)、近平滑假絲酵母(Candidaparapsilosis)、熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)和新型隱球菌(Cryptococcusneoformans)。
用于免疫以產(chǎn)生抗病毒抗體的優(yōu)選抗原包括包膜蛋白和減毒形式的病毒，其包括，但不限于，呼吸道合胞病毒(RSV)(特別是F-蛋白)、丙肝病毒(HCV)、乙肝病毒(HBV)、巨細胞病毒(CMV )、EBV和HSV。
可以通過用分離的腫瘤細胞或腫瘤細胞系以及腫瘤相關(guān)抗原免疫轉(zhuǎn)基因動物來產(chǎn)生癌癥特異性的抗體，腫瘤相關(guān)抗原包括，但不限于，Her-2-neu抗原(針對其的抗體可用于治療乳癌)KD20、⑶22和⑶53抗原(針對其的抗體可用于治療B細胞淋巴瘤)，前列腺特異性膜抗原(PMSA)(針對其的抗體可用于治療前列腺癌)和17-1A分子(針對其的抗體可用于治療結(jié)腸癌)。
可以以任何方便的方式將抗原給予轉(zhuǎn)基因動物，使用或不使用佐劑，并且可以根據(jù)預定的時間表來給予。
為了制備單克隆抗體，從免疫過的轉(zhuǎn)基因動物分離脾細胞，并用于與轉(zhuǎn)化的細胞系融合，用于生產(chǎn)雜交瘤，或通過標準分子生物學技術(shù)克隆cDNA編碼抗體并在轉(zhuǎn)染的細胞中表達。用于制備單克隆抗體的程序是本領域公知的。參見，例如，歐洲專利申請0583980A1(“從兔產(chǎn)生單克隆抗體的方法”)，美國專利號4，977，081(“穩(wěn)定的兔-鼠雜交瘤及其分泌產(chǎn)物”)，W097/16537(“穩(wěn)定的雞B-細胞系及其使用方法”)和EP 0491057B1(“產(chǎn)生禽類特異性免疫球蛋白G的雜交瘤”)，在此將其公開內(nèi)容引入作為參考。Andris-Widhopf等“Methodsfor the generation of chicken monoclonal antibody fragments by phage display，，,JTmmunol Methods 242:159 (2000),和 Burton,D. R. ,“Phage display”，ImmunotechnologyI 87 (1995)已經(jīng)描述了在體外從克隆的cDNA分子產(chǎn)生單克隆抗體。
一旦產(chǎn)生具有人獨特型的嵌合單克隆抗體，就可以使用標準分子生物學技術(shù)將這樣嵌合抗體容易地轉(zhuǎn)化成完全人抗體。完全人單克隆抗體在人體內(nèi)不是免疫原性的并適用于人患者的治療。
本發(fā)明的抗體包括只有重鏈 的抗體
在一個實施方案中，用抗原免疫缺乏功能性Ig輕鏈基因座但含有人工重鏈基因座的轉(zhuǎn)基因動物，來產(chǎn)生特異性結(jié)合抗原的只有重鏈的抗體。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供源自這些動物的單克隆抗體產(chǎn)生細胞，以及從其產(chǎn)生的核酸。還提供了從其產(chǎn)生的雜交瘤。還提供了完全人的只有重鏈的抗體，以及從其產(chǎn)生的編碼核酸。
關(guān)于只有重鏈的抗體的教導可以在本領域中找到。例如，參見，PCT公開W002085944、W002085945、W02006008548 和 W02007096779。還可以參見 US5, 840，526 ；US5,874，541 ；US6, 005，079 ；US6, 765，087 ；US5, 800，988 ；EP1589107 ；W09734103 和US6, 015，695。
藥物組合物
在本發(fā)明進一步的實施方案中，將純化的單克隆或多克隆抗體與適于給藥于患者的合適藥物載體混合，以提供藥物組合物。
用本發(fā)明的藥物組合物治療患者優(yōu)選是哺乳動物，更優(yōu)選人，盡管也包括脊椎動物使用。
可以用于本發(fā)明藥物組合物中的藥物學上可接受的載體可以是隨便什么溶劑、分散介質(zhì)、等滲劑等。只要任何常規(guī)的介質(zhì)、試劑、稀釋劑或載體對受體或?qū)ζ渲兴贵w的治療有效性是無害的，其在本發(fā)明的藥物組合物中的使用是合適的。
該載體可以是液體、半固體(例如，糊狀物)或固體載體。載體的實例包括油、水、鹽溶液、醇、糖、凝膠、脂質(zhì)、脂質(zhì)體、樹脂、多孔基質(zhì)、粘合劑、填充劑、包衣劑、防腐劑等，或其組合。
治療方法
在本發(fā)明另外的方面中，提供了通過將本發(fā)明純化的抗體組合物給藥于需要治療該疾病的脊椎動物，來治療疾病的方法，所述脊椎動物優(yōu)選是哺乳動物，優(yōu)選靈長類動物，人是特別優(yōu)選的實施方案。
抗體組合物可以用于結(jié)合和中和或調(diào)節(jié)人體組織內(nèi)導致或引起疾病或引發(fā)不利或異常免疫應答的抗原實體。在此將“抗原實體”限定為包括任何可溶性的或結(jié)合細胞表面的分子，包括蛋白質(zhì)，以及至少能夠結(jié)合抗體并優(yōu)選還能夠刺激免疫應答的細胞或引起傳染病的生物體或物質(zhì)。
作為單一治療或與化療聯(lián)合的針對傳染因子的抗體組合物的給藥導致傳染顆粒的消除。單次給藥抗體通常將傳染粒子的數(shù)量降低10至100倍，更常見超過1000倍。相似地，患有惡性疾病的患者中作為單一治療或與化療聯(lián)合使用的抗體治療通常將惡性細胞的數(shù)量減少10至100倍，或超過1000倍。治療可以在延長的時間段內(nèi)重復進行以確保完全消除傳染粒子、惡性細胞等。在一些情況中，使用抗體制劑的治療在可檢測量的傳染粒子或不良細胞不存在的情況下將持續(xù)延長的時間段。
相似地，抗體治療用于調(diào)節(jié)免疫應答的使用可以由單次或多次給藥治療性抗體構(gòu)成?？梢栽谌魏渭膊“Y狀不存在的情況下將治療持續(xù)延長的時間段。
主體治療可以連同化療一起使用，其劑量足以抑制傳染病或惡性腫瘤。在自體免疫疾病患者或移植接受者中，抗體治療可以 連同免疫抑制治療一起使用，其劑量足以抑制免疫反應。
所有引用文獻在此特意以其整體引入作為參考。
實驗
大鼠免疫球蛋白序列特異性的歸巢內(nèi)切核酸酶的定向進化
大鼠IgM外顯子序列的分析導致鑒定了幾個用于工程化歸巢內(nèi)切核酸酶的靶切割序列。使用歸巢內(nèi)切核酸酶I-Scel，鑒定了兩個靶序列，一個在大鼠IgM外顯子II內(nèi)(CGTGGATCACAGGGGTCT)，另一個在大鼠 IgM 外顯子 III 內(nèi)(CTGGGATAACAGGAAGGA)。這些位點與I-SceI的天然識別序列(TAGGGATAACAGGGTAAT)共享61% (18個堿基中的11個)的序列同一'I"生。
表I.大鼠IgM外顯子中的靶序列(不同的核苷酸是帶下劃線的)
國杼__序歹丨J__相似性__位置_
T3_( GTGGATC:A(:AG(;(;(;T( Γ 61%__外顯子 II
Τ4_CTGGGATAACAGGAAGGA 61%_￡卜顯子 III
野生型 TAGGGATAACAGGGTAAT
為了這些靶序列特異性的歸巢內(nèi)切核酸酶的工程化，我們使用了高度敏感性的選擇，用于將酶促DNA切割與宿主細胞存活聯(lián)系起來的歸巢內(nèi)切核酸酶的定向進化(由Chen和Zhao詳細描述，Nucleic Acid Research 33 (18) : el54，2005)。使用體外協(xié)同進化策略來工程化具有靶序列特異性的I-SceI變體。如表2中所示的，對于靶序列T3，選擇了兩個新的序列，Τ3 1和T3i2，作為中間產(chǎn)物序列，而對于靶序列T4，選擇了兩個新的序列，Τ4 1和T4i2，作為中間產(chǎn)物序列。將T3il和T4il序列克隆至報告質(zhì)粒中，分別產(chǎn)生pll-LacY-T3il和 pll-LacY-T4il。
表2.三個步驟中的序列(不同的核苷酸是帶下劃線的)
權(quán)利要求
1.生產(chǎn)單克隆抗體的方法，包括(i)用免疫原免疫非人轉(zhuǎn)基因動物，所述轉(zhuǎn)基因動物具有至少一個種系失活的內(nèi)源性Ig基因座和人工Ig基因座，( )從所述轉(zhuǎn)基因動物分離產(chǎn)生單克隆抗體的細胞，其中所述產(chǎn)生單克隆抗體的細胞產(chǎn)生特異性結(jié)合所述免疫原的單克隆抗體jP(iii)使用所述產(chǎn)生單克隆抗體的細胞來產(chǎn)生特異性結(jié)合所述免疫原的所述單克隆抗體，或使用所述產(chǎn)生單克隆抗體的細胞來生產(chǎn)產(chǎn)生所述單克隆抗體的雜交瘤細胞，和使用所述雜交瘤細胞來產(chǎn)生所述單克隆抗體； 其中所述非人轉(zhuǎn)基因動物是通過從具有至少一個失活的內(nèi)源性Ig基因座和人工Ig基因座的非人生殖細胞或其生殖細胞后代產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物而產(chǎn)生的；并且 其中所述具有至少一個失活的內(nèi)源性Ig基因座的非人生殖細胞是通過包括下列步驟的方法產(chǎn)生的在生殖細胞、受精的卵母細胞或胚胎中表達至少一種大范圍核酸酶，以產(chǎn)生具有至少一個失活的內(nèi)源性Ig基因座的活的生殖細胞，其中所述大范圍核酸酶識別存在于或接近于所述內(nèi)源性Ig基因座的大范圍核酸酶靶序列。
2.生產(chǎn)單克隆抗體的方法，包括(i)用免疫原免疫非人轉(zhuǎn)基因動物，所述轉(zhuǎn)基因動物具有至少一個種系失活的內(nèi)源性Ig基因座和人工Ig基因座，(ii)從所述轉(zhuǎn)基因動物分離產(chǎn)生單克隆抗體的細胞，其中所述產(chǎn)生單克隆抗體的細胞產(chǎn)生特異性結(jié)合所述免疫原的單克隆抗體；(iii)從所述產(chǎn)生單克隆抗體的細胞分離編碼特異性結(jié)合所述免疫原的所述單克隆抗體的單克隆抗體核酸jP(iv)使用所述單克隆抗體核酸來產(chǎn)生特異性結(jié)合所述抗原的所述單克隆抗體； 其中所述非人轉(zhuǎn)基因動物是通過從具有至少一個失活的內(nèi)源性Ig基因座和人工Ig基因座的非人生殖細胞或其生殖細胞后代產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物而產(chǎn)生的；并且 其中所述具有至少一個失活的內(nèi)源性Ig基因座的非人生殖細胞是通過包括下列步驟的方法產(chǎn)生的在生殖細胞、受精的卵母細胞或胚胎中表達至少一種大范圍核酸酶，以產(chǎn)生具有至少一個失活的內(nèi)源性Ig基因座的活的生殖細胞，其中所述大范圍核酸酶識別存在于或接近于所述內(nèi)源性Ig基因座的大范圍核酸酶靶序列。
3.權(quán)利要求
I或2的方法，其中所述單克隆抗體具有人獨特型。
4.生產(chǎn)完全人單克隆抗體的方法，包括(i)用免疫原免疫非人轉(zhuǎn)基因動物，所述轉(zhuǎn)基因動物具有至少一個種系失活的內(nèi)源性Ig基因座和人工Ig基因座，(ii)從所述轉(zhuǎn)基因動物分離產(chǎn)生單克隆抗體的細胞，其中所述產(chǎn)生單克隆抗體的細胞產(chǎn)生特異性結(jié)合所述免疫原的單克隆抗體；(iii)從所述產(chǎn)生單克隆抗體的細胞分離編碼特異性結(jié)合所述免疫原的所述單克隆抗體的單克隆抗體核酸；(iv)修飾所述單克隆抗體核酸以產(chǎn)生編碼完全人單克隆抗體的重組核酸；和(0使用編碼完全人單克隆抗體的所述重組核酸來產(chǎn)生編碼的完全人單克隆抗體； 其中所述非人轉(zhuǎn)基因動物是通過從具有至少一個失活的內(nèi)源性Ig基因座和人工Ig基因座的非人生殖細胞或其生殖細胞后代產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物而產(chǎn)生的；并且 其中所述具有至少一個失活的內(nèi)源性Ig基因座的非人生殖細胞是通過包括下列步驟的方法產(chǎn)生的在生殖細胞、受精的卵母細胞或胚胎中表達至少一種大范圍核酸酶，以產(chǎn)生具有至少一個失活的內(nèi)源性Ig基因座的活的生殖細胞，其中所述大范圍核酸酶識別存在于或接近于所述內(nèi)源性Ig基因座的大范圍核酸酶靶序列。
5.權(quán)利要求
1-4任一項的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因動物是大鼠。
6.生產(chǎn)只有重鏈的抗體的方法，包括用免疫原免疫非人轉(zhuǎn)基因動物，所述轉(zhuǎn)基因動物具有至少一個種系失活的內(nèi)源性Ig基因座和人工Ig基因座， 其中所述非人轉(zhuǎn)基因動物是通過從具有至少一個失活的內(nèi)源性Ig基因座和人工Ig基因座的非人生殖細胞或其生殖細胞后代產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物而產(chǎn)生的；并且 其中所述具有至少一個失活的內(nèi)源性Ig基因座的非人生殖細胞是通過包括下列步驟的方法產(chǎn)生的在生殖細胞、受精的卵母細胞或胚胎中表達至少一種大范圍核酸酶，以產(chǎn)生具有至少一個失活的內(nèi)源性Ig基因座的活的生殖細胞，其中所述大范圍核酸酶識別存在于或接近于所述內(nèi)源性Ig基因座的大范圍核酸酶靶序列； 其中所述轉(zhuǎn)基因動物能夠產(chǎn)生具有人獨特型的免疫球蛋白或只有重鏈的抗體。
7.通過權(quán)利要求
6的方法產(chǎn)生的只有重鏈的抗體，其中所述轉(zhuǎn)基因動物是大鼠。
8.可通過權(quán)利要求
I的方法獲得的細胞。
9.包含編碼權(quán)利要求
2或3中定義的單克隆抗體的核酸的經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞。
10.權(quán)利要求
9的經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞，其生產(chǎn)完全人單克隆抗體。
11.編碼可通過權(quán)利要求
2或3的方法獲得的單克隆抗體的分離的核酸，其中人工基因座包含至少一個人J基因區(qū)段。
12.包含權(quán)利要求
11的核酸編碼的多肽序列的免疫球蛋白。
13.權(quán)利要求
12的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白具有選自下列的恒定(C)區(qū)(i)大鼠恒定(C)區(qū)；或(ii)人工恒定(C)區(qū)，其中所述人工恒定區(qū)衍生自人和大鼠恒定區(qū)。
14.權(quán)利要求
13的免疫球蛋白，其中所述人工恒定(C)區(qū)具有人IgGCHl結(jié)構(gòu)域和大鼠IgG2CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。
15.包含權(quán)利要求
11的核酸的經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞。
16.權(quán)利要求
15的經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞，其生產(chǎn)完全人單克隆抗體。
專利摘要
本發(fā)明涉及缺乏內(nèi)源性Ig并能夠產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因抗體的轉(zhuǎn)基因動物，及其制備方法。本發(fā)明還涉及在這樣的動物中生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因抗體的方法，和由此生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因抗體。
文檔編號C12N5/16GKCN102850452SQ201210301950
公開日2013年1月2日 申請日期2008年5月30日
發(fā)明者R·布洛夫 申請人:Omt公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan