專(zhuān)利名稱(chēng):一種飼料中狗源成分檢測(cè)側(cè)向流試紙條檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域，飼料中來(lái)自狗的動(dòng)物源原料的PCR核酸擴(kuò)增，以及側(cè)向流免疫膠體金試紙條試劑盒的制備和應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
為防止牛海綿狀腦病(bovine spongiform encephalopathy, BSE )經(jīng)添加在動(dòng)物飼料中的牛肉、牛骨傳播，1994年歐盟和1997年美國(guó)分別在1994年和1997年制定禁止在反芻動(dòng)物的飼料中添加反芻動(dòng)物源性蛋白的法規(guī)，2000年歐盟將這項(xiàng)禁令擴(kuò)大到禁止向用于食用的動(dòng)物飼喂加工過(guò)的哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)類(lèi)和魚(yú)類(lèi)蛋白成分。我國(guó)農(nóng)業(yè)部于2004年頒布的《動(dòng)物源性飼料產(chǎn)品安全衛(wèi)生管理辦法》中規(guī)定禁止在反芻動(dòng)物飼料中使用動(dòng)物源性飼料產(chǎn)品(乳及乳制品除外)，但在動(dòng)物飼料中人為摻入反芻動(dòng)物(主要是牛、羊)肉和骨制品的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，要保證此類(lèi)法規(guī)的嚴(yán)格實(shí)施需要靈敏、便捷、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法提供基礎(chǔ)。
傳統(tǒng)的飼料中動(dòng)物性成分鑒定主要通過(guò)顯微鏡檢、基于蛋白質(zhì)檢測(cè)的免疫學(xué)方法以及基于核酸檢測(cè)的各類(lèi)PCR方法，近年還發(fā)展了近紅外檢測(cè)法(NIRS)。飼料成分中摻入的各種動(dòng)物源成分在高溫處理和加工過(guò)程中易于受到破壞，不同種屬動(dòng)物的蛋白質(zhì)序列之間差異不大，難以區(qū)別，發(fā)明專(zhuān)利“SDS-PAGE法鑒別肉及肉制品中動(dòng)物源性成份”(公開(kāi)號(hào):CN 102213720 A)提供了一種以蛋白質(zhì)的SDS-PAGE電泳方式鑒定豬、牛、羊、雞、魚(yú)的動(dòng)物蛋白的方法，但不同來(lái)源和處理方式的蛋白電泳譜帶不同，帶來(lái)結(jié)果判別的障礙，對(duì)于飼料中的動(dòng)物成分更難以實(shí)施。
因?yàn)榛蚓幋a序列的簡(jiǎn)并性特征和非編碼序列的存在，核酸成為較蛋白更易檢出差異的靶分子，特別是線粒體DNA，拷貝數(shù)高，存在物種間差異，對(duì)其差異片段的分析是主要的鑒定方法，這類(lèi)方法因靈敏度高，特異性好，耗時(shí)少而發(fā)展迅速，主要的方法包括普通/熒光PCR方法及基因芯片技術(shù)。在以線粒體DNA序列進(jìn)行物種的種屬鑒別時(shí)，常用的區(qū)域包括編碼細(xì)胞色素B的Cytochrome b基因核糖體小亞基12S RNA編碼序列(12Sribosomal RNA)、細(xì)胞色素 C 亞基 Kcytochrome C oxidase subunit I)的編碼基因 cozJ、編碼ATP8及ATP6的_8 Ratp6基因以及控制區(qū)D-1oop片段。這些區(qū)域的序列變異適中，即在種內(nèi)有一定的保守性，又體現(xiàn)出一定的中間差異。
熒光定量PCR技術(shù)是一種高靈敏度核酸檢測(cè)和定量方法，基本原理是在實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)中 ，引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷積累，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。熒光定量PCR技術(shù)使定性檢測(cè)邁上了可以量化的臺(tái)階，而且具有靈敏度高、特異性和可靠性更強(qiáng)、能實(shí)現(xiàn)多重反應(yīng)、自動(dòng)化程度高、無(wú)污染性，具有實(shí)時(shí)性和準(zhǔn)確性等特點(diǎn)，特別是依賴(lài)探針結(jié)合的TaqMan方法，目前已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域。在物種鑒定應(yīng)用方面，國(guó)內(nèi)已經(jīng)發(fā)布的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)涵蓋了狗、羊、鹿、駱駝、馬、驢、豬、兔、狗和魚(yú)等哺乳動(dòng)物或水生生物。鑒于反芻動(dòng)物的重要性，發(fā)明專(zhuān)利“鑒別反芻動(dòng)物源性成分的熒光PCR檢測(cè)試劑及制備方法和應(yīng)用”(公開(kāi)號(hào):CN101659996A)描述了一種能同時(shí)鑒別牛、羊和山羊的熒光PCR方法，以三條探針進(jìn)行動(dòng)物來(lái)源甄別，公開(kāi)號(hào)為CN 102311999 A的發(fā)明專(zhuān)利“驢或驢源性成分實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法及檢測(cè)用引物和探針”提供了以特定探針鑒別驢來(lái)源成分的熒光PCR方法，而公開(kāi)號(hào)為CN102311998 A的發(fā)明專(zhuān)利“馬或馬源性成分實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法及檢測(cè)用引物和探針”則提供了一種鑒定馬來(lái)源成分的熒光PCR方法。公開(kāi)號(hào)為的發(fā)明專(zhuān)利“一種動(dòng)物源性成分的鑒別方法”提供了一組可以鑒別牛、羊、豬、馬、雞等脊椎動(dòng)物的引物序列和常規(guī)PCR-凝膠電泳方法，類(lèi)似的，在禽類(lèi)動(dòng)物源鑒定方面，發(fā)明專(zhuān)利“一對(duì)鵝源性成分PCR檢測(cè)用引物”(公開(kāi)號(hào):CN 102337337 A)描述了一種以常規(guī)PCR結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定的方法，公開(kāi)號(hào)為CN 101270392A發(fā)明專(zhuān)利“PCR -mtDNA檢測(cè)總禽源性成分的擴(kuò)增引物及其檢測(cè)試劑盒和使用方法”則進(jìn)一步提供了以一對(duì)引物檢測(cè)多種禽類(lèi)來(lái)源線粒體DNA的方法，上述方法中，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)對(duì)設(shè)備依賴(lài)性強(qiáng)，難以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，常規(guī)的PCR擴(kuò)增檢測(cè)需要對(duì)產(chǎn)物凝膠電泳后進(jìn)行圖像采集和分析，耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，且難以保證檢測(cè)的靈敏度。
通過(guò)將免疫學(xué)檢測(cè)的方法移植于核酸產(chǎn)物檢測(cè)可以有效提高核酸產(chǎn)物的檢測(cè)效率。通過(guò)將PCR擴(kuò)增使用的引物標(biāo)記特定的蛋白質(zhì)或化合物可以在其擴(kuò)增產(chǎn)物中引入同時(shí)包括兩種化合物/蛋白質(zhì)標(biāo)記的核酸復(fù)合物，這個(gè)標(biāo)記的產(chǎn)物可以通過(guò)抗體或者配體以類(lèi)似雙抗體夾心的方式進(jìn)行檢測(cè)，這個(gè)過(guò)程類(lèi)似常規(guī)的免疫金標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)，這種方法已經(jīng)在單核苷酸多態(tài)性以及恒溫?cái)U(kuò)增靶基因的方法中使用，特別是對(duì)病原微生物或疾病關(guān)聯(lián)基因的鑒定，公開(kāi)號(hào)為CN 102134596 A的發(fā)明專(zhuān)利-一種基于核酸橫向流試紙條檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性的方法即以此方法進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)。而公開(kāi)號(hào)為CN 102520172 A的發(fā)明專(zhuān)利-單增李斯特氏菌核酸層析檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法和應(yīng)用描述了一種分別采用生物素和地高辛標(biāo)記引物的狗基因組檢測(cè)方法。因此類(lèi)方法僅對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的有無(wú)進(jìn)行判斷，不對(duì)產(chǎn)物的分子量確認(rèn)，因此在擴(kuò)增反應(yīng)中的干擾因素更多一些，常見(jiàn)的引起假陽(yáng)性的原因包括:非特異性擴(kuò)增、引物二聚體、擴(kuò)增產(chǎn)物間的異常復(fù)性，解決引物二聚體、異常退火造成的干擾可以從PCR聚合酶的選擇、引物序列優(yōu)化、dNTP底物、雜交過(guò)程的控制幾個(gè)方面開(kāi)展。選擇具有熱啟動(dòng)(Hot-start)功能的DNA聚合酶可以明顯降低引物二聚體和非特異擴(kuò)增產(chǎn)物的形成。在引物優(yōu)化方面，公開(kāi)號(hào)為CN 102146432 A的發(fā)明專(zhuān)利-“一對(duì)部分同序引物減少其二聚體的方法”描述了一種在引物5,端帶有短回文序列的引物設(shè)計(jì)方法，該引物常溫下自身環(huán)化，避免形成異源二`聚體，公開(kāi)號(hào)為CN 102719547 A的發(fā)明專(zhuān)利檢測(cè)HER2基因表達(dá)水平的實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑”也采用了類(lèi)似的方法用于實(shí)時(shí)定量PCR的擴(kuò)增；公開(kāi)號(hào)為CN 101842494 A的發(fā)明專(zhuān)利使用嵌合引物降低異源二聚體形成”描述了一種使用嵌合引物進(jìn)行擴(kuò)增的方法；在對(duì)反應(yīng)底物的優(yōu)化中，公開(kāi)號(hào)CN 101171343A的發(fā)明專(zhuān)利“含有假異胞胞嘧啶核酸堿基衍生物的3'修飾寡核苷酸及其作為引物或探針的應(yīng)用”提供了一種使用特別修飾的核苷酸作為底物以減少引物二聚體形成的方法，使用探針或者引入內(nèi)控探針也可以降低非特異擴(kuò)增的干擾，公開(kāi)號(hào)為CN 101957373 A的發(fā)明專(zhuān)利-“一種加入內(nèi)控核酸對(duì)病原體核酸進(jìn)行半定量檢測(cè)的方法”即采用內(nèi)控探針來(lái)降低干擾，上述方法中，使用熱啟動(dòng)技術(shù)和環(huán)化引物是通行的方法，其余方法或者采用了特殊合成的底物及底物，或者需要通過(guò)探針引入第二次雜交過(guò)程，都會(huì)增加檢測(cè)過(guò)程的復(fù)雜程度，特別是探針雜交方法，因需要保溫過(guò)程而失去了試紙條方法的便利性。
本發(fā)明引物設(shè)計(jì)中，在保持特異性基礎(chǔ)上，對(duì)引物對(duì)及引物內(nèi)5'及3'末端退火的自由能進(jìn)行評(píng)估后選擇合適的區(qū)域避免二聚體的形成，針對(duì)試紙條檢測(cè)方法二聚體的干擾情況以適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增子長(zhǎng)度，配合展開(kāi)緩沖液中去污劑及變性劑的濃度優(yōu)化，可以實(shí)現(xiàn)引物二聚體和非特異擴(kuò)增產(chǎn)物的有效清除。

發(fā)明內(nèi)容
將生物小分子或化合物標(biāo)記的核酸分子可以被該小分子或化合物的抗體特異性識(shí)別，從而通過(guò)免疫學(xué)方法檢測(cè)。常見(jiàn)的可用于核酸分子標(biāo)記的分子包括半抗原分子生物素(Biotin)、地高辛(Digoxin)，熒光染料分子羅丹明(RBITC)、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)、Cy3、Cy5等。上述標(biāo)記分子中，地高辛、異硫氰酸熒光素都易于獲得特異的抗體，而生物素分子與其配體-鏈親和素具有高度特異的結(jié)合特性，因此這幾種分子都可以選擇用于核酸分子的標(biāo)記和免疫學(xué)檢測(cè)。本發(fā)明旨在將抗原或半抗原小分子標(biāo)記單鏈寡核酸作為引物，對(duì)待檢的靶核酸特異性擴(kuò)增，形成的復(fù)合物分子同時(shí)具備兩種抗原或半抗原標(biāo)記，免疫原性的，該復(fù)合物即可用與特異抗體或特異配體結(jié)合，實(shí)現(xiàn)核酸 擴(kuò)增產(chǎn)物的免疫膠體金檢測(cè)。
因此，一方面，本發(fā)明提供一種試紙條法檢測(cè)飼料中狗源成分的的檢測(cè)技術(shù)，主要包
括:
1)設(shè)計(jì)兩條獨(dú)特的擴(kuò)增引物，其中正向引物Dog-D-F具有如下序列:5 , -TCCAGGTAAACCCTTCTCCCC-3 ,，用抗原或半抗原分子生物素(Biotin)、異硫氰酸熒光素(FITC)或地高辛(Digoxin)中的一種標(biāo)記；下游引物Dog-D-R的序列為
-CATGATAGTAACCCCCACGTTAG-3'，以不同于上游引物的一種標(biāo)記，；在適宜的擴(kuò)增條件下，可擴(kuò)增線粒體D-1oop區(qū)一段長(zhǎng)度為264 bps的DNA片段；當(dāng)無(wú)被檢核酸模板存在時(shí)，無(wú)特異性核酸片段擴(kuò)增產(chǎn)物；
2)將一種標(biāo)準(zhǔn)的通用抗體，如抗FITC抗體與膠體金顆粒交聯(lián)，在顆粒表面形成包被的抗體；
3)將另一種標(biāo)記分子的抗體或配體，如抗地高辛抗體或生物素分子的配體-鏈親和素分子以線條狀固定于膜上形成檢測(cè)線；
4)當(dāng)存在待檢的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，因上、下游引物的作用，擴(kuò)增產(chǎn)物中同時(shí)帶有上述三種標(biāo)記物種的兩種，形成標(biāo)記分子1-擴(kuò)增產(chǎn)物-標(biāo)記分子2的復(fù)合物；
5)將步驟4)形成的標(biāo)志物1-擴(kuò)增產(chǎn)物-標(biāo)志物2與膠體金顆粒表面包被的標(biāo)志物I的抗體結(jié)合，形成抗標(biāo)志物I抗體-標(biāo)志物1-擴(kuò)增產(chǎn)物-標(biāo)志物2有色顆粒復(fù)合物；
6)將步驟5)得到的有色顆粒復(fù)合物在溶液中通過(guò)毛細(xì)現(xiàn)象沿纖維膜向上流動(dòng)至涂布有標(biāo)志物2的抗體或配體的線條上，復(fù)合物因與標(biāo)志物2的抗體(配體)結(jié)合而沉積，滯留在檢測(cè)線上，形成肉眼可見(jiàn)的有色線條，判定為陽(yáng)性；或者
7)當(dāng)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物不存在時(shí)，不發(fā)生上述步驟4)-6)，不能形成標(biāo)志物1-擴(kuò)增產(chǎn)物-標(biāo)志物2復(fù)合物，也就不能形沉積于檢測(cè)線上標(biāo)志物2的抗體(配體)之上，不形成可見(jiàn)的條帶，判為陰性。
另一方面，本發(fā)明還提供了用于核酸序列檢測(cè)的展開(kāi)液，該展開(kāi)液可以減少引物二聚體對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾；
另一方面，本發(fā)明提供了用于食源性病原微生物的快速檢測(cè)的試紙條，其包括在帶有不干膠的襯墊，按順序有:1:吸水濾紙墊；2:結(jié)合物墊，附有第一種核酸標(biāo)記物的抗體或配體的生色顆粒(膠體金或乳膠);3:側(cè)向?qū)游龌|(zhì)(硝酸纖維素膜或尼龍膜)；4:檢測(cè)帶，附有第二種核酸標(biāo)記物的抗體；5:質(zhì)控帶，附有可結(jié)合特定種屬來(lái)源抗體的抗體；6:襯底；7:吸水墊。
另一方面，本發(fā)明還提供了用于檢測(cè)核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的通用標(biāo)準(zhǔn)試紙條。
最后，本發(fā)明還提供了上述檢測(cè)方法和試紙條飼料中狗源成分檢測(cè)中的用途。
本發(fā)明說(shuō)明書(shū)中所使用的技術(shù)術(shù)語(yǔ)解釋:
引物:DNA合成的起始物。一般為一對(duì)單鏈寡核普酸，在與模板雜交后，DNA合成從其3'末端開(kāi)始。
標(biāo)記:將可檢測(cè)的信號(hào)分子(如半抗原，熒光，放射性等)與單鏈寡核苷酸相偶連的方法。
雜交:特指互補(bǔ)的DNA單鏈通過(guò)堿基配對(duì)形成雙鏈結(jié)構(gòu)。
展開(kāi):經(jīng)擴(kuò)增反應(yīng)的PCR產(chǎn)物在展開(kāi)緩沖液的層析作用下由試紙條吸水墊底端開(kāi)始向檢測(cè)線、質(zhì)控線方向移動(dòng)的過(guò)程。
核酸:脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的通稱(chēng)。
抗原和半抗原:具備免疫原性的物質(zhì)。通常為大分子蛋白質(zhì)或細(xì)胞組分。但有些小分子也具備免疫原性，被稱(chēng)為半抗原((Hapten)。半抗原常被用于標(biāo)記探針。
抗體:能與抗原或半抗原特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)分子。
復(fù)合體:由兩種或兩種以上分子特異性結(jié)成的結(jié)合物。
引物二聚體:在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)過(guò)程中，因引物對(duì)間、或單條引物相互退火形成的二聚體分子，由兩條不同引物構(gòu)成的二聚體為異二聚體，因帶有兩種標(biāo)記而可能引起與種抗體(配體)的結(jié)合而造成假陽(yáng)性，由單一引物退火形成的二聚體為同二聚體，僅帶有一種標(biāo)記而不會(huì)引起假陽(yáng)性，但過(guò)多的二聚體形成會(huì)降低擴(kuò)增效率。
免疫試紙條:用于快速檢測(cè)的醫(yī)學(xué)工具。又稱(chēng)為呈色薄膜層析。
核酸聚合酶:合成核酸長(zhǎng)鏈的酶類(lèi)。分為DNA聚合酶和RNA聚合酶兩大類(lèi)。
有益效果:
由于本發(fā)明是以標(biāo)記的特異性引物擴(kuò)增適當(dāng)長(zhǎng)度的基因片段，能夠保證檢測(cè)的高度特異性，從而保證了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。本發(fā)明的新穎之處避免了擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋和探針雜交等流程，保持了免疫膠體金(試紙條)技術(shù)直觀，快速，方便，成熟，廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)，又具備PCR擴(kuò)增方法高度靈敏度、高度特異性的特點(diǎn)，因此，本發(fā)明的方法是一種有效的狗來(lái)源動(dòng)物成分檢測(cè)手段。
作為一個(gè)核酸擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)的通用技術(shù)平臺(tái)，本發(fā)明的方法及其試紙條可以廣泛用于飼料中動(dòng)物源成分的鑒定及食源性病原微生物的檢測(cè)，在農(nóng)牧業(yè)，海關(guān)檢驗(yàn)檢疫都有廣泛的應(yīng)用前景。目前雖有多種基于PCR的動(dòng)物源成分鑒定方法，但其引物設(shè)計(jì)和產(chǎn)物片段都適于探針?lè)ɑ蚰z電泳，而對(duì)于膠體金試紙條法中降低引物二聚體及非特異復(fù)性的干擾去除缺乏必要的考慮，解決方法也并不適用。本發(fā)明目的在于提供一種基于免疫膠體金方法檢測(cè)狗源動(dòng)物成分的PCR引物、擴(kuò)增和檢 測(cè)方法，以及該方法的應(yīng)用。其他常見(jiàn)物種，如羊、豬、牛、驢、兔、駱駝、鴨、鵝、雞、狐貍、貂、鹿等的鑒定都可以采用與此類(lèi)似的方法完成。[0025]核酸試紙條檢測(cè)方法的發(fā)明將大大簡(jiǎn)化核酸擴(kuò)增后的檢測(cè)程序。結(jié)果判讀簡(jiǎn)單明了、直觀(檢測(cè)示意結(jié)果如附圖2)。
本專(zhuān)專(zhuān)利所申請(qǐng)的食源性病原 微生物試紙條快速檢測(cè)技術(shù)作為一種新型的核酸擴(kuò)增后檢測(cè)技術(shù)，具有以下優(yōu)點(diǎn):
操作簡(jiǎn)單:只需要把核酸擴(kuò)增后的樣品直接滴到核酸試劑檢測(cè)板上即可，不需要專(zhuān)業(yè)人員操作，便于向現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)推廣；
快速:檢測(cè)5分鐘后判讀結(jié)果；
靈敏:與瓊脂糖凝膠電泳相比，檢測(cè)靈敏度提高近100 200倍；
特異性高:由于在檢測(cè)過(guò)程中加使用的為特異性標(biāo)記引物，使結(jié)果更加準(zhǔn)確；
價(jià)格便宜:費(fèi)用大大低于傳統(tǒng)的凝膠電泳和ELISA檢測(cè)。
如下實(shí)施例舉例說(shuō)明本發(fā)明的檢測(cè)方法及其檢測(cè)效果。實(shí)施例僅用來(lái)舉例，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的任何限制，本發(fā)明的保護(hù)范圍在所附的權(quán)利要求
書(shū)說(shuō)明。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明
附圖1顯示本發(fā)明的核酸序列擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)的試紙條的基本結(jié)構(gòu)；
附圖2是核酸檢測(cè)試紙條的檢測(cè)結(jié)果示意圖；
附圖3是顯示用實(shí)施例1的方法，采用特異性標(biāo)記引物檢測(cè)狗源DNA成分PCR-試紙條的檢測(cè)結(jié)果；
附圖4是顯示用實(shí)施例2的方法，采用檢測(cè)狗源DNA特異性標(biāo)記引物的特異性PCR-試紙條的檢測(cè)結(jié)果；


1.狗線粒體DNA D-1oop區(qū)片段檢測(cè)
以狗基因組DNA為模板，PCR結(jié)果直接進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖3。表明，PCR檢測(cè)以3μ I擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，此時(shí)檢測(cè)結(jié)果，1.陽(yáng)性模板(狗基因組)檢測(cè)線為陽(yáng)性；2.陰性對(duì)照、
3.負(fù)對(duì)照檢測(cè)線為陰性。
2.特異性檢測(cè)
哺乳動(dòng)物其它物種:物種見(jiàn)實(shí)驗(yàn)1，檢測(cè)結(jié)果為3μ I擴(kuò)增產(chǎn)物，全部為陰性，樣本分別為1:狗；2:鼠；3:兔；4:貓；5:豬；6:雞；7:鴨；8:鵝；9_10:空白對(duì)照。
實(shí)施例
實(shí)施例1
I材料與方法
1.2引物設(shè)計(jì)
1.3PCR擴(kuò)增體系:
1.3PCR擴(kuò)增體系:
權(quán)利要求
1.本發(fā)明提供一種動(dòng)物飼料中狗源成分的試紙條快速檢測(cè)方法。
2.如權(quán)利要求
I所述的檢測(cè)方法，采用兩條獨(dú)特設(shè)計(jì)的引物PCR進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，其中上游引物 Dog-D-F 的序列為5'3.如權(quán)利要求
I所述的檢測(cè)方法使用帶有核酸變性劑的展開(kāi)緩沖液完成試紙條上的層析，其成分為:10mM Tris、l% BSA、1% Tween 20 以及濃度分別為 O. 05mol/L 到 O. 5mol/L的 NaOH。
4.權(quán)利要求
I所述的用于核酸擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)的試紙條，其中有色顆粒是膠體金顆?；蛉槟z顆粒，所述的纖維膜為硝酸纖維素膜或尼龍膜。
5.如權(quán)利要求
2所述的PCR過(guò)程，其引物對(duì)可以選擇生物素分子(Biotin)、異硫氰酸熒光素(FITC)或地高辛(Digoxin)中兩種不同的方法標(biāo)記。
6.如權(quán)利要求
2所述的PCR過(guò)程，其反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5 min, 94 °C變性30sec ；55 °C退火30 sec ；72 °C延伸30sec，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，最后在72 °C延伸5 min。
7.權(quán)利要求
I所述的PCR-免疫膠體金試紙條用于飼料中狗源成分核酸的擴(kuò)增及通過(guò)免疫膠體金技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)的用途。
專(zhuān)利摘要
本發(fā)明公開(kāi)了在飼料成中狗(Canis familiaris)成分的核酸快速檢測(cè)試劑盒的制備方法及其應(yīng)用方法，屬于分子生物學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明將核酸檢測(cè)中的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的高靈敏度、高特異性方法與免疫學(xué)檢測(cè)中的免疫膠體金快速檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合，通過(guò)設(shè)計(jì)獨(dú)特的引物，并對(duì)引物進(jìn)行標(biāo)記，對(duì)提取的靶DNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增以及擴(kuò)增產(chǎn)物在展開(kāi)液中與試紙條條上固定的金標(biāo)記抗體結(jié)合而形成穩(wěn)定、可見(jiàn)的檢測(cè)帶及質(zhì)控帶，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)主要飼料中狗源成分快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N21/64GKCN103255217SQ201310145299
公開(kāi)日2013年8月21日 申請(qǐng)日期2013年4月25日
發(fā)明者鄭文杰, 劉偉, 張宏偉, 程瑜, 劉培, 吳冬雪, 奚文輝, 杜敬, 韓宇寧, 尹長(zhǎng)城, 劉斯奇 申請(qǐng)人:天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan