專利名稱:堿性芽孢桿菌淀粉酶的制作方法
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及改進(jìn)了在低溫下堿性洗滌劑溶液中的洗滌性能的淀粉酶。
發(fā)明背景多年來，α-淀粉酶已經(jīng)用于多種用途，其中最重要的有淀粉液化，織物脫漿，造紙和紙漿工業(yè)中的淀粉改性，以及用于釀造和烘烤。α-淀粉酶的另一用途正變得日益重要，即用于在堿性pH下與洗滌劑一起洗滌時去除淀粉類污漬。
市售α-淀粉酶產(chǎn)品例如有Termamyl，BAN和Fungamyl，這些都得自Novo Nordisk A/S，丹麥。這些產(chǎn)品和其它市售的類似產(chǎn)品的最佳pH在酸性到中性范圍，一般在5-7.5之間，它們在堿性pH下的洗滌劑溶液中不能表現(xiàn)出最佳活性。
WO 95/26397披露了一種來自芽孢桿菌菌株的α-淀粉酶，其在pH8時具有最佳活性。WO 96/23873描述了在洗滌條件下性能改進(jìn)的芽孢桿菌屬淀粉酶變體。
US 5147796記述了具有α-淀粉酶活性的堿性支鏈淀粉酶。此文獻(xiàn)的圖2b顯示其在pH 8-8.5時具有最佳淀粉酶活性。
M.Takagi等，J.Ferment.Bioeng.，vol 81，No.6，557-559(1996)描述了得自芽孢桿菌的堿性α-淀粉酶-支鏈淀粉酶。此酶的最佳α-淀粉酶活性在pH9，但是此活性隨pH升高而快速降低，在pH10的活性低于pH7的活性。
本發(fā)明的一個目的是提供改進(jìn)了在堿性溶液中，特別是在pH約為9-11的堿性洗滌劑溶液中性能的新α-淀粉酶。
發(fā)明概述本發(fā)明提供α-淀粉酶，它是a)產(chǎn)自芽孢桿菌NCIMB 40916的多肽，或b)具有SEQ ID NO2的1-556位所示氨基酸序列的多肽，或c)由克隆在大腸桿菌DSM 13001的質(zhì)粒上的DNA序列中該α-淀粉酶編碼部分所編碼的多肽，或d)在(a)或(b)中定義的多肽的類似物，其i)與所述多肽至少60％同源，或ii)是從所述多肽通過一或幾個氨基酸的取代，缺失和/或插入而得的多肽，另一方面，本發(fā)明提供了具有下列一或多個特征的α-淀粉酶●37℃檢測時，在pH10.5下的活性是pH7.3下的至少2倍。
●37℃檢測時，在pH9.5下的活性是pH7.3下的至少4倍。
●37℃檢測時，最佳pH約為9.5。
●其具有的熱穩(wěn)定性使得在3g/l的實(shí)驗(yàn)洗滌劑(含有20％STPP，25％Na2SO4，15％Na2CO3，20％LAS，5％C12-C15脂肪醇乙氧基化物，5％Na2Si2O5，0.3％NaCl，pH10.5，German硬度為6度)中25℃下溫育20分鐘，活性保持90％以上，30℃下在同一溶液中溫育20分鐘活性保持低于90％。
●SDS-PAGE測定其分子量約為55kDa。
●等電聚焦測定其等電點(diǎn)約為5。
本發(fā)明還提供了分離的編碼α-淀粉酶的DNA序列，其中該α-淀粉酶如上所述，或其中的DNA序列包含a)SEQ ID NO1的94-1764位所示的DNA序列，或b)在a)中定義的DNA序列的類似物，其i)與所述DNA序列至少60％同源，或ii)與所述DNA序列在至少55℃下雜交。
本發(fā)明還提供了含有所述DNA序列的重組表達(dá)載體，和用所述DNA序列或重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及提供通過培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)α-淀粉酶的方法和含有該α-淀粉酶的洗滌劑組合物。
附圖簡述本發(fā)明參照附圖進(jìn)一步說明，其中
圖1表示來自NCIMB 40916的淀粉酶與兩種現(xiàn)有淀粉酶(SP722和Termamyl)對比的pH活性圖譜。
圖2表示了來自NCIMB 40916的淀粉酶的溫度活性圖譜。
圖3表示了在不同溫度下溫育時，來自NCIMB 40916的淀粉酶的穩(wěn)定性。
圖4表示了實(shí)施例1所述的克隆載體pSJ1678。
圖5和6表示了實(shí)施例4所述的洗滌實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
發(fā)明詳述微生物來源本發(fā)明的α-淀粉酶可得自芽孢桿菌。優(yōu)選菌株是芽孢桿菌菌株NCIMB40916。按照布達(dá)佩斯條約對用于專利程序目的的微生物保藏的國際認(rèn)可，本發(fā)明人將此菌株于1998年1月28日保藏在國立工業(yè)和海洋微生物保藏有限公司(NCIMB)，23 St.Machar Drive，Aberdeen AB 21 RY，蘇格蘭，英國。含有表示為SEQ ID NO1克隆進(jìn)質(zhì)粒pJA 386的α-淀粉酶基因的大腸桿菌菌株NN049489，按照布達(dá)佩斯條約于1999年8月7日保藏于德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ)，Mascheroder Weg 1b，D-38124Braunschweig DE，保藏號DSM 13001。
α-淀粉酶的生產(chǎn)可通過在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)合適的生產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌菌株或本發(fā)明的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，然后從該培養(yǎng)基中回收該α-淀粉酶，從而生產(chǎn)本發(fā)明α-淀粉酶。
用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是任何適于目的宿主細(xì)胞生長并可以使本發(fā)明的α-淀粉酶表達(dá)的傳統(tǒng)培養(yǎng)基。合適的培養(yǎng)基可得自市售產(chǎn)品或根據(jù)出版文獻(xiàn)配制(例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心目錄所述)。
可由已知方法從培養(yǎng)基中方便地回收宿主細(xì)胞分泌的α-淀粉酶，包括通過離心或過濾從培養(yǎng)基分離細(xì)胞，然后用鹽如硫酸銨沉淀培養(yǎng)基中的蛋白成分，再使用層析方法如離子交換層析，親和層析等。α-淀粉酶的性質(zhì)優(yōu)選得自芽孢桿菌NCIMB 40916的α-淀粉酶。它可按照實(shí)施例所述生產(chǎn)。此淀粉酶和編碼它的DNA的全長氨基酸表示為SEQ ID NO1和2。本發(fā)明的淀粉酶(NCIMB 40916的α-淀粉酶)具有下列特點(diǎn)采用Novex，4-25％梯度凝膠通過SDS-PAGE測定分子量約為55kDa。
通過等電聚焦(Ampholine PAG，pH 3.5-9.5)測定pI約為5。
pH-活性曲線表示在圖1中，以pH 7.3的活性為100％。這是通過采用調(diào)整至各種pH值的50mM Britten-Robinson緩沖液經(jīng)Phadebas檢測測定的。作為參照，圖1也表示了同樣條件下兩種現(xiàn)有芽孢桿菌淀粉酶(得自地衣芽孢桿菌的Termamyl和按照WO 95/26397生產(chǎn)的SP722)的pH圖譜。圖1表示在pH 9.5時本發(fā)明的淀粉酶比現(xiàn)有的兩種淀粉酶活性高約10倍。圖1也顯示最佳活性在約pH 9.5處。
以調(diào)整pH到9.5的50mM Britten-Robinson緩沖液在各種溫度下經(jīng)Phadebas檢測測定得到溫度-活性曲線。結(jié)果顯示在圖2中。從圖2可以看到本發(fā)明的淀粉酶在約55℃具有最佳活性。
經(jīng)30分鐘溫育在pH 10.5(50Mm CAPS)下于22，37，45，55和65℃測定所述淀粉酶穩(wěn)定性。所述酶用緩沖液稀釋到40NU/ml，在各個溫度下取25ml樣品溫育。30分鐘后，將樣品于冰上冷卻，測定殘余活性。圖3表示本發(fā)明的淀粉酶和現(xiàn)有淀粉酶(SP 722)的穩(wěn)定性圖譜。
通過如上所述在3g/l的A/P型洗滌劑溫育40NU/ml淀粉酶于pH 10.5和6°DH(German硬度，Ca∶Mg 2∶1)下測定穩(wěn)定性。溫育后，采用Phadebas法在pH 7.3下測定殘余活性。25℃下溫育后，殘余活性為95％，30℃為87％。
多肽和DNA序列的同源性氨基酸的同源性可測定為指示第一個序列衍生自第二個序列的兩個序列間同一性的程度。同源性優(yōu)選通過本領(lǐng)域已知的計算機(jī)程序測定。例如，可使用GCG version 8提供的FASTA(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)，Journal of Molecular Biology 48，443-453)，采用以下設(shè)定Scoringmatrix GenRunDatablosum50.cmp，所用Variable pamfactor的缺口產(chǎn)生罰分為12，缺口延伸罰分為2。
所述氨基酸序列與SEQ ID NO2的1-556位表示的氨基酸序列表現(xiàn)出的同一性優(yōu)選為至少60％，優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選80％，特別是至少90％或至少95％，更優(yōu)選至少97％或至少99％。
DNA序列的同源性可測定為指示第一個序列衍生自第二個序列的兩個序列間同一性的程度。同源性適合通過本領(lǐng)域已知的計算機(jī)程序，例如GCG軟件包中提供的GAP(如上所述)測定。Gap GCG version 8采用以下缺省參數(shù)設(shè)定GAP的缺口產(chǎn)生罰分為5.0，GAP缺口延伸罰分為0.3，缺省使用Scoring matrix。GAP采用Needleman/Wunsch/Sellers的方法進(jìn)行比對。
本發(fā)明的DNA構(gòu)建體包含與SEQ ID NO1的95-1764位核酸序列優(yōu)選至少60％，優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選80％，特別是至少90％或至少95％，更優(yōu)選至少97％或至少99％同一性的DNA序列。
雜交采用雜交指示特定DNA序列是對應(yīng)于SEQ ID NO1的核苷酸探針的類似物。雜交條件如下所述。
確定核酸探針與同源DNA或RNA序列間雜交的合適條件涉及在5×SSC(標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鹽)中預(yù)浸泡攜有待雜交的DNA片段或RNA的濾膜10分鐘，在含5×SSC(Sambrook等，1989)，5×Denhardt＇s溶液(Sambrook等，1989)，0.5％SDS和100μg/ml超聲變性鮭精DNA(Sambrook等，1989)的溶液中預(yù)雜交濾膜，然后在含有隨機(jī)引發(fā)的(Feinberg，A.P.和Vogelstein，B.(1983))Anal.Biochem.1326-13)，32P-dCTP標(biāo)記的(比活＞1×109cpm/μg探針的相同溶液中約45℃下雜交12小時。濾膜在2×SSC，0.5％SDS中于溫度至少55℃的條件下沖洗2遍，溫度更優(yōu)選至少60℃，更優(yōu)選至少65℃，更優(yōu)選至少70℃，特別至少75℃。
采用x-線膠片檢測在這些條件下寡核苷酸探針與之雜交的分子。
重組表達(dá)載體本發(fā)明的重組表達(dá)載體一般包括編碼啟動子，操縱子，核糖體結(jié)合位點(diǎn)，翻譯起始信號，和任選地，阻抑基因或各種活化子基因的控制序列。
攜帶編碼本發(fā)明α-淀粉酶的DNA序列的重組表達(dá)載體可以是任何可方便地進(jìn)行重組DNA操作的載體，載體的選擇經(jīng)常取決于要引導(dǎo)載體進(jìn)入其中的宿主細(xì)胞。這樣，所述載體可以是自主復(fù)制載體，即作為染色體外實(shí)體存在的載體，其復(fù)制獨(dú)立于染色體的復(fù)制，例如質(zhì)粒，噬菌體或染色體外元件，微型染色體或人工染色體。可選地，所述載體可以是當(dāng)引入宿主細(xì)胞時整合進(jìn)宿主細(xì)胞染色體組并且與整合的染色體一起復(fù)制的那些。
載體中，DNA序列應(yīng)與合適的啟動子序列操作性連接。啟動子可以是在所選宿主細(xì)胞中表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄活性的任何DNA序列，并且可能得自編碼相對于宿主細(xì)胞同源或異源的蛋白的基因。指導(dǎo)編碼本發(fā)明α-淀粉酶的DNA序列轉(zhuǎn)錄，特別是在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的適合啟動子有大腸桿菌1ac操縱子的啟動子，天藍(lán)色鏈霉菌瓊脂糖酶基因dagA啟動子，地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)的啟動子，嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽糖淀粉酶基因(amyM)的啟動子，解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶(amyQ)的啟動子，枯草芽孢桿菌xy1A和xy1B基因的啟動子等。可用于在真菌宿主中轉(zhuǎn)錄的啟動子有編碼米曲霉TAKA淀粉酶，米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶，黑曲霉中性α-淀粉酶，黑曲霉耐酸α-淀粉酶，黑曲霉葡糖淀粉酶，米赫根毛霉脂肪酶，米曲霉堿性蛋白酶，米曲霉三糖磷酸異構(gòu)酶或構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶的基因的啟動子。
本發(fā)明的表達(dá)載體也可包含合適的轉(zhuǎn)錄終止子，并且在真核細(xì)胞中，包含聚腺苷酸化序列，它們與編碼本發(fā)明α-淀粉酶的DNA序列操作性相連。終止序列和聚腺苷酸化序列優(yōu)選與啟動子同源。
載體還可包括使載體在目的宿主細(xì)胞中復(fù)制的DNA序列。這樣的序列例如有質(zhì)粒pUC 19，pACYC 177，pUB 110，pE 194，pAMB1和pIJ 702的復(fù)制起點(diǎn)。
載體還可含有選擇性標(biāo)記，例如其產(chǎn)物能彌補(bǔ)宿主細(xì)胞缺陷的那些基因，例如枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的da1基因，或賦予抗生素，如氨芐青霉素，卡那霉素，氯霉素或四環(huán)素抗性的那些基因。此外，該載體還含有曲霉選擇性標(biāo)記，如amdS，argB，niaD，sC，產(chǎn)生潮霉素抗性的標(biāo)記，或可選擇通過共轉(zhuǎn)化來實(shí)現(xiàn)，例如WO 91/17243所述。
盡管胞內(nèi)表達(dá)在某些方面較為有利，例如當(dāng)使用特定細(xì)菌作宿主細(xì)胞時，但優(yōu)選胞外表達(dá)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員了解適合構(gòu)建本發(fā)明的編碼α-淀粉酶的載體(還分別含有啟動子，終止子和其它元件)的方法(參見，例如Sambrook等，(1989))。
宿主細(xì)胞本發(fā)明的含有如上定義的本發(fā)明DNA構(gòu)建體或表達(dá)載體的細(xì)胞有利于用作重組生產(chǎn)本發(fā)明α-淀粉酶的宿主細(xì)胞。該細(xì)胞可用編碼所述淀粉酶的本發(fā)明DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化，這可方便地通過將所述DNA構(gòu)建體(一或多個拷貝)整合入宿主染色體來完成。當(dāng)所述DNA序列很可能穩(wěn)定保持在所述細(xì)胞中時，通常認(rèn)為此整合是有利的?？砂凑諅鹘y(tǒng)方法將所述DNA構(gòu)建體整合入宿主染色體，例如通過同源或異源重組。備選地，所述細(xì)胞可根據(jù)不同的宿主細(xì)胞類型用如上所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明的細(xì)胞可以是高等生物，如哺乳動物或昆蟲的細(xì)胞，但優(yōu)選是微生物細(xì)胞，如細(xì)菌或真菌(包括酵母)細(xì)胞。
在培養(yǎng)時能產(chǎn)生本發(fā)明的酶的細(xì)菌宿主細(xì)胞有革蘭氏陽性細(xì)菌如芽孢桿菌屬，如枯草芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，遲緩芽孢桿菌，B.clausi短芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌，嗜堿芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌，凝結(jié)芽孢桿菌，環(huán)狀芽孢桿菌，燦爛芽孢桿菌，巨大芽孢桿菌，或蘇云金芽孢桿菌，或鏈霉菌如淺青紫鏈霉菌，鼠灰鏈霉菌，或革蘭氏陰性細(xì)菌如大腸桿菌。細(xì)菌的轉(zhuǎn)化可通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，電穿孔，偶聯(lián)，或通過使用感受態(tài)細(xì)胞以其本身已知的方式來實(shí)現(xiàn)(參見Sambrook等，出處同上)。
酵母可優(yōu)先選自糖酵母屬或裂殖酵母屬，例如釀酒酵母。絲狀真菌可優(yōu)先選自曲霉屬，如米曲霉或黑曲霉。轉(zhuǎn)化真菌細(xì)胞的方法涉及原生質(zhì)體的形成及轉(zhuǎn)化，然后使細(xì)胞壁以其本身已知的方式再生。EP 238023中記述了適于曲霉屬宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的方法。
工業(yè)應(yīng)用由于本發(fā)明的α-淀粉酶在堿性pH值下的活性，很適用于多種工業(yè)工藝，特別是所述酶作為洗滌劑，例如洗衣和硬表面洗滌的洗滌劑組合物中一種成分的潛在應(yīng)用，它也可用于生產(chǎn)甜味劑和由淀粉生產(chǎn)乙醇。這樣，它可用于傳統(tǒng)的淀粉轉(zhuǎn)化過程，如美國專利3912590和歐洲專利公開號EP252730和63909所述的液化和糖化過程。
本發(fā)明的堿性α-淀粉酶也可用于從淀粉增強(qiáng)型廢紙和紙板生產(chǎn)木質(zhì)纖維材料，如紙漿，紙和紙板，特別是當(dāng)在pH 7以上再漿化時以及當(dāng)?shù)矸勖缚纱龠M(jìn)降解增強(qiáng)型淀粉從而分解廢料時。本發(fā)明的α-淀粉酶在從淀粉包覆的印刷紙張生產(chǎn)造紙用紙漿的工藝中特別有用。此工藝可按照WO95/14807所述進(jìn)行，包括如下步驟a)分解紙產(chǎn)生紙漿，b)在步驟a)之前，期間，之后用淀粉降解酶處理，
c)在步驟a)和b)之后從紙漿中除去墨點(diǎn)。
本發(fā)明的α-淀粉酶在淀粉改性，即淀粉經(jīng)酶促改性后與堿性填充劑如碳酸鈣，高嶺土和粘土一起用于造紙時很有用。由于本發(fā)明堿性α-淀粉酶，使得在填充劑的存在下能使淀粉改性，這樣可以簡化整合過程。
本發(fā)明的α-淀粉酶在織物脫漿中也非常有用。在織物加工工業(yè)中，α-淀粉酶傳統(tǒng)上在脫漿工藝中用作輔料，這樣有助于去除用作紡織中紡織紗上的保護(hù)層的含淀粉的漿。紡織后漿衣的徹底去除對于在隨后的工藝中確保最佳效果是重要的，所述后續(xù)步驟包括纖維的洗滌，漂白，和染色。優(yōu)選用酶分解淀粉，因?yàn)檫@不會對纖維材料造成任何損害。為減少處理費(fèi)用并提高工廠產(chǎn)量，脫漿工藝有時與洗滌和漂白步驟結(jié)合。在這種情況下，一般用非酶性輔料如堿或氧化劑分解淀粉，這是因?yàn)閭鹘y(tǒng)的α-淀粉酶不能與高pH值和漂白劑很好的相容。因?yàn)樗没瘜W(xué)制劑具有相當(dāng)?shù)那治g性，非酶性分解淀粉漿確實(shí)導(dǎo)致一些纖維損害。因此，希望使用在堿性溶液中性能改進(jìn)的本發(fā)明α-淀粉酶。所述α-淀粉酶可以單獨(dú)使用或當(dāng)對含纖維素的纖維或織物脫漿時與纖維素酶結(jié)合使用。
本發(fā)明的α-淀粉酶還在啤酒制造工藝中十分有用；該α-淀粉酶通常在化醪操作期間加入。
洗滌劑組合物本發(fā)明的α-淀粉酶一般用作洗滌組合物例如洗衣洗滌劑組合物的一個成分。這樣，它可以無粉塵顆粒，穩(wěn)定液體，或受保護(hù)的酶的形式包含有洗滌劑組合物中。可按照US 4106991和4661452(都屬于Novo Industri A/S)公開的方法制造無粉塵顆粒，可任選以本領(lǐng)域已知的任何方法包覆。蠟質(zhì)包覆材料例如平均分子量1000到20000的聚環(huán)氧乙烷產(chǎn)物(聚乙二醇，PEG)；具有16到50個氧丙環(huán)單位的乙氧基壬基酚；乙氧基脂肪醇，其中所述醇含有12到20個碳原子并且其中含有15到80個氧丙環(huán)單位；脂肪醇；脂肪酸；脂肪酸的單-和雙-和三甘油酯。GB 1483591中給出了通過流化床技術(shù)適合用于形成膠片(film)的包覆材料。例如可以通過已知方法加入多元醇如丙二醇，糖或糖醇，乳酸或硼酸來穩(wěn)定液態(tài)酶制劑。其它的酶穩(wěn)定劑也為本領(lǐng)域所熟知?？砂凑誆P 238216公開的方法制備受保護(hù)的酶。
本發(fā)明α-淀粉酶的性質(zhì)使其特別適于在堿性，例如在pH 9.5-10.5中的洗滌劑中使用，和在低溫如20-40℃下洗滌。
本發(fā)明的洗滌劑組合物可以采用任何便利的形式，如粉末，顆粒，漿或液體。液體洗滌劑可以是水性的，一般含有多達(dá)70％的水和0-30％的有機(jī)溶劑，或?yàn)榉撬缘摹?br>所述洗滌劑組合物包含一或多種表面活性劑，它們分別可以是陰離子型的，非離子型的，陽離子型的或兩性的。所述洗滌劑通常包含0-50％的陰離子表面活性劑如線性烷基苯磺酸(LAS)，α-烯烴磺酸鹽(AOS)，烷基磺酸酯(脂肪醇磺酸酯)(AS)，脂肪醇乙氧基硫酸酯(AEOS或AES)，仲烷基磺酸酯(SAS)，α-磺基脂肪酸甲酯，烷基或烷烯琥珀酸，或肥皂。它還可包含0-40％的非離子表面活性劑如脂肪醇乙氧基化物(AEO或AE)，脂肪醇丙氧基化物，羧基化脂肪醇乙氧基化物，壬基酚乙氧基化物，烷基多聚葡糖苷，烷基二甲胺氧化物，乙氧基化脂肪酸單乙醇胺，脂肪酸單乙醇胺，或多羥基烷基脂肪酸胺(例如WO 92/06154所述)。
所述洗滌劑組合物還可含有一種或多種其它酶，如支鏈淀粉酶，酯酶，脂肪酶，角質(zhì)酶(cutinase)，蛋白酶，纖維素酶，過氧化物酶，或氧化酶，如漆酶。
通常所述洗滌劑含有1-65％的洗滌劑增潔劑(builder)或復(fù)合劑如沸石，二磷酸鹽，三磷酸鹽，膦酸酯，檸檬酸鹽，次氮基三乙酸(NTA)，乙二胺四乙酸(EDTA)，二亞乙基三氨基五乙酸(DTMPA)，烷基或鏈烯基琥珀酸，可溶性硅酸鹽或分層硅酸鹽(例如，Hoechst的SKS-6)。
可將洗滌劑增潔劑分為含磷型和不含磷型。含磷型無機(jī)堿性洗滌劑增潔劑例如包括水溶性鹽，特別是堿金屬焦磷酸鹽，正磷酸鹽，多磷酸鹽和膦酸酯。不含磷型無機(jī)增潔劑例如包括水溶性堿金屬碳酸鹽，硼酸鹽，硅酸鹽以及分層的二硅酸鹽，各種類型的水不溶性晶狀或無定形硅酸鋁，其中沸石已知最具代表性。
合適的有機(jī)增潔劑例如有琥珀酸，丙二酸，脂肪酸丙二酸，脂肪酸磺酸，羧甲氧基琥珀酸，聚乙酸，羧酸，聚羧酸，氨基聚羧酸，聚乙酰羧酸的堿金屬鹽，銨鹽或取代的銨鹽。洗滌劑也可以是非增強(qiáng)的，即基本上不含洗滌劑增潔劑。
洗滌劑可包含一或多種聚合物。例如有羧甲基纖維素(CMC)，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，聚乙二醇，聚乙烯醇(PVA)，聚羧酸酯如聚乙酸酯，聚馬來酸酯，馬來酸/丙烯酸共聚物，甲基丙烯酸月桂酸/丙烯酸共聚物。
洗滌劑組合物可能包括氯/溴型或氧型漂白劑。漂白劑可以是包覆型的或膠囊型的。
無機(jī)氯/溴型漂白劑例如有次氯酸或次溴酸鋰，鈉或鈣，以及氯化磷酸三鈉。有機(jī)氯/溴型漂白劑例如有N-溴和N-氯酰亞胺的雜環(huán)化物例如三氯異氰尿酸，三溴異氰尿酸，二溴異氰尿酸，二氯異氰尿酸，及它們與水溶性陽離子如鉀和鈉形成的鹽。乙內(nèi)酰脲化合物也是適合的。漂白系統(tǒng)還可包含如酰胺，酰亞胺或磺酸型的過氧酸。
氧型漂白劑可以是無機(jī)過酸鹽(優(yōu)選帶有漂白活性劑)，或過氧酸化合物。無機(jī)過酸鹽例如有過硼酸堿金屬鹽的四水合物和一水合物，過碳酸，過硅酸和過磷酸的堿金屬鹽?；罨瘎┛梢允撬囊阴；叶?TAED)或壬酰氧苯磺酸鹽(NOBS)。
本發(fā)明洗滌劑組合物的酶可采用傳統(tǒng)穩(wěn)定劑，例如多元醇，如丙二醇或甘油，糖或糖醇，乳酸，硼酸或硼酸衍生物如芳香族硼酸酯來穩(wěn)定，所述組合物可按照，例如WO 92/19709和WO 92/19708進(jìn)行配制。也可以加入可逆的酶抑制劑，如EP 0544777B1所述的蛋白型，來穩(wěn)定本發(fā)明的酶。
所述洗滌劑還可包含其它傳統(tǒng)的洗滌劑成分，例如織物調(diào)理劑包括粘土，懸浮劑材料，泡沫促進(jìn)劑，消泡劑(foam depressor)，抑泡劑(sudssuppressor)，抗腐蝕劑，污垢懸浮劑，抗污垢再沉積劑(anti-soil-redepositionagent)，染料，脫水劑，殺菌劑，光亮劑，或香味劑。
pH值(在所用濃度的水溶液中測量)通常為中性或堿性，例如范圍是7-11。
更具體地說，本發(fā)明的α-淀粉酶可以加入到WO 96/23873所述的任何一種洗滌劑配方中。
本發(fā)明α-淀粉酶可以按照洗滌劑中常規(guī)使用的濃度來加入。目前設(shè)想，在本發(fā)明的洗滌劑組合物中，所述α-淀粉酶的加入量為每升洗液中α-淀粉酶為0.00001-1mg(以純酶蛋白計算)。
本發(fā)明還在下列實(shí)施例中予以說明，它們不應(yīng)視作對本發(fā)明的限制。
實(shí)施例宿主生物
Diderichsen，B.，Wedsted，U.，Hedegaard，L.，Jensen B.R.，Sjoholm，C.(1990)Journal ofBacteriology，Vol.172，No.8，p.4315-4321中所述的大腸桿菌(Escherichia coli)SJ2。
質(zhì)粒基因文庫載體是pSJ1678，它還公開在WO 94/19454中(在此引入作為參考)。
基因文庫載體pSJ1678還公開在WO 94/19454中(在此引入作為參考)。
典型(model)洗滌劑A/P(亞/太)典型洗滌劑組成如下20％STPP(三磷酸鈉)，25％Na2SO4，15％Na2CO3，20％LAS(線性烷基苯磺酸，Nansa 80S)，5％C12-C15脂肪醇乙氧基化物(Dobanol 25-7)，5％Na2Si2O5，0.3％NaCl。
實(shí)施例1將α-淀粉酶基因克隆進(jìn)大腸桿菌采用Pitcher，D.G.，Saunders，N.A.，和Owen，R.J.(1989)Lett.Appl.Microbiol.8，151-156的方法從芽孢桿菌NCIMB 40916分離出DNA。染色體DNA用限制酶Sau3AI部分消化。將這些片段克隆進(jìn)如圖4所示的克隆載體pSJ1678的BamHI位點(diǎn)，并轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌SJ2，從而產(chǎn)生芽孢桿菌NCIMB 40916的基因文庫。
對此基因文庫的α-淀粉酶活性進(jìn)行篩選，表現(xiàn)出α-淀粉酶活性的菌株命名為大腸桿菌NN049489菌株，它含有本發(fā)明的α-淀粉酶。對此菌株進(jìn)行保藏，保藏號DSM 13001。載有編碼α-淀粉酶的名為pJA386的質(zhì)粒的大腸桿菌NN049489菌株用于DNA測序。
實(shí)施例2DNA和α-淀粉酶測序采用Taq deoxytermianl cycle測序試劑盒(Perkin Elmer，USA)，熒光標(biāo)記的終止子，以適當(dāng)?shù)墓押塑账嶙饕锿ㄟ^引物步行法進(jìn)行DNA測序，以此鑒定已克隆在質(zhì)粒pJA386中的α-淀粉酶基因。
按照Devereux等(1984)Nucleic Acids Res.，12，387-395的方法進(jìn)行序列數(shù)據(jù)分析。所述序列對應(yīng)于表示為SEQ ID NO1的DNA序列。α-淀粉酶的預(yù)計蛋白序列表示為SEQ ID NO2，它包含信號肽和成熟α-淀粉酶。通過對該蛋白N末端34個氨基酸的測序證實(shí)推論的N末端序列。
實(shí)施例3α-淀粉酶的生產(chǎn)在含有10mg/ml氯霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃，以250rpm過夜培養(yǎng)載有質(zhì)粒pJA386的大腸桿菌NN049489(DSM 13001)。通過6000rpm離心15分鐘，從2.71培養(yǎng)液收獲細(xì)胞。通過下述滲透壓休克法從細(xì)胞內(nèi)釋放出位于胞內(nèi)的淀粉酶1)將細(xì)胞重懸，并用500ml 10mM Tris-HCl，pH7.0(EKV-緩沖液)沖洗，然后離心。
2)將細(xì)胞重懸于75ml 20％蔗糖，30mM Tris-HCl pH8，1mM EDTA中，加入溶菌酶至濃度為5mg/ml。
3)將此溶液冰上溫育15分鐘，然后離心。此時，大部分淀粉酶包含在上清液中。
上清對101 EKV緩沖液透析過液，期間更換一次緩沖液以降低葡萄糖的高濃度。此溶液經(jīng)過0.45mm膜真空過濾器過濾。
將酶液上柱到預(yù)先用EKV緩沖液(pH7)平衡的Pharmacia Q Sepharosecolume FF，用EKV緩沖液沖洗柱。以0-500mM NaCl線性梯度，10倍柱體積洗脫結(jié)合的蛋白，匯集含有淀粉酶的級分，對EKV緩沖液透析過夜。
然后將所得溶液上柱到預(yù)先用EKV緩沖液(pH8)平衡的Q Sepharosecolume FF，用EKV緩沖液沖洗柱。以0-500mM NaCl線性梯度，10倍柱體積洗脫結(jié)合的蛋白，匯集含有淀粉酶的級分。
所得酶液中加入硫酸銨至濃度1M，上樣到預(yù)先用含有1M硫酸銨的EKV緩沖液(pH8)平衡的Phenyl Superose柱。用硫酸銨緩沖液洗出未結(jié)合的物質(zhì)，以1-0mM NaCl線性梯度的硫酸銨，用20倍柱體積洗脫。匯集含有淀粉酶的級分。
通過SDS-PAGE分析純化的淀粉酶，考馬司亮蘭染色后只得到一條帶。
實(shí)施例4洗滌實(shí)驗(yàn)將已弄臟的待檢布樣在含本發(fā)明α-淀粉酶的洗滌劑液中25℃下洗滌15分鐘，以此進(jìn)行洗滌效果的評價。
所用洗滌劑是上述的A/P型洗滌劑，用量3g/l，pH10.5，或馬來西亞產(chǎn)的一種市售洗滌劑(Colgate的FAB Total)，用量3g/l，pH約9.7。將實(shí)施例3的純化淀粉酶以如下所示濃度加入到洗滌劑溶液中。實(shí)驗(yàn)樣品污漬為orangerice starch得自(CFT(Center for Test Material，荷蘭)的CS-28樣品)。
洗滌后，測定布樣在460nm的污漬減少程度(remission)以對其進(jìn)行評價。結(jié)果表示為DR＝用所述α-淀粉酶洗滌的布樣的污漬減少程度減去同樣條件下沒有用該α-淀粉酶而洗滌的布樣的污漬減少程度。
α-淀粉酶濃度 DR DR(mg酶蛋白/l) 典型洗滌劑 馬來西亞洗滌劑0(參比) ＝0 ＝00.1 0.9 10.2 1.9 1.30.5 3 2.41.5 4.1 4.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示在圖5和6中。這些結(jié)果說明本發(fā)明的α-淀粉酶在兩種洗滌劑中于高堿性pH下都有效。
序 列 表序列表<110>諾維信公司(NOVOZYMES A/S)<120>堿性芽孢桿菌淀粉酶<130>5948.000-DK<160>2<170>Fast SEQ for Windows Version 3.0<210>1<211>1764<212>DNA<213>芽胞桿菌屬(Bacillus sp.)<220>
<221>CDS<222>(1)...(1764)<221>sig_peptide<222>(1)...(93)<221>mat_peptide<222>(94)...(1764)<400>1atg caa aac aca gcg aaa aac tcc atc tgg cag agg gtg cgc cac agc 48Met Gln Asn Thr Ala Lys Asn Ser Ile Trp Gln Arg Val Arg His Ser-30 -25 -20gcc att gcc tta tcc gct ctc agt tta tcc ttt ggc ctg cag gcc agc 96Ala Ile Ala Leu Ser Ala Leu Ser Leu Ser Phe Gly Leu Gln Ala Ser-15 -10 -5 1gag tta cca caa att cca cca cag cag gtg aac aac acc atg tac cag 144Glu Leu Pro Gln Ile Pro Pro Gln Gln Val Asn Asn Thr Met Tyr Gln5 10 15gca ttt tat tgg gat gcc tac cct ggc ctt tgg gcc aat tta ccg gcc 192Ala Phe Tyr Trp Asp Ala Tyr Pro Gly Leu Trp Ala Asn Leu Pro Ala20 25 30atg gcg gcc cct ttg gcc gag cgt ggc att acc tcg atg tgg ttg ccg 240Met Ala Ala Pro Leu Ala Glu Arg Gly Ile Thr Ser Met Trp Leu Pro35 40 45ccc gcc gcc aaa ggc atg aat ggt act ttc agt gtc ggt tac gat gta 288Pro Ala Ala Lys Gly Met Asn Gly Thr Phe Ser Val Gly Tyr Asp Val50 55 60 65tac gat ttc tgg gat ctg ggc gag ttt aac caa aaa ggc acc acc gcc 336Tyr Asp Phe Trp Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Thr Ala70 75 80acc cgt tac ggt act cgt cag cag ctg caa caa gca ctg agt gct ctg 384Thr Arg Tyr Gly Thr Arg Gln Gln Leu Gln Gln Ala Leu Ser Ala Leu85 90 95gac caa ctg ggt att cag gcc tat ttt gat gtg gtg ttt aac cac cgc 432Asp Gln Leu Gly Ile Gln Ala Tyr Phe Asp Val Val Phe Asn His Arg100 105 110atg ggc gcc gat gca cag gag aat att cct ggc ttt ggc ctg gcc tgg 480Met Gly Ala Asp Ala Gln Glu Asn Ile Pro Gly Phe Gly Leu Ala Trp115 120 125acc gag tat cat ctg caa ggt cgt cag gcg cat tat acc cag caa aac 528Thr Glu Tyr His Leu Gln Gly Arg Gln Ala His Tyr Thr Gln Gln Asn130 135 140 145tgg ggc tac ttg tgg cac gac ttt gac tgg aac tgg acc gcg ttt aat 576Trp Gly Tyr Leu Trp His Asp Phe Asp Trp Asn Trp Thr Ala Phe Asn150 155 160ggc tcc gac aat cag ctc tac ccc ggc aaa tgg tgg ggc aat acc ttc 624Gly Ser Asp Asn Gln Leu Tyr Pro Gly Lys Trp Trp Gly Asn Thr Phe165 170 175cac ttc cct tat ttg atg ggt gag gat gtc gat tac aac cgc ttt gaa 672His Phe Pro Tyr Leu Met Gly Glu Asp Val Asp Tyr Asn Arg Phe Glu180 185 190gtg cag cag gaa atg aaa gcc tgg ggc gag tgg atc atc aac agc gtt 720Val Gln Gln Glu Met Lys Ala Trp Gly Glu Trp Ile Ile Asn Ser Val195 200 205ggc ttt agc ggc ttt cgg atg gat gcc atc gcc cat gtc gat acc gat 768Gly Phe Ser Gly Phe Arg Met Asp Ala Ile Ala His Val Asp Thr Asp210 215 220 225ttt acc cgt gac tgg atc aat cac gtg cag tgg gcc acc agt gag gat 816Phe Thr Arg Asp Trp Ile Asn His Val Gln Trp Ala Thr Ser Glu Asp230 235 240gtg ttc ttt gtc gct gaa gcc tgg gtc agt gat atc aac ggc tat ctg 864Val Phe Phe Val Ala Glu Ala Trp Val Ser Asp I1e Asn Gly Tyr Leu245 250 255gat gca gtc aat acg ccg cat ttg cgc gct ttt gat ttc aat ttg cgc 912Asp Ala Val Asn Thr Pro His Leu Arg Ala Phe Asp Phe Asn Leu Arg260 265 270gaa gac ttc gtt gct tta agc agc ggt agc aaa gac atg cgt tgg tgg 960Glu Asp Phe Val Ala Leu Ser Ser Gly Ser Lys Asp Met Arg Trp Trp275 280 285ggc ggt ctg gtc aat agc cag cac cgt gat cgg gcg gtc act ttt gtc 1008Gly Gly Leu Val Asn Ser Gln His Arg Asp Arg Ala Val Thr Phe Val290 295 300 305gat aac cac gat acc agc cgg gcc ggc aac cct tat ggc atg ccg cag 1056Asp Asn His Asp Thr Ser Arg Ala Gly Asn Pro Tyr Gly Met Pro Gln310 315 320gtg atc aac tac aag aac cag gcc tac gct tac att ctg ttg cgt gag 1104Val Ile Asn Tyr Lys Asn Gln Ala Tyr Ala Tyr Ile Leu Leu Arg Glu325 330 335cat ggg gtg ccg act gtg ttt gcc cgc gat tac gac gaa ttt ggc atg 1152His Gly Val Pro Thr Val Phe Ala Arg Asp Tyr Asp Glu Phe Gly Met340 345 350gcg cca acg ctg gat aaa ttg att gag gcg cgc cgc tac ttt gct tat 1200Ala Pro Thr Leu Asp Lys Leu Ile Glu Ala Arg Arg Tyr Phe Ala Tyr355 360 365ggt cct ggc cat gag tac tcc ggc aat acc gag gcc gtc tac gcc tat 1248Gly Pro Gly His Glu Tyr Ser Gly Asn Thr Glu Ala Val Tyr Ala Tyr370 375 380 385gtg cgc gaa ggg ctt agc act gtg ccg ggt acc ggt ctg gtg atg ctg 1296Val Arg Glu Gly Leu Ser Thr Val Pro Gly Thr Gly Leu Val Met Leu390 395 400ata tcg ggt cga aac tgg ggt ggt cag cag tcg ttc acc atc aac agc 1344Ile Ser Gly Arg Asn Trp Gly Gly Gln Gln Ser Phe Thr Ile Asn Ser405 4l0 415cac cag ccg aat acc acc ttt tac gat tat acc ggc aat gtt agc ggc 1392His Gln Pro Asn Thr Thr Phe Tyr Asp Tyr Thr Gly Asn Val Ser Gly420 425 430acg gtg acc acc aat gcg cag ggc tat ggc agc ttc ccg gtc act atg 1440Thr Val Thr Thr Asn Ala Gln Gly Tyr Gly Ser Phe Pro Val Thr Met435 440 445acg gaa agt acc ggt tgg tca gtc tgg gta cca caa tcc aat ggt ggc 1488Thr Glu Ser Thr Gly Trp Ser Val Trp Val Pro Gln Ser Asn Gly Gly450 455 460 465act cag ccg gga tcc att acc ctg cgg atg acc aag gat gtt ggc tat 1536Thr Gln Pro Gly Ser Ile Thr Leu Arg Met Thr Lys Asp Val Gly Tyr470 475 480ggc ttt tcg ttg ttc ttc acc ggc agc agt gcg gaa ctg acc aac tgg 1584Gly Phe Ser Leu Phe Phe Thr Gly Ser Ser Ala Glu Leu Thr Asn Trp485 490 495ggc ggc ggt att gaa ggc acc tgg aca tcc ggt aat gtc tgg gaa gtg 1632Gly Gly Gly Ile Glu Gly Thr Trp Thr Ser Gly Asn Val Trp Glu Val500 505 510acc atc ccg gat ccg ggc aac ttt gaa tgg aaa acc cgt aaa ggc cca 1680Thr Ile Pro Asp Pro Gly Asn Phe Glu Trp Lys Thr Arg Lys Gly Pro515 520 525acc ggt ggc agt ggt cag gac tgg gaa agt ggc agc aac cac aat cag 1728Thr Gly Gly Ser Gly Gln Asp Trp Glu Ser Gly Ser Asn His Asn Gln530 535 540 545acc aat ttg cac ccc agt ttt aat ggt ggg ttt taa 1764Thr Asn Leu His Pro Ser Phe Asn Gly Gly Phe *550 555
<210>2<211>587<212>PRT<213>芽胞桿菌屬(Bacillus sp.)<220>
<221>SIGNAL<222>(1)...(31)<400>2Met Gln Asn Thr Ala Lys Asn Ser Ile Trp Gln Arg Val Arg His Ser-30 -25 -20Ala Ile Ala Leu Ser Ala Leu Ser Leu Ser Phe Gly Leu Gln Ala Ser-15 -10 -5 1Glu Leu Pro Gln Ile Pro Pro Gln Gln Val Asn Asn Thr Met Tyr Gln5 10 15Ala Phe Tyr Trp Asp Ala Tyr Pro Gly Leu Trp Ala Asn Leu Pro Ala20 25 30Met Ala Ala Pro Leu Ala Glu Arg Gly Ile Thr Ser Met Trp Leu Pro35 40 45Pro Ala Ala Lys Gly Met Asn Gly Thr Phe Ser Val Gly Tyr Asp Val50 55 60 65Tyr Asp Phe Trp Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Thr Ala70 75 80Thr Arg Tyr Gly Thr Arg Gln Gln Leu Gln Gln Ala Leu Ser Ala Leu85 90 95Asp Gln Leu Gly Ile Gln Ala Tyr Phe Asp Val Val Phe Asn His Arg100 105 110Met Gly Ala Asp Ala Gln Glu Asn Ile Pro Gly Phe Gly Leu Ala Trp115 120 125Thr Glu Tyr His Leu Gln Gly Arg Gln Ala His Tyr Thr Gln Gln Asn130 135 140 145Trp Gly Tyr Leu Trp His Asp Phe Asp Trp Asn Trp Thr Ala Phe Asn150 155 160Gly Ser Asp Asn Gln Leu Tyr Pro Gly Lys Trp Trp Gly Asn Thr Phe165 170 175His Phe Pro Tyr Leu Met Gly Glu Asp Val Asp Tyr Asn Arg Phe Glu180 185 190Val Gln Gln Glu Met Lys Ala Trp Gly Glu Trp Ile Ile Asn Ser Val195 200 205Gly Phe Ser Gly Phe Arg Met Asp Ala Ile Ala His Val Asp Thr Asp210 215 220 225Phe Thr Arg Asp Trp Ile Asn His Val Gln Trp Ala Thr Ser Glu Asp230 235 240Val Phe Phe Val Ala Glu Ala Trp Val Ser Asp Ile Asn Gly Tyr Leu245 250 255Asp Ala Val Asn Thr Pro His Leu Arg Ala Phe Asp Phe Asn Leu Arg260 265 270Glu Asp Phe Val Ala Leu Ser Ser Gly Ser Lys Asp Met Arg Trp Trp275 280 285Gly Gly Leu Val Asn Ser Gln His Arg Asp Arg Ala Val Thr Phe Val290 295 300 305Asp Asn His Asp Thr Ser Arg Ala Gly Asn Pro Tyr Gly Met Pro Gln310 315 320Val Ile Asn Tyr Lys Asn Gln Ala Tyr Ala Tyr Ile Leu Leu Arg Glu325 330 335His Gly Val Pro Thr Val Phe Ala Arg Asp Tyr Asp Glu Phe Gly Met340 345 350Ala Pro Thr Leu Asp Lys Leu Ile Glu Ala Arg Arg Tyr Phe Ala Tyr355 360 365Gly Pro Gly His Glu Tyr Ser Gly Asn Thr Glu Ala Val Tyr Ala Tyr370 375 380 385Val Arg Glu Gly Leu Ser Thr Val Pro Gly Thr Gly Leu Val Met Leu390 395 400Ile Ser Gly Arg Asn Trp Gly Gly Gln Gln Ser Phe Thr Ile Asn Ser405 410 415His Gln Pro Asn Thr Thr Phe Tyr Asp Tyr Thr Gly Asn Val Ser Gly420 425 430Thr Val Thr Thr Asn Ala Gln Gly Tyr Gly Ser Phe Pro Val Thr Met435 440 445Thr Glu Ser Thr Gly Trp Ser Val Trp Val Pro Gln Ser Asn Gly Gly450 455 460 465Thr Gln Pro Gly Ser Ile Thr Leu Arg Met Thr Lys Asp Val Gly Tyr470 475 480Gly Phe Ser Leu Phe Phe Thr Gly Ser Ser Ala Glu Leu Thr Asn Trp485 490 495Gly Gly Gly Ile Glu Gly Thr Trp Thr Ser Gly Asn Val Trp Glu Val500 505 510Thr Ile Pro Asp Pro Gly Asn Phe Glu Trp Lys Thr Arg Lys Gly Pro515 520 525Thr Gly Gly Ser Gly Gln Asp Trp Glu Ser Gly Ser Asn His Asn Gln530 535 540 545Thr Asn Leu His Pro Ser Phe Asn Gly Gly Phe550 555
權(quán)利要求
1.一種α-淀粉酶，它是a)一種由芽孢桿菌NCIMB 40916菌株產(chǎn)生的多肽，或b)一種具有SEQ ID NO2的1-556位所示氨基酸序列的多肽，或c)一種由克隆在大腸桿菌DSM 13001(NN049489)的質(zhì)粒上的DNA序列中所述α-淀粉酶編碼部分所編碼的多肽，或d)在(a)或(b)中定義的多肽的類似物，其(i)與所述多肽至少有60％的同源性，或(ii)是從所述多肽通過一或多個氨基酸的取代，缺失和/或插入而得的多肽。
2.一種α-淀粉酶，在37℃測定時，其在pH10.5下的活性比pH7.3下的高至少2倍。
3.一種α-淀粉酶，在37℃測定時，其在pH9.5下的活性比pH7.3下的高至少4倍。
4.一種α-淀粉酶，在37℃測定時，其最佳pH約為9.5。
5.前述任一項權(quán)利要求
的α-淀粉酶，其得自芽孢桿菌，優(yōu)選芽孢桿菌NCIMB 40916菌株。
6.前述任一項權(quán)利要求
的α-淀粉酶，其中3g/I的實(shí)驗(yàn)洗滌劑溶液中25℃下溫育20分鐘后，其活性還保留了90％以上，所述實(shí)驗(yàn)洗滌劑含有20％的STPP，25％Na2SO4，15％Na2CO3，20％LAS，5％C12-C15脂肪醇乙氧基化物，5％Na2Si2O5，0.3％NaCl，pH10.5，German硬度為6，同一種溶液中30℃溫育20分鐘后其活性保持小于90％。
7.前述任一項權(quán)利要求
的α-淀粉酶，SDS-PAGE測定其分子量約為55kDa。
8.前述任一項權(quán)利要求
的α-淀粉酶，等電聚焦測定其等電點(diǎn)約為5。
9.前述任一項權(quán)利要求
的α-淀粉酶，其在洗滌劑添加劑的形式中為非粉塵狀顆粒或穩(wěn)定液體。
10.一種分離的DNA序列，其編碼前述任一項權(quán)利要求
的α-淀粉酶。
11.一種分離的DNA序列，其編碼一種α-淀粉酶并包含a)SEQ ID NO1的94-1764位所示的DNA序列，或b)在a)中定義的DNA序列的類似物，其i)與該DNA序列有至少60％的同源性，或ii)在至少55℃下與該DNA序列雜交。
12.權(quán)利要求
10或11的DNA序列，其來自細(xì)菌，優(yōu)選來自芽孢桿菌屬，最優(yōu)選來自NCIMB 40916菌株。
13.含有權(quán)利要求
10-12中任一項的DNA序列的重組表達(dá)載體。
14.由權(quán)利要求
10-12中任一項的DNA序列或權(quán)利要求
13的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
15.權(quán)利要求
14的細(xì)胞，其是原核細(xì)胞，具體是細(xì)菌細(xì)胞或最初產(chǎn)生該DNA序列的內(nèi)源細(xì)胞。
16.權(quán)利要求
15的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞屬于芽孢桿菌屬或埃希氏菌屬，優(yōu)選大腸桿菌。
17.生產(chǎn)α-淀粉酶的方法，其包括在允許所述α-淀粉酶產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求
14-16中任一項的細(xì)胞，然后從培養(yǎng)液中回收該α-淀粉酶。
18.生產(chǎn)前述任一項權(quán)利要求
的α-淀粉酶的方法，其包括在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)能生產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌屬菌株，然后從培養(yǎng)液中回收該α-淀粉酶。
19.一種包含權(quán)利要求
1-9中任一項的α-淀粉酶和一種表面活性劑的洗滌劑組合物。
20.前述權(quán)利要求
的洗滌劑組合物，其水溶液的pH值為8.5-11，優(yōu)選pH9-10.5。
21.權(quán)利要求
19或20的洗滌劑組合物，其是衣物洗滌劑。
專利摘要
本發(fā)明涉及改進(jìn)了在低溫下堿性洗滌劑中的洗滌性能的淀粉酶。更具體地，本發(fā)明提供了源自芽孢桿菌的α－淀粉酶，其改進(jìn)了在堿性溶液中，特別是在pH9－11左右的堿性洗滌劑中的性能。
文檔編號C12N1/21GKCN1399676SQ00814434
公開日2003年2月26日 申請日期2000年8月21日
發(fā)明者赫勒·奧特拉普, 比賈恩·R·尼爾森, 利斯貝思·H·霍克, 詹斯·T·安德森 申請人:諾維信公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan