專利名稱:從培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生克隆胚胎和成年動物的方法
發(fā)明技術(shù)領(lǐng)域：
描述了一種從體外培養(yǎng)的細(xì)胞克隆胚胎和成活后代的方法。優(yōu)選地，該細(xì)胞是建立的細(xì)胞系，更優(yōu)選它們是胚胎干(ES)細(xì)胞。也公開了來自克隆源胚胎的細(xì)胞系。我們描述了本發(fā)明不同的方案，表明該方法不是非常依賴于核供體細(xì)胞的細(xì)胞周期或基因組含量。該方法在產(chǎn)生具有或不具有定向突變的克隆來源組織和生物中有潛在的用途。這種潛在性比現(xiàn)有技術(shù)更大，因?yàn)楝F(xiàn)有技術(shù)不能使單個(gè)細(xì)胞從已建立的細(xì)胞系執(zhí)行完整胚胎發(fā)育到足月的程序。
最近，發(fā)展了一種獨(dú)特的克隆方法，其中首先選擇來自成年哺乳動物組織的供體細(xì)胞核，然后顯微注射到去核卵母細(xì)胞中(Wakayama等，Nature 394，369
)。顯微注射法能用于生產(chǎn)能被選擇性遺傳改造的存活胚胎、活后代和健康成年動物。這個(gè)核轉(zhuǎn)移方法的應(yīng)用已經(jīng)使采用成年來源的丘細(xì)胞克隆雌性動物(Wakayama等，Nature 394，369
)和尾來源細(xì)胞克隆雄性動物(Wakayama和Yanagimachi，NatureGenet.22，127
)的活產(chǎn)后代的克隆可行。用表型和基因組分析已經(jīng)嚴(yán)格證實(shí)了這些動物的克隆起源(Wakayama等，Nature394，369
)。
迄今為止，細(xì)胞融合和顯微注射法都存在缺點(diǎn)，它們描述使用新鮮分離的細(xì)胞或來自原代的，常常不清楚的細(xì)胞培養(yǎng)物作為核供體。這部分是由于培養(yǎng)細(xì)胞的外遺傳不穩(wěn)定性(Dean等，Development 125，2273
)。任何規(guī)避了這些問題的克隆方法將允許細(xì)胞在被用作克隆方法中的核供體前，在體外被改造。這將具有重大的實(shí)用性它將，例如，允許含有基因組定向突變克隆的產(chǎn)生和允許克隆祖先細(xì)胞的長期貯存。
培養(yǎng)的胚胎干(ES)細(xì)胞(如ES細(xì)胞系)來自胚泡的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)，并在體外顯示出罕見的核型和細(xì)胞遺傳學(xué)穩(wěn)定性(Evans等，Nature292，154
；Martin等，Proc.Natl.Acad.Sci.美國78，7634
；Hogan等，Manipulating the mouse embryo.第二版[ColdSpring Harbor Laboratory Press]，173-181頁
)。小鼠ES細(xì)胞顯示發(fā)育多潛能當(dāng)被轉(zhuǎn)移至小鼠胚胎時(shí)，它們能產(chǎn)生含有細(xì)胞類型方面明顯無限制的ES細(xì)胞貢獻(xiàn)的嵌合后代(Hogan等，Manipulating themouse embryo.第二版.[Cold Spring Harbor Laboratory Press]，173-181頁
；Bradley等，Nature 309，255
)。然而，對于完全由ES細(xì)胞發(fā)育為個(gè)體，它們必須與來自發(fā)育中胚胎的異源細(xì)胞相伴(因此，該胚胎是嵌合的)。該異源細(xì)胞來自二倍體(Bradley等，Nature309，255
；Hooper等，Nature 326，292
)或四倍體(Nagy等，Development 110，815
；Nagy等，Proc.Natl.Acad.Sci.美國90，8424
；Zang等，Mech.Dev.62，137
)胚胎。除非ES細(xì)胞被發(fā)育中胚胎的異源細(xì)胞拯救，否則ES細(xì)胞不可能進(jìn)行足月胚胎發(fā)育。這是使用ES細(xì)胞的一個(gè)主要缺點(diǎn)，因?yàn)樗鼈儾荒苤笇?dǎo)能夠向足月發(fā)育進(jìn)展的胚胎發(fā)育；因此由它們產(chǎn)生的后代先前必然是嵌合的。這就使得必需漫長的育種程序以獲得僅僅來自ES細(xì)胞的后代。
ES細(xì)胞可用于將定向基因組改變導(dǎo)入動物。ES細(xì)胞基因?qū)ぐ幸呀?jīng)被廣泛用于創(chuàng)造帶有定向突變的多種小鼠品系(Capecchi，Science244，1288
)；Ramirez-Solis等，Mets.Enzymol.225，855-878
)。定向突變的導(dǎo)入利用同源重組來“剔除”或“引入(knock in)”基因組的靶片段，以用新來的基因替換它們。突變的表型效果可由選擇引入基因來制定，可以完全改變表型，或細(xì)微改變。來自ES細(xì)胞的克隆動物能夠結(jié)合基因?qū)ぐ泻蛣游锟寺〉膬?yōu)點(diǎn)，利于基因打靶動物的生產(chǎn)。如果來自ES細(xì)胞的核-甚至在體外長期培養(yǎng)的-能用于生產(chǎn)有活力的、可繁殖的克隆動物的話，它們將是通過克隆改造哺乳動物基因組的最佳選擇。然而，以前的一些困難已經(jīng)包括開發(fā)適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)和選擇步驟以有效允許在尋靶步驟而不是隨機(jī)DNA修飾中ES細(xì)胞的選擇。
現(xiàn)有技術(shù)尚未證明任何培養(yǎng)的ES細(xì)胞系，或ES細(xì)胞樣細(xì)胞系或其它已建立的細(xì)胞系能指導(dǎo)核轉(zhuǎn)移后完整發(fā)育，盡管核轉(zhuǎn)移已經(jīng)用于生產(chǎn)綿羊、牛和山羊。例如，Campbell等(Nature 380，64
)已經(jīng)報(bào)道采用核轉(zhuǎn)移，從短期培養(yǎng)的、胚胎源上皮細(xì)胞通過細(xì)胞融合方法克隆綿羊；然而，這些細(xì)胞表達(dá)與分化和細(xì)胞定型關(guān)聯(lián)的標(biāo)記，因此明顯不是ES細(xì)胞。
Stice等(WO 95/17500)已經(jīng)報(bào)道用同代來源的、低傳代的ES細(xì)胞樣細(xì)胞的膜融合核轉(zhuǎn)移來生產(chǎn)牛胚胎。Stice等沒有提供他們在從這些或任何其它ES細(xì)胞樣細(xì)胞生產(chǎn)后代(活或仍活產(chǎn))中，核轉(zhuǎn)移方法成功的實(shí)施例，因?yàn)樗惺茉性谌焉?0天前均流產(chǎn)；母牛最長的妊娠是55天，平均妊娠期280天。
Tsunoda and Kato(J.Reprod.Fert.98，537
)報(bào)道了與來自已經(jīng)傳代11-20次的細(xì)胞系的ES細(xì)胞核融合(用副流感病毒和電融合)的小鼠去核卵在體外至雙細(xì)胞、四細(xì)胞、桑椹胚和胚泡期的發(fā)育。然而，用所得胚胎向替代母親轉(zhuǎn)移后沒有獲得活胎兒。
與此顯著不同，現(xiàn)在公開的本發(fā)明的方法允許從單個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞的核產(chǎn)生活后代。
發(fā)明概述這里描述的發(fā)明提供了這些缺點(diǎn)的解決方法。它提供了一種從單個(gè)重建的細(xì)胞克隆繁殖(例如，以完整動物的形式)分化細(xì)胞的方法。供體核典型地插入去核受體細(xì)胞如，卵母細(xì)胞或卵裂球中，并產(chǎn)生重建細(xì)胞。所得重建細(xì)胞的發(fā)育被啟動和培養(yǎng)。因此，在相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了(i)從ES細(xì)胞，通過將ES細(xì)胞的核內(nèi)容物插入去核卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，并允許重建細(xì)胞分化，而克隆地衍生胚胎，和(ii)該方法產(chǎn)生的培養(yǎng)細(xì)胞或動物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所得重建細(xì)胞的分化沿著一個(gè)或多個(gè)導(dǎo)致產(chǎn)生各種不同細(xì)胞類型的特定的途徑進(jìn)行。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所得重建細(xì)胞發(fā)育為胚胎，該胚胎接著發(fā)育為有活力的活產(chǎn)后代。這里使用的術(shù)語“核”意指包含整個(gè)核或其一部分，其中核內(nèi)容物至少包括能夠在缺乏任何其它非線粒體基因組的細(xì)胞中指導(dǎo)發(fā)育的最少物質(zhì)。所得組織是由提供用于注射到去核卵母細(xì)胞中的核的細(xì)胞(核供體)克隆得到的；該步驟產(chǎn)生后代時(shí)，該后代是來自核供體細(xì)胞的克隆。
因此，本發(fā)明提供了通過將培養(yǎng)的ES細(xì)胞系的細(xì)胞核插入去核卵母細(xì)胞中，由ES細(xì)胞系克隆動物的方法。核供體可來自構(gòu)建成熟的細(xì)胞系，或可來自新產(chǎn)生的細(xì)胞系。在一些動物如哺乳動物中，大多數(shù)構(gòu)建的ES細(xì)胞系會源于雄性；即，它們擁有XY核型。相反，在鳥類中，大多數(shù)構(gòu)建的ES細(xì)胞系會源于雌性；即，它們擁有XX核型。來自這種XY細(xì)胞系的完整動物克隆因此反映了這個(gè)起源并且是雄性。相應(yīng)地，在核供體來自源于雌性的細(xì)胞系的實(shí)施方案中，產(chǎn)生具有XX核型的完整動物克隆并且其是雌性，反之對于來自XY核型的ES細(xì)胞的動物亦然。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中使用的細(xì)胞來自除小鼠之外的物種，包括但不限于下組中的那些靈長類動物、綿羊、牛、豬、熊、貓、山羊、犬、馬、cetids和鼠的其它嚙齒動物。在一個(gè)有利實(shí)施方案中，ES細(xì)胞樣細(xì)胞來自這些物種胚泡的ICM。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，就在使用待提供核供體細(xì)胞的ES細(xì)胞前，構(gòu)建該細(xì)胞。在一個(gè)有利實(shí)施方案中，在ES細(xì)胞用于產(chǎn)生克隆來源細(xì)胞，如克隆動物前，進(jìn)行遺傳修飾。
ES細(xì)胞核轉(zhuǎn)移后重建的細(xì)胞可在體外培養(yǎng)后發(fā)育為胚泡，或在體內(nèi)可實(shí)施這種發(fā)育，如，對于豬而言。在一個(gè)實(shí)施方案中，胚泡可轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)拇心赣H中，產(chǎn)生來自重建細(xì)胞的克隆動物。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法的克隆來源的桑椹胚或胚泡可以，反過來，與來自最初用于提供核供體以產(chǎn)生克隆來源胚胎的培養(yǎng)物的ES細(xì)胞聚集(或注射該ES細(xì)胞)。這產(chǎn)生其細(xì)胞部分來自克隆胚胎、部分來自培養(yǎng)ES細(xì)胞的注射/聚集細(xì)胞的胚胎。這些聚集和注射的方法是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員中建立成熟的，并且原則上與在標(biāo)準(zhǔn)基因?qū)ぐ蟹椒ㄖ杏糜诋a(chǎn)生嵌合胚胎的相同(Hogan等，Manipulating the mouse embryo.第二版[Cold Spring Harbor Laboratory Press]，189-216頁
；Joyner[ed]，Gene targeting.[Oxford University Press]，107-146頁
)。然而，現(xiàn)在公開的本發(fā)明的方法產(chǎn)生的胚胎的核基因組不是嵌合的，因?yàn)樗没詈蟠鷣碜赃z傳上等同的ES細(xì)胞。該方法的這個(gè)實(shí)施方案提高了由ES細(xì)胞生產(chǎn)克隆活后代的效率。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，用本發(fā)明方法克隆得到的桑椹胚或胚泡可用作干細(xì)胞如胚泡的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)細(xì)胞的來源。這種細(xì)胞能夠按照本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的方法沿著指定的途徑進(jìn)行分化。因此，本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施方案從任何核供體細(xì)胞的培養(yǎng)群產(chǎn)生給定類型的分化細(xì)胞。能用這個(gè)方法產(chǎn)生的細(xì)胞類型包括，但不限于，分布廣泛的解剖學(xué)部位中存在的細(xì)胞類型，如上皮細(xì)胞、血細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等，以及顯示較多解剖學(xué)限制的細(xì)胞，如心肌細(xì)胞、造血細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、角化細(xì)胞等。
這里我們示范了由來自F1和近交鼠品系的已構(gòu)建ES細(xì)胞系的ES細(xì)胞核克隆的活后代的產(chǎn)生。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，克隆的活后代是由‘2C’ES細(xì)胞核產(chǎn)生的；即，它們擁有基因組DNA的二倍體含量，如在細(xì)胞周期G0或G1期的S期前細(xì)胞中所見。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，供體ES細(xì)胞核是‘2-4C’。盡管對于分裂中細(xì)胞的大多數(shù)生活史中，它包含2C DNA，表現(xiàn)為2n染色體，在細(xì)胞周期的S期之后的一個(gè)時(shí)期，染色體數(shù)目保持不變，但DNA含量已經(jīng)由DNA合成復(fù)制循環(huán)而加倍；因此這種細(xì)胞是2n，但為4C，直到有絲分裂末期二價(jià)染色體的姐妹染色單體分離。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用4C核生產(chǎn)活克隆后代。這證明(ES)細(xì)胞處于細(xì)胞周期的G0或G1期，對于為了它們的核指導(dǎo)任何細(xì)胞類型的發(fā)育，并不是必要的。
在一個(gè)實(shí)施方案中，已經(jīng)經(jīng)遺傳改變使ES細(xì)胞核供體含有期望的突變。因此，用本發(fā)明的方法從遺傳改變的ES細(xì)胞克隆的動物或細(xì)胞群將擁有該突變。ES細(xì)胞中的遺傳改變可以是非定向突變、接觸誘變劑造成突變、或由已知方法(如電穿孔、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染等)將外源核酸或核酸衍生物導(dǎo)入到細(xì)胞中的結(jié)果。更優(yōu)選，用作核供體的ES細(xì)胞已經(jīng)通過基因?qū)ぐ羞M(jìn)行遺傳改變，以致一個(gè)或多個(gè)特定基因的一部分或全部以精確的和可控制的方式被修飾。
因此，本發(fā)明提供了一種在一代中從細(xì)胞系(包括但不限于ES細(xì)胞系)產(chǎn)生克隆的、遺傳改變的活后代的方法，該細(xì)胞系在核轉(zhuǎn)移前能在體外被遺傳操作和表征。因此，本發(fā)明的方法提高了從相應(yīng)細(xì)胞系產(chǎn)生基因打靶動物的速度和效率。
圖2是包含其中去核卵母細(xì)胞接受E14核，但沒有接受活化刺激的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果的表。
圖3是包含其中去核卵母細(xì)胞接受E14核，并在核轉(zhuǎn)移后用鍶離子活化的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果的表。
圖4是用來自不同大小并與不同濃度FCS一起生長的E14細(xì)胞的核重建1765個(gè)卵母細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果總結(jié)表。
圖5是包含用來自F1雜種129/SV × 129/SV-CP的細(xì)胞系R1實(shí)施的1087個(gè)核轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)的結(jié)果的表。
發(fā)明詳述本發(fā)明公開了通過將胚胎干(ES)細(xì)胞的核組分(包括染色體)插入去核卵母細(xì)胞中，并促使所得重建細(xì)胞發(fā)育至足月，可獲得可存活的活產(chǎn)后代。在用于核轉(zhuǎn)移前，ES細(xì)胞可培養(yǎng)或長期深低溫保存。小鼠ES細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和操作-包括通過同源重組基因?qū)ぐ?在Hogan等，Manipulating the mouse embryo.第二版.(Cold Spring HarborLaboratory Press)，253-290頁(1994)中描述。關(guān)于牛、倉鼠、人和兔的建立ES細(xì)胞或類似ES細(xì)胞的細(xì)胞(ES細(xì)胞樣細(xì)胞)的方法，已分別在Cibelli等，Theriogenology 47，241
；Doetschman等，Dev.Biol.127，224
；Thomson等，Science 282，1145
和Schoonjans等，Mol.Reprod Dev.45，439
中描述。
來自根據(jù)本發(fā)明的ES細(xì)胞核的后代是基因組克隆，其中后代的每個(gè)細(xì)胞的染色體均來自起源核供體ES細(xì)胞的染色體。
優(yōu)選地，ES細(xì)胞來自ES細(xì)胞系，該ES細(xì)胞系的干細(xì)胞性能已經(jīng)通過在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)胚泡注射步驟(Bradley等，Nature，309，255
；Hogan等，Manipulating the mouse embryo.第二版.[Cold Spring Harbor Laboratory Press]，196-204頁
)后，嵌合后代中種系貢獻(xiàn)和傳遞而被證明。這個(gè)過程通常包括將ES細(xì)胞注射到受精產(chǎn)生的胚泡的腔中。在這個(gè)細(xì)胞背景中，ES細(xì)胞能夠參與形成部分來自宿主胚泡、部分來自注射的ES細(xì)胞的嵌合動物的發(fā)育過程。ES細(xì)胞能在嵌合體中產(chǎn)生軀體組織并能形成所有細(xì)胞類型，包括嵌合體的種系。ES細(xì)胞形成多方面細(xì)胞類型的能力被稱為“多能性”。證明ES在種系傳遞中的多潛能限于小鼠和牛，盡管沒有已知的理由相信該現(xiàn)象限于這些物種。ES細(xì)胞系被認(rèn)為為哺乳動物遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的研究提供了一個(gè)有力的工具。
ES細(xì)胞可以來自已建立的ES細(xì)胞系。這種ES細(xì)胞系是熟知的，包括但不限于，來自F1雜種系和近交小鼠系的那些。來自F1雜種系的ES細(xì)胞系的實(shí)例包括R1(Nagy，A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.美國，90，8424
)(見實(shí)施例2)。來自近交系的ES細(xì)胞系的實(shí)例包括129/01a來源的雄性系E14(Hooper，M.等，Nature 326，292
)(可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Bethesda，MD獲得，[ATCC]號CRL-11632)、D3(ATCC號CRL-1934)和可從Lexicon Genetics購買得到的AB1和AB2.2。
除了小鼠ES細(xì)胞系，ES細(xì)胞樣細(xì)胞已從牛(Cibelli等，Tlaeriogenology 47，241
)、倉鼠(Doetschman等，Dev.Biol.127，224
)、人(Thomson等，Science 282，1145
)和兔(Schoonjans等，Mol.Reprod.Dev.45，439
)獲得。技術(shù)障礙妨礙將和鼠相同的嚴(yán)格條件應(yīng)用于來自這些動物的ES細(xì)胞，即它們是廣泛多潛能的并能夠?qū)Υ蠖鄶?shù)或全部細(xì)胞命運(yùn)(包括種系)有貢獻(xiàn)。可以預(yù)期，對于小鼠以外的物種，將會證明實(shí)驗(yàn)證實(shí)能達(dá)到所有ES細(xì)胞限定標(biāo)準(zhǔn)的ES細(xì)胞系。
ES細(xì)胞(或來自ICM的細(xì)胞)以外的細(xì)胞可在體外充分培養(yǎng)以在完整動物的克隆步驟中進(jìn)行基因組操作和/或用作核供體。這種細(xì)胞類型不是物種限制的，其實(shí)例有人成纖維細(xì)胞系、豬胚胎生殖(EG)細(xì)胞(REF)，以及鼠胚胎癌性(EC)細(xì)胞(Stewart和Mintz，J Exp.Zoot.224，465
；Hogan等，Manipulating the mouse embryo.第二版.[ColdSpring Harbor Laboratory Press]，p92
)。適于在體外長期培養(yǎng)和遺傳操作的細(xì)胞種類可能增加；所有這些細(xì)胞是本發(fā)明方法中潛在的核供體。
確然，ES細(xì)胞系能被基因組改造。實(shí)施的方法現(xiàn)在已經(jīng)建立成熟并且在改造ES細(xì)胞系以使它們具有給定遺傳(且常常是相應(yīng)的表型)性狀的文獻(xiàn)(Mombaerts等，Proc.Nad.Acad Sci.美國，88，3084
；Mombaerts等，Nature 360，225
；Itohara等，Cell 72，337
)中有許多報(bào)道。這又是通過采用如電穿孔或脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入重組DNA實(shí)現(xiàn)的。突變ES細(xì)胞也可以在培養(yǎng)物中自發(fā)產(chǎn)生并可以在選擇性培養(yǎng)基存在下富集。例如，據(jù)報(bào)道通過變異體ES細(xì)胞抵抗嘌呤類似物6-巰基鳥嘌呤，可從培養(yǎng)物中選擇次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT)缺陷的變異體ES細(xì)胞，而且這些突變ES細(xì)胞用于生產(chǎn)導(dǎo)致HPRT缺陷的雄性后代的種系嵌合體(Hooper等，Nature 326，292
)。
ES細(xì)胞技術(shù)的一個(gè)關(guān)鍵特征是它們允許在整個(gè)基因組環(huán)境中DNA序列的定向改變。這依賴于被稱為同源重組的現(xiàn)象，其中在細(xì)胞內(nèi)，DNA序列與它們的互補(bǔ)(匹配，或接近等同的)基因組序列對準(zhǔn)。該互補(bǔ)序列被稱為同源序列。然后該序列可以進(jìn)行交換反應(yīng)(互換)，產(chǎn)生有效替代染色體上存在序列的新來序列。如果新來序列與其基因組對應(yīng)物接近等同，或如果它被另外無關(guān)序列點(diǎn)綴，則該替代使新序列定向?qū)?。該替代利用?xì)胞酶，據(jù)認(rèn)為該酶的正常作用是在DNA修復(fù)和維持方面。由于目前未知的原因，ES細(xì)胞是這種酶的豐富來源，并且是已知易于支持同源(即定向)重組的唯一被很好表征的哺乳動物細(xì)胞。然后，基因?qū)ぐ袑?dǎo)致產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)特定位點(diǎn)以精確指定方式修飾的ES細(xì)胞?；?qū)ぐ械膶?shí)例包括用作為一部分相對短(＜約25千堿基對[kbp])重組DNA片段的新來DNA序列來產(chǎn)生“剔除”和“引入”鼠。預(yù)期ES細(xì)胞樣細(xì)胞也可以使用與基因?qū)ぐ蠩S細(xì)胞類似的技術(shù)進(jìn)行基因打靶。
目前使用基因打靶ES細(xì)胞系來產(chǎn)生遺傳改變鼠的方法涉及將改造的ES細(xì)胞分別與桑椹胚(大約8個(gè)細(xì)胞)或胚泡(16個(gè)細(xì)胞以上)一起聚集或注射至其中。植入后，這種胚胎可以產(chǎn)生嵌合親本(F0)動物，其隨后與野生型動物繁殖使來自ES細(xì)胞的基因組以可變的頻率(常常等于零)進(jìn)行種系傳遞。對已經(jīng)傳遞了定向基因修飾的任何第一代(F1)后代進(jìn)行表型(例如，它們的毛色)鑒定，且通過分析它們的基因組DNA進(jìn)行鑒定(Joyner[主編]，Gene targeting.[Oxford University Press]，52-59頁
；Hogan等，Manipulating the mouse embryo.第二版[Cold Spring Harbor Laboratory Press]，291-324頁
)。
F1雜合體的繁殖常常是必要的，且在一些情況下，能產(chǎn)生突變純合的第二代(F2)動物。因此，產(chǎn)生定向基因突變純合的動物的當(dāng)前程序至少涉及三代動物。對于小鼠，這需要大約至少六個(gè)月來建立給定的突變等位基因純合的純育系。然而，對于大多數(shù)哺乳動物，包括可購買到的有價(jià)值品種，具有長得多的妊娠/成熟期，產(chǎn)生純育系所需的時(shí)間將遠(yuǎn)遠(yuǎn)更長。例如，對于牛，三代需要至少3×280天，或大約2.3年。
由于ES細(xì)胞系是克隆的(在細(xì)胞克隆的意義上，不是完整動物克隆)，它們在完整動物克隆中的應(yīng)用允許相對較快地產(chǎn)生本質(zhì)上無限數(shù)量的等同動物。因此，通過使用單一ES細(xì)胞群作為核供體以產(chǎn)生相應(yīng)數(shù)量的能夠發(fā)育至足月的重建細(xì)胞，來生產(chǎn)大量等同動物將成為可能。預(yù)期接近等同的、遺傳改造的動物的增殖為人醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)及農(nóng)業(yè)帶來巨大的益處。例如，通過在乳汁或其它液體或組織，通常是分泌性組織，產(chǎn)生有價(jià)值的藥物劑，遺傳改變的動物(包括較大的動物)能作為活的制藥“工廠”。這個(gè)生產(chǎn)方法有時(shí)稱作“制藥法(pharming)”。
大量的等同研究動物，如小鼠、豚鼠、大鼠和倉鼠的產(chǎn)生也是令人期望的，因?yàn)樗鼈冊谒幬锇l(fā)現(xiàn)和篩選中有用。接近等同的小鼠的群體的可利用性在例如發(fā)育、人類疾病的分析中，和在新藥測試中非常有益；個(gè)體間固有的可變性最小，利于對比研究。
本發(fā)明描述了一種通過核轉(zhuǎn)移產(chǎn)生分化細(xì)胞群，例如來自培養(yǎng)細(xì)胞如ES細(xì)胞的動物克隆的方法。在該方法中，克隆來源的細(xì)胞從接受ES細(xì)胞(如來自建立的ES細(xì)胞系)核(或其一部分，至少包括染色體)的去核卵母細(xì)胞開始發(fā)育。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在用本發(fā)明的方法將ES細(xì)胞核顯微注射到去核卵母細(xì)胞后可以產(chǎn)生克隆小鼠。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，ES細(xì)胞核供體可以來自ES細(xì)胞系，E14。從ES細(xì)胞克隆的后代可以在出生幾天后，通過它們的毛色來識別，毛色反映了核供體細(xì)胞系所來源的小鼠品系的表型。目前可獲得的許多ES細(xì)胞系來自Jackson實(shí)驗(yàn)室Leroy Stevens博士的129小鼠品系，129/Sv。
本發(fā)明可用于克隆能夠或可能從中分離ES細(xì)胞并培養(yǎng)形成ES細(xì)胞系的所有動物，包括兩棲動物、魚、鳥(如家雞、火雞、鵝等)和哺乳動物，如靈長類、綿羊、牛、豬、熊、貓、犬、馬、山羊、鼠等。
本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案包括步驟(i)在ES細(xì)胞核插入卵母細(xì)胞后，但在發(fā)育活化之前，允許ES細(xì)胞核與去核卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)接觸一段時(shí)間(如不超過大約6小時(shí))，和(ii)活化重建細(xì)胞以啟動發(fā)育。
在一個(gè)實(shí)施方案中，使用具有2C基因組含量的供體核。當(dāng)核供體是2C時(shí)，為了抑制假極體(pseudo-polar body)中染色體的擠出，優(yōu)選在微管和/或微絲組裝抑制劑存在下進(jìn)行活化。當(dāng)例如使用4C供體核時(shí)，在缺乏微管/微絲抑制劑下活化之前，重建細(xì)胞可以培養(yǎng)不超過大約6小時(shí)；在這種情況下，假極體被擠出，以致重建細(xì)胞的倍性可恢復(fù)到2n。(形式上的2n倍體通常是指導(dǎo)原腸胚形成以上胚胎發(fā)育的先決條件。)在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，用顯微注射法將ES細(xì)胞核插入去核卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，并且，更優(yōu)選用壓電驅(qū)動(piezo-electrically-actuated)顯微注射法。使用壓電顯微操作器允許用單針收獲和注射來自ES細(xì)胞的核供體。而且，卵母細(xì)胞的去核和供體ES細(xì)胞核的注射可快速、高效完成，并且與以前報(bào)道的方法(如，用融合促進(jìn)化學(xué)制劑、放電或融合病毒誘導(dǎo)供體細(xì)胞和卵母細(xì)胞的融合)相比，降低了對卵母細(xì)胞的創(chuàng)傷。
用顯微注射法導(dǎo)入核物質(zhì)的方法與用細(xì)胞融合導(dǎo)入核物質(zhì)的方法在時(shí)間和拓?fù)渖厦黠@不同。在本發(fā)明的顯微注射法中，首先供體ES細(xì)胞的質(zhì)膜被穿孔，隨后，去核卵母細(xì)胞的質(zhì)膜被穿孔。因此，從供體細(xì)胞提取核(或其一部分，至少包括染色體)與該核送遞到受體細(xì)胞在時(shí)間上是分開的。核內(nèi)容物的分離和送遞在時(shí)間和空間上分離不是細(xì)胞融合的特征，在細(xì)胞融合中使兩個(gè)細(xì)胞并列，然后在單個(gè)步驟中發(fā)生融合。
而且，本發(fā)明方法的核取出和導(dǎo)入的時(shí)間空間分離允許有控制地導(dǎo)入除核之外的物質(zhì)?？赡芊浅Ｆ谕コ鈦砦镔|(zhì)(如細(xì)胞質(zhì)和核質(zhì))和導(dǎo)入額外物質(zhì)和試劑的工具。例如添加劑可能很好地影響隨后的發(fā)育。這種試劑可以包含抗體、藥理學(xué)上信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑，或其組合，其中抗體和/或抑制劑直接對抗和/或抑制在細(xì)胞分裂或胚胎發(fā)育中起負(fù)調(diào)節(jié)作用的蛋白或其它分子的作用。該試劑可以包括核酸序列，如重組質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)化載體構(gòu)建體，它們可以在胚胎發(fā)育過程中表達(dá)以編碼對發(fā)育具有潛在正作用的蛋白和/或核酸序列，可以在核與去核卵母細(xì)胞結(jié)合前、結(jié)合過程中或結(jié)合后，將試劑導(dǎo)入細(xì)胞。
本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，通過核轉(zhuǎn)移從培養(yǎng)ES細(xì)胞克隆產(chǎn)生分化細(xì)胞群的步驟和分步在
圖1中圖解。
概括地說，從卵母細(xì)胞供體動物收獲(1)卵母細(xì)胞，優(yōu)選中期I階段卵母細(xì)胞，并除去每一個(gè)卵母細(xì)胞的中期II(mII)板(plate)(含mII染色體)(2)形成去核卵母細(xì)胞(缺乏母系來源的染色體)。可以在體外用已知步驟或在體內(nèi)用其他研究者已經(jīng)描述的步驟使受體卵母細(xì)胞成熟。如本發(fā)明中不同實(shí)施方案提供的，從含有直徑或小(典型地10μm)或大(典型地18μm)的細(xì)胞的體外培養(yǎng)物中選擇外貌健康ES細(xì)胞(3，4)。單一核被注射到(5)去核卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。允許核在去核卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中停留(6)不超過6小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，這個(gè)時(shí)期最小大約0-5分鐘。在一個(gè)更優(yōu)選實(shí)施方案中，這個(gè)時(shí)期是1-3小時(shí)。
然后，在微管和/或微絲組裝抑制劑存在或缺乏下，活化卵母細(xì)胞(7)，抑制劑存在與否依賴于新來核的倍性或基因組當(dāng)量(genomeequivalence)，其部分由供體核在轉(zhuǎn)移時(shí)所處細(xì)胞周期階段反映。有絲分裂細(xì)胞周期確保在DNA復(fù)制的一個(gè)復(fù)制循環(huán)后，活躍分裂的細(xì)胞將相等的遺傳物質(zhì)分給兩個(gè)子細(xì)胞。DNA合成并不是貫穿整個(gè)細(xì)胞周期，而是限于細(xì)胞周期的一部分合成期，S期。其后是間期，G2期，這期間細(xì)胞在進(jìn)入有絲分裂(M期)前為分裂作進(jìn)一步準(zhǔn)備。初生子細(xì)胞從那時(shí)起遞送到另一個(gè)間期，G1期。明顯地，某些非分裂細(xì)胞，例如在體內(nèi)終末分化細(xì)胞，在周期中的這個(gè)階段-相當(dāng)于分裂細(xì)胞G1期并在S期前的階段-懸置。這種細(xì)胞通常稱作“靜止的”，從細(xì)胞周期中退出進(jìn)入G0期。細(xì)胞周期的G0或G1期的細(xì)胞核是二倍體，帶有相應(yīng)于這種情況下2C DNA含量的2n染色體；它們具有每條形態(tài)學(xué)明顯不同的常染色體(非X，非Y)的兩個(gè)拷貝，和依賴于物種，或XX(雌性)或XY對。細(xì)胞周期G2期的細(xì)胞核經(jīng)歷了一輪DNA復(fù)制，染色體數(shù)量仍是2n，但此時(shí)含有4C DNA含量。在S期期間，每條不同的染色體的兩個(gè)拷貝中每一個(gè)的DNA都被復(fù)制，但這些拷貝(單價(jià)姐妹染色單體)連接在每個(gè)染色體的著絲粒處。在非同步分裂的ES細(xì)胞培養(yǎng)物中，可期望，根據(jù)定義，表現(xiàn)出細(xì)胞周期的所有階段。所以，ES細(xì)胞培養(yǎng)物中含有由一個(gè)直徑范圍反映的細(xì)胞混合物；這個(gè)范圍可以從大約10μm到大約18μm。相對小的細(xì)胞(直徑大約10μm)有可能是二倍體(2n)并有2C的基因組DNA，因?yàn)檫@些細(xì)胞相對較近分裂，細(xì)胞質(zhì)體積后來增加相對較小。趨向最大大小的細(xì)胞(直徑大約18μm)更有可能前進(jìn)到S期后。
當(dāng)ES細(xì)胞供體核是二倍體和2C時(shí)，在核轉(zhuǎn)移后，在胞質(zhì)分裂抑制劑存在下活化重建細(xì)胞(7)。這抑制假極體的形成并防止染色體遺失，以此維持重建細(xì)胞的2n二倍性。當(dāng)認(rèn)為核可能處于S期后(因?yàn)樗嬖谟谳^大細(xì)胞中)時(shí)，在胞質(zhì)分裂抑制劑缺失下，活化卵母細(xì)胞，這樣假極體形成能同時(shí)使卵母細(xì)胞的二倍性減少到2n，2C。在活化期間，可觀察到假前核(pseudo-pronuclei)形成。
ES核供體細(xì)胞培養(yǎng)基中胎牛血清(FCS)濃度可以在廣泛范圍內(nèi)變化；認(rèn)為FCS濃度對來自培養(yǎng)的ES細(xì)胞的核支持用本發(fā)明方法克隆的活后代發(fā)育的能力沒有明顯的影響。
或小或大細(xì)胞的核轉(zhuǎn)移后，將形成假前核的重建卵母細(xì)胞(8)轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基，胚胎培養(yǎng)1到大約3.5天(9)。培養(yǎng)后，胚胎可以轉(zhuǎn)移(10)到替代母親以允許活后代的發(fā)育和出生(11)?？晒┻x擇地，(9)產(chǎn)生的胚胎可用作ES細(xì)胞樣細(xì)胞培養(yǎng)物的后續(xù)衍生中ICM細(xì)胞的來源。
因此，本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案描述了哺乳動物的克隆，包括步驟(a)收集細(xì)胞如ES細(xì)胞的核的全部或一部分，至少包括染色體；(b)將其插入去核卵母細(xì)胞中；(c)允許重建細(xì)胞發(fā)育為胚胎；和(d)允許胚胎發(fā)育為胎兒和隨后發(fā)育為活后代，或使胚胎的細(xì)胞在體外培養(yǎng)。這些步驟中的每一步在下面進(jìn)行詳細(xì)描述，以ES細(xì)胞核供體作為范例。
可以從ES細(xì)胞收集ES細(xì)胞核(或包含染色體的核組分)，該ES細(xì)胞具有如上所述的2-4C的基因組DNA含量。優(yōu)選，ES細(xì)胞核插入到去核卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。優(yōu)選通過顯微注射法進(jìn)行核插入，并且更優(yōu)選通過壓電驅(qū)動顯微注射法進(jìn)行。在進(jìn)一步的方案中，可以通過允許核供體細(xì)胞與受體去核卵母細(xì)胞融合的方法將核導(dǎo)入(Willadsen，Nature320，63
)。
可以在ES細(xì)胞核插入前、插入過程中或插入后，活化重建細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，在ES細(xì)胞核插入零小時(shí)到大約六小時(shí)后，實(shí)施活化步驟。在活化前的時(shí)間內(nèi)，核與mII卵母細(xì)胞(可能被新來的成分修飾)的居住(resident)細(xì)胞質(zhì)接觸?；罨梢酝ㄟ^多種方式實(shí)施，包括但不限于，電活化，或接觸乙醇、精子胞質(zhì)因子(sperm cytoplasmic factors)、卵母細(xì)胞受體配體肽模擬物、Ca2+釋放的藥理學(xué)刺激劑(如咖啡因)、Ca2+離子載體(如A2318，離子霉素)、磷蛋白信號傳導(dǎo)(signaling)調(diào)節(jié)劑、蛋白合成抑制劑等，或它們的組合。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通過使細(xì)胞接觸鍶離子(Sr2+)進(jìn)行活化。
優(yōu)選通過接觸微管和/或微絲組裝的抑制劑以防止極體形成(見下)，來實(shí)施已經(jīng)用含有2C DNA的核注射的重建細(xì)胞的活化。這有利于在重建細(xì)胞內(nèi)保留來自供體核的所有染色體。優(yōu)選在這種抑制劑缺乏時(shí)，活化已接受2-4C核的重建細(xì)胞，以允許假極體的形成，從而使基因組含量降為2C。在一個(gè)實(shí)施方案中，2C基因組含量對應(yīng)于2n染色體。
允許胚胎發(fā)育的步驟可包括將胚胎轉(zhuǎn)移給受體替代母親，在那里胚胎發(fā)育為存活胎兒(即，足以正常發(fā)育至足月的成功植入的胎兒)的分步。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，胚胎可以在體外發(fā)育的任何階段，從兩細(xì)胞到桑椹胚/胚泡，進(jìn)行轉(zhuǎn)移。
根據(jù)圖1的步驟(1)到(10)，本發(fā)明另外實(shí)施方案的前十步產(chǎn)生了克隆的桑椹胚或胚泡(胚胎)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在此之后，在克隆胚胎轉(zhuǎn)移給替代受體雌性動物前，根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知的方法，用聚集技術(shù)或胚泡注射將至少一個(gè)，通常5-15個(gè)ES細(xì)胞導(dǎo)入克隆胚胎中。這些“第二”ES細(xì)胞被完整導(dǎo)入并可以來自與核供體來源的培養(yǎng)物相同的培養(yǎng)物，或那個(gè)培養(yǎng)物的繼續(xù)，或不同的培養(yǎng)物，或混合物。第二ES細(xì)胞的一個(gè)功能是拯救或增強(qiáng)克隆胚胎的發(fā)育潛力，這樣使其完全發(fā)育的可能性更大。所得胚胎現(xiàn)在含有來自克隆來源胚胎和第二導(dǎo)入的ES細(xì)胞的細(xì)胞混合物。接著將混合細(xì)胞胚胎轉(zhuǎn)移到雌性替代受體中，在那里胚胎發(fā)育為成活胎兒。當(dāng)核供體和第二ES細(xì)胞采用相同的ES細(xì)胞培養(yǎng)物時(shí)，所得胚胎不是遺傳嵌合的。當(dāng)采用不同的ES細(xì)胞培養(yǎng)物時(shí)，所得胚胎可以是遺傳上嵌合的。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，在核組分轉(zhuǎn)移到去核卵母細(xì)胞后重建的細(xì)胞接受一個(gè)信號，從而活化胚胎在體外的發(fā)育，并如所述進(jìn)行培養(yǎng)。然而，得到的胚胎在體外進(jìn)一步培養(yǎng)，用于衍生細(xì)胞系。在一個(gè)優(yōu)選方案中，根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，將胚胎培養(yǎng)到胚泡期并用于衍生胚胎干(ES)細(xì)胞系或ES細(xì)胞樣系。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，通過變化體外培養(yǎng)條件，誘導(dǎo)用這種方法來源的細(xì)胞系的細(xì)胞沿著指定的途徑進(jìn)行分化。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠誘導(dǎo)ES細(xì)胞或ES樣細(xì)胞分化產(chǎn)生各種細(xì)胞類型的群體，包括但不限于心肌細(xì)胞(Klug等，J.Clin.Invest.98，216
)，神經(jīng)元細(xì)胞(Bain等，Dev.Biol.168，342
)或血細(xì)胞(Wiles和Keller，Development 111，259
)。這種細(xì)胞有巨大的用途，如在組織工程的新興領(lǐng)域(描述在Kaihara和Vacanti，Arch.Surg.134，1184
)。
顯微注射法具有許多優(yōu)點(diǎn)，涉及ES細(xì)胞送遞到去核卵母細(xì)胞中和ES細(xì)胞的隨后重建方面，包括下列優(yōu)點(diǎn)。第一，采用顯微注射法實(shí)施全部或部分核送遞(即部分送遞到去核卵母細(xì)胞和包含核組分(包括染色體組分)的ES核的隨后重建)，可應(yīng)用于大量各種細(xì)胞類型，無論在體外或在體內(nèi)生長，不論其大小、形態(tài)、核供體的發(fā)育階段等。第二，顯微注射法送遞核能夠仔細(xì)控制在核注射時(shí)，共導(dǎo)入到去核卵母細(xì)胞的核供體細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和核質(zhì)體積。當(dāng)外來物質(zhì)對發(fā)育潛能有不利影響時(shí)，這是特別恰當(dāng)?shù)?。第三，顯微注射法送遞核允許仔細(xì)控制在核注射時(shí)，另外的試劑共注射(與供體核共同注射)到卵母細(xì)胞中這些試劑在下示例。第四，顯微注射法送遞核易于允許在活化前，使供體核與去核卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)接觸一段時(shí)間。這種接觸可便于染色質(zhì)改型(remodeling)、重編程或其它轉(zhuǎn)移染色質(zhì)的改變(如母系來源的轉(zhuǎn)錄因子的募集)，這將利于胚胎隨后的發(fā)育。第五，顯微注射法送遞核使隨后活化方案的選擇范圍廣(在一個(gè)實(shí)施方案中，使用Sr2+)；不同的活化方案可能對發(fā)育潛能產(chǎn)生不同的影響。第六，活化可以在微絲干擾劑(在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞松弛素B)存在下進(jìn)行以防止染色體擠出，和在細(xì)胞分化調(diào)節(jié)物(在不同的實(shí)施方案中，二甲基亞砜或9-順-視黃酸)存在下進(jìn)行以促進(jìn)有利的發(fā)育結(jié)果。第七，在一個(gè)方案中，用壓電驅(qū)動的顯微注射法進(jìn)行核送遞，允許快速和有效地處理樣品并因此降低對進(jìn)行操作的細(xì)胞的損傷。損傷降低部分是因?yàn)楣w細(xì)胞核的制備和導(dǎo)入去核卵母細(xì)胞的過程是用相同的注射針實(shí)施的；相比之下，使用傳統(tǒng)顯微注射針，在透明帶取核和卵母細(xì)胞質(zhì)膜穿刺之間至少需要更換一次針。第八，不僅各單個(gè)步驟，而且其相互關(guān)系，是本發(fā)明方法的一個(gè)特征?，F(xiàn)在我們更詳細(xì)地提供這些單個(gè)的步驟并顯示它們在本發(fā)明中彼此之間是如何安排的。
詳細(xì)描述1受體卵母細(xì)胞。卵母細(xì)胞在收獲用于去核和制備用作核轉(zhuǎn)移的受體前，在體內(nèi)的成熟階段對克隆方法的結(jié)果有潛在的影響。供體核可以注射到任何發(fā)育階段的卵母細(xì)胞或它們的祖先細(xì)胞中。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，將核轉(zhuǎn)移到成熟的mII卵母細(xì)胞受體中；這種mII卵母細(xì)胞是被受精精子正?；罨念愋汀Ｂ涯讣?xì)胞細(xì)胞質(zhì)的化學(xué)變化貫穿成熟的過程。這可被中期促進(jìn)因子(MPF)-細(xì)胞周期蛋白B2和cdc2蛋白激酶的二聚復(fù)合體例證。MPF活性高的細(xì)胞處于細(xì)胞周期的中期。例如，在小鼠中，與MPF有關(guān)的細(xì)胞質(zhì)活性在那些停滯在第一次減數(shù)分裂中期(中期I，mI)的未成熟卵母細(xì)胞中最高。然后，隨著第一極體(Pb1)的擠出，MFF活性下降，在第二中期，mII時(shí)再次達(dá)到高水平。在mII期，這些高水平保持不變并使卵母細(xì)胞滯留在mII期，當(dāng)卵母細(xì)胞接受重新開始細(xì)胞周期(活化)的信號，如由受精精子或Sr2+傳遞的信號時(shí)，它快速減少。當(dāng)ES細(xì)胞核注射到mII卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)時(shí)，高M(jìn)PF活性破裂其核被膜，伴隨染色質(zhì)凝聚，導(dǎo)致來自ES細(xì)胞的中期染色體的形成。
可用于本發(fā)明方法的卵母細(xì)胞包括未成熟期卵母細(xì)胞(如帶有完整核，即稱為生發(fā)泡的那些)和成熟期卵母細(xì)胞(即，那些在mII的卵母細(xì)胞)。成熟卵母細(xì)胞可通過，如注射促性腺或其它激素(例如，連續(xù)給予馬和人絨毛膜促性腺激素)來誘導(dǎo)動物超排卵并在排卵后不久(例如，在小鼠動情期開始后13-15小時(shí)，母牛動情期開始后72-96小時(shí)和家貓動情期開始后80-84小時(shí))手術(shù)收獲卵細(xì)胞而得到。
當(dāng)可獲得的卵母細(xì)胞限于未成熟卵母細(xì)胞時(shí)，可以在促進(jìn)成熟培養(yǎng)基中培養(yǎng)它們，直到它們進(jìn)展到mII；這是已知的體外成熟(IVM)。未成熟牛卵母細(xì)胞的IVM方法在WO 98/07841中描述，對于未成熟小鼠卵母細(xì)胞在Eppig和Telfer(Mets.Enzymol.[Academic Press]225，pp.77-84，
)中描述。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，未成熟卵母細(xì)胞可以不經(jīng)IVM用作受體細(xì)胞，如卵母細(xì)胞在去核前可以在體外成熟。
詳細(xì)描述2卵母細(xì)胞去核?？梢杂帽绢I(lǐng)域已知的方法實(shí)施卵母細(xì)胞的去核。優(yōu)選，卵母細(xì)胞在去核前和去核過程中接觸含有微管和/或微絲組裝抑制劑的培養(yǎng)基。含肌動蛋白的微絲或含微管蛋白的微管的破壞給予了細(xì)胞膜和/或下面的皮層細(xì)胞質(zhì)相對的流動性，這樣能夠很容易地將裝在膜內(nèi)的一部分卵母細(xì)胞吸出到移液管中，伴有亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)最低限度的破壞。一個(gè)微絲干擾劑的選擇是細(xì)胞松弛素B(5μ/ml)。合適的微管干擾劑，如諾考達(dá)唑、6-二甲氨基嘌呤和秋水仙堿，也是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。另外的微絲干擾劑包括但不限于，細(xì)胞松弛素D、jasplakinolide、拉春庫林A(latrunculin A)等。
在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，采用壓電驅(qū)動微量移液管吸引實(shí)施mII卵母細(xì)胞的去核。去核顯微外科術(shù)過程中，用常規(guī)固定微量移液管錨定mII卵母細(xì)胞。壓電驅(qū)動去核微量移液管(內(nèi)徑約等于7μm)的平頭尖端接觸透明帶。合適的壓電驅(qū)動裝置在Prime Tech Ltd.(Tsukuba，Ibaraki-ken，日本)以Piezo Micromanipulator/Piezo Impact DriveUnit的名稱出售。該單位利用壓電效果來以高度可控、快速的方式使顯微注射微管尖前進(jìn)一個(gè)短距離(大約0.5μm)。每一脈沖的強(qiáng)度和脈沖間的間隔可被控制單元改變和調(diào)節(jié)。應(yīng)用壓電脈沖(例如，強(qiáng)度＝1-5，速度＝4-16)使微量移液管前進(jìn)(或鉆過)通過透明帶，同時(shí)保持其內(nèi)小的負(fù)壓。這樣，微量移液管尖快速通過透明帶，并前進(jìn)到臨近mII板的位置(它含有染色體-紡錘體復(fù)合體，在幾個(gè)物種的mII卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中可分辯為半透明區(qū)，通常位于第一極體附近)。然后輕輕地敏捷地將含有中期板的卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)以最小體積吸出到顯微注射移液管中，抽出注射移液管(此時(shí)含有mII染色體)。這步的作用是使部分含有mII染色體的卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)被吸出。接著顯微注射移液管被抽出脫離透明帶，在從下一個(gè)卵母細(xì)胞手術(shù)取出染色體前，將染色體釋放到周圍培養(yǎng)基中。適當(dāng)?shù)?，成批卵母?xì)胞可篩選證實(shí)完全去核。對于顆粒狀細(xì)胞質(zhì)的卵母細(xì)胞(如豬、綿羊和貓卵母細(xì)胞)，用DNA特異性熒光染料(例如，Hoeschst 33342)染色并在低強(qiáng)度UV照明下簡單檢測(在一些情況下，用圖像加強(qiáng)視頻監(jiān)視器增強(qiáng))在確定去核效率中是有利的。
mII卵母細(xì)胞的去核可通過其它方法實(shí)施，如在美國專利4,994,384中描述的方法。例如，用與壓電驅(qū)動微量移液管相對的常規(guī)微量移液管顯微手術(shù)進(jìn)行去核?？赏ㄟ^首先用玻璃針沿著10-20％的周緣和接近mII染色體的位置切開卵母細(xì)胞的透明帶來實(shí)施去核。卵母細(xì)胞存在于顯微鏡載物臺上含有細(xì)胞松弛素B的培養(yǎng)基懸滴中。用不銳利傾斜尖的去核移液管取出染色體。
去核后，卵母細(xì)胞等待接受ES細(xì)胞核。優(yōu)選在供體核插入前大約2小時(shí)內(nèi)制備去核細(xì)胞。
詳細(xì)描述3ES細(xì)胞系的制備和維持。ES細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和操作在如Hogan等，Manipulating the mouse embryo.第二版(Cold SpringHarbor Laboratory Press)(1994)中描述。在這里總結(jié)了該描述的要素。
原代小鼠ES細(xì)胞可以從發(fā)育活化(如受精)后至少大約3.5天的擴(kuò)張胚泡分離。胚胎用培養(yǎng)基如DMEM(補(bǔ)充10％胎牛血清和25mM HEPES，pH7.4)從動物的子宮角沖洗出并分別放置到含有預(yù)制飼養(yǎng)細(xì)胞層(下面描述)和1ml ES細(xì)胞培養(yǎng)基的10mm孔組織培養(yǎng)皿中。胚胎培養(yǎng)的初期階段也可以在不含飼養(yǎng)細(xì)胞的ES培養(yǎng)基小懸滴中，少量石蠟油下培養(yǎng)。進(jìn)一步培養(yǎng)1-2天后，胚胎從透明帶中“孵出”并粘附在組織培養(yǎng)皿的表面，以滋養(yǎng)外胚層(TE)譜系細(xì)胞遷移。胚胎粘附后不久，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)變得很容易與TE譜系(滋養(yǎng)層)的細(xì)胞區(qū)分并且生長快速。胚泡培養(yǎng)總共4-5天后，用末端密封的細(xì)巴斯德移液管移出來自ICM的(ES)細(xì)胞。
用胰蛋白酶處理細(xì)胞，將ES細(xì)胞團(tuán)解聚為通常包含3或4個(gè)細(xì)胞的較小組。然后將這些轉(zhuǎn)移到新的飼養(yǎng)細(xì)胞組織培養(yǎng)孔中。原代ES細(xì)胞樣集落可由其形態(tài)學(xué)來辨認(rèn)，如下所述。
在嚴(yán)格生長條件下培養(yǎng)ES細(xì)胞及其遺傳改造的衍生物以使它們保持正常的核型；這對確保它們具有以工作頻率貢獻(xiàn)給功能性生殖細(xì)胞的潛能是必需的。已知次最優(yōu)的培養(yǎng)條件可以產(chǎn)生發(fā)生核型改變、染色體重排和/或增加其生長速度和降低其在體內(nèi)分化能力的其它突變的ES細(xì)胞變異體。最佳的培養(yǎng)條件對培養(yǎng)ES細(xì)胞領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，包括提供必需濃度的營養(yǎng)物和生長因子并避免以很高密度培養(yǎng)細(xì)胞。高密度培養(yǎng)細(xì)胞具有形成團(tuán)的傾向，團(tuán)表面細(xì)胞分化為多能性受限的內(nèi)胚層樣細(xì)胞?？梢愿鶕?jù)標(biāo)準(zhǔn)方法，每隔2-3天以1∶2到1∶6分裂培養(yǎng)物，用蛋白酶胰蛋白酶適度處理使3-4個(gè)細(xì)胞的小組進(jìn)一步分成單個(gè)細(xì)胞，達(dá)到良好的培養(yǎng)密度。培養(yǎng)物中健康ES細(xì)胞典型地以輪廓“光滑”的緊密壓縮群形式生長。集落表面“粗糙”內(nèi)胚層的出現(xiàn)，或細(xì)胞在基層鋪開，是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知的次最優(yōu)培養(yǎng)條件的指征。
所有培養(yǎng)基、添加物等是無內(nèi)毒素的。最常用的培養(yǎng)基是Dulbecco改良Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM)和4.5mg/ml葡萄糖，可選擇地含有1mM的丙酮酸鈉。DMEM是設(shè)計(jì)在5％CO2的空氣中，大約35℃下，提供pH7.2-7.4的碳酸氫鹽緩沖培養(yǎng)基。DMEM通常就在使用前補(bǔ)充(a)2mM谷氨酰胺；0.1mM非必需氨基酸；(c)0.1mM β-巰基乙醇；(d)50μg/ml慶大霉素，或青霉素和鏈霉素各100U/ml，或不含抗生素；(e)15％胎牛血清(FCS；見下)；并可任選，(f)白血病抑制因子(LIF)，也稱分化抑制因子(DIA)(見下)。
對于ES細(xì)胞繼代培養(yǎng)和收獲，用含胰蛋白酶和乙二胺四乙酸(EDTA)混合物(例如，終濃度分別為0.025％和75mM)的無Ca2+-Mg2+的磷酸緩沖鹽水處理，使其從組織培養(yǎng)皿分離下來并彼此分開。
用胎牛血清FCS補(bǔ)充到用于ES細(xì)胞培養(yǎng)的DMEM中。典型地，F(xiàn)CS以15％(v/v)使用。然而，在本發(fā)明方法中，更低濃度(如1-5％)的FCS支持ES細(xì)胞的培養(yǎng)，該細(xì)胞的核能夠指導(dǎo)胎兒和活后代的發(fā)育。而且，這些更低濃度的FCS支持活躍生長的培養(yǎng)物，意味著其中可呈現(xiàn)出處于細(xì)胞周期各個(gè)階段的細(xì)胞，并且它們在本發(fā)明方法中可使用。
白血病抑制因子(LIF)是一種抑制ES細(xì)胞自發(fā)分化的分泌性細(xì)胞因子。它是已知可用于ES細(xì)胞生長的水牛-大鼠-肝(BRL)細(xì)胞條件培養(yǎng)基的活性成分之一。在ES細(xì)胞共培養(yǎng)中，飼養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)活性形式LIF，盡管可用純化LIF補(bǔ)充該培養(yǎng)基。飼養(yǎng)細(xì)胞調(diào)節(jié)的無細(xì)胞培養(yǎng)基不足以支持ES細(xì)胞培養(yǎng)，需要補(bǔ)充，例如純化的LIF(見下)。
盡管在缺乏飼養(yǎng)細(xì)胞的含有LIF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)ES細(xì)胞是可能的，但是大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室依賴飼養(yǎng)層來提供增強(qiáng)ES細(xì)胞的增殖和維持未分化狀態(tài)的因子。最常用的兩種飼養(yǎng)細(xì)胞是用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法從12.5到14.5dpc胚胎中收獲的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEFs)的原代培養(yǎng)物，和STO小鼠成纖維細(xì)胞系，它是SIM小鼠成纖維細(xì)胞的抗硫代鳥嘌呤和烏本苷的亞系。用絲裂霉素C處理或用γ射線輻射制備不有絲分裂的飼養(yǎng)細(xì)胞。
已經(jīng)描述了其它物種的得到ES細(xì)胞樣細(xì)胞的方法，包括牛(Cibelli等，Theriogenology 47，241
)、倉鼠(Doetschman等，Dev.Biol.127，224
)、人(Thomson等，Science 282，1145
)和兔(Schoonjans等，Mol.Reprod.Dev.45，439
)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可將這些方法應(yīng)用于任何適當(dāng)?shù)奈锓N以得到ES細(xì)胞樣細(xì)胞。
詳細(xì)描述4遺傳修飾或基因打靶ES細(xì)胞的制備?？捎帽绢I(lǐng)域已知技術(shù)對ES細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾。優(yōu)選用“基因?qū)ぐ小睂S細(xì)胞進(jìn)行修飾?；?qū)ぐ忻枋隽艘环N將基因組突變以定向非隨機(jī)方式導(dǎo)入的方法。這樣，特定的突變可以被導(dǎo)入到整個(gè)基因組內(nèi)。由于ES細(xì)胞可以用來產(chǎn)生個(gè)體，所以含有定向改變基因的ES細(xì)胞能夠產(chǎn)生包含該定向突變的完整動物。該方法的一個(gè)重要特征-“尋靶構(gòu)建體”的設(shè)計(jì)和構(gòu)建-是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。尋靶構(gòu)建體典型地包括至少一個(gè)非宿主基因組天然的核苷酸序列。非天然序列相當(dāng)于待導(dǎo)入的突變，側(cè)翼有相比之下與宿主基因組中那些區(qū)域高度保守的，如果不等同的話，較大區(qū)域(典型地＞5kbp)。這意味著一旦進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，該保守/等同序列能夠與靶基因組中存在的它們的互補(bǔ)對應(yīng)物發(fā)生同源重組。
為了將突變導(dǎo)入給定ES細(xì)胞類型的基因組中，制備相對純形式的尋靶構(gòu)建體DNA并用下列方法，包括用野生型或重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染等，并優(yōu)選電穿孔(Hogan等，Manipulating the mouseembryo.第二版.[Cold Spring Harbor Laboratory Press]，277-278頁
；Joyner[ed]，Gene targeting.[Oxford University Press]
)，使ES細(xì)胞攝取該DNA。
基因?qū)ぐ械男室蕾囉诳赡苁敲總€(gè)尋靶構(gòu)建體序列、DNA制品或ES細(xì)胞系獨(dú)特的變量的組合。然而，這些僅需要本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)的常規(guī)實(shí)驗(yàn)。例如，效率可受等基因?qū)Ψ堑然駾NA的使用、尋靶構(gòu)建體內(nèi)的互補(bǔ)序列的長度、尋靶DNA和內(nèi)源基因之間序列連續(xù)片段的等同程度、尋靶DNA的每一側(cè)的互補(bǔ)的長度等的影響。產(chǎn)生基因打靶ES細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。適合用于本發(fā)明的示范基因打靶ES細(xì)胞包括但不限于Mombaerts等，Proc.Nad.Acad.Sci.美國，88，3084(1991)；Mombaerts等，Nature 360，225(1992)；Itohara等，Cell 72，337(1993)；美國專利5,859,307等中描述的那些。
詳細(xì)描述5ES細(xì)胞供體核的制備。培養(yǎng)后，用含胰蛋白酶和乙二胺四乙酸(EDTA)(例如，分別以0.025％和75mM的終濃度)混合物的無Ca2+和Mg2+的磷酸緩沖鹽水處理從組織培養(yǎng)皿中分離ES細(xì)胞未匯合培養(yǎng)物并使它們彼此分開。然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至顯微鏡載物臺上含有12％聚乙烯吡咯烷酮的CZB·H培養(yǎng)基懸滴中。
詳細(xì)描述6供體核插入去核卵母細(xì)胞中?？梢圆捎蔑@微注射技術(shù)將核(或至少包括染色體的核組分)直接注射到去核卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。在一個(gè)將來自ES細(xì)胞的核注射到去核卵母細(xì)胞的優(yōu)選方法中，使用壓電驅(qū)動微量移液管，其中可基本使用帶有這里詳述改進(jìn)的上述裝置和技術(shù)(有關(guān)卵母細(xì)胞的去核)。
例如，如前所述制備顯微注射針，使其具有一個(gè)內(nèi)徑大約5μm的平頭尖端。根據(jù)供應(yīng)商的說明，該針在它的針尖附近可以含有汞并位于壓電驅(qū)動裝置中。顯微注射移液管尖部附近存在汞小滴能增加尖部前進(jìn)固有的動量，因此能以可控制方式增加尖穿透能力。含有各自選擇核的顯微注射移液管尖部緊密接觸去核卵母細(xì)胞的透明帶，應(yīng)用幾個(gè)壓電脈沖(應(yīng)用時(shí)用控制器設(shè)置尺度調(diào)節(jié)，可以是強(qiáng)度1-5、速度4-6)來推進(jìn)微量移液管，同時(shí)可選地使其內(nèi)部保持輕微負(fù)壓。當(dāng)移液管尖部通過透明帶，所得帶“核心”被逐至卵周隙，微量移液管中預(yù)選的核前進(jìn)到尖部附近。然后移液管尖部置于質(zhì)膜(卵膜)附近并推進(jìn)(朝向卵母細(xì)胞的相反面)直到幾乎位于卵母細(xì)胞皮質(zhì)的對側(cè)。此時(shí)卵母細(xì)胞質(zhì)膜深深凹入包繞在注射針的尖部。應(yīng)用一到兩個(gè)壓電脈沖(例如，強(qiáng)度1-2、速度1)后，卵膜快速和典型可辨的松弛指示質(zhì)膜在尖部被穿刺。核被排到卵質(zhì)中，帶有最少量(小于等于約1pl)伴隨介質(zhì)。接著，小心撤回微量移液管，在卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中留下了新導(dǎo)入的核。該方法輕快、典型地批處理15-20個(gè)去核卵母細(xì)胞，該卵母細(xì)胞在其它所有時(shí)間保持在培養(yǎng)條件下。
可以使用可供選擇的變型通過常規(guī)顯微注射插入供體核。這種使用常規(guī)顯微注射將精子核插入倉鼠卵母細(xì)胞的一個(gè)方法的描述，在Yanagida，Biol.Reprod.44，440(1991)中描述，其中涉及這種方法的公開在此引入作為參考。
詳細(xì)描述7與核供體共插入發(fā)育調(diào)節(jié)性因子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在供體核與去核卵母細(xì)胞結(jié)合前、結(jié)合過程中或結(jié)合后，可以導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)具有改變胚胎發(fā)育結(jié)果潛能的試劑。例如，核可以與對抗具有假定或已知影響本發(fā)明方法結(jié)果潛能的蛋白的功能調(diào)節(jié)型抗體共同注射。這種分子可以包括但不限于，參與囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白(如突觸結(jié)合蛋白)，那些可以介導(dǎo)染色質(zhì)-卵質(zhì)通訊的蛋白(如DNA破壞細(xì)胞周期關(guān)卡分子如Chk1)，那些在卵母細(xì)胞信號傳導(dǎo)中有推定作用的蛋白(如轉(zhuǎn)錄因子，STAT3)或修飾DNA的蛋白(如DNA甲基轉(zhuǎn)移酶)。這類分子中的成員也可以是用本發(fā)明方法中顯微注射法導(dǎo)入、并且具有與抗體類似的功能調(diào)節(jié)作用的調(diào)節(jié)性藥理學(xué)試劑的(間接)靶標(biāo)?？贵w和藥理學(xué)試劑通過與它們各自的靶分子或它們各自靶分子的配體結(jié)合來發(fā)揮作用。當(dāng)該靶對發(fā)育結(jié)果具有抑制性作用時(shí)，這種結(jié)合降低靶的功能，當(dāng)該靶對發(fā)育結(jié)果有正作用時(shí)，結(jié)合能促進(jìn)那個(gè)功能。作為替代，在克隆方法中重要功能的調(diào)節(jié)可以直接通過注射這些因子(或具有類似活性的因子)，而不是注射與它們結(jié)合的試劑來達(dá)到。
在本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可以在供體核插入前或后，通過顯微注射將核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)導(dǎo)入卵母細(xì)胞中。例如，注射帶有必需的順式作用信號的重組DNA可使居住或共同注射的轉(zhuǎn)錄因子引起重組DNA上存在的序列發(fā)生轉(zhuǎn)錄；編碼蛋白的隨后表達(dá)可以對抑制胚胎發(fā)育的因子具有拮抗作用，或?qū)φ宰饔玫囊蜃泳哂性鰪?qiáng)作用。而且，轉(zhuǎn)錄本可以對編碼減少發(fā)育潛能的蛋白的mRNA具有反義調(diào)節(jié)活性?？晒┻x擇地，這種調(diào)節(jié)可以通過直接送遞具有反義功能(如反義mRNA)的核酸(或其衍生物)來達(dá)到；這排除了在卵母細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生反義調(diào)節(jié)分子的需要。在一個(gè)有利實(shí)施方案中，通過顯微注射進(jìn)行送遞。最后，轉(zhuǎn)錄本可以對早期胚胎中基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)起關(guān)鍵的影響。這種影響也可能被顯微注射能夠影響翻譯的另外分子種類介導(dǎo)。
本發(fā)明方法導(dǎo)入的重組DNA(或環(huán)狀或線性)可以包含含有一個(gè)或多個(gè)表達(dá)的功能性基因的功能性復(fù)制子。該基因可以在一個(gè)或多個(gè)啟動子的控制之下，啟動子的活性可以表現(xiàn)狹窄、寬廣或中等的發(fā)育表達(dá)范圍。例如，僅在早期合子中有活性的啟動子會指導(dǎo)其關(guān)聯(lián)基因立即但短暫的表達(dá)。導(dǎo)入的DNA可以在胚胎發(fā)育期間丟失，或整合在一個(gè)或多個(gè)基因組座位，在所得轉(zhuǎn)基因個(gè)體的整個(gè)生活史中穩(wěn)定復(fù)制。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過顯微注射法將編碼推斷的“抗老化”蛋白，如端粒酶、過氧化物歧化酶或其它氧化保護(hù)蛋白的DNA構(gòu)建體，導(dǎo)入卵母細(xì)胞?？晒┻x擇地，可以直接在那里注射蛋白，如精子因子蛋白。
詳細(xì)描述8重建細(xì)胞發(fā)育的活化。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，接受了供體核的去核卵母細(xì)胞，在活化前，重回培養(yǎng)條件培養(yǎng)0-6個(gè)小時(shí)；這樣，卵母細(xì)胞可以在供體核插入去核卵母細(xì)胞后不超過大約6小時(shí)的任何時(shí)間進(jìn)行活化。我們這里將這個(gè)間隔稱作“潛伏期”。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，潛伏期是1-3個(gè)小時(shí)。活化可以，但不限于，以電的方式，通過注射一種或多種卵母細(xì)胞活化物質(zhì)，或?qū)⒙涯讣?xì)胞轉(zhuǎn)移至含有一種或多種卵母細(xì)胞活化物質(zhì)的介質(zhì)中來進(jìn)行。
能夠提供活化刺激(或活化刺激的組合)的試劑包括，但不限于，來自精子的胞質(zhì)因子(例如負(fù)責(zé)溶解活性(soluble artivity)的蛋白，oscillogen)和某些藥理學(xué)化合物(例如6-二甲氨基嘌呤[DMAP]、IP3和其它信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑)；可以在由供體核插入的細(xì)胞重建前、與重建同時(shí)或重建后，通過顯微注射將這些導(dǎo)入。一種或多種活化刺激可以在重建細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有活化化合物子集一或多個(gè)成員的介質(zhì)后(立即或潛伏期后)提供。這個(gè)子集包括但不限于，Ca2+釋放刺激劑(如咖啡因、乙醇和Ca2+離子載體如A23187和離子霉素)、磷蛋白信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié)劑(如2-氨基嘌呤、星形孢菌素和鞘氨醇)、蛋白合成抑制劑(如A23187和環(huán)己酰胺(cyclohexamide))、DMAP或前述的組合(如DMAP加離子霉素)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通過在含有10mM SrCl2提供的二價(jià)鍶離子Sr2+的無Ca2+CZB培養(yǎng)基中培養(yǎng)1-6個(gè)小時(shí)達(dá)到重建細(xì)胞的活化。
本發(fā)明的活化刺激與供體核的插入同時(shí)或在其后應(yīng)用的實(shí)施方案中，重建細(xì)胞可以在進(jìn)行活化刺激時(shí)或刺激后很快被轉(zhuǎn)移到含有一種或多種微絲干擾劑如含5μg/ml細(xì)胞松弛素B的二甲基亞砜的培養(yǎng)基中；這能抑制胞質(zhì)分裂并因此抑制通過假極體造成的染色體損失。在胞質(zhì)分裂抑制劑存在下培養(yǎng)4-12小時(shí)，但更優(yōu)選6個(gè)小時(shí)。這個(gè)方案優(yōu)選應(yīng)用于含有2C DNA的供體核。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，去核卵母細(xì)胞可以在供體核插入前用上述活化方法活化。接觸活化刺激后，如上所述在2C核注射前培養(yǎng)去核卵母細(xì)胞不超過大約6小時(shí)。在這個(gè)方案中，新導(dǎo)入的染色體快速與前核樣結(jié)構(gòu)聯(lián)合并且不期望與胞質(zhì)分裂防止劑培養(yǎng)抑制假極體排出。
詳細(xì)描述9發(fā)育產(chǎn)生有活力胎兒和后代。重建細(xì)胞被活化產(chǎn)生可經(jīng)體外培養(yǎng)允許發(fā)育的前核、1-細(xì)胞胚胎。當(dāng)該胚胎與胞質(zhì)分裂阻斷劑接觸抑制假極體排出時(shí)，將胚胎轉(zhuǎn)移到缺乏微絲或微管干擾劑的新鮮培養(yǎng)基中。繼續(xù)培養(yǎng)到2-細(xì)胞到桑椹胚/胚泡期，在此時(shí)可將胚胎轉(zhuǎn)移到假孕替代母親的輸卵管或子宮中。
可供選擇地，為了通過增加由單一細(xì)胞重建來源的后代數(shù)量而增加產(chǎn)量，可以分裂胚胎和克隆擴(kuò)增細(xì)胞。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，通過系列核轉(zhuǎn)移用本發(fā)明方法得到的胚胎產(chǎn)生進(jìn)一步的胚胎。為了達(dá)到這點(diǎn)，如上所述活化重建細(xì)胞并允許體外培養(yǎng)發(fā)育。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以在轉(zhuǎn)移到合適的替代母親后在體內(nèi)培養(yǎng)。繼續(xù)培養(yǎng)幾天，優(yōu)選3-5天后，用蛋白酶如胰蛋白酶適度處理，或用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的機(jī)械方法將所得胚胎的細(xì)胞分散開。接著，來自這些胚胎的各個(gè)細(xì)胞被用作核供體；每個(gè)細(xì)胞的核可以被移出并插入到去核卵母細(xì)胞，去核卵母細(xì)胞隨后活化并允許進(jìn)行發(fā)育。上面描述了供體核插入、去核、發(fā)育活化和胚胎培養(yǎng)的方法。
詳細(xì)描述10分化細(xì)胞群的產(chǎn)生。在另外的實(shí)施方案中，用本發(fā)明方法產(chǎn)生的克隆胚胎建立體外ES細(xì)胞樣細(xì)胞培養(yǎng)物。這可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法達(dá)到且在Hogan等，Manipulating the mouse embryo.第二版。(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，265-272(1994)中描述?？梢哉T導(dǎo)這種培養(yǎng)物以指定的方式進(jìn)行分化，因此產(chǎn)生可能無限的特定基因型的豐富細(xì)胞來源。已經(jīng)描述了誘導(dǎo)這種分化的方法獲得豐富的神經(jīng)元細(xì)胞群(Bain等，Dev.Biol.168，342
)、心肌細(xì)胞群(Klug等，J.Clin.Invest.98，216
)和造血細(xì)胞群(Wiles和Keller，Development 111，259
)。作為例子，這允許擴(kuò)增免疫相容細(xì)胞用于移植。該細(xì)胞之所以可以相容，因?yàn)樗鼈兪怯帽景l(fā)明方法從移植受體克隆得到的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對擴(kuò)增細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾，例如，使它們不再表達(dá)免疫監(jiān)視的分子靶標(biāo)，如妨礙非靈長類來源細(xì)胞成功移植到靈長類的Galαl-3Gal部分?？寺碓醇?xì)胞在體外基質(zhì)中的生長為克隆技術(shù)和組織工程之間提供了聯(lián)系(Kaihara和Vacanti，Arch.Surg.134，1184
)。因此，本發(fā)明方法產(chǎn)生的細(xì)胞群在移植醫(yī)學(xué)中有用。這里使用的定義2C，4C細(xì)胞的基因組含量(genomic complement)。1C代表單位基因組，因此定義為“C”。1C代表單倍體復(fù)制前細(xì)胞的基因組，其中每個(gè)座位出現(xiàn)一次。
2n細(xì)胞的二倍體狀態(tài)，“n”是指染色體的單倍體(單位)數(shù)量。
分化細(xì)胞群變得逐漸特化，通常是基因表達(dá)改變的結(jié)果。
克隆動物克隆產(chǎn)生的動物。其核基因組來自單一細(xì)胞的非嵌合后生動物。
克隆核染色體從核供體細(xì)胞轉(zhuǎn)移到居住染色體已被移走的受體細(xì)胞后，生產(chǎn)分化細(xì)胞群；該方法優(yōu)選使用去核卵母細(xì)胞作為受體細(xì)胞。這可發(fā)育這樣的后代，其非線粒體DNA來自單個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞，核供體。
卵卵母細(xì)胞或最近受精的雌性配子。
胚胎卵母細(xì)胞發(fā)育活化后的任何階段，或另一種細(xì)胞類型模擬卵母細(xì)胞活化步驟后的任何階段。
胚胎干(ES)細(xì)胞來自植入前胚胎(胚泡)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)的那些細(xì)胞，具有下列性質(zhì)(i)它們能經(jīng)受長期實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)和保存，(ii)它們保持未分化狀態(tài)，(iii)它們保持2n倍性，(iv)如果與胚胎的細(xì)胞混合并培養(yǎng)形成嵌合胚胎，它們能夠重新開始它們的發(fā)育程序并分化為任何細(xì)胞類型，包括功能性生殖細(xì)胞。ES細(xì)胞展現(xiàn)能被操作的同源重組，如在基因?qū)ぐ兄小?br> ES細(xì)胞樣細(xì)胞來自胚泡ICM的培養(yǎng)細(xì)胞，但ES細(xì)胞性質(zhì)沒有被完全證實(shí)。
胎兒胎盤形成后和足月(后代出生或分娩)前的發(fā)育階段。
活產(chǎn)活后代。
微絲細(xì)胞支架聚合肌動蛋白。
微管包含錨定和定向染色體的微管蛋白亞單位的亞細(xì)胞細(xì)絲。
核整個(gè)核或其一部分，其中核內(nèi)容物至少包括能夠在缺乏任何其它非線粒體基因組的細(xì)胞中指導(dǎo)發(fā)育的最少的物質(zhì)。
后代至少發(fā)育至足月的個(gè)體。
卵母細(xì)胞已經(jīng)歷了減數(shù)分裂第一個(gè)中期并停滯于第二中期(中期II)的雌性配子。因此，卵母細(xì)胞沒有受精但處于可以參與正常受精的發(fā)育階段。卵母細(xì)胞可以排卵后在體內(nèi)產(chǎn)生，或可以是允許隨后在體外成熟的手術(shù)分離的未成熟前體成熟的結(jié)果。
多潛能分化為多種細(xì)胞類型的任何一個(gè)的能力。它典型描述干細(xì)胞。
重建細(xì)胞通過將至少包括核供體細(xì)胞中存在的指導(dǎo)持續(xù)發(fā)育必需的最少套染色體的另外物質(zhì)插入去核卵母細(xì)胞的方法制備的細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，重建細(xì)胞是具有插入其中的ES細(xì)胞核的去核卵母細(xì)胞。
足月完整期限。已經(jīng)歷了胚胎在子宮發(fā)育的全部程序，相當(dāng)于妊娠期。
合子最近受精的雌性配子，也稱為1-細(xì)胞胚胎。
試劑。除非另外說明，所有有機(jī)和無機(jī)化合物是實(shí)驗(yàn)室級別或更高級別的，并購自Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)。一般地除非另外說明，卵母細(xì)胞培養(yǎng)在補(bǔ)充了5.56mM D-葡萄糖的CZB培養(yǎng)基中(Chatot等，1989.J.Reprod Fert.86，679-688)。CZB培養(yǎng)基是81.6mM NaCl、4.8mM KCl、1.7mM CaCl2、1.2mM MgSO4、1.8mM KH2PO4、25.1mM NaHCO3、0.1mM Na2EDTA、31mM乳酸鈉、0.3mM丙酮酸鈉、7U/ml青霉素G、5U/ml硫酸鏈霉素和4mg/ml牛血清白蛋白(BSA)。輸卵管中的排卵卵母細(xì)胞的收集和它們隨后在顯微鏡載物臺上的顯微操作是在修飾的CZB(這里稱為CZB·H)中進(jìn)行的，它是補(bǔ)充20mM Hepes但降低了NaHCO3(5mM)和BSA(3mg/ml)濃度的CZB；CZB·H的pH是7.4。CZB·H中的BSA可以用0.1mg/ml聚乙烯醇(PVA；冷水溶解，平均相對分子量約等于103)替代；BSA和PvA的作用都是降低顯微操作過程中注射移液管壁的粘性。PVA的潤滑效果比BSA持續(xù)更長時(shí)間，這使得在單個(gè)微量移液管重復(fù)用于廣泛顯微操作的過程將其包括在內(nèi)是理想的。適當(dāng)?shù)臅r(shí)候，卵母細(xì)胞或重建細(xì)胞在缺乏CaCl2(即Ca2+)，但補(bǔ)充了誘導(dǎo)卵母細(xì)胞活化的試劑，以及一些情況下，補(bǔ)充了抑制胞質(zhì)分裂的試劑的CZB中培養(yǎng)。
ES細(xì)胞在用于ES細(xì)胞的Dulbecco改良Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM)(Specialty Media，Lavallette，NJ)中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基補(bǔ)充了0.5％-15％(v/v)熱滅活胎牛血清(FCS；HyClone Laboratories，Logan，UT)、100U/ml青霉素-100μg/ml鏈霉素(Specialty Media)、0.2mM L-谷氨酸(Specialty Media)、1％(v/v)非必需氨基酸混合物(SpecialtyMedia)、1％(v/v)2-β巰基乙醇(Specialty Media)、1％(v/v)核苷混合物(Specialty Media)和1000U/ml重組白血病抑制因子(LIF)(GIBCO，Grand Island，NY)。FCS使用前在56℃熱滅活25分鐘。
動物。這些實(shí)施例中使用的動物根據(jù)實(shí)驗(yàn)資源國家研究委員會協(xié)會實(shí)驗(yàn)動物的管理和使用委員會制定的聯(lián)合指南(DHEW公開號[NIH]80-23，1985年修訂)飼養(yǎng)。
實(shí)施例1由成熟建立的ES細(xì)胞系E14制備核供體細(xì)胞這個(gè)實(shí)施例利用成熟建立和可廣泛獲得的ES細(xì)胞系，E14作為用于顯微注射給去核小鼠卵母細(xì)胞的核來源。E14細(xì)胞系來自小鼠胚泡129/Ola株(Hooper等，Nature 326，292
)。129/Ola親本株是A(野灰色)基因純合的，具有灰鼠毛色，這反映了其cchp/cchp基因型(灰鼠毛色是柔和的黃色)。ES細(xì)胞系E14來自這種小鼠株之一；129/Ola，來自Edinburgh，UK的Martin Hooper博士的實(shí)驗(yàn)室。為了通過后代毛色識別由ES細(xì)胞核克隆的后代，需要選擇卵母細(xì)胞供體并飼養(yǎng)毛色與ES細(xì)胞來自的小鼠株不同的母本株。在一個(gè)方案中，E14細(xì)胞的核(遺傳上是灰鼠)被轉(zhuǎn)移到去核B6D2F1卵母細(xì)胞(遺傳上是黑色)中，在轉(zhuǎn)移到CD-1替代母親(遺傳上是白色)中后允許重建細(xì)胞發(fā)育。
低傳代E14細(xì)胞等分試樣(即傳代少于11次的細(xì)胞)在1990年獲得并在三個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步培養(yǎng)，共進(jìn)行了31-39次傳代。這里報(bào)道的實(shí)施例中E14細(xì)胞的選擇被它們在產(chǎn)生基因?qū)ぐ行∈?Mombaerts等，Proc.Nad.Acad.Sci.美國，88，3084
；Mombaerts等，Nature 360，225
；Itohara等，Cell 72，337
；Rodriguez等，Cell 87，199
)中的相當(dāng)大有用性所支持。因此，E14細(xì)胞被證明在種系嵌合體的產(chǎn)生中是有效的，從這些種系嵌合體已建立了基因?qū)ぐ行∈笃废怠14培養(yǎng)物典型地呈現(xiàn)從大約10μm到大約18μm的細(xì)胞直徑范圍。無理論上的限制，推測小細(xì)胞(大約10μm到大約12μm)很可能在S期前并因此含有2C基因組含量(在2n染色體中)，以及較大細(xì)胞(大約16μm到大約18μm)通常在S期后，可能含有2-4C DNA(2n染色體)。
ES細(xì)胞在“用于ES細(xì)胞的DMEM”(Specialty Media，Phillipsburg，NJ)中生長，其中補(bǔ)充了0.5-15％(v/v)熱滅活胎牛血清(FCS)(Hyclone)、1000U白血病抑制因子(LIF)/ml(Gibco)，和下列試劑(Specialty Media)1％(v/v)青霉素-鏈霉素、1％(v/v)L-谷氨酰胺、1％(v/v)非必需氨基酸、1％(v/v)核苷和1％(v/v)β巰基乙醇。每隔24小時(shí)將細(xì)胞以1∶3或1∶4分裂，這反映了大約12小時(shí)的細(xì)胞周期期限，適當(dāng)?shù)臅r(shí)候，在用絲裂霉素C處理的來自胚胎13.5天小鼠的原代胚胎成纖維細(xì)胞的飼養(yǎng)層上進(jìn)行培養(yǎng)。在這些情況下，顯微操作前，ES細(xì)胞在無飼養(yǎng)條件下培養(yǎng)至少一周；到核轉(zhuǎn)移的時(shí)候，培養(yǎng)物中檢測不到飼養(yǎng)細(xì)胞。
在缺乏飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下ES細(xì)胞在補(bǔ)充15％(v/v)FCS和1000U/mlLIF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。如期望在低[FCS]中生長，則逐步降低FCS的濃度。在5％(v/v)FCS的濃度下，與在15％(v/v)時(shí)細(xì)胞幾乎同樣活躍地分裂，幾乎沒有明顯分化。然而，當(dāng)FCS濃度是4％(v/v)或更低時(shí)，細(xì)胞生長明顯地緩慢。當(dāng)細(xì)胞在有0.75％或0.5％(v/v)FCS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，發(fā)生了廣泛細(xì)胞死亡，這種條件可能造成某些類型細(xì)胞“饑餓”并使它們退出了細(xì)胞周期(即進(jìn)入G0期)。
為從培養(yǎng)物中制備單個(gè)ES細(xì)胞懸液，首先用磷酸緩沖鹽水(PBS)洗滌細(xì)胞。隨后用含胰蛋白酶(0.025％[w/v])和乙二胺四乙酸二鈉(EDTA；0.75mM)在無Ca2+/Mg2+PBS中的混合物使細(xì)胞彼此之間以及和培養(yǎng)容器之間分開。接著通過輕微離心(2000g，5分鐘)和重懸(兩次在DMEM中，一次在PBS中)洗滌細(xì)胞三次，并以大約107/ml的濃度重懸于PBS培養(yǎng)基中。
ES細(xì)胞核收集前不超過2天(但通常在收集前立即)，將一滴大約2μl ES細(xì)胞懸液與補(bǔ)充了12％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)(平均相對分子量，3.6×105)的20μl CZB·H混合；這里我們稱之為CZB·H-PVP。將混合物轉(zhuǎn)移到顯微鏡載物臺上進(jìn)行顯微操作。
卵母細(xì)胞的去核。卵母細(xì)胞去核是通過吸入到用MB-U型裝置(PrimeTech Ltd.，Tsukuba，Ibaralci-ken，日本)經(jīng)壓電驅(qū)動(piezo-actuation)已前進(jìn)通過卵母細(xì)胞透明帶的微量移液管(內(nèi)徑6μm)中而完成的。這個(gè)裝置使用壓電效應(yīng)來使微量移液管尖部以高速度每個(gè)脈沖前進(jìn)非常短的距離(大約0.5μm)。脈沖的強(qiáng)度和速度由控制器來調(diào)節(jié)，對于透明帶穿刺典型設(shè)置分別是2和4。
從雌性、8-12周齡的B6D2F1小鼠的輸卵管收集成熟卵母細(xì)胞，其中5U妊娠母馬血清促性腺激素(PMSG)和5U人絨毛膜促性腺激素(hCG)分別在卵母細(xì)胞收集前64和13-16小時(shí)，腹膜內(nèi)系列給予該小鼠，使其超量排卵。卵母細(xì)胞立即置于含有0.1％(w/v)牛睪丸透明質(zhì)酸酶(300U/mg，ICN Biochemicals Inc.，Costa Mesa，CA)的CZB·H中，25-30℃處理5-10分鐘，使其從周圍卵丘細(xì)胞中分離出來。通過使用移液管作系列轉(zhuǎn)移在CZB·H(無透明質(zhì)酸酶)中洗滌無卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞四次。洗過的卵母細(xì)胞隨后保持在一滴在水飽和的4％(在空氣中v/v)CO2中37℃下平衡的CZB(10-30μl)中，置于礦物油(E.R.Squibb and Sons，Princeton，NJ)下，預(yù)備用于顯微操作。
將無卵丘卵母細(xì)胞群(通常15-20個(gè))轉(zhuǎn)移到顯微鏡載物臺上含有5μg/ml細(xì)胞松弛素B的一小滴CZB·H中。用帶孔移液管抵住進(jìn)行顯微手術(shù)的卵母細(xì)胞，向去核移液管施加幾個(gè)壓電脈沖后，透明帶被“去核”。mII染色體-紡錘體復(fù)合體(可辨認(rèn)的半透明區(qū))被吸出到移液管中，帶有最少量的卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)。相對高溫(達(dá)到30℃)使mII板更容易辨認(rèn)，原因是其半透明度增加。一組中所有卵母細(xì)胞去核(大約花費(fèi)10分鐘)后，將它們轉(zhuǎn)移到無細(xì)胞松弛素B的CZB中并在那里37℃保持不超過2小時(shí)后，再返回到顯微鏡載物臺進(jìn)行進(jìn)一步操作。
用顯微注射法將ES細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到去核卵母細(xì)胞中。這里，將ES細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到如上所述制備的去核卵母細(xì)胞中。最好使用與卵母細(xì)胞去核時(shí)相同的微量移液管進(jìn)行這種轉(zhuǎn)移。
為了將供體核顯微注射給去核卵母細(xì)胞，使用塑料皿(100mm×15mm；Falcon Plastics，Oxnard，CA，catalogue no.1001)的蓋(深度大約5mm)制成顯微注射室。一排或多排液滴，每排由兩個(gè)圓形小滴以及一個(gè)延長滴組成并沿著皿中線排列。第一個(gè)小滴(大約2μl；直徑2mm)，用于顯微注射移液管洗滌，是CZB·H-PVP。第二個(gè)小滴(大約2μl；直徑2mm)含有存在于CZB·H-PVP中的核供體細(xì)胞懸液。第三個(gè)(延長的)小滴(大約6μl；2×6mm)，用于去核的卵母細(xì)胞，是CZB·H。將整個(gè)皿，包括小滴，浸于礦物油(Squibb)中。將皿放置到裝備了Hoffman對比光調(diào)節(jié)器的倒置顯微鏡的載物臺上，準(zhǔn)備用于顯微操作。
供體細(xì)胞核顯微注射給卵母細(xì)胞是通過壓電驅(qū)動顯微注射達(dá)到的。取出ES供體細(xì)胞的核，每個(gè)核被輕輕吸入和擠出顯微注射移液管(內(nèi)徑大約7μm)，直到它們的核中基本上見不到細(xì)胞質(zhì)的物質(zhì)。這是為了使核組分不含細(xì)胞質(zhì)污染物。有些情況下，需要實(shí)施少量(典型的是1次)壓電脈沖(低強(qiáng)度設(shè)置下)打破供體細(xì)胞的質(zhì)膜。當(dāng)核膜破裂，非染色體的核質(zhì)成分能被洗掉。
5-10分鐘內(nèi)將分離到移液管中的每個(gè)核顯微注射到各去核卵母細(xì)胞。在微量移液管被移入含有去核卵母細(xì)胞的小滴中前，在微量移液管中收集幾個(gè)細(xì)胞(典型地多達(dá)7個(gè))的核形成一行裸核通常能加速核轉(zhuǎn)移過程。
去核卵母細(xì)胞被置于顯微鏡載物臺上一滴含有5μg/ml細(xì)胞松弛素B的CZB中。去核卵母細(xì)胞的透明帶抵住帶孔移液管的尖部并應(yīng)用輕吸力將其固定在適當(dāng)位置。然后，注射移液管的尖部向透明帶前進(jìn)，并使其緊密接觸透明帶。用幾個(gè)壓電脈沖(如，強(qiáng)度1-2，速度1-2)來推進(jìn)移液管，同時(shí)保持其內(nèi)部輕度負(fù)壓。當(dāng)移液管尖部通過透明帶，注射移液管內(nèi)產(chǎn)生的圓柱形核心帶物質(zhì)被擠到卵周隙中。接著，注射移液管內(nèi)(典型地含有多達(dá)7個(gè)快速連續(xù)收獲的核)最前的供體核被推進(jìn)，直到它接近針尖。然后，移液管又被機(jī)械推進(jìn)直到其尖部幾乎到達(dá)卵母細(xì)胞皮層的對側(cè)。這使去核卵母細(xì)胞質(zhì)膜(卵膜)產(chǎn)生了一個(gè)深的凹陷。接著，應(yīng)用1或2個(gè)壓電脈沖(典型的強(qiáng)度1-2，速度1)穿刺凹陷的卵膜，ES細(xì)胞核組分被擠到卵質(zhì)中，伴隨的介質(zhì)＜1pl。然后輕輕撤回移液管，核留在卵質(zhì)內(nèi)。每個(gè)去核卵母細(xì)胞注射一個(gè)核。用這個(gè)方法在10-15分鐘內(nèi)，典型顯微注射大約15-20個(gè)去核卵母細(xì)胞。所有注射在室溫進(jìn)行，通常在25-30℃的范圍。
卵母細(xì)胞活化。ES細(xì)胞培養(yǎng)物典型地含有處于不同細(xì)胞周期階段的細(xì)胞，一些含有2n細(xì)胞典型的2C含量DNA，另一些已經(jīng)經(jīng)歷了DNA合成(S期)的復(fù)制循環(huán)，以致它們含有這個(gè)量的兩倍(4C DNA)，準(zhǔn)備進(jìn)行細(xì)胞分裂。DNA含量的差異是本發(fā)明方法預(yù)期的，因此需要在核轉(zhuǎn)移后對重建細(xì)胞進(jìn)行不同的處理。處于不同細(xì)胞周期階段的細(xì)胞間的區(qū)別(如不同的DNA含量)在下面描述；這里我們將相對小直徑細(xì)胞(10-12μm，稱作“小”)與2C DNA以及相對大直徑細(xì)胞(16-18μm，稱作“大”)與4C DNA聯(lián)系起來。
相當(dāng)于已接受來自小ES細(xì)胞的核的卵母細(xì)胞的重建細(xì)胞在CZB中(礦物油下，在空氣中4％v/v CO2飽和濕度，37℃下平衡)，孵育1-3個(gè)小時(shí)。接著，將這些細(xì)胞移到含10mM SrCl2和5.1/ml細(xì)胞松弛素B(從二甲基亞砜[DMSO]中的100×原液加入)的無Ca2+CZB中孵育6小時(shí)。這種處理誘導(dǎo)發(fā)育的活化，同時(shí)防止胞質(zhì)分裂，并且因此，防止染色體以假第二極體形式損失。6小時(shí)后，細(xì)胞轉(zhuǎn)移到缺乏Sr2+/細(xì)胞松弛素B的新鮮CZB培養(yǎng)基中，并在37℃，在空氣中4％v/v CO2及飽和濕度下繼續(xù)培養(yǎng)。因此，6小時(shí)后沒有抑制S期完成后的正常減數(shù)分裂。
相當(dāng)于已接受來自大ES細(xì)胞的核的卵母細(xì)胞的重建細(xì)胞在CZB中(礦物油下，在空氣中4％v/v CO2及飽和濕度，37℃下平衡)，孵育多達(dá)2個(gè)小時(shí)?；罨芭囵B(yǎng)將允許在刺激減數(shù)分裂和胞質(zhì)分裂重新開始前，功能性地完成有利的大分子成分(如紡錘體微管)的合成。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含10mM SrCl2的無Ca2+CZB中，在空氣中4％v/v CO2及飽和濕度下37℃1小時(shí)，啟動減數(shù)分裂的重新開始(活化)。注意這個(gè)培養(yǎng)基不含細(xì)胞松弛素B或任何其它阻斷胞質(zhì)分裂的試劑。因此，這些活化的細(xì)胞排出了假第二極體。既然ES供體細(xì)胞的轉(zhuǎn)移核含有4C DNA，后來的姐妹染色單體分離和染色體丟失應(yīng)當(dāng)使胚胎恢復(fù)至2C的基因組DNA含量。
活化后，重建細(xì)胞接著被轉(zhuǎn)移到新鮮CZB中，在空氣中4％v/v CO2及飽和濕度下，37℃進(jìn)行胚胎培養(yǎng)。這種方法產(chǎn)生的胚胎在活化后大約5小時(shí)，通常具有2個(gè)假前核和一個(gè)假第二極體。
基于細(xì)胞周期狀態(tài)選擇ES核供體細(xì)胞。我們推測小細(xì)胞處于G1期(2C DNA)，而大細(xì)胞相對于處于G2/M期的那些細(xì)胞(S期后，4C DNA)。這提供了一個(gè)快速和無損傷的細(xì)胞倍性的計(jì)量方法。通過使用經(jīng)改造含有可無破壞性測定的報(bào)道基因衍生物(如突變的綠色熒光蛋白，EGRP)的ES細(xì)胞系(該報(bào)道基因衍生物處于指導(dǎo)細(xì)胞周期階段診斷性轉(zhuǎn)錄的啟動子控制之下)，能夠增強(qiáng)這種評定。這種啟動子的實(shí)例包括那些指導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白D(限于細(xì)胞周期的G1期)或細(xì)胞周期蛋白B2(限于細(xì)胞周期的M期)轉(zhuǎn)錄的啟動子。該報(bào)道蛋白含有定向破壞序列(破壞盒)如長存于細(xì)胞周期蛋白中的序列。這確保了其半衰期短暫，且它的存在反映了啟動子活性(因此反映細(xì)胞周期階段)而不是蛋白的壽命。當(dāng)報(bào)道基因是EGRP時(shí)，通過用長波長的表面熒光顯微鏡術(shù)檢查，可容易并無損傷地將處于特定細(xì)胞周期階段的細(xì)胞從非同步培養(yǎng)物中鑒定出來；只有那些細(xì)胞周期階段特異性啟動子活動的細(xì)胞具有熒光，使得可立即鑒定并選擇它們作為核轉(zhuǎn)移的供體。
最后，我們使Rl ES細(xì)胞接觸微管干擾劑諾考達(dá)唑(Sigma)3μg/ml12小時(shí)。這種方法處理的培養(yǎng)物與未處理的培養(yǎng)物相比，發(fā)生了戲劇性的改變，出現(xiàn)了許多圓形和漂浮的細(xì)胞。這種處理的作用是通過防止細(xì)胞完成中期，使ES細(xì)胞培養(yǎng)物同步。這種細(xì)胞的基因組含量是4C，因?yàn)樗鼈円淹瓿闪薙期無減數(shù)循環(huán)的復(fù)制DNA合成。
胚胎轉(zhuǎn)移。在一滴CAB(10-30μl)中(礦物油下(Squibb)，在水飽和的4％(在空氣中v/v)CO2中37℃下平衡)，培養(yǎng)3.5-4天后，檢測桑椹胚/胚泡，并且適當(dāng)?shù)臅r(shí)候，轉(zhuǎn)移到受體白化病CD1雌性小鼠的子宮角中，該小鼠在3天前與切除輸精管的CD-1雄性小鼠交配；這在胚胎發(fā)育和子宮內(nèi)膜的發(fā)育間建立了協(xié)調(diào)。雌性或者允許分娩并撫養(yǎng)它們的替代后代，或者在交配(coitum)后19.5天通過剖腹產(chǎn)分娩幼畜并給予幼畜合適的哺乳母親的照顧。實(shí)施例2用ES細(xì)胞核克隆進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)，其中用來自各種ES細(xì)胞系的細(xì)胞核顯微注射去核卵母細(xì)胞，用最初來自小鼠自交和F1系的成熟建立的細(xì)胞系示例。我們描述了核供體ES細(xì)胞在各種條件下培養(yǎng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)所產(chǎn)生的后代，并進(jìn)一步用不同倍性的供體細(xì)胞證明了本發(fā)明的方法。
核轉(zhuǎn)移到去核卵母細(xì)胞后ES細(xì)胞染色體的命運(yùn)。在實(shí)驗(yàn)系列1(圖2)中，接受E14核的去核卵母細(xì)胞沒有進(jìn)行活化刺激。因此這種重建卵母細(xì)胞停滯在mII。在小細(xì)胞的核顯微注射后2-4小時(shí)我們作了檢查，51％的重建卵母細(xì)胞具有以分散形式排列的凝聚染色體。相比之下，用來自大細(xì)胞的核注射的68％卵母細(xì)胞具有以規(guī)律陣列排列的凝聚染色體，類似在成熟中期II卵母細(xì)胞中母系來源的染色體。
在實(shí)驗(yàn)系列2(圖3)，我們在核轉(zhuǎn)移后給重建細(xì)胞作活化刺激(鍶離子，Sr2+)。預(yù)期小和大細(xì)胞DNA含量的潛在差異，因此我們對每種細(xì)胞型所用的核轉(zhuǎn)移方案進(jìn)行了修改。用小細(xì)胞的核重建的卵母細(xì)胞在核顯微注射后約4小時(shí)，從CZB培養(yǎng)基中移走，并置于含有Sr2+(為了活化它們)和細(xì)胞松弛素B(為了防止胞質(zhì)分裂)的培養(yǎng)基中。我們包括了細(xì)胞松弛素B，是因?yàn)樵谒狈r(shí)，供體染色體將被半隨機(jī)地?cái)D出成為假第二極體，產(chǎn)生無活力的亞二倍體胚胎。我們由小細(xì)胞核產(chǎn)生的胚胎中，活化后約6小時(shí)檢測有78％含有兩個(gè)假前核(圖3)，推測是由于細(xì)胞內(nèi)染色體在假前核形成前常常形成2個(gè)簇。
相比之下，用大ES細(xì)胞的核重建的每個(gè)卵母細(xì)胞的活化都在細(xì)胞松弛素B缺乏下進(jìn)行，因?yàn)槲覀兺普摷俚诙O體的胞質(zhì)分裂擠出預(yù)期會在許多這種情況下使重建細(xì)胞重新建立正常的2C DNA含量。我們注意到在細(xì)胞松弛素B缺乏下活化后，68％的1-細(xì)胞胚胎含有單一假前核并釋發(fā)出假第二極體(圖3)。
由E14細(xì)胞克隆的小鼠的足月發(fā)育。圖4總結(jié)了實(shí)驗(yàn)系列3得到的結(jié)果，其中用來自不同大小的E14細(xì)胞的核重建1765個(gè)卵母細(xì)胞并在不同濃度的FCS存在下生長。我們沒有發(fā)現(xiàn)證據(jù)表明培養(yǎng)基中FCS的濃度對ES細(xì)胞核指導(dǎo)發(fā)育為桑椹胚/胚泡期的能力有顯著的影響。
小細(xì)胞的核轉(zhuǎn)移后，17％的活化卵母細(xì)胞產(chǎn)生了桑椹胚/胚泡。轉(zhuǎn)移到合適的替代母親后，62％的所得胚胎被植入，在活化后20天(dpa)產(chǎn)生了9個(gè)胎兒；通過剖腹切開分娩了4個(gè)活后代，5個(gè)胎兒在15-17dpa停止發(fā)育。
一個(gè)活產(chǎn)仔由于缺乏代孕母親而安樂死，2個(gè)在分娩后24小時(shí)死亡。一個(gè)小鼠(稱作“Hooper”)存活，是灰色毛色和粉紅色眼睛的雄性。這些特性是預(yù)知的，因?yàn)镋14是來自雄性129/Ola小鼠品系的XY細(xì)胞系；129/Ola小鼠具有灰色毛色和粉紅色眼睛。所有發(fā)育至足月的小仔也是無著色眼睛的雄性。Hooper與CD-1雌性交配時(shí)產(chǎn)下三窩仔，共33只表面正常的仔。
大細(xì)胞核轉(zhuǎn)移后，37％成功活化的卵母細(xì)胞在體外培養(yǎng)3.5天后，發(fā)育至桑椹胚/胚泡期。在被轉(zhuǎn)移的胚胎中，67％植入到子宮中。在20dpa，剖腹切開將一個(gè)完全長大、表面正常仔和3個(gè)死胎兒(在15-17dpa停止發(fā)育)移出。我們從ES細(xì)胞來源克隆小鼠的胎盤和Hooper的耳活檢物分離了基因組DNA，并對樣本進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)分析，尋找多態(tài)性標(biāo)記和Y染色體特異性基因Zfy的存在。這些分析進(jìn)一步證實(shí)了克隆仔的E14起源。
這些效率的大小意味著本發(fā)明的方法易于重復(fù)。然而，與發(fā)明的補(bǔ)充實(shí)施方案聯(lián)合可以進(jìn)一步增強(qiáng)該方法的效率，在補(bǔ)充實(shí)施方案中胚胎是由ES細(xì)胞和根據(jù)本發(fā)明方法核轉(zhuǎn)移產(chǎn)生的來自ES細(xì)胞的胚胎細(xì)胞的混合物形成的。
從R1 ES細(xì)胞核轉(zhuǎn)移后胚胎的發(fā)育。在實(shí)驗(yàn)系列4(圖5)中，我們用來自F1雜種129/Sv×129/Sv-CP的細(xì)胞系R1實(shí)施了1087個(gè)核轉(zhuǎn)移。FCS濃度對克隆結(jié)果沒有明顯的影響。然而，R1細(xì)胞的克隆效率明顯高于E14細(xì)胞。從314個(gè)轉(zhuǎn)移的桑椹胚/胚泡得到了26個(gè)活產(chǎn)克隆仔(8.3％)。PCR分析支持它們的克隆起源。
因?yàn)榇驟14細(xì)胞的核，在適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)條件下，能夠支持轉(zhuǎn)移后的所有發(fā)育，所以在第五個(gè)實(shí)驗(yàn)系列(系列5)中，我們用R1細(xì)胞進(jìn)行了類似實(shí)驗(yàn)。這里，代替了簡單選擇大R1細(xì)胞，在核轉(zhuǎn)移前，我們使培養(yǎng)物接觸諾考達(dá)唑12小時(shí)，使培養(yǎng)物中細(xì)胞同步處于M期，使得它們含有4CDNA。所得后代的比例與小R1細(xì)胞相應(yīng)的值沒有明顯的差異。出生了三個(gè)活產(chǎn)克隆。這進(jìn)一步提示核供體倍性或細(xì)胞周期階段都不是克隆中關(guān)鍵的參數(shù)。實(shí)施例3用基因打靶ES細(xì)胞的核進(jìn)行克隆本方法的有用性通過其在從含有定向突變的ES細(xì)胞系產(chǎn)生后代中的用途而闡明。
基因打靶ES細(xì)胞的產(chǎn)生。包含定向突變的ES細(xì)胞系來自E14。該系(Zheng和Mombaerts描述；提交發(fā)表)是用M72→VRi2-IRES-tauGFP構(gòu)建體電穿孔E14細(xì)胞，隨后如所描述(Mombaerts等，Cell 87，675
)進(jìn)行培養(yǎng)而產(chǎn)生的。一個(gè)攜帶該突變的所得細(xì)胞系，T15，在胚泡注射后產(chǎn)生了軀體組織和種系廣泛集群的嵌合體。因此，我們估計(jì)了這個(gè)系提供本發(fā)明克隆方法中的核供體的能力。
由基因打靶E14細(xì)胞系T15克隆小鼠的發(fā)育。選擇小T15細(xì)胞(估計(jì)平均直徑大約12μm和2n倍性、2C)并如上所述將它們的核轉(zhuǎn)移產(chǎn)生重建細(xì)胞。T15這樣核轉(zhuǎn)移后，成功重建了252個(gè)細(xì)胞并在體外培養(yǎng)。培養(yǎng)3.5天后，91個(gè)(36％)已發(fā)育至桑椹胚/胚泡期。它們轉(zhuǎn)移到假孕代孕母親使發(fā)育繼續(xù)。
剖腹切開交配(coitum)后19.5天的代孕母親，顯示8個(gè)死胎(轉(zhuǎn)移胚胎的9％)和一個(gè)活產(chǎn)克隆。這表明來自含有定向突變的細(xì)胞的核可用來通過這里描述的本發(fā)明的方法克隆產(chǎn)生后代。實(shí)施例4ES細(xì)胞樣細(xì)胞的獲得胚胎可以通過體外受精或自然交配和收獲而產(chǎn)生。植入前胚胎在體外至胚泡期的發(fā)育是在Gardner等，F(xiàn)ertil.Steril.69，84(1998)描述的G1.2或G2.2培養(yǎng)基中進(jìn)行。用兔抗BeWo細(xì)胞的抗血清免疫外科分離所選胚泡的ICM的細(xì)胞，如前所述(Thomson等，Proc.Nad.Acad.Sci.美國92，7844
；Solter和Knowles，Proc.Nad.Acad Sci.美國72，5099
)。細(xì)胞各自鋪到含有預(yù)先形成的輻射小鼠胚胎成纖維細(xì)胞層和1ml培養(yǎng)基的10mm孔組織培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)基由80％Dulbecco改良Eagle’s培養(yǎng)基(無丙酮酸鹽，高葡糖配方；Gibco-BRL)，補(bǔ)充20％FCS(Hyclone)、1mM谷氨酰胺、0.1mM β-巰基乙醇(Sigma)和1％非必需氨基酸貯液(GIBCO-BRL)組成。
進(jìn)一步培養(yǎng)9-15天后，通過接觸含有1mM乙二胺四乙酸(EDTA)的無Ca2+和Mg2+的磷酸緩沖鹽水，或接觸分散酶，或用巴斯德移液管機(jī)械分散，把來自內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的生長暈分成含有3或4個(gè)細(xì)胞的小團(tuán)。該較小的團(tuán)轉(zhuǎn)移到新鮮飼養(yǎng)細(xì)胞組織培養(yǎng)孔中。進(jìn)一步生長后，選擇形態(tài)均勻未分化的獨(dú)立集落并重新鋪板如前所述。
據(jù)其形態(tài)學(xué)可鑒定的原代ES細(xì)胞樣集落，通過接觸IV型膠原酶(1mg/ml；GIBCO-BRL)或用巴斯德移液管選擇單個(gè)集落后進(jìn)行傳代和擴(kuò)增。
已知次最優(yōu)培養(yǎng)條件可產(chǎn)生經(jīng)歷核型改變、染色體重排和/或增加其生長速率并減少其在體內(nèi)分化能力的其它突變的ES細(xì)胞變異體。傳代2-7次時(shí)對每個(gè)ES細(xì)胞樣系進(jìn)行核型分析，丟棄核型異常的那些系。
最佳培養(yǎng)條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。所有培養(yǎng)基、補(bǔ)充物、塑料器具等應(yīng)該不含內(nèi)毒素。已經(jīng)描述了牛(Cibelli等，Theriogenology47，241
)、倉鼠(Doetschman等，Dev.Biol.127，224
)、人(Thomson等，Science 282，1145
)和兔(Schoonjans et al.，Mol.Reprod.Dev.45，439
)的ES細(xì)胞樣培養(yǎng)物的衍生。
這里引用的所有專利和參考文獻(xiàn)通過參考文獻(xiàn)的方式引入。我們進(jìn)一步通過參考文獻(xiàn)的方式特別引入了Wakayama等，ProceedingNational Academy of Sciences，美國，96(26)14984-14989(1999年12月21日)的全部。
權(quán)利要求
1.克隆胚胎的方法，包括步驟(a)收集培養(yǎng)細(xì)胞的核；(b)將(a)的核或其包括染色體的至少一部分顯微注射到去核卵母細(xì)胞中，重建細(xì)胞；和(c)允許重建細(xì)胞進(jìn)行胚胎發(fā)育。
2.權(quán)利要求
1的方法，其中顯微注射是壓電驅(qū)動的顯微注射。
3.權(quán)利要求
1的方法，其中允許胚胎發(fā)育為活后代。
4.權(quán)利要求
3的方法，其中允許所得胚胎發(fā)育為活后代的步驟進(jìn)一步包括將該胚胎轉(zhuǎn)移給雌性替代受體的分步。
5.權(quán)利要求
1的方法，其中培養(yǎng)細(xì)胞是胚胎干(ES)細(xì)胞。
6.權(quán)利要求
5的方法，其中ES細(xì)胞來自ES細(xì)胞系。
7.權(quán)利要求
6的方法，其中ES細(xì)胞系來自F1小鼠系。
8.權(quán)利要求
7的方法，其中ES細(xì)胞系是R1。
9.權(quán)利要求
6的方法，其中ES細(xì)胞系來自近交小鼠系。
10.權(quán)利要求
9的方法，其中ES細(xì)胞系是E14。
11.權(quán)利要求
1的方法，其中培養(yǎng)細(xì)胞是ES細(xì)胞樣細(xì)胞。
12.權(quán)利要求
9的方法，其中ES細(xì)胞樣細(xì)胞來自選自靈長類動物、綿羊、牛、豬、熊、貓、山羊、犬、馬、cetids、嚙齒類動物、鳥類、兩棲動物、爬行動物和魚類的動物。
13.權(quán)利要求
1的方法，其中培養(yǎng)細(xì)胞是胚胎生殖(EG)細(xì)胞。
14.權(quán)利要求
12的方法，其中EG細(xì)胞來自選自靈長類動物、綿羊、牛、豬、熊、貓、山羊、犬、馬、cetids和嚙齒類動物如鼠的哺乳動物。
15.權(quán)利要求
15的方法，其中哺乳動物是豬。
16.權(quán)利要求
1的方法，其中步驟(a)中的細(xì)胞核具有2n染色體。
17.權(quán)利要求
1的方法，其中步驟(a)中的細(xì)胞核含有2-4C基因組DNA。
18.權(quán)利要求
1的方法，其中步驟(a)中的細(xì)胞被遺傳改變。
19.權(quán)利要求
18的方法，其中遺傳改變是通過基因?qū)ぐ羞M(jìn)行的。
20.權(quán)利要求
16的方法，其中細(xì)胞核來自ES細(xì)胞。
21.權(quán)利要求
17的方法，其中細(xì)胞核來自ES細(xì)胞。
22.權(quán)利要求
18的方法，其中遺傳改變的細(xì)胞是ES細(xì)胞。
23.權(quán)利要求
22的方法，其中遺傳改變是通過基因?qū)ぐ羞M(jìn)行的。
24.權(quán)利要求
1的方法，其中步驟(b)中的去核卵母細(xì)胞停滯在第二次減數(shù)分裂的中期。
25.權(quán)利要求
1的方法，進(jìn)一步包括在細(xì)胞核或其一部分插入前、或插入過程中、或插入后活化卵母細(xì)胞的步驟。
26.權(quán)利要求
25的方法，其中活化步驟發(fā)生在插入步驟后大約0-6小時(shí)。
27.權(quán)利要求
25的方法，其中活化步驟發(fā)生在細(xì)胞核或其一部分插入后大約1-3小時(shí)。
28.權(quán)利要求
25的方法，其中活化步驟包括電活化或接觸化學(xué)活化劑。
29.權(quán)利要求
28的方法，其中化學(xué)活化劑選自乙醇、精子胞質(zhì)因子、卵母細(xì)胞受體配體肽模擬物、Ca2+釋放藥理學(xué)刺激劑、Ca2+離子載體、鍶離子、磷蛋白信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié)劑、蛋白合成抑制劑或它們的組合。
30.權(quán)利要求
28的方法，其中化學(xué)活化劑選自咖啡因、Ca2+離子載體A23187、乙醇、2-氨基嘌呤、星形孢菌素、鞘氨醇、環(huán)己酰胺、離子霉素、6-二甲氨基嘌呤、精子攜帶的可溶性卵母細(xì)胞活化因子-I(SOAF-Is)或它們的組合。
31.權(quán)利要求
28的方法，其中活化劑包含Sr2+。
32.權(quán)利要求
1的方法，進(jìn)一步包括在插入步驟(b)前或后一段時(shí)間間隔中，干擾卵母細(xì)胞中微管和/或微絲組裝的步驟。
33.權(quán)利要求
32的方法，其中時(shí)間間隔是大約0-6小時(shí)。
34.權(quán)利要求
32的方法，其中微管組裝被諾考達(dá)唑或二甲氨基嘌呤抑制。
35.權(quán)利要求
32的方法，其中微絲組裝被細(xì)胞松弛素B、細(xì)胞松弛素D、jasplakinolide、拉春庫林A或它們的組合干擾。
36.權(quán)利要求
1的方法，其中步驟(b)進(jìn)一步包括將除了細(xì)胞核部分以外的試劑插入到所述卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。
37.權(quán)利要求
34的方法，其中試劑選自外源蛋白、外源蛋白的衍生物、抗體、藥理學(xué)試劑和它們的組合。
38.權(quán)利要求
37的方法，其中試劑是外源核酸或核酸衍生物。
39.克隆得到分化細(xì)胞的方法，包括步驟(a)收集ES細(xì)胞的核；(b)將包括染色體的ES細(xì)胞核的至少一部分顯微注射到去核卵母細(xì)胞中，形成重建細(xì)胞；(c)活化前，培養(yǎng)重建細(xì)胞0-6小時(shí)；(d)活化重建細(xì)胞的發(fā)育；和(e)允許重建細(xì)胞發(fā)育。
40.權(quán)利要求
39的方法，其中步驟(a)的核是2C。
41.權(quán)利要求
39的方法，其中步驟(a)的核是2-4C。
42.權(quán)利要求
39的方法，其中進(jìn)一步允許步驟(e)的重建細(xì)胞發(fā)育為胚胎。
43.權(quán)利要求
39的方法，其中活化步驟(d)包括接觸化學(xué)活化劑。
44.權(quán)利要求
43的方法，其中活化劑包括Sr2+。
45.權(quán)利要求
43的方法，其中接觸進(jìn)行不超過大約6小時(shí)的一段時(shí)間。
46.權(quán)利要求
39的方法，其中活化步驟(d)在微管和/或微絲組裝抑制劑存在下進(jìn)行。
47.權(quán)利要求
45的方法，其中微管和/或微絲組裝抑制劑包含細(xì)胞松弛素B。
48.克隆得到分化細(xì)胞的方法，包括步驟(a)收集細(xì)胞的核；(b)將包括染色體的(a)的細(xì)胞核的至少一部分顯微注射到去核卵母細(xì)胞中，形成重建細(xì)胞；(c)允許重建細(xì)胞發(fā)育為桑椹胚/胚泡；(d)收集ES細(xì)胞；(e)將(d)的ES細(xì)胞導(dǎo)入(c)的桑椹胚/胚泡中；(f)允許(e)的重建胚胎發(fā)育。
49.權(quán)利要求
48的方法，其中進(jìn)一步允許步驟(f)的重建細(xì)胞發(fā)育為成活胚胎。
50.權(quán)利要求
48的方法，其中步驟(a)的細(xì)胞是ES細(xì)胞。
51.權(quán)利要求
50的方法，其中ES細(xì)胞是在體外培養(yǎng)的。
52.權(quán)利要求
48的方法，其中步驟(a)的細(xì)胞是與步驟(d)的ES細(xì)胞來自相同培養(yǎng)物的ES細(xì)胞。
53.權(quán)利要求
1的方法產(chǎn)生的分化細(xì)胞。
54.權(quán)利要求
1的方法產(chǎn)生的動物，其核染色體來自培養(yǎng)細(xì)胞的核。
55.權(quán)利要求
54的方法產(chǎn)生的動物，其中培養(yǎng)細(xì)胞是ES細(xì)胞。
56.權(quán)利要求
54的動物，其中ES細(xì)胞包含重組DNA且所得動物包含該重組DNA。
57.權(quán)利要求
54的動物，其中重組DNA是基因組整合的。
58.權(quán)利要求
57的動物，其中重組DNA通過基因?qū)ぐ袑?dǎo)入。
59.權(quán)利要求
57的動物，其中動物選自哺乳動物、兩棲動物、魚類和鳥類。
60.權(quán)利要求
57的動物，其中動物是哺乳動物。
61.權(quán)利要求
60的動物，其中哺乳動物選自靈長類動物、綿羊、牛、豬、熊、貓、山羊、犬、馬、cetids和鼠。
62.權(quán)利要求
61的動物，其中哺乳動物是小鼠。
63.權(quán)利要求
61的動物，其中哺乳動物是豬。
64.權(quán)利要求
61的動物，其中哺乳動物是母牛。
65.調(diào)節(jié)胚胎學(xué)發(fā)育的方法，包括步驟(a)將ES細(xì)胞的核與去核卵母細(xì)胞組合形成重建細(xì)胞；(b)在組合步驟之前、或過程中、或之后，將試劑插入到卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中；和(c)允許試劑處理的重建細(xì)胞發(fā)育。
66.權(quán)利要求
65的方法，其中進(jìn)一步允許步驟(c)的重建細(xì)胞發(fā)育為成活胚胎。
67.權(quán)利要求
65的方法，其中步驟(b)的試劑選自外源蛋白、外源蛋白的衍生物、抗體、藥理學(xué)試劑、和外源核酸、外源核酸的衍生物，或它們的組合。
68.權(quán)利要求
65的方法，其中ES細(xì)胞含有正常DNA量的兩倍。
69.權(quán)利要求
68的方法，其中顯微注射是壓電驅(qū)動的顯微注射。
70.權(quán)利要求
1的方法，其中將所得胚胎解離，并允許其細(xì)胞分化成一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞系。
71.權(quán)利要求
1的方法，其中細(xì)胞系是心肌細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞或造血細(xì)胞。
72.權(quán)利要求
70的方法產(chǎn)生的細(xì)胞。
專利摘要
提供了一種核轉(zhuǎn)移方法,其中核DNA整個(gè)或部分被注射到去核卵母細(xì)胞中。該方法適合于不同的供體核,并優(yōu)選ES細(xì)胞。
文檔編號C12N5/10GKCN1423522SQ00818200
公開日2003年6月11日 申請日期2000年12月20日
發(fā)明者安東尼·C·F·佩里, 彼得·蒙伯特斯, 和歌山輝彥 申請人:安東尼·C·F·佩里, 彼得·蒙伯特斯, 和歌山輝彥導(dǎo)出引文