專利名稱:水稻黃單胞hrf1基因重組載體及轉(zhuǎn)基因植物育種方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明“水稻黃單胞hrf1基因重組載體及轉(zhuǎn)基因植物育種方法”屬于生物技術(shù)領(lǐng)域：
，專用于通過植物基因工程技術(shù)改善植物抗病性和其他有益生產(chǎn)性狀。
(二)技術(shù)背景1.基因hrf存在于水稻黃單胞(Xanthomonas oryzae)兩個致病變種(pv.oryzae和pv.oryzicola)和其他黃單胞細菌(Xanthomonas spp.)中，屬于過敏反應(yīng)和致病性(hypersensitive response andpathogenicity，hrp)基因簇成員。大多數(shù)革蘭氏陰性植物病原細菌都有hrp基因簇，其中編碼誘導(dǎo)植物產(chǎn)生過敏反應(yīng)的蛋白質(zhì)(Harpin)的基因各不相同。目前已對革蘭氏陰性4個屬植物病原細菌中的hrp基因簇進行了全序列測定，并依據(jù)基因簇的結(jié)構(gòu)，操縱子的組成和調(diào)節(jié)基因的共線性關(guān)系等特征將已知的4種類型hrp基因簇分為兩組。第I組包括梨火疫歐文氏菌(E.amylovora)和丁香假單胞(Pseudomonas syringae pv.syringae)；第II組包括青枯拉爾氏菌(Ralstonia solanacearum)和甘蘭黑腐黃單胞(Xanthomonas campestris pv.campestris)。關(guān)于編碼harpins的基因，在梨火疫病菌中是hrpN，在丁香假單胞中是hrpZ，在青枯拉爾氏菌中是pop1，在水稻白葉枯病菌(X.oryzae pv.oryzae)中是hrf1。不同植物病原細菌來源的編碼Harpins基因的序列比較發(fā)現(xiàn)，獲得hrf1基因的代表菌株為水稻黃單胞白葉枯致病變種的JXOIII，這一菌株為公知公用菌株(陳功友等.2001，水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzae)化學(xué)誘變hrp基因突變體及相關(guān)性狀的研究，植物病理學(xué)報.31(3)199～207)。
作為hrp基因簇成員hrf1對致病性有調(diào)節(jié)作用，但體外表達的蛋白質(zhì)產(chǎn)物具有誘導(dǎo)抗病性、抗蟲性和促進植物生長等有益效應(yīng)。Hrf1基因編碼的蛋白質(zhì)HarpinXo具有Harpin蛋白家族的特征蛋白質(zhì)親水性，對熱穩(wěn)定，等電點為酸性4.3左右。與報道的Harpins蛋白家族成員HarpinEa和HarpinPss不同之處在于HaprinXo含有一個半胱氨酸，氨基酸殘基中有GGG-GG重復(fù)單元，3～5μg/ml可誘導(dǎo)植物產(chǎn)生細胞編程死亡(PCD)。本課題組的前一個發(fā)明“一種編碼植物生長調(diào)節(jié)劑的基因表達產(chǎn)物及其用途”(專利申請?zhí)?0135403.5；公開號CV 1300547A)已對從水稻黃單胞白葉枯致病變種(X.oryzae pv.oryzae)中獲得的hrf1基因及其表達產(chǎn)物HarpinXoo在體外直接應(yīng)用即以制劑形式進行浸種、拌種、蘸根和葉面噴霧以及用hrf1基因構(gòu)建重組微生物的應(yīng)用進行了專利保護。
以hrf1基因的表達產(chǎn)物HarpinXoo作為制劑在植物體外直接噴霧后，可以激活植物防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)酶，如苯丙氨酸解氨酶(PAL)、過氧化物酶(PO)和多酚氧化酶(PPO)的活性，同時誘導(dǎo)病程相關(guān)蛋白基因如PR-1b和PR-1a基因的表達。其中PR-1b基因受茉莉酸分子的調(diào)控，PR-1a受水楊酸分子的調(diào)控(Eyal et al.，1993，Ohshima et al.，1990)。其中茉莉酸和水楊酸作為信號分子在誘導(dǎo)植物抗蟲、抗病性中起作用。另外，在番茄上使用時，還能啟動pto介導(dǎo)的信號反應(yīng)，其中pti4/5/6和效應(yīng)基因PR-1a1、PR-1b1、NP24、Pin2在不同時間有不同程度的增強表達。
作為與hrpN同類，但其蛋白質(zhì)產(chǎn)物明顯不同的水稻黃單胞編碼HarpinXo的基因hrpA可能在植物基因工程中作為目的基因有應(yīng)用價值。植物基因工程是以具有明確功能的外源基因作為目的基因，通過一定的技術(shù)路線轉(zhuǎn)化植物后，隨機整合到植物基因組中，使其在植物體內(nèi)表達，來改善植物的抗病、抗蟲和其他有益性狀。如蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)殺蟲蛋白(ICP)可以作為生物制劑噴灑植物進行害蟲防治，基因轉(zhuǎn)化棉花后，轉(zhuǎn)基因棉花對棉鈴蟲也有抗性(A 01N63/02 CN 95113498.1A)；抗菌肽(Cecropin)基因轉(zhuǎn)化煙草、馬鈴薯和水稻后，轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)對這些植物上的細菌病害有抗性(賈士榮，1993)。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)還可以改善作物品質(zhì)如耐貯性、耐鹽性、氨基酸品質(zhì)和植物脂質(zhì)等。作為Harpin基因家族的一個成員，來自梨火疫病菌(Erwinia amylovora)的編碼HarpinEa的基因hrpN已在美國研發(fā)生物農(nóng)藥Messenger中成功應(yīng)用，作為目的基因用于轉(zhuǎn)基因馬鈴薯和蘋果，分別對馬鈴薯晚疫病(Phytophthora infestans)和梨火疫病(Erwinia amylovora)的抗病性有不同程度的改善。但是hrf1基因還沒有在植物轉(zhuǎn)基因育種工程技術(shù)中的得到應(yīng)用。目前也沒有有關(guān)以hrf基因為目的基因的hrf基因轉(zhuǎn)基因育種方法的報道。
技術(shù)方案本發(fā)明所提供的一種水稻黃單胞hrf1基因重組載體是通過以下方法構(gòu)建而成1)hrf1基因序列如序列表SEQ ID NO.1所示2)hrf1基因作為目的基因構(gòu)建在植物表達的Ti-質(zhì)粒雙元載體pBI121上用于構(gòu)建雙元轉(zhuǎn)化—表達載體的質(zhì)粒的是由T-DNA改造而來，其中除T-DNA 25bp重復(fù)序列(LB和RB)，胭脂堿合成酶基因的啟動子(P-nos)和終止子(T-nos)外，還有在原核生物(細菌)中作為選擇標(biāo)記使用的nptI和在真核生物(植物)中作為選擇標(biāo)記使用的nptII，用于選擇的抗生素均為Km和G-418；另外在pBI121中還有在真核生物表達的花椰菜花葉病毒的啟動子35S(p35S)和β-葡糖醛酸酶(Gus)基因uidA；作為目的基因使用的hrf1基因插入在pBI121質(zhì)粒的p35S和uid之間的多酶切克隆位點上，所用內(nèi)切酶為XbaI和BamHI，即為重組載體。
本發(fā)明所提供的水稻黃單胞hrf1基因重組載體的轉(zhuǎn)基因植物育種方法為3)構(gòu)建的雙元轉(zhuǎn)化重組載體質(zhì)粒pBI121∷hrf1，可以直接轉(zhuǎn)化于含vir區(qū)輔助質(zhì)粒不帶Km抗性的pTiBo542衍生質(zhì)粒的感受態(tài)根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105中；也可以用含pBI121∷hrf1的大腸桿菌DH5α，在幫助質(zhì)粒pRK2013存在情況下，通過三親交配轉(zhuǎn)移到EHA105中。EHA105是EHA101(C58/pTiBo542)的Km敏感衍生株。
4)同時含有輔助質(zhì)粒pTiBo542(Kms)和轉(zhuǎn)化質(zhì)粒(pBI121∷hrf1)的根癌土壤桿菌EHA105用于植物細胞的轉(zhuǎn)化，重組根癌土壤桿菌轉(zhuǎn)化植物細胞的方法用葉碟法、胚轉(zhuǎn)化法或花粉管導(dǎo)入方法。
5)外植體在含Km的植物再生培養(yǎng)基中篩選被轉(zhuǎn)化的再生植株(T0代)T1代種子催芽時用Km(150μg/ml)浸泡12小時進行篩選轉(zhuǎn)化植株，對T1代植株按株系檢測轉(zhuǎn)化頻率以及植株中hrf1基因的表達。
6)轉(zhuǎn)化株系的檢測方法用PCR和Southern印跡雜交法檢測轉(zhuǎn)化植株葉片中hrf1基因和P-35S啟動子，hrf1基因的表達用定量RT-PCR方法檢測植株葉片中hrf1基因的RNA的積累。
根癌土壤桿菌EHA105為公知公用菌株，基因重組轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化細胞的植株再生方法為轉(zhuǎn)基因植物的常規(guī)方法(Sambrook J，Russell D.W.，2001，Molelcular cloning，A LaboratoryManual(3rded)，Spring Harbor Laboratory Press；聞偉剛、王金生，2001，水稻白葉枯病菌harpin基因的克隆與表達，植物病理學(xué)報，31(4)295～300)。
有益效果 本發(fā)明提供了一種水稻黃單胞hrf1基因重組載體及轉(zhuǎn)基因植物育種方法，突破了hrf1基因還沒有在植物轉(zhuǎn)基因育種工程技術(shù)中的得到應(yīng)用的現(xiàn)狀，首次將hrf基因構(gòu)建在植物表達的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，以雙元轉(zhuǎn)化—表達載體pBI121∷hrf1轉(zhuǎn)化植物及hrf1基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導(dǎo)的方法，轉(zhuǎn)化水稻、煙草獲得了轉(zhuǎn)基因植株。在溫室和大田鑒定轉(zhuǎn)基因植株的抗病性對植物上的真菌病害、細菌病害和病毒病害的抗病性均有明顯增強。試驗表明，hrf1基因轉(zhuǎn)基因水稻的T1代對稻瘟病免疫和高抗的單株各占20％，對水稻白葉枯病表現(xiàn)中抗的單株約占15％，與對照相比，防病效果分別達到80～100％和70～80％。水稻的轉(zhuǎn)Harpin基因植株還表現(xiàn)耐弱光、耐低溫、株型矮化、多分蘗等優(yōu)良生產(chǎn)性狀。hrf1基因轉(zhuǎn)基因煙草的T1代植株90％以上表現(xiàn)出抗煙草花葉病毒(TMV)，煙草青枯病細菌(Ralstonia solanacearum)和煙草赤星病菌(Alternaria alternata)3種病害，達到高抗和中抗水平，效果分別為84％、70％和54％。在轉(zhuǎn)基因植物株系可以檢測到GST1、PR-1a、PR-1b等防衛(wèi)相關(guān)基因的表達，而在親本品系中不表達。已獲得hrf1轉(zhuǎn)基因棉花、小麥、玉米和番茄，并檢測到hrf1基因和相關(guān)防衛(wèi)基因的表達。


圖1 35S∷hrf1基因重組載體構(gòu)建圖HHindIII；SSphI；PPstI；XXbaI；BBamHI；SmSmaI；SaSacI；EEcoRI
雙元轉(zhuǎn)化—表達載體pBI121∷hrf1轉(zhuǎn)化植物及hrf1基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達構(gòu)建的雙元轉(zhuǎn)化載體質(zhì)粒pBI121∷hrf1，可以直接轉(zhuǎn)化含vir區(qū)輔助質(zhì)粒不帶Km抗性的pTiBo542衍生質(zhì)粒的感受態(tài)根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105中。EHA105是EHA101(C58/pTiBo542)的Km敏感衍生株。也可以用含pBI121∷hrf1的大腸桿菌DH5α，在幫助質(zhì)粒pRK2013存在情況下，通過三親交配轉(zhuǎn)移到EHA105中。同時含有輔助質(zhì)粒pTiBo542(Kms)和轉(zhuǎn)化質(zhì)粒(pBI121∷hrf1)的根癌土壤桿菌EHA105用于植物細胞的轉(zhuǎn)化。重組根癌土壤桿菌轉(zhuǎn)化植物細胞的方法用葉碟法、胚轉(zhuǎn)化法或花粉管導(dǎo)入方法。外植體在含Km的植物再生培養(yǎng)基中篩選被轉(zhuǎn)化的再生植株(T0代)。T1代種子催芽時用Km(150μg/ml)浸泡12小時進行篩選轉(zhuǎn)化植株。
對T1代植株按株系檢測轉(zhuǎn)化頻率以及植株中hrf1基因的表達。轉(zhuǎn)化株系的檢測方法是用PCR和Southern印跡雜交法檢測轉(zhuǎn)化植株葉片中hrf1基因和P-35S啟動子，hrf1基因的表達用定量RT-PCR方法檢測植株葉片中hrf1基因的RNA的積累。
根癌土壤桿菌EHA105為公知公用菌株，基因轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化細胞的植株再生方法為轉(zhuǎn)基因植物的常規(guī)方法。(Clark MS，1997，Plant Molecular Biology，A Laboratory Manual，Springer，Berlin Germany)。2.hrf1基因轉(zhuǎn)基因水稻的表型特征將1所得到的hrf1基因轉(zhuǎn)基因水稻的T1代種子分別播種在溫室和病害流行區(qū)隔離田塊中，用人工接種和誘發(fā)行感染法測定hrf1基因轉(zhuǎn)基因水稻株系對稻瘟病(Magnaporthe grisea)和水稻白葉枯病(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)的抗病型。人工接種法用常規(guī)噴霧(稻瘟病菌)和剪葉接種法(白葉枯病菌)。誘發(fā)行感染法是用稻瘟病菌人工噴霧接種感病品種秈優(yōu)63，發(fā)病后移栽到病害鑒定圃的四周及畦間。畦面寬1.8米，株行距均為15厘米。誘發(fā)行水稻中病斑上的孢子可以隨風(fēng)雨均勻隨機傳播。感病株系和出發(fā)品種100％被感染發(fā)病。通過34個轉(zhuǎn)基因水稻株系約3000個單株的鑒定結(jié)果，對稻瘟病免疫和高抗的單株各占20％，對水稻白葉枯病表現(xiàn)中抗的單株約占15％，與對照相比，防病效果分別達到80～100％和70～80％。用于轉(zhuǎn)基因的親本水稻品種有優(yōu)質(zhì)粳稻R109，秈稻3103和雜交稻恢復(fù)系明恢63。除抗病表型有明顯改善外，轉(zhuǎn)基因株系還表現(xiàn)明顯的耐弱光、耐低溫和株型矮化等特點。轉(zhuǎn)基因水稻品系命名為轉(zhuǎn)hrp基因抗優(yōu)稻(Harice)。
進行抗病性鑒定的水稻白葉枯病菌和稻瘟病菌均為公知公用。轉(zhuǎn)基因親本水稻品種R109、3103和明恢63是生產(chǎn)上使用的品種，公知公用。
3.hrf1基因轉(zhuǎn)基因煙草的表型特征將1所得到的hrf1基因轉(zhuǎn)基因煙草的T1代種子，播種在溫室盆缽中，2葉期單株移栽至直徑20厘米的盆缽中，4～5片真葉時人工接種煙草花葉病毒(TMV)，煙草青枯病細菌(Ralstonia solanacearum)和煙草赤星病菌(Alternaria alternata)。TMV接種用葉面摩擦接種，青枯病用細菌懸浮液莖注射法，赤星病菌用孢子懸浮液液滴法葉面接種。轉(zhuǎn)基因煙草株系T1代種子經(jīng)Km(150μg/ml)篩選后的植株90％以上表現(xiàn)出抗以上3種病害，達到高抗和中抗水平，效果分別為84％、70％和54％。但其他性狀與親本煙草品種Xanthi(nc)相同。轉(zhuǎn)Harpin基因煙草品系命名為轉(zhuǎn)Hrp基因抗優(yōu)煙(Hartob)。
進行煙草抗病性鑒定的煙草花葉病毒、青枯病細菌和赤星病菌在田間經(jīng)常發(fā)生，為公知公用。
表達hrf1基因的轉(zhuǎn)基因植物品系啟動植物防衛(wèi)反應(yīng)的特征從水稻T1代植株中有約70％的單株，煙草T1植株中有95％的單株可以用PCR和Southern印跡雜交方法檢測到hrf1基因的全長插入序列和外源p35S啟動子。hrf1基因轉(zhuǎn)基因水稻和煙草的轉(zhuǎn)基因品系T1代植株均不表現(xiàn)細胞編程死亡(PCD)現(xiàn)象。用定量RT-PCR方法測定hrf1基因和抗病防衛(wèi)相關(guān)基因表達，PCR、Southern印跡雜交和RT-PCR方法是分子生物學(xué)常規(guī)研究方法。在轉(zhuǎn)基因植物株系可以檢測到GST1、PR-1a、PR-1b等防衛(wèi)相關(guān)基因的表達，而在親本品系中不表達。
運用相同方法，已獲得hrf1轉(zhuǎn)基因棉花、小麥、玉米和番茄，并檢測到hrf1基因和相關(guān)防衛(wèi)基因的表達。
雙元載體pBI121和根癌土壤菌EHA105，水稻品種R109，明恢63，煙草品種Xanthi(nc)；公知公用。
作為目的基因使用的hrf1基因來源菌株JXOIII公知公用(陳功友等，2001，水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)化學(xué)誘變hrp基因突變體及相關(guān)性狀的研究，植物病理學(xué)報，31(3)199～207)。
權(quán)利要求
1.一種水稻黃單胞hrf1基因重組載體是通過以下方法構(gòu)建而成(1)hrf1基因序列如序列表SEQ ID NO.1所示(2)以hrf1基因作為目的基因構(gòu)建在植物表達的Ti-質(zhì)粒雙元載體pBI121上用于構(gòu)建雙元轉(zhuǎn)化—表達載體的質(zhì)粒的是由T-DNA改造而來，其中除T-DNA 25bp重復(fù)序列(LB和RB)，胭脂堿合成酶基因的啟動子P-nos和終止子T-nos外，還有在原核生物(細菌)中作為選擇標(biāo)記使用的nptI和在真核生物(植物)中作為選擇標(biāo)記使用的nptII，用于選擇的抗生素均為Km和G-418；另外在pBI121中還有在真核生物表達的花椰菜花葉病毒的啟動子35S(p35S)和β-葡糖醛酸酶(Gus)基因uidA；作為目的基因使用的hrf1基因插入在pBI121質(zhì)粒的p35S和uid之間的多酶切克隆位點上，所用內(nèi)切酶為XbaI和BamHI，即獲得基因重組載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的水稻黃單胞hrf1基因重組載體，其特征在于，Ti-質(zhì)粒雙元載體指的是Ti-質(zhì)粒雙元載體pBI121。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1或2所述的水稻黃單胞hrf1基因重組載體，其轉(zhuǎn)基因植物育種的方法為將構(gòu)建的雙元轉(zhuǎn)化重組載體質(zhì)粒pBI121∷hrf1直接轉(zhuǎn)化于含vir區(qū)輔助質(zhì)粒、不帶卡那霉素抗性的pTiBo542衍生質(zhì)粒的感受態(tài)根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105中；也可以用含pBI121∷hrf1的大腸桿菌DH5α，在幫助質(zhì)粒pRK2013存在情況下，通過三親交配轉(zhuǎn)移到EHA105中；1)轉(zhuǎn)化植物細胞同時含有輔助質(zhì)粒pTiBo542(Kms)和轉(zhuǎn)化質(zhì)粒(pBI121∷hrf1)的根癌土壤桿菌EHA105用于植物細胞的轉(zhuǎn)化，方法為葉碟法、胚轉(zhuǎn)化法或花粉管導(dǎo)入方法；2)外植體在植物再生培養(yǎng)基中篩選被轉(zhuǎn)化的再生植株(T0代)T1代種子催芽時用150μg/ml Km浸泡12小時進行篩選轉(zhuǎn)化植株，對T1代植株按株系檢測轉(zhuǎn)化頻率以及植株中hrf1基因的表達篩選被轉(zhuǎn)化的再生植株；3)轉(zhuǎn)化株系的檢測用PCR和Southern印跡雜交法檢測轉(zhuǎn)化植株葉片中hrf1基因和P-35S啟動子，hrf1基因的表達用定量RT-PCR方法檢測植株葉片中hrf1基因的RNA的積累，即獲得轉(zhuǎn)化株系。
4.根據(jù)權(quán)利要求
3所述的水稻黃單胞hrf1基因重組載體轉(zhuǎn)基因植物育種的方法，其特征在于用農(nóng)桿菌介導(dǎo)感染法或花粉管導(dǎo)入法獲得轉(zhuǎn)基因品系。
專利摘要
本發(fā)明水稻黃單胞hrf1基因重組載體及轉(zhuǎn)基因植物育種方法屬于生物技術(shù)領(lǐng)域：
。以hrf1基因作為目的基因構(gòu)建在植物表達的Ti－質(zhì)粒雙元載體pBI121上，獲得基因重組載體，將構(gòu)建的重組載體pBI121∷hrf1轉(zhuǎn)化于EHA105中；轉(zhuǎn)化植物細胞，外植體在植物再生培養(yǎng)基中篩選被轉(zhuǎn)化的再生植株(T
文檔編號C12N15/31GKCN1451754SQ02157213
公開日2003年10月29日 申請日期2002年12月23日
發(fā)明者王金生, 邵敏, 董漢松, 陳功友, 高學(xué)文, 李平, 楊春 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan