專利名稱:中國對蝦抗菌肽基因的重組表達與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物基因工程技術領域：
中重組表達和純化等技術，具體涉及對蝦抗菌肽(對蝦素)基因表達、表達產(chǎn)物純化與活性測定等技術，屬于分子生物學技術領域：
。
抗菌肽是20世紀70年代研究昆蟲免疫系統(tǒng)時發(fā)現(xiàn)的一類具有抗菌特性的小分子多肽。昆蟲抗菌肽具有分子量小、熱穩(wěn)定高、水溶性好、殺菌力強、抗菌譜廣等優(yōu)點，對細菌、真菌、病毒、腫瘤細胞均有明顯的殺傷作用，而對正常真核細胞無毒害作用。這就使得研究人員對抗菌肽產(chǎn)生了濃厚的興趣，并在誘導釋放、抗菌機理、結(jié)構(gòu)功能、重組表達等各個方面進行了深入的研究。
水產(chǎn)養(yǎng)殖品種生活于富含各種各樣微生物的水環(huán)境中，長期的生存適應使其形成了有效的防衛(wèi)功能。抗菌肽被認為是魚、蝦、貝等防御系統(tǒng)的主要成分之一。對水產(chǎn)養(yǎng)殖品種抗菌肽的分離純化并研究其結(jié)構(gòu)與功能，進而通過基因工程技術在原核細胞、真核細胞或某些藻類中重組表達，將有希望成為對付水產(chǎn)養(yǎng)殖品種主要病原菌特別是耐藥菌或病毒的新型藥物。
同屬甲殼綱的蝦類抗菌肽的研究起步較晚。法國貝車瑞(Bachere)教授實驗室對凡納對蝦抗菌肽(對蝦素)進行了系統(tǒng)研究1997年他們從養(yǎng)殖的凡納對蝦(Penaeusvannamei)的血細胞和血漿中分離了3種抗菌肽，稱為對蝦素1，2和3(penaeidin-1，2 and 3)，具有抗真菌、細菌尤其是革蘭氏陽性菌的活力，參見戴斯特謬克司等的“對蝦素-從凡納對蝦分離得到的抗菌肽的一個新家族”，刊于生物化學雜志，1997年272卷，28398-28406頁(Destoumieux D，Bulet P，Loew D，et al.Penaeidins，a new familyof antimicrobial peptides isolated from the shrimp Penaeus vannamei(Decapoda).J.Biol.Chem.，1997，27228398～28406)。戴斯特謬克司-卡森等又在凡納對蝦(Litopenaeus vannamei)和南美白對蝦(Litopenaeus stylirostris)中發(fā)現(xiàn)了具有嚴格抗真菌活性的3種于陰離子抗菌肽。該文的題目為“微生物誘導產(chǎn)生的來自對蝦血藍蛋白C-末端的的抗真菌肽”發(fā)表在生物化學雜志2002年276卷47070-47077頁(Destoumieux-Garzon D，Saulniner D，Garnier Jet al.Crustacean Immunityantifungal peptides are generated from the c terminus of shrimp hemocyanin inresponse to microbial challenge.J.Biol.Chem.2001，276，47070-47077)。戴斯特謬克司將編碼對蝦素成熟肽的基因克隆到PCRscript SK(+)載體，并轉(zhuǎn)化到釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，進行表達和抗菌活性分析，發(fā)現(xiàn)基因工程合成的抗菌肽與天然抗菌肽在結(jié)構(gòu)上雖有差異，但活性相似。參見戴斯特謬克司等刊于歐洲生物化學雜志1999年266卷第335-346頁的文章，題目為“來自對蝦的抗菌肽，對蝦素的重組表達和活性研究”(Deatoumieux D，Bulet P，Strub J M，et al.Recombinantexpression and range of activity of penaeidins，antibacterial peptides frompenaeid shrimp.Eur J Biochem，1999，266335～346)。我們利用RT-PCR和末端快速擴增等方法，從中國對蝦血細胞中克隆得到1種對蝦素(Penaeidins)家族的抗菌肽Ch-penaedin基因(chp)，見康翠潔，王金星，趙小凡，相建海，2002，中國對蝦抗菌肽成熟肽cDNA克隆，山東大學學報(理學版)37(6)552-556，并對其表達和性質(zhì)進行了系統(tǒng)研究。申請?zhí)?2109931、公開號1381587的專利文獻也公開了克隆到的對蝦抗菌肽的cDNA序列。
根據(jù)克隆得到的對蝦素基因，分別構(gòu)建原核和真核表達載體，利用大腸桿菌、酵母菌和昆蟲細胞表達系統(tǒng)分別表達了有活性的抗菌肽(對蝦素)，建立純化方法和活性鑒定方法。
本發(fā)明中國對蝦抗菌肽基因的重組表達方法，包括重組載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)化與篩選和表達產(chǎn)物鑒定、純化和抗菌譜測定。分別說明如下1.重組載體構(gòu)建根據(jù)已克隆到的對蝦抗菌肽成熟肽的cDNA序列(申請?zhí)?2109931，公開號1381587)，利用特異引物在其兩端引入兩個不同的限制性內(nèi)切酶位點，亞克隆到表達載體，載體包括pET系列、pGEX-4T系列、pPIC系列、pAO815和桿狀病毒表達載體。
2.轉(zhuǎn)化與篩選將構(gòu)建得到的載體分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌和酵母菌及轉(zhuǎn)染昆蟲細胞，篩選工程菌株并誘導表達。
3.表達產(chǎn)物鑒定、純化和抗菌譜測定采用誘導劑誘導表達工程菌，破細胞收集上清液，分泌型表達的細胞直接收集上清液，采用層析的方法純化抗菌肽，并測定抗菌譜。
上述的誘導劑是原核表達的誘導劑為異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，簡稱IPTG，酵母表達的誘導劑是甲醇。
上述特異性引物是下列之一(1)以重組質(zhì)粒chp/pGEM T-easy為模板，以chppGEXF/chppGEXR為引物，引物兩端加EcoR I和Xho I酶切位點，擴增對蝦抗菌肽成熟肽基因chp，引物序列為ChppGEX F 5’GCGC GAA TTC AAG GGT GGT TAC ACA CGC 3’，ChppGEX R 5’GCGC CTCGAG ACT TAC ATC CCA CAT GCA C3’。
(2)以對蝦Chp/pGEM T-easy質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，兩條引物分別為F 5’CTGGGAA TTC ATG AAG GGT GGT TAC ACA CGC 3’加EcoR I位點，R 5’TCGG GCG GCC GC ACTTAC ATC CCA CATG 3’加Not I位點。
(3)以chp/pGEM-T easy為模板，以ChpBac F ChpBac R為引物擴增對蝦素基因，引物序列為ChpBac F 5’GCGC GGA TCC AAG GGT GGT TAC ACA CGC 3’，ChpBac R5’GCGC CTC GAG ACT TAC ATC CCA CAT GCA C3’，引物兩端加Bam H I和Xho I酶切位點。
本發(fā)明在大腸桿菌、酵母菌和昆蟲細胞中分泌表達了有活性的抗菌肽。用本發(fā)明重組表達的對蝦抗菌肽(對蝦素)進行抑菌實驗，表明對蝦素對大腸桿菌、金黃葡萄球菌、藤黃微球菌等革藍氏陰性菌和陽性菌有抑菌活性。
本發(fā)明表達產(chǎn)物可用于制作飼料添加劑、保鮮劑、化妝品和醫(yī)藥產(chǎn)品。
PCR反應體積25μl，擴增條件94℃2min；94℃30s，51℃45s，72℃45s共30循環(huán)；72℃10min。經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳檢測得到大約350bp左右的擴增產(chǎn)物。用膠純化試劑盒純化所得的產(chǎn)物。2)m-chp-pGEX-4T-1重組質(zhì)粒的構(gòu)建載體pGEX-4T-1和純化的PCR產(chǎn)物(m-chp)分別用Eco RI/Xho I 37℃酶切3h，然后將對蝦素成熟肽基因連于pGEX-4T-1質(zhì)粒，連接反應于22℃進行6小時。3)m-chp-pGEX-4T-1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21將m-chp-pGEX-4T-1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，以chppGE F/chppGE R為引物PCR篩選chp-pGEX-4T-1-DH5α陽性菌株。提取m-chp-pGEX-4T-1-DH5α陽性菌株質(zhì)粒，用于測序。用測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21，篩選陽性克隆。4)m-chp-pGEX-4T-1 BL21菌株的誘導表達及純化挑取m-chp-pGEX-4T-1-BL21單菌落于5ml LB/Amp培養(yǎng)液中試誘導表達。挑取試誘導表達為陽性的菌落于5ml LB/Amp培養(yǎng)液中37℃過夜培養(yǎng)，次日取1ml接種于100mlLB/Amp培養(yǎng)液中37℃培養(yǎng)4h，至OD600為0.8-1.0，加入IPTG至終濃度1mM，誘導培養(yǎng)5小時。7000rpm離心10分鐘收集細胞，加入5ml PBS，50μl 20％ Triton X-100重懸細胞，并超聲波破碎細胞12min，12000rpm離心10分鐘收集上清。將上清過GlutathioneSepharose 4B親和層析柱純化GST-CHP融合蛋白，12.5％SDS-PAGE檢測，電泳方法參照Laemmli(1970)的方法。5)氨基酸序列測定，酶裂解后的融合蛋白經(jīng)15％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干法轉(zhuǎn)移到PVDF膜，ponceau 3R染液中染色，切下目的帶，在ab Appllid Biosystems，491蛋白質(zhì)測序儀上測序。6)液體生長抑制方法檢測CHP活性以1μl凝血酶100mg GST-CHP融合蛋白的比例于23℃裂解GST-CHP融合蛋白8h。于5ml LB培養(yǎng)液中37℃過夜培養(yǎng)E.coli DH5α，次日以1μl過夜培養(yǎng)物1mlLB培養(yǎng)液的比例將E.coli DH5α稀釋，于96孔板中每孔加入稀釋后的E.coli DH5α菌液100μl，然后加入經(jīng)過裂解GST-CHP融合蛋白樣品100μl。用LB，GST-CHP融合蛋白，PBS，Glutathione Elution Buffer作為對照。每組設定三個平行試驗，25℃ 30rpm搖動培養(yǎng)，在450nm波長下每30min測定吸光度。對每組的平行試驗求平均值，繪制吸光度與時間的曲線，見附
圖1。實施例2.利用酵母表達系統(tǒng)表達對蝦素，pPIC載體系列。1)載體構(gòu)建(以pPIC9K為例)以對蝦Chp/pGEM T-easy質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，兩條引物分別為F 5’CTGG GAA TTC ATG AAG GGT GGT TAC ACA CGC 3’加EcoR I位點，R 5’TCGG GCG GCC GC ACT TAC ATC CCA CATG 3’加Not I位點，PCR反應條件94℃ 2分鐘，進入下面30個循環(huán)94℃ 30秒，53℃ 45秒，72℃30秒；最后72℃延伸10分鐘。擴增反應完成后，用膠純化試劑盒純化所得的產(chǎn)物。先后進行Not I、EcoR I雙酶切，酚/氯仿抽提。
pPIC9K質(zhì)粒同樣進行Not I、Eco R I雙酶切，與chp基因連接。將m-chp/pPIC9K-重組載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α的感受態(tài)細胞中，在含氨芐青霉素(50μg/ml)的固體LB平板上，37℃倒置過夜培養(yǎng)。PCR篩選陽性克隆，擴大培養(yǎng)提取重組質(zhì)粒，測序驗證重組質(zhì)粒中m-chp序列的正確性。2)對蝦素表達的酵母工程菌株的篩選將m-chp/pPIC9K重組質(zhì)粒、pPIC9K空質(zhì)粒分別進行Sal I酶切，酚/氯仿抽提純化。轉(zhuǎn)化酵母KM71感受態(tài)細胞。涂布在不含His的MD平板上，收集長出的his+菌落。再在含有不同濃度G418的YPD梯度平板進行梯度篩選。挑取單菌落于10μl水中，沸水煮5分鐘，冰浴5分鐘，再煮5分鐘。室溫下離心，取2μl作為模板，PCR檢測，正向引物為載體上5’-AOX1 Primer，逆向引物為chp基因的逆向引物。將篩到的陽性菌落進行表達研究。
取m-chp/pPIC9K/KM71、pPIC9K/KM71在YPD平板上劃線，28℃培養(yǎng)兩天后挑單菌落分別接種于5ml的YPD液體培養(yǎng)基中，28℃，200-250rmp培養(yǎng)24h。然后將菌液轉(zhuǎn)移到BMGY中擴大培養(yǎng)，28℃，200-250rpm培養(yǎng)至OD600為2-6，5000rpm離心取沉淀，換用1/5體積含0.5％甲醇的BMMY誘導表達。每隔24h取1ml菌液，12000rpm離心5min，-20℃保存上清液，同時補加甲醇至0.5％繼續(xù)誘導。一直誘導3-4天。每天所得上清液進行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，檢測分泌表達的情況。3)表達產(chǎn)物純化表達產(chǎn)物過親和層析柱，然后過Sephadex柱脫鹽，得到純化產(chǎn)物。4)表達產(chǎn)物抗菌活性的測定瓊脂孔穴擴散法將處于對數(shù)生長期的大腸桿菌DH5α懸浮液(0D600＝0.3)20μl與固體PBM(Poor broth medium1％agar，1％trypton，0.5％Nacl)培養(yǎng)基15mL在45℃左右混合均勻，鋪在水平的無菌培養(yǎng)皿中，待其凝固后在皿內(nèi)打直徑為5mm的小孔，加入待測樣品液，37℃培養(yǎng)過夜。
液體生長抑制法將過夜培養(yǎng)的大腸桿菌DH5α懸浮液，金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌等用液體PBM(Poor broth medium1％trypton，0.5％Nacl)培養(yǎng)基調(diào)至OD600值為0.001。取100μl加入96孔板的小孔中，加入50μl含有抗菌肽的上清液，37℃震蕩培養(yǎng)，每1h用酶標儀測一次吸光度OD600。實施例3.利用酵母表達系統(tǒng)表達對蝦素，pAO815載體。
如實施例2所述，所不同的是載體拷貝篩選在體外進行，表達產(chǎn)物純化要破細胞。實施例4.利用昆蟲細胞表達系統(tǒng)表達對蝦素以chp/pGEM-T easy為模板，以ChpBac F ChpBac R為引物擴增對蝦素基因。引物序列為ChpBac F 5’GCGC GGA TCC AAG GGT GGT TAC ACA CGC 3’ChpBac R 5’GCGCCTC GAG ACT TAC ATC CCA CAT GCA C3’，引物兩端加Bam H I和Xho I酶切位點。
回收擴增產(chǎn)物，亞克隆到pFastBac質(zhì)粒，得到pFastBac/Chp重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化DH10Bac細胞，在輔助質(zhì)粒(Helper)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)座酶的作用下，將m-Chp基因片段轉(zhuǎn)座到穿梭載體Bacmid上，利用藍白斑篩選重組Bacmid。驗證后轉(zhuǎn)染昆蟲細胞，收集并裂解轉(zhuǎn)染的細胞，離心收集上清液，柱層析純化表達產(chǎn)物。實施例5.實施例1、2和3的表達產(chǎn)物用做飼料添加劑，如對蝦飼料添加劑，魚類飼料添加劑，禽類飼料添加劑和畜類飼料添加劑。實施例6.實施例1、2和3的表達產(chǎn)物用做保鮮劑，如肉類食品保鮮、水果保鮮等。實施例7.實施例1、2和3的表達產(chǎn)物用于化妝品，如護膚霜。實施例8.實施例1、2和3的表達產(chǎn)物用于醫(yī)藥產(chǎn)品，如抗細菌、真菌和病毒藥物。
權(quán)利要求
1.中國對蝦抗菌肽基因的重組表達方法，包括重組載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)化與篩選和表達產(chǎn)物鑒定、純化和抗菌譜測定其特征在于，所述的重組載體構(gòu)建是根據(jù)已克隆到的對蝦素成熟肽的cDNA序列，利用特異引物在其兩端引入兩個不同的限制性內(nèi)切酶位點，亞克隆到表達載體，載體包括pET系列、pGEX-4T系列、pPIC系列、pAO815和桿狀病毒表達載體；所述的轉(zhuǎn)化與篩選是將構(gòu)建得到的載體分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌和酵母菌及轉(zhuǎn)染昆蟲細胞，篩選工程菌株或細胞并誘導表達；所述的表達產(chǎn)物鑒定、純化和抗菌譜測定是采用誘導劑誘導表達的工程菌，破細胞收集上清液，分泌型表達的細胞直接收集上清液，采用層析的方法純化抗菌肽，并測定抗菌譜。
2.如權(quán)利要求
1所述的中國對蝦抗菌肽基因的重組表達方法，其特征在于，所述的誘導劑是原核表達的誘導劑為異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，酵母表達的誘導劑是甲醇。
3.如權(quán)利要求
1所述的中國對蝦抗菌肽基因的重組表達方法，其特征在于，所述特異性引物是下列之一(1)以重組質(zhì)粒chp/pUCM-T為模板，引物chppGEXF/chppGEXR，引物兩端加EcoRI和Xho I酶切位點，擴增蝦防御素成熟肽基因chp，引物序列為ChppGEX F 5’GCGCGAA TTC AAG GGT GGT TAC ACA CGC 3’，ChppGEX R 5’GCGC CTC GAG ACT TAC ATC CCACAT GCA C3’；(2)以對蝦Chp/pGEM T-easy質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，兩條引物分別為F 5’CTGGGAA TTC ATG AAG GGT GGT TAC ACA CGC 3’加EcoR I位點，R 5’TCGG GCG GCC GC ACTTAC ATC CCA CATG 3’加Not I位點；(3)以chp/pGEM-T easy為模板，以ChpBac F ChpBac R為引物擴增對蝦素基因，引物序列為ChpBac F 5’GCGC GGA TCC AAG GGT GGT TAC ACA CGC 3’，ChpBac R5’GCGC CTC GAG ACT TAC ATC CCA CAT GCA C3’，引物兩端加Bam H I和Xho I酶切位點。
4.權(quán)利要求
1所述的中國對蝦抗菌肽基因的重組表達方法，其特征在于，表達產(chǎn)物可用于制作飼料添加劑、保鮮劑、化妝品和醫(yī)藥產(chǎn)品。
專利摘要
中國對蝦抗菌肽基因的重組表達與應用，屬于分子生物學技術領域：
。重組表達方法包括重組載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)化與篩選和表達產(chǎn)物鑒定、純化和抗菌譜測定，其中重組載體構(gòu)建是根據(jù)已克隆到的對蝦素成熟肽的cDNA序列，利用特異引物在其兩端引入兩個不同的限制性內(nèi)切酶位點，亞克隆到表達載體，載體包括pET系列、pGEX－4T系列、pPIC系列、pAO815和桿狀病毒表達載體；再將構(gòu)建得到的載體分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌和酵母菌及轉(zhuǎn)染昆蟲細胞，篩選工程菌株或細胞并誘導表達。表達產(chǎn)物可用于制作飼料添加劑、保鮮劑、化妝品和醫(yī)藥產(chǎn)品。
文檔編號C12N15/63GKCN1459506SQ03112294
公開日2003年12月3日 申請日期2003年5月30日
發(fā)明者王金星, 趙小凡, 相建海, 李富花 申請人:山東大學, 中國科學院海洋研究所導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan