專利名稱:非還原性糖類生成酶及其制備和應(yīng)用的制作方法
本發(fā)明涉及一種新的非還原性糖類生成酶，以及它的制備和應(yīng)用更具體地說，涉及這樣一種新的還原性糖類生成酶當(dāng)其作用于一種或多種具有3個或3個以上的葡萄糖聚合度的還原性淀粉部分水解產(chǎn)物時，生成一種具有海藻糖結(jié)構(gòu)的非還原性糖類，還涉及這種酶的制備，以及能夠產(chǎn)生這種酶的微生物。本發(fā)明還涉及含有可由這種酶制備的以海藻糖結(jié)構(gòu)為末端單元的非還原性糖類的組合物，含有上述非還原性糖類的還原性比較低的糖類，和/或由這種糖類所制備的海藻糖。
海藻糖或α，α-海藻糖長期以來一直被認(rèn)為是由葡萄糖單元組成的非還原性糖類。正如在Advance in Carbohydrate Chemistry，18卷，第201-225(1963)中(由美國的AcademicPress出版)和在Applied and Environmental Microbiology，第56卷，3213-3215頁(1990)中所公開的，海藻糖廣泛存在于微生物、蘑菇和昆蟲中，但含量較低由于非還原性糖類包括不會與具有氨基的物質(zhì)，如氨基酸和蛋白質(zhì)反應(yīng)的海藻糖，所以它們即不會引起氨基-羰基反應(yīng)，也不會改變含有氨基酸的物質(zhì)。因此，非還原性糖類被認(rèn)為可以使用而不用擔(dān)心會引起不理想的褐變和變質(zhì)。因為上述原因，就迫切需要建立一種制備這種還原糖的方法在海藻糖的傳統(tǒng)制備方法中，和在日本專利公開號No.154,485/75中所公開的，采用的微生物，或者如日本專利公開號No.216,695/83中提出的，同時采用麥芽糖酶-和麥芽糖磷酸化酶將麥芽糖轉(zhuǎn)化成海藻糖。然而，前一種方法不適于工業(yè)規(guī)模的制備，因為海藻糖在作為原材料的微生物中的含量以干固體物計(d.s.b.)低于15w/w％(“w/w％”的表達形式在說明書中可簡化為“％”，除非另有說明)，且分離和提純步驟復(fù)雜。而后一種方案具有如下缺點(i)因為海藻糖是通過葡萄糖-1-磷酸生成的，作為底物的麥芽糖不能以較高的濃度使用；(ii)因為磷酸化酶促反應(yīng)體系是可逆反應(yīng)，所以目的產(chǎn)物海藻糖的產(chǎn)量較低(iii)要保持該反應(yīng)體系的穩(wěn)定和順利延續(xù)其菌促反應(yīng)實際上是困難的。
關(guān)于海藻糖的制備．在“Food Chemicals”，No.88，67-72頁(1992年8月)上題為“Current Status ofStarch Application Development and Related Problems”的章節(jié)中的標(biāo)題為“Oligosaccharides”的專欄中有報道“盡管海藻糖具有廣泛的用途，但是通過直接糖轉(zhuǎn)移反應(yīng)或水解反應(yīng)的酶促制備海藻糖的方法在本領(lǐng)域被認(rèn)為從科學(xué)上來講是不可能的。”因此，以淀粉為材料酶促制備海藻糖的方法被認(rèn)為從科學(xué)上講是極為困難的。
業(yè)已知道，由淀粉材料，如液化淀粉、環(huán)狀糊精和麥芽寡糖制備的淀粉的部分水解產(chǎn)物通常以還原性末端基團為末端單元。在說明書中，這種淀粉的部分水解產(chǎn)物被稱為“非還原性的淀粉部分水解產(chǎn)物”。這種還原性淀粉部分水解產(chǎn)物的還原能力通常表達為以其干固體物重計的“葡萄糖當(dāng)量(DE)值”。業(yè)已知道，還原性淀粉部分水解產(chǎn)物中那些具有較高的DE值的產(chǎn)物通常具有較低的分子量和粘度，以及較高的適宜甜度和反應(yīng)性，且易與含有氨基的物質(zhì)如氨基酸和蛋白質(zhì)反應(yīng)，使其品質(zhì)發(fā)生不理想的褐變、發(fā)臭和變質(zhì)。
還原性淀粉部分水解產(chǎn)物的這些不利特性根據(jù)其DE值有所變化，且還原性淀粉部分水解產(chǎn)物與其DE值之間的關(guān)系是極為重要的。甚至在本領(lǐng)域中一直認(rèn)為要打破這種關(guān)系是不可能的。
打破這種關(guān)系的唯一途徑是一種在較高的氫壓下通過氫化還原性淀粉部分水解產(chǎn)物將其還原性末端基團轉(zhuǎn)化成羥基而將這種水解產(chǎn)物制成非還原性糖類。不過，這種方法需要高壓滅菌鍋并耗費大量的氫和能源，而且還需要較高的水平的控制或安全設(shè)施以免發(fā)生災(zāi)難。還原性部分淀粉水解產(chǎn)物與所得產(chǎn)物不同，因為前者由葡萄糖單元組成而后者，即所得淀粉部分產(chǎn)物的糖醇則是由葡萄糖和山梨醇組成，當(dāng)將其用在人體上時可能導(dǎo)致出現(xiàn)消化紊亂或腹瀉癥狀。因此，迫切需要建立一種降低甚至消除還原性淀粉部分水解產(chǎn)物的還原能力而又不改變以葡萄糖單元作為其組分糖的狀況的方法。
本發(fā)明的目的是要提供一種新的非還原性糖類及其應(yīng)用，并由還原性淀粉部分水解產(chǎn)物來制備，以使打破傳統(tǒng)上認(rèn)為的還原性部分淀粉部分水解產(chǎn)物和其DE值之間的關(guān)系，并揭示這種非還原性糖類的新用途。
為達上述目的，本發(fā)明人廣泛篩選了能產(chǎn)生一種新的非還原性糖類生成酶的微生物，當(dāng)這種酶作用于還原性淀粉部分水解產(chǎn)物時，可生成具有海藻糖結(jié)構(gòu)的非還原性糖類。
結(jié)果，從日本岡山市和Soja市的土壤中分別分離出了根瘤菌屬(Rhizobium)的新微生物，命名為“Rhizobium Sp.M-11”，和節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)的新微生物，命名為“Arthrobacter Sp.Q36”；并發(fā)現(xiàn)上述微生物能產(chǎn)生非還原性糖生成酶，當(dāng)這種酶作用于還原性淀粉部分水解產(chǎn)物時，能生成具有海藻糖結(jié)構(gòu)的非還原性糖類，而且當(dāng)這種酶作用于還原性淀粉部分水解產(chǎn)物時容易制備出所需要的非還原性糖類。
我們還發(fā)現(xiàn)，通過先將這種酶作用于還原性淀粉部分水解產(chǎn)物再將所得非還原性糖類用葡萄糖淀粉酶或α-葡萄糖苷酶處理可很容易地制備出海藻糖。這樣，本發(fā)明人完成了這一發(fā)明。此外，我們還從常規(guī)微生物中廣泛篩選了能產(chǎn)生這種酶的微生物。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，短桿菌屬(Brevibacterium)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、微珠菌屬(Micrococcus)、彎曲桿菌(Curtobacterium)和土桿菌屬(Terrabacter)的微生物與根瘤菌屬和節(jié)桿菌屬的微生物一樣能產(chǎn)生這種非還原性糖類生成酶，并且我們完成了這一發(fā)明。另外，我們建立了制備含有這種非還原性糖類及含非還原性糖類的還原性較低的糖類和/或由這種糖類制成的海藻糖的組合物如食品、化妝品和藥品的制品方法，而且我們完成了這一發(fā)明。

圖1表示溫度對由根瘤菌屬的Rhizobium SP.M-11菌獲得的非還原性糖類生成酶的活性的影響。
圖2表示pH值對由根瘤菌屬的Rhizobium SP.M-11菌獲得的非還原性糖類生成酶的活性的影響。
圖3表示由Rhizibium SP.M-11菌獲得的非還原性糖類生成酶的熱穩(wěn)定性。
圖4表示由Rhizibium SP.M-11菌獲得的非還原性糖類生成酶的pH穩(wěn)定性。
圖5表示溫度對由節(jié)桿菌屬的Arthrobacter SP.Q36菌獲得的非還原性糖類生成酶的活性的影響。
圖6表示pH值對由Arthrobacter SP.Q36菌獲得的非還原性糖類生成酶的活性的影響。
圖7表示由Arthrobacter SP.Q36菌獲得的非還原性糖類生成酶的熱穩(wěn)定性。
圖8表示由Arthrobacter SP.Q36獲得的非還原性糖類生成酶的pH穩(wěn)定性。
本發(fā)明涉及一種新的非還原性糖類生成酶，以及它的制備和應(yīng)用。本發(fā)明還涉及能夠產(chǎn)生這種酶的微生物，用這種酶所制備的非還原性糖類含有所說非原性糖類的相對低還原性糖類，由這些糖類制備的海藻糖、以及含有這些糖類和海藻糖的之一和兩者的組合物。
本發(fā)明人廣泛篩選了能夠產(chǎn)生一種新的非還原性糖類生成酶的微生物，當(dāng)這種酶作用于還原性淀粉部分水解產(chǎn)物時能生成具有海藻糖結(jié)構(gòu)的非還原性糖類，最終發(fā)現(xiàn)了目標(biāo)微生物。
現(xiàn)在，本發(fā)明人首先闡述該根瘤菌屬微生物，即本發(fā)明的“Rhizobium Sp.M-11”菌的鑒定試驗。該試驗是按照在“Bisebutsu-no-Bunvui-to-Dotei”(微生物分類和鑒定)中所述方法進行的。該書由Takej Hasegawa編輯，由日本科協(xié)出版社出版，日本，東京(1985)。結(jié)果如下A.形態(tài)學(xué)當(dāng)在27℃在營養(yǎng)瓊脂中培育時細胞的特征一般呈0.6～0.8×1.0～1.5μm的桿狀一般單獨存在，但偶爾也以偶聯(lián)或接合形式存在；不表現(xiàn)出多形性；
具有游動性、不產(chǎn)孢子性和鞭毛；不耐酸；革蘭氏染色陰性；胞襄無；異染粒有；能積累多-β-羥丁酸。
B.培養(yǎng)特性(1)當(dāng)在27℃在營養(yǎng)瓊脂板中培養(yǎng)時所形成的菌落的特征形狀在培養(yǎng)24小時之后圓形菌落的直徑為1.5mm左右邊緣完整；突出物平均或半球形；光澤有；表面光滑；顏色乳白色半透明；(2)在27℃溫度下，在含有葡萄糖和胰蛋白胨的瓊脂板上培養(yǎng)時所形成菌落的特征乳白色半透明菌落具有類粘蛋白(3)在27℃溫度下，在含有酵母抽提物和甘露醇的瓊脂板上培養(yǎng)時所形成菌落的特點形狀培養(yǎng)5天后，圓形菌落的直徑為3mm左右顏色乳白色半透明菌落具有類粘蛋白；(4)在27℃溫度下，在含有酵母抽提物、甘露醇和剛果紅的瓊脂板上培養(yǎng)時所形成菌落的特征呈淺桃紅色且基本上不吸收剛果紅；
(5)在27℃的溫度下，在含有酵母抽提物、甘露醇和2w/v％ NaCl的瓊脂板上生長；(6)在27℃溫度下，在營養(yǎng)瓊脂斜面上培養(yǎng)時所形成菌落的特征生長令人滿意；形狀絲狀并且(7)在27℃溫度下在營養(yǎng)明膠上穿刺培養(yǎng)時不會液化明膠。
C.生理特性(1)硝酸還原作用陽性(2)反硝化作用陰性(3)甲基紅測驗陰性(4)VP-測驗陰性(5)吲哚生成陰性(6)硫化氫生成陽性(7)淀粉水解陰性(8)檸檬酸的利用陽性(9)無機氨源的利用利用了銨鹽和硝酸鹽；(10)色素的生成未生成可溶的色素(11)脲酶陽性(12)氧化酶陰性(13)過氧化氫酶陽性(14)生長條件在pH5.5～9.0和溫度4～35℃范圍內(nèi)生長；
(15)需氧情況需氧；(16)碳源的利用和酸的生成碳源 利用 酸生成D-葡萄糖 + +D-半乳糖 + +D-果糖 + +L-阿拉伯糖 + +D-木糖 + +L-鼠李糖 + +麥芽糖 + -蔗糖 + +乳糖 + -海藻糖 + -棉子糖 + +甘露醇 + -糊精 + -半乳糖醇 + -(17)對氨基酸的脫羧酶測驗對L-賴氨酸，L-精氨酸和L-鳥氨酸呈陰性；(18)氨基酸的利用利用L-谷氨酸鈉、L-天冬氨酸鈉、L-組氨酸和L-脯氨酸；(19)DNase(脫氧核糖核酸酶)陰性；(20)3-酮乳糖的生成陰性；以及
(21)DNA的鳥嘌呤(G)加胞嘧啶(C)的Mol％61％。
參考《柏捷氏細菌分類學(xué)手冊》第1卷(1984)對這種微生物和已知微生物的細菌學(xué)特征進行了比較。結(jié)果證實這種微生物確系根瘤菌屬的一種微生物。這種微生物在某些特性上類似于草木犀根瘤菌種(Rhizobium melitoti)，但它們在以下方面是不同的本發(fā)明微生物利用麥芽糖、乳糖和甘露醇但不生成酸，它能產(chǎn)生一種非還原性糖類生成酶，當(dāng)這種酶作用于還原性淀粉部分水解產(chǎn)物時會生成具有海藻糖結(jié)構(gòu)的非還原性糖類。沒有出版物報道過具有這種特性的這樣一種微生物。
基于這些結(jié)果，本發(fā)明人將這種微生物命名為“Rhizobium Sp.M-11”，并于1992年12月24日將其保藏在工業(yè)科學(xué)技術(shù)機構(gòu)的發(fā)酵研究所，Ibaraki，日本。微生物的保藏于當(dāng)天被接受，并由該研究所以FERM BP-4130的入藏號保存。
除了上面所鑒定的微生物之外，根瘤菌屬的其它菌株及其突變體也可適當(dāng)?shù)赜糜诒景l(fā)明中，只要它們能夠產(chǎn)生這種非還原性糖類生成酶。
對節(jié)桿菌屬的一種微生物，即本發(fā)明的Arthobacter Sp.Q 36菌的鑒定試驗得出了以下結(jié)果。該試驗與Rhizobium Sp.M-11菌的鑒定類似，也是按照在“Biseibutsu-no-Bunrui-to-Dotei”(微生物分類與鑒定)一書中所記載的方法進行的。該書由Takej Hasegawa編輯，由日本科協(xié)出版社出版，日本，東京(1985)。結(jié)果如下
A.形狀學(xué)(1)當(dāng)在27℃溫度下在營養(yǎng)瓊脂中培養(yǎng)時細胞的特征通常呈0.5～0.7×0.8～1.6μm的桿狀；單獨存在；表現(xiàn)出多形性；不具備游動性、鞭毛和不產(chǎn)孢子性；不耐酸；革蘭氏染色陽性；胞襄無；(2)當(dāng)在27℃的溫度下在EYG瓊脂中培養(yǎng)時細胞的特征呈桿狀球形環(huán)。
B.培養(yǎng)特性(1)在27℃溫度下，在營養(yǎng)瓊脂板上培養(yǎng)時所形成菌落的特征形狀培養(yǎng)3天之后圓形菌落的直徑為2-2.5mm左右；邊緣完整；突出物半球形；光澤濕潤的光澤；表面光滑；顏色半透明和白色或淡黃色；(2)在27℃溫度下，在營養(yǎng)瓊脂板上進行斜面培養(yǎng)時細胞的特征生長率令人滿意;
形狀絲狀(3)當(dāng)在27℃溫度下，在含有酵母抽提物和胨的瓊脂板上進行斜面培養(yǎng)時細胞的特征生長率令人滿意；形狀絲狀；(4)當(dāng)在27℃溫度下肉湯和明膠中進行穿刺培養(yǎng)時細胞的特征液化肉湯和明膠；C.生理特性(1)硝酸還原作用有(2)反硝化作用無(3)甲基紅測驗陰性(4)VP-測驗陽性(5)吲哚的生成陰性(6)硫化氫的生成陽性(7)淀粉水解作用陰性(8)纖維素水解作用陰性(9)檸檬酸的利用陽性(10)無機氮源的利用利用了銨鹽和硝酸鹽(11)色素的生成陰性(12)脲酶陽性(13)氧化酶陰性(14)過氧化氫酶陽性(15)生長條件在pH5-10和溫度4-37℃的范圍內(nèi)生長(16)需氧情況需氧(17)碳源的利用和酸的生成碳 源 利 用 酸的生成D-葡萄糖 + -D-半乳糖 + -D-果糖 + -L-阿拉伯糖 + -D-木糖 + -L-鼠李糖 + -麥芽糖 + -蔗糖 + -乳糖 + -棉子糖 + -甘露糖 + -糊精 + -半乳糖醇 + -(18)氨基酸的利用利用L-谷氨酸鈉、L-天冬氨酸鈉、L-緩氨酸和L-脯氨酸；(19)脫氧核糖核酸酶-(DNase)陰性；(20)3-酮乳糖的生成陰性；(21)細胞壁的主要二氨基酸賴氨酸；(22)DNA中鳥嘌呤(G)和胞嘧啶的Mol％63％參考《柏捷氏細菌分類學(xué)手冊》，第2卷(1984)，對這種微生物和已知微生物的細菌學(xué)特性進行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這種微生物被證實為節(jié)桿菌屬的微生物。這種微生物具有這樣一個特征它能產(chǎn)生一種非還原性糖類生成酶，當(dāng)這種酶作用于還原性淀粉部分水解產(chǎn)物時能生成具有海藻糖結(jié)構(gòu)的非還原性糖類。還沒有出版物記載過這樣一種酶。
基于上述結(jié)果，本發(fā)明人將這種微生物定命為“Arthobacter Sp.Q36”菌，并于1993年6月3日將其保藏在工業(yè)科學(xué)技術(shù)機構(gòu)的國立生物科學(xué)與人體技術(shù)研究所，Ibarak，日本。該微生物的保藏已于當(dāng)天被接受，并由該研究所以FERM BP-4316的入藏號保存。
除上述微生物之外，節(jié)桿菌屬的其它菌株及其突變體也可適當(dāng)?shù)挠糜诒景l(fā)明，只要它們能夠產(chǎn)生這種非還原性糖類生成酶。
任何微生物均可用于本發(fā)明，只要它能夠產(chǎn)生這種酶。例如，除上述Rhizobium Sp.M-11(FERM BP-4130)和Arthrobacter Sp.Q36(FERM BP-4316)之外，迄今已知的其它微生物，如以下種的微生物Brevibacterium helovolum(ATCC 11822)，水生黃桿菌(Flavobacteriumaquatitle)(IFO 3772)，藤黃微球菌(MicrococcusLuteus)(IFO 3064)，玫瑰色微球菌(Micrococcusroseus)(ATCC 186)，恥垢分技桿菌(MycobacteriumSegmatis)(ATGC 19420)，Terrabacter tumescens(IFO 12960)以及它們的突變體也可有利地用于本發(fā)明。
任何一種營養(yǎng)培養(yǎng)基均可用于本發(fā)明，只要這種微生物能在其中生長并產(chǎn)生這種非還原性糖類生成酶例如，合成的和天然的營養(yǎng)培養(yǎng)基均可用作這種營養(yǎng)培養(yǎng)基。任何含碳的物質(zhì)均可用作本發(fā)明的碳源，只要它能夠被這種微生物利用這種碳源的例子有糖類，如葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、甘糖醇、山梨醇、糖蜜和還原性淀粉部分水解產(chǎn)物；還有有機酸類，如檸檬酸和琥珀酸。營養(yǎng)培養(yǎng)基中這種碳源的濃度是適當(dāng)選擇的。例如，在采用還原性淀粉部分水解產(chǎn)物時，鑒于微生物的生長，理想的濃度以干固體物計通常為20％或更低，更具體地說為5％或更低，可用于本發(fā)明的氨源有，例如無機化合物，象銨鹽和硝酸鹽；還有含氮的有機物質(zhì)，象尿素、玉米漿、酪蛋白、胨、酵母抽提物和牛肉膏?？捎糜诒景l(fā)明的無機成分有，例如，鈣鹽、鎂鹽、鉀鹽、鈉鹽、磷酸鹽，還有鎂、鋅、鐵、銅、鉬和鈷的其它鹽類。如有必要，也可將氨基酸和維生素適當(dāng)?shù)亟Y(jié)合使用。
可用于本發(fā)明的微生物是在好氧條件下培養(yǎng)，通常溫度為4-40℃，20～37℃較理想pH為4-10，pH5-9較理想。
用于本發(fā)明的培養(yǎng)時間定的要比這種微生物開始生長的時間長一些，10-100小時較好。營養(yǎng)培養(yǎng)基中的溶解氧(DO)濃度不受特殊限制，但通常在0.5～20ppm范圍內(nèi)。通過控制通氣、攪動、充氧氣和提高發(fā)酵罐的內(nèi)部壓力的方式可將DO濃度維持在該范圍內(nèi)。培養(yǎng)可以分批方式或連續(xù)方式進行。
在結(jié)束微生物培養(yǎng)之后，回收這種酶。由于在細胞和無細胞的上清液中都發(fā)現(xiàn)了這種酶，因此，可將這些細胞和上清液作為粗制酶加以回收。所得培養(yǎng)物也可原封不動地用作粗制酶。傳統(tǒng)的液體-固體分離方法可在本發(fā)明中用作從培養(yǎng)物中去除細胞的方法。例如，直接將所得培養(yǎng)物離心的那些方法，還有用預(yù)涂濾器過濾培養(yǎng)物的方法，或通過采用平板濾器或系列纖維(follow fibers)的膜過濾分離細胞的方法均可適當(dāng)?shù)夭捎?。盡管這樣所獲得的無細胞濾液可以原封不動的用作酶溶液，但在用之前可將其濃縮?？捎糜诒景l(fā)明的濃縮方法有，例如用硫酸氨鹽析，用丙酮和乙醇沉淀，也可用膜如平板濾器和系列纖維濃縮。
無細胞濾液及其濃縮物可進行常規(guī)固相化處理。這種常規(guī)方法的例子有利用離子交換劑的結(jié)合法，利用樹脂和膜的共價鍵結(jié)合和吸收法，以及利用高分子量物質(zhì)的內(nèi)含法。從所得培養(yǎng)物中分離出的細胞可以用作粗制酶而不加任何處理，或者在使用前將其固定。例如，通過將這種細胞與藻酸鈉混合并將所得混合物滴入氯化鈣溶液中以使所滴入的液體凝膠化成顆粒從而將其固定。因此所獲得的顆粒可以通過用聚乙烯亞胺或戊二酫處理而被固定。細胞提取物在本發(fā)明中也可用作粗制酶溶液。例如，通過從用超聲波破碎、利用玻璃珠和氧化鋁的機械破碎和frehch-press破碎方法處理過的細胞中提取這種酶來制備含有這種酶的透明的粗制酶溶液；并對所得到的提取物進行離心或膜過濾處理。
由此所獲得的粗制酶溶液可以原樣使用或者在用常規(guī)方法提純之后再使用。例如，純化的酶制劑在電泳時只出現(xiàn)一條譜帶，這種純化酶的制備是透析經(jīng)硫酸銨鹽析和濃縮所制成的粗酶制劑并用采用“DEAE Toyopearl”(一種陰離子交換樹脂)的陰離子交換柱層析、采用“Butyl Toyopearl”(一種疏水樹脂)的疏水性柱層析、和采用“ToyopearlHW-55”(一種用于凝膠過濾的樹脂)的凝膠過濾層析法連續(xù)地純化透析溶液。上述樹脂都是Tosoh公司的產(chǎn)品(日本，東京)。
由此所獲得的這種非還原性糖類生成酶具有以下物理化學(xué)特性(1)作用當(dāng)作用于具有3個或3個以上葡萄糖聚合度的一種或多種還原性淀粉部分水解產(chǎn)物時，生成以海藻糖結(jié)構(gòu)為末端單元的非還原性糖類；(2)分子量通過十二浣基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測得約為76,000±87,000道爾頓；(3)等電點(PI)在利用兩性電解質(zhì)進行等電電泳時約為3.6±4.6；(4)最適溫度當(dāng)在pH7.0條件下培養(yǎng)60分鐘時約為35-40℃；(5)最適pH當(dāng)在40℃溫度下培養(yǎng)60分鐘時約為pH6.4-7.2；(6)熱穩(wěn)定性當(dāng)在pH7.0條件下培養(yǎng)60分鐘時在大約35-40℃溫度下都是穩(wěn)定的；(7)pH 穩(wěn)定性當(dāng)在25℃溫度下培養(yǎng)16小時時，pH穩(wěn)定在5.5～11.0的范圍。
這種非還原性糖生成酶的活性測定如下將1ml酶溶液加入4ml用50mM的磷酸緩沖液(pH7.0)配制的1.25w/v％的麥芽戊糖中，并將該混合液在40℃保溫60分鐘。將該反應(yīng)混合液加熱至100℃處理10分鐘以終至該酶促反應(yīng)，并用去離子水將該反應(yīng)混合物精確地稀釋10倍，接著用Somogyi-Nelson′s方法測定該稀釋溶液的還原力。作為對照，對曾被加熱至100℃處理10分鐘以使其失活的酶溶液進行類似的處理。該酶的一個活性單位被定義為在1分鐘內(nèi)消除1微摩爾麥芽戊糖的還原力所需要的酶量。
可用作這種酶的底物的還原性部分淀粉水解產(chǎn)物是那些通過用淀粉酶或酸部分水解淀粉狀物質(zhì)，如淀粉、支鏈淀粉和直鏈淀粉所制備的產(chǎn)物。通過用淀粉酶水解所獲得的這種還原性淀粉部分水解產(chǎn)物，包括那些用淀粉酶如α-淀粉酶、麥芽三糖生成酶、麥芽四糖生成酶、麥芽戊糖生成酶和麥芽己糖生成酶水解淀粉狀物質(zhì)所制備的具有直鏈和支鏈結(jié)構(gòu)的水解產(chǎn)物，如在由Dergamon出版社出版的Handbookof Amylases and Related Enzymes一書中所公開的(日本，東京，1988)。在制備還原性淀粉的部分水解產(chǎn)物時，將脫支酶如支鏈淀粉酶和異淀粉酶與淀粉酶結(jié)合使用是有利的。可將一種或多種麥芽糖低聚糖如麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽戊糖、麥芽己糖和麥芽庚糖任意用作還原性淀粉的部分水解產(chǎn)物。
在本發(fā)明中被用作底物的還原性淀粉部分水解產(chǎn)物的濃度沒特殊限定。盡管即便底物溶液的濃度低至0.1％時這種酶促反應(yīng)也能發(fā)生，但是，當(dāng)?shù)孜锶芤旱臐舛葹?％或更高時這一酶促反應(yīng)會進行的更好，最好采用濃度為5～50％的底物(d.s.b.)。在這樣的濃度下，具有海藻糖結(jié)構(gòu)的非還原性糖類可以令人滿意的高產(chǎn)率順利形成。含有不可溶的底物的懸浮液也可物于本發(fā)明。本發(fā)明酶促反應(yīng)的溫度可以這樣確定，在該溫度下這種酶不會失活，即反應(yīng)溫度可達到約55℃，最好采用40～50℃范圍內(nèi)的溫度。用于本酶促反反應(yīng)的pH控制在5～10的范圍，最好在6-8之間。該酶促反應(yīng)的反應(yīng)時間是根據(jù)酶促反應(yīng)條件適當(dāng)選擇的。
所得到的含有非還原性糖類的反應(yīng)混合物的還原力遠低于用作底物的還原性淀粉部分水解產(chǎn)物的還原力。例如，在以麥芽庚糖為底物時，其原有還原力減少約93％，或者說其還原力相對原有還原力而言下降至約7％。
所得的反應(yīng)混合物以常規(guī)方法過濾和離心分離，以便除去不溶性物質(zhì)，并用活性碳將所得溶液脫色，用H型和OH型的離子交換劑脫鹽，然后濃縮成漿狀制品。這種漿狀制品可適當(dāng)?shù)馗稍锍煞蹱钪破?。如有必要，可方便地將這種粉狀制品制備成具有最大可能純度的非還原性糖類，是通過采用一種或多種方法提純這種粉狀制品進行制備的，例如，柱層析分級分離，象離子交換柱層析，采用活性碳和硅膠的柱層析；采用有機酸如丙酮和乙醇的分離法；以及用堿處理分解和除去殘留的還原性糖類。
更具體地說，離子交換柱層析方法可適當(dāng)?shù)卦诒景l(fā)明中被用作工業(yè)規(guī)模制備這種目標(biāo)糖類的方法。具有改進的純度的目標(biāo)非還原性糖類可用采用強酸性陽離子交換樹脂的柱層析法(如在日本專利公開號23,799/83和72,598/83中所述)除去伴隨糖類而制成。在這種情況下，可以使用固定床、移動床和半移動方法中的任何一種。
如有必要，可用淀粉酶如α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶和α-葡糖苷酶水解這種具有海藻糖結(jié)構(gòu)的非還原性糖類或含有這種非還原性糖類的還原性較低的糖類，以控制其甜度和還原力或降低其粘度并且所得的產(chǎn)物還可以用各種處理方法進一步處理，在處理過程中，殘留的還原性糖被氫化成糖醇而失去其還原力。
更具體地說，通過將葡糖淀粉酶或α-葡糖苷酶作用于這種非還原性糖類或含有這種糖的還原力較低的糖類可很容易地制備海藻糖。通過用葡糖淀粉酶或α-葡糖苷酶作用于這種糖類生成海藻糖和葡萄糖混合物，并對這種混合物進行上述的純化處理，如離子交換柱層析以除去其中的葡萄糖可以獲得高海藻糖含量的部分。該高海藻糖含量部分可適當(dāng)加以提純并濃縮成漿狀制品，而且，如有必要，可將這種漿狀制品濃縮成過飽和溶液，接著結(jié)晶成有水或無水結(jié)晶海藻糖，并回收所得晶體。
為了制備有水結(jié)晶海藻糖，將純度約為60％或更高的大約為65-90％的海藻糖溶液放入結(jié)晶器內(nèi)，在95℃或更低溫度下，最好是在10-90℃的溫度范圍內(nèi)，在有0.1～20％的晶種的情況下逐步冷卻并攪拌，以獲得一種含有有水結(jié)晶海藻糖的糖膏。常規(guī)方法，如分離方法、團塊粉碎法、流化床?；ê蛧婌F干燥法可在本發(fā)明中用于制備有水結(jié)晶的海藻糖糖膏或含有這種糖的結(jié)晶糖類。
在分離時，通常對糖膏進行藍式離心處理，從母液中分離有水結(jié)晶海藻糖，而且，如有必要，可用少量冷水噴霧洗滌該有水結(jié)晶海藻糖，以便制備純度更高的有水結(jié)晶海藻糖。在噴霧干燥時，通過一臺高壓泵從噴嘴中噴出濃度為70～85％(d.s.b.)結(jié)晶度為20～60％(d.s.b.)的糖膏，并用60～100℃的熱空氣(這一溫度不會熔化所得結(jié)晶粉)干燥所得產(chǎn)物；老化所得結(jié)晶粉1-20小時，同時吹送30～60℃的熱空氣，可很容易地制備沒有或基本上沒有吸濕性的結(jié)晶糖類。在團塊粉碎時，通過將含水量為10～20％，結(jié)晶度約為10～60％(d.s.b.)糖膏靜置0.1-3天以使所有的內(nèi)容物結(jié)晶化并固化成塊狀，然后粉碎或切碎所得團塊，可很方便地制備沒有吸濕性或基本上沒有吸濕性的結(jié)晶糖類。
盡管可以通過干燥將有水結(jié)晶海藻糖轉(zhuǎn)化成無水形式的結(jié)晶來制備無水結(jié)晶海藻糖，但是，一般是通過提供一種含水量不到10％的高海藻糖含量的溶液，將這種溶液放入結(jié)晶器內(nèi)，在有晶種存在的情況下將該溶液保持在50～160℃，最好在80～140℃溫度范圍內(nèi)并攪拌，以得到含有無水結(jié)晶海藻糖的糖膏，通過常規(guī)方法如團塊粉碎、流化床粒化和噴霧干燥進行結(jié)晶并分碎該無水結(jié)晶海藻糖來制備這種海藻糖的。
根據(jù)本發(fā)明，所得到的非還原性糖類和含有這種糖的還原性較低的糖類與還原性淀粉部分水解產(chǎn)物相比具有較低的還原力和較高的穩(wěn)定性，正因為如此，這種糖類可以與其它材料特別是氨基酸和含有氨基酸的物質(zhì)如低聚肽和蛋白質(zhì)混合并加工而無須擔(dān)心導(dǎo)致該材料出現(xiàn)不理想的褐變、發(fā)臭和變質(zhì)。與還原性淀粉部分水解產(chǎn)物不同，這種糖類具有較低的還原力和粘度，而且，這種糖中那些具有較低葡萄糖聚合度的糖與水解產(chǎn)物相比具有更為令人滿意的品質(zhì)和更為適中的甜度。
這種非還原性糖類由淀粉酶，如胰腺所產(chǎn)生的α-淀粉酶水解成分子量較低的非還原性低聚糖或麥芽寡糖，而且這種低聚糖易于被α-葡糖苷酶和腸酶水解成葡萄糖和海藻糖分子。所得海藻糖易于被海藻糖易于被海藻水解成葡萄糖。因此，當(dāng)口服這種非還原性糖類和含有這種糖的還原性較低的糖類，以及海藻糖對，它們可以作為人體的能源。這種糖類和海藻糖基本上不含被牙齒所帶的微生物發(fā)酵，這使得它們可被用作牙齒所帶的保護性增香劑。
這種非還原性糖類和含有這種糖的還原性較低的糖類、以及海藻具有令人滿意的穩(wěn)定性和甜度，其結(jié)晶形式可任意與粘接劑如出芽短梗孢糖、羥乙基淀粉和聚乙烯吡咯烷酮一起用作糖衣材料。這種糖類和海藻具有如下特性滲透壓控制能力，填料賦予能力，光澤賦予能力、保濕能力，粘度賦予能力，基本上無發(fā)酵力，防止凝膠化淀粉退化的能力和防止其它糖類結(jié)晶的能力。
無水結(jié)晶海藻糖可適當(dāng)用作食品、化妝品、藥品及其材料和中間制品的干澡劑，并可方便地制成具有令人滿意的穩(wěn)定性和品質(zhì)的粉狀、粒狀和片狀組合物。
因此，這種非還原性糖類和含有這種糖的還原性較低的糖類、以及由這種糖制備成的海藻糖可以在各種組合物中，如食品、煙草、香煙、飼料、寵物食品、化妝品和藥品中被適當(dāng)用作甜味劑、增味劑、質(zhì)量改善劑、穩(wěn)定劑、賦形劑和干燥劑。
這種還原性糖類和含有這種糖的還原性較低的糖類以及由這種糖所制備的海藻糖可原封不動地用作甜度調(diào)味劑。如有必要，可將其與適量的一種或多種其它甜味劑共同使用，例如粉狀糖漿、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、異構(gòu)化糖、蜂蜜、槭糖、低聚異麥芽糖、半乳糖低聚糖、果糖低聚糖、乳蔗糖(Lactosucrose)、山梨醇、麥芽醇、乳醇、二氫查爾酮、卡哈苡苷、α-糖基卡哈苡苷、雷包丁苷(rebaudioside)甘草甜、L-天冬氨酰L-苯丙氨酸甲酯、糖精和丙氨酸和/或填料如糊精、淀粉和乳糖。
這種非還原性糖類和含有這種糖的還原性較低的糖類以及由這種糖制成的粉狀或結(jié)晶海藻糖可以原樣使用，但如有必要，也可在使用之前將其與賦形劑、填充劑和粘合劑混合，制成顆粒、球狀、桿狀(Shot-rods)、板狀、方塊狀和片裝。
這種非還原性糖類、含有這種糖的還原性較低的糖類和由這種糖制備成的海藻糖具有如下特征(i)具有與酸腐味、酸味、咸味、苦味、收斂性酸味和美味物質(zhì)很好地調(diào)和的甜味；(ii)具有很高的耐酸、耐熱性。因此可很有利地將其用作食品和一般甜味劑、增味劑和品質(zhì)改善劑。
這種非還原性糖類、含有這種糖的還原性較低的糖類和由這種糖制備成的海藻糖可用在如下調(diào)味劑中，如氨基酸、肽、醬油、粉狀醬油、“miso”、“funmatsu-miso”(miso粉)、”moromi”(精制日本精酒)、“hishio”(精制醬油)、“furikake”(調(diào)味魚粉)、蛋黃醬、調(diào)味品、醋、“Sanbai-zu”(糖醬、醬油和醋)、“funmatsu-sushi-su”(用于魚片生粉團的醋粉)、“Chuka-no-moto”(中國菜的即用佐料)、“tentsuyu”(一種深油層日式油炸食物的醬)、“mentsuyu”(用于日本細條面的醬)，醬，番茄醬、“yakiniku-no-tare”(用于日本烤肉的醬)、咖喱增稠作料、即用煮鍋調(diào)料、即用醬混配料、dashi-no-moto”(即用原混合配料)、核酸調(diào)味品、混合調(diào)味劑、“mirin”(日本甜清酒)、“Shin-mirin”(一種合成mirin)，餐桌用糖和調(diào)咖啡用糖。
而且，這種非還原性糖類、含有這種糖的還原性較低的糖類和由這鐘糖制備成的海藻糖?？勺杂傻赜糜诮o以下食品增加甜味“wagashi”(日本餅)如“Senbei ”(一種稻米薄餅)、“arare-mochi”(米糕塊)、“Okoshi”(小米-大米糕)、“mochi”(稻米膏)、“manju”(一種帶有豆醬的甜點心)、“uiro”(一種甜的米凍膠)、“an”(一種果醬)、“yokan”(一種豆子的甜凍膠)、“mizu-yokan”(一種軟的赤豆凍膠)、“kingyo-ku”(一種yokan)、果凍、pao de castella和“ame-dama”(一種日本太妃)糖果如甜點心、餅干、薄餅、家常小甜餅、餡餅、布丁、奶油乳酪、乳蛋糕乳酪、奶油松餅、蛋奶烘餅、松軟蛋糕、油炸發(fā)面圈、巧克力、口香糖、焦糖和結(jié)晶蔗糖；冰凍甜點心如冰淇淋和舍伯特氏冰鎮(zhèn)稀釋果汁飲料糖漿如“kajitsu-no-syrup-zuke”(一種制成罐頭的水果)和“korimitsu”(用于創(chuàng)冰的糖漿)糊如面粉糊、花生糊、水果糊和水果醬；加工過的水果和蔬菜如果醬、橘子醬、“syrup-zuke”(一種腌水果)和“toka”(蜜餞)泡菜和腌制食品如“fukujin-zure ”(紅色腌羅卜)、“bettara-zuke”(一種腌制新鮮整蘿卜)、“senmai-zuke”(一種腌制鮮蘿卜條)和rakkyo-zuke”(腌青蔥)泡菜和腌制食品的預(yù)混合物如“takuan-zuke-no-meto”(腌蘿卜的預(yù)混合物)和“hakusai-zuke-no-moto”(腌泡鮮白葡萄的預(yù)混合物)肉制品如火腿和香腸魚肉制品如魚肉火腿和魚肉香腸、“Kamaboko”(汽蒸魚肉膏)、“chikuwa”(一種魚肉膏)和“tenpura”(一種日式深油層炸魚肉膏)“Chinmi”(調(diào)味品)如“uni-no-shiokara”(咸海膽腸)、“ika-no-shiokara”(咸柔魚腸)、“ Su-konbu”(加工過的昆布)“Saki-surume”(干柔魚條)和“fugu-no-mirin-boshi”(一種干燥的用mirin調(diào)味的脹魚)；“tsukudani”(在醬油中熬制的食物)如紫菜、食用野生植物、干柔魚、魚類和貝類家常菜如“nimame”(煮豆)、土豆色拉和“konbu-maki”(昆布卷)奶制品罐裝和瓶裝食品如肉類、魚肉、水果和蔬菜的罐裝食品酒精飲料如合成日本清酒、葡萄糖和裂酒軟飲料如咖啡、茶、可可、果汁、碳酸飲料、酸奶飲料和含有乳酸菌的飲料即用食品如即用布丁混合物、即用熱糕混合物和“sokuseki-shiruco”(一種赤豆湯與稻米糕的即用混合物)和即用湯混合物；以及飲料如嬰兒食品、治療食品、補充營養(yǎng)的食物，肽類食物和冷凍食物還可將其用于改善上述食品的味道和品質(zhì)。
這種非還原性糖類、含有這種糖的還原性較低的糖類和由這種糖制備成海藻糖還可用于飼養(yǎng)動物如家畜、家禽、蜜蜂、家蠶和魚類的飼料和寵物飼料以改善其適口性。這種糖類和海藻糖可以以糊劑和液體形式用作其它制品如煙草、香煙、牙膏、口紅、胭脂、唇膏、內(nèi)服藥、藥片、錠劑、魚肝油滴劑、口香片、口服清涼劑、含漱劑、化妝品和藥品的增甜劑、增味劑、品質(zhì)改善劑和穩(wěn)定劑。
這種非還原性糖類，含有這種糖的還原性較低的糖類和這種糖制備成的海藻糖還可用作易失去其有效成份和活性的生物學(xué)活性物質(zhì)的品質(zhì)改善劑和穩(wěn)定劑，以及作為含有這種生物學(xué)活性物質(zhì)的保健食品和藥品的品質(zhì)改善劑和穩(wěn)定劑。這種生物學(xué)活性物質(zhì)的例子有淋巴因子，如α-、β-和γ-干擾素、腫瘤壞死因子α-(TNF-α)、腫瘤壞死因子-β(TNF-β)、巨噬細胞移動抑制因子、菌落刺激因子、轉(zhuǎn)移因子和白細胞介素-2激素，如胰島素、生長激素、促乳素、促紅細胞生成素、卵胞刺激激素素；生物制品，如BCG疫苗、日本腦炎疫苗、麻疹疫苗、活脊髓灰質(zhì)炎疫苗、天花疫苗、破傷風(fēng)類毒素、竹葉青屬抗毒素和人體免疫球蛋白；抗生素，如青霉素、紅霉素、氯霉素、四環(huán)素、鏈霉素和硫酸卡那霉素；維生素，如VB1、VB2、L-抗壞血酸、魚肝油、類胡蘿卜素、麥角甾醇和維生素E；酶，如脂酶、彈性蛋白酶、尿激酶、蛋白酶、β-淀粉酶、異淀粉酶、葡聚糖酶和乳糖酶；提取物，如人參提取物，電提取物、小球藻提取物、蘆薈提取物和蜂膠提取物活性微生物，如病毒、乳酸桿菌和酵母；以及其它生物學(xué)活性物質(zhì)。如王漿。使用這種非還原性糖類、含有這種糖的還原性較低的糖類和由這種糖制備成的海藻糖，可將上述生物學(xué)活性物質(zhì)適當(dāng)?shù)刂苽涑删哂辛钊藵M意的高穩(wěn)定性和品質(zhì)的保健食品和藥品，無須擔(dān)心其有效成分和活性的損失和失活。
如上所述，將這種非還原性糖類、含有這種糖的還原性較低的糖類和或由這種糖制備成的海藻糖摻入上述組合物的方法包括常規(guī)方法，如混合、揉捏、溶解、熔融、浸泡、滲透、噴灑、涂敷、包覆、噴霧、噴射、結(jié)晶化和固化。這種糖類和海藻糖常以0.1％或更高的用量，最好以1％或更高的用量(d.s.b.)摻入上述組合物。
下面的實施例將更詳細地闡述本發(fā)明。
首先，解釋由一種新的微生物Rhizobium Sp.M-11所產(chǎn)生的非還原性糖類生成淀粉酶的生產(chǎn)、提純和特性；其次，對由Arthrobater Sp.Q36微生物所產(chǎn)生的非還原性糖類生成酶做類似上述有關(guān)Rhizobium Sp.M-11的說明。第三，對由迄今已知的微生物所產(chǎn)生的非還原性糖類生成酶進行說明。
實施例1由Rhizobium Sp.M-11生產(chǎn)非還原性糖類生成酶將由2.0w/v％的麥芽糖、0.5w/v％的胨、0.1w/v％的酵母提取物、0.1w/v％的Na2HPO4、0.1w/v％的KH2PO4和水組成的液體營養(yǎng)培養(yǎng)基調(diào)至pH7.0。
將大約100ml等份的該營養(yǎng)培養(yǎng)基放入500ml的三角瓶中，在120℃高壓滅菌20分鐘以實現(xiàn)消毒，冷卻，接種Rhizobium Sp.M-11(FERE BP-4130)的培養(yǎng)物原液，在以130rpm攪拌條件下、在27℃培養(yǎng)24小時。將所得培養(yǎng)物合并用作菌種培養(yǎng)物。
將大約20L新制備的與上述培養(yǎng)中所用培養(yǎng)基相同的營養(yǎng)培養(yǎng)基放入一個30L的發(fā)酵罐，滅菌、冷卻至30℃，用1w/v％的菌種培養(yǎng)物接種，在30℃、pH6.0-8.0，和好氧條件下攪拌培養(yǎng)24小時。所得培養(yǎng)物具有大約1.5單位/ml的酶活性。將一部分培養(yǎng)物離心使細胞與培養(yǎng)上清液分離，將細胞懸浮在50mM的磷酸緩沖液(pH7.0)中使其達到該部分的原有體積，隨后分析細胞懸浮液和培養(yǎng)物上清液的酶活性，結(jié)果分別為0.6單位/ml和0.9單位/ml。
實施例2酶的提純將大約18L實施例1中所獲得的培養(yǎng)物用“Mini-Rabo”(一種由Dainippon藥品有限公司出售的超高壓細胞破碎裝置，日本，東京)處理，以便破碎細胞。所得混合物以10,000rpm的速度離心30分鐘獲得約16L上清液。向該上清液中加入(NH4)2SO4并使其溶解；達到0.2的飽和度，所得溶液在4℃放置1小時，并以10,000rpm的速度離心30分鐘，獲得上清液。
將(NH4)2SO4溶解在該上清液中得到0.6的飽和度，所得溶液以10.000rpm的速度離心30分鐘獲得沉淀物。將所得沉淀物溶解在10mM的磷酸緩沖液(pH7.0)中，所得溶液用新制備的同一種磷酸緩沖液透折24小時，以10,000rpm的速度離心30分鐘，去除不溶性物質(zhì)。將所得到的360ml透析溶液分成2份，分別用裝有300ml“DEAE-Toyopearl”(Tosoh公司出的產(chǎn)品，一種離子交換劑。日本，東京)的柱進行柱層析。
目標(biāo)酶被吸附在離子交換劑上，并可由新制備的補充有鹽的同一種磷酸緩沖液洗脫。將所得到的具有目標(biāo)酶活性的洗脫液合并，并用補充了2M(NH4)2SO4的新制備的同一種磷酸緩沖液透析。所獲得的透析液以10,000rpm的速度離心30分鐘，除去不溶性物質(zhì)。所得上清液用裝有300ml“Butyl-Toyopeal”(由Tosoh公司出售的疏水凝膠，日本，東京)的柱進行疏水柱層析。吸附在凝膠上的酶由2M至0M的線性梯度的緩沖液洗脫，隨后收集具有酶活性的洗脫液。將所得洗脫液用“ToyopealHW-55”(由Tosoh公司出售的用于凝膠層析的樹脂，日本，東京)進行凝膠過濾層析，隨后收集具有酶活性的餾分。每一提純步驟中酶的活性比活性和產(chǎn)率如表1所示。
表1酶活性 比活 產(chǎn)率純化步驟 (單位) (單位mg蛋白質(zhì)) (％)培養(yǎng)物 26,800 100細胞破碎厲的上清液 20,300 0.10 76用(NH4)2SO4鹽析后的透析液 16,100 0.32 60離子交換柱的洗脫物 11,300 5.5 42疏水柱洗脫物 5,730 98 21凝膠過濾柱洗脫物 3,890 195 15由表1中凝膠過濾柱獲得的洗脫液形式的純化酶制劑，通過7.5％聚丙烯酰胺凝膠電泳確定其純度，在凝膠上只出現(xiàn)一條蛋白質(zhì)譜帶，這表明該制劑是純度較高的電泳均一性酶。
實施例3酶的特性將實施例2中所得到的純化酶制劑用10％的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠進行電泳處理，通過與標(biāo)記蛋白質(zhì)(由日本Bio-Rad實驗室出售，日本，東京)比較表明其分子量約為77,000-87,000道爾頓。
將純化的酶制劑用含有2v/v％“Ampholine”(一種由Pharmacia LKB Biotechnology AB提供的兩性電解質(zhì)，瑞典，烏普薩拉)的聚丙烯酰胺凝膠進行等電點電泳。將所得凝膠切成片，并確定含有這種酶的凝膠片的pH值，以證實這種酶的PI值約為3.6-4.6。
按照用以分析酶活性的方法研究溫度和pH對酶的影響。這些結(jié)果分別示于圖1和2中。當(dāng)在pH7.0、反應(yīng)60分鐘時，該酶的最適溫度為40℃而在溫度為40℃、反應(yīng)60分鐘時，該酶的最適pH為7.0。這種醇的熱穩(wěn)定性是這樣確定的將其放在50mM的磷酸緩沖液(pH7.0)中在不同的溫度下保溫60分鐘，冷卻緩沖并分析每種緩沖液中的殘余酶活性。這種酶的pH穩(wěn)定性是這樣測定的將其放在具有不同的pH的50mM的磷酸的緩沖液中在25℃保溫16小時，將各緩沖液的pH調(diào)整至7.0，分析每種緩沖液中的殘余酶活性。有關(guān)熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性的結(jié)果分別示于圖3和4中。這種酶在40℃左右的溫度下和pH6-9的條件下是穩(wěn)定的。
實施例4非還原性糖類的制備制備一種含有20％葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽戊糖、麥芽己糖或麥芽庚糖的水溶液作為底物，并使其以2單位/g底物(d.s.b.)的比例與實施例2所得純化酶混合，所得混合物在40℃、pH7.0的條件下酶促反應(yīng)48小時。將反應(yīng)混合物脫鹽并用“Wakobeads WB-T-330柱”進行高效液相色譜(HPLC)分析(上述層析柱是由Wako Purre化學(xué)工業(yè)有限公司出售，日本，東京)。HPLC過程是在環(huán)境溫度下進行的，以流速0.5ml/分的水為洗脫液，并用“RI-8012”(一種由Tosoh公司出售的差示析光計，日本，東京)分析反應(yīng)產(chǎn)物。結(jié)果示于表2中。
表2在HPLC上的 百分比底物 產(chǎn)物 洗脫時間(分) (％)葡萄糖 葡萄糖 33.4 100.0麥芽糖 麥芽糖 28.5 100.0麥芽三糖 PI 23.3 35.0麥芽三糖 25.9 65.0麥芽四糖 PII 21.6 85.6麥芽四糖 24.1 14.4麥芽戊糖 PIII 19.7 92.7麥芽戊糖 22.6 7.3麥芽己糖 PIV 18.7 93.5麥芽己糖 21.4 6.5麥芽庚糖 PV 17.8 93.4麥芽庚糖 21.0 6.7注表中符號“PI”、“PII”、“PIII”、“PIV”和“PV”表示相應(yīng)的底物麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽戊糖、麥芽己糖和麥芽庚糖所生成的新糖類。
正如從表2中可以看出的，每種反應(yīng)物基本上都是由殘余底物和新生成的糖類PI、PII、PIII、PIV和PV組成，基本上沒有檢測到其它糖類。它表明，具有4個或4個以上葡萄糖聚合度的PII、PIII、PIV和PV的產(chǎn)率較高，即產(chǎn)率為85％或更高(d.s.b)，而葡萄糖聚合度為3個或3個以上的PI的產(chǎn)率比較低。它還表明，在葡萄糖和麥芽糖中沒有生成新糖類。
為了純化每種反應(yīng)混合物中新生成的糖類，將它們在“XT-1016(Na+-形式，4％的聚合度)”(一種堿金屬強酸性陽離子交換樹脂，東京有機化學(xué)工業(yè)有限公司出品，日本，東京)上進行柱層析。將這種樹脂裝入3根套層不銹鋼柱中，每根柱的內(nèi)徑為2.0cm，長1m，并將3根柱串接在一起，向樹脂中加入5v/v％的含該糖類反應(yīng)混合物，柱內(nèi)溫度保持在55℃，以0.13的SV(空間流速)流速用55℃熱水洗脫，以獲得含有97％或更多新糖類(d.s.b.)的高純度糖類餾分。將該餾分在真空中干燥，以得到新糖的高純度制劑。PI、PII、PIII、PIV和PV的產(chǎn)率相對其原料糖的產(chǎn)率分別約為9％、65％、82％ 、80％和77％(d.s.b.)。PI、PII、PIII、PIV和PV的純度分別為97.5％、98.6％，99.5％、98.4％、和98.4％(d.s.b.)。
這些新糖類的還原力用Somogyi-Nelson′s方法進行測定并用DE(葡萄糖當(dāng)量)表示。所得結(jié)果示于表3。
表3糖制劑 純度(％) DEPI 97.5 0.83PII 98.6 0.35PIII 99.5 0.10PIV 98.4 0.27PV 98.4 0.23
從表3中的結(jié)果可以看出，每種糖制劑僅表現(xiàn)出很微弱的還原力。估計這些微弱的還原力是因為來自底物的殘余還原性麥芽糖低聚糖引起的，由此可得出這樣的結(jié)論新生成的糖類基本上是無還原性的糖類。
實施例5梅拉德反應(yīng)將含有1％甘氨酸和10％的實施例4中的一種PI、PII、PIII、PIV或PV糖制劑以及50mM磷酸緩沖液(pH7.0)的溶液在100℃保持90分鐘，隨后冷卻所得溶液，測定其在480nm波長下在1-cm比色杯中的吸光度。作為對照，將麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽戊糖、麥芽己糖和麥芽庚糖作為糖制劑材料進行類似處理、并測定其在480nm波長下的吸光度。結(jié)果示于表4中。
表4色 度糖制劑 (480nm) 判斷PI 0.027 本發(fā)明PII 0.018 本發(fā)明PIII 0.012 本發(fā)明PIV 0.016 本發(fā)明PV 0.015 本發(fā)明麥芽三糖 0.623 對照麥芽四糖 0.475 對照麥芽戊糖 0.369 對照麥芽己糖 0.318 對照麥芽庚糖 0.271 對照由表4可以看出，新生成的非還原性糖類PI、PII、PIII、PIV和PV只表現(xiàn)出因梅拉德反應(yīng)所致的很微小的著色，即其色度僅為其相應(yīng)麥芽糖低聚糖材料的3-6％。這一結(jié)果表明由這種酶所生成的非還原性糖類基本上不發(fā)生梅拉德反應(yīng)。
實施例6葡糖淀粉酶的酶促水解將實施例4中非還原性糖類PI、PII、PIII、PIV和PV的50mg等分試樣分別溶于1ml 50mM的乙酸鹽緩沖液(pH4.5)中，并與1個單位的葡糖淀粉酶(Sei-Kagaku-Kogyo有限公司出品)相混合，在40℃進行6小時的酶促水解。在HPLC分析時在每種所得混合物中檢測的糖類都是葡萄糖和海藻糖，其分子比率示于表5中。
糖制劑 葡萄糖 海藻糖 分子比率(％) (％) (葡萄糖/海藻糖)PI 36.2 63.8 1.07PII 52.0 48.0 2.06PIII 61.4 38.6 3.02PIV 68.3 31.7 4.09PV 72.9 27.1 5.11由表5中結(jié)果可以看出，(i)非還原性糖PI被水解成1mole的葡萄糖和1mole的海藻糖；(ii)PII被水解成2mole的葡萄糖和1mole的海藻糖(iii)PIII被水解成3mole的葡萄糖和1mole的海藻糖；(iv)PIV被水解成4mole的葡萄糖和1mole的海藻糖；(v)PV被水解成5mole的葡萄糖和1mole的海藻糖。
就葡糖淀粉酶的酶促機制而言，這種非還原性糖類具有由1mole或1mole以上的葡萄糖與1mole的海藻糖通過α-1，4鍵或α-1.6鍵結(jié)合組成的糖結(jié)構(gòu)非還原性糖PI是一種具有3個葡萄糖聚合度(DP3)的非還原性糖，由1mole葡萄糖與1mole海藻糖結(jié)合組成PII，一種具有DP4的非還原性糖，由2mole葡萄糖與1mole海藻糖結(jié)合組成；PIII，一種具有DP5的非還原性糖，由3mole葡萄糖與1mole海藻糖結(jié)合組成；PIV，一種具有DP6的非還原性糖，由4mole葡萄糖與1mole的海藻糖結(jié)合組成PV一種具有DP7的非還原性糖類，由5mole葡萄糖與1mole海藻糖結(jié)合組成。這表明，當(dāng)β-淀粉酶以與葡糖淀粉酶類似方式作用于這種非還原性糖類時，PI和PII不水解，而PIII、PIV和PV分別被水解成1mole麥芽糖和1mole PI、1mole麥芽糖和1mole PII2mole麥芽糖和1mole PI。
基于上述結(jié)果，可得出這樣的結(jié)論這種非還原性糖類生成酶的酶促反應(yīng)是一種不改變所用底物分子量的分子內(nèi)反應(yīng)，即一種不改變其葡萄糖聚合度的分子內(nèi)反應(yīng)。結(jié)論是，非還原性糖類PI、PII、PIII、PIV和PV是相應(yīng)的α-糖基海藻糖類(Gn-T，其中符號G是指葡萄糖殘基符號“n”是指一個或多個整數(shù)；符號“T”是指α，α-海藻糖殘基)α-葡糖基海藻、α-麥芽糖基海藻糖、α-麥芽三糖基海藻糖、α-麥芽四糖基海藻糖和α-麥芽戊糖基海藻糖。
實施例7酶促水解以實施例4中的非還原性糖PI、PII、PIII、PIV或pV為底物，用得自豬胰臟的α-淀粉酶樣品、得自稻米的α-葡糖苷酶樣品或鼠腸丙酮粉(這些酶均是Sigma化學(xué)公司的產(chǎn)品，美國，圣·路易絲卅)進行處理，所得每種水解產(chǎn)物用HPLC分析以了解其糖組成。α-淀粉酶的酶促反應(yīng)如下將10mg底物溶解在1ml 50mM的磷酸緩沖液中(pH6.9)，將所得溶液與1單位α-淀粉酶混合，將所得混合物在37℃溫育18小時。α-葡糖苷酶的酶促反應(yīng)是在與α-淀粉酶的酶促反應(yīng)相同的條件下進行的，只是以50mM乙酸緩沖液(pH4.0)為緩沖液。鼠腸丙酮粉的酶促反應(yīng)是在以與α-淀粉酶酶促反應(yīng)相同的條件下進行的，只是緩沖液用的是50mM順丁烯二酸緩沖液(pH6.0)。由α-淀粉酶、α-葡糖苷酶和鼠腸兩酮粉所得糖的組成情況示于表6、7和8中。
表6水解產(chǎn)物的糖類組成糖類 PI PII G3 G2 G1PI 97.3 0 2.3 0.4 0PII 0 98.8 0.4 0.8 0PIII 61.0 4.8 0 33.0 1.2PIV 47.2 3.3 40.4 7.5 1.6PV 10.2 44.9 35.3 8.6 1.0注表中符號“G3”、“G2”和“G1”分別表示麥芽三糖、麥芽糖和葡萄糖。
表7α-葡糖苷酶的水解產(chǎn)物的糖類組成糖類 葡萄糖 海藻糖 其它糖類(％) (％) (％)PI 36.5 63.0 0.5PII 52.1 47.6 0.3PIII 61.7 38.1 0.2PIV 69.5 30.2 0.3PV 71.4 28.3 0.3表8鼠腸丙酮粉的水解產(chǎn)物的組成糖類 葡萄糖 海藻糖 其它糖類(％) (％) (％)PI 37.2 62.4 0.4PII 52.5 47.1 0.4PIII 62.0 37.6 0.4PIV 68.8 30.8 0.4PV 73.4 26.5 0.1從表6中可以看出，糖制劑PI和PII基本上不被α-淀粉酶水解，而糖制劑PIII、PIV和PV則可由α-淀粉酶水解成低分子量的低聚糖PI、PII、麥芽三糖、麥芽糖和葡萄糖。
從表7和8中結(jié)果可以看出，與例6中葡萄糖淀粉酶類似，糖類制劑PI、PII、PIII、PIV和PV由α-葡糖苷酶和鼠腸酮粉水解成葡萄糖和海藻糖分子。
向所得α-葡糖苷酶或鼠腸丙酮粉的水解產(chǎn)物中加入1個單位的得自豬腎的海藻酶(Sigma化學(xué)公司的酶制劑，圣·路易絲卅，美國)接著在HPLC上分析這種糖的組成，以揭示由糖制劑PI、PII、PIII、PIV和PV生成的海藻糖被海藻糖酶水解成葡萄糖分子。
這些觀察結(jié)果總結(jié)如下(1)這種非還原性糖類生成酶作用于具有3個或3個以上葡萄糖聚合度的一種或多鐘還原性淀粉部分水解產(chǎn)物可生成具有海藻糖結(jié)構(gòu)的非還原性糖類而又不改變其葡萄糖聚合度；(2)非還原性糖PV主要由α-淀粉酶水解成非還原性糖PII和麥芽三糖，而非還原性糖PII由葡糖淀粉酶水解成1mole藻糖和2mole葡萄糖。
基于這些結(jié)果，可得出這樣的結(jié)論這種非還原性糖類生成酶是一種新酶，它能在分子內(nèi)作用將還原性淀粉部分水解產(chǎn)物的還原性末端單元轉(zhuǎn)化為一種非還原性末端單元海藻糖結(jié)構(gòu)。
實施例8急性毒性試驗以7周齡的dd-品系小鼠為試驗對象，給小鼠口服非還原性糖類制劑PI、PII、PIII、PIV或PV對其進行急性毒性試驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些糖劑是毒性較低的安全物質(zhì)，并且，即使給它們服用最大可能的劑量時也沒有小鼠死亡。盡管不是很準(zhǔn)確，這種糖類制劑的LD50值為50g/Kg或更高。
實施例9由Arthrobacter SP·Q36生產(chǎn)非還原性糖類生成酶與實施例1相似，用Arthrobacter SP·Q36(FERM BP-4316)菌種培養(yǎng)物代替Rhizobium SP·M-11(FERM BP-4130)，由發(fā)酵罐培養(yǎng)72小時。所得培養(yǎng)物中非還原性糖類生成酶的酶活性大約為1.2單位/ml。與在實施例1中相似，測試由所得培養(yǎng)物制備的細胞懸浮液和上清液的活性，結(jié)果分別約為0.5和0.7單位/ml。
實施例10酶的提純采用大約18L用實施例9方法所獲的培養(yǎng)物，以與實施例2類似方法純化。所得非還原性糖類生成酶每個純化步驟的結(jié)果制成表9。
表 9提純步驟 用酶*活性 比活 產(chǎn)率(單位) (單位mg蛋白質(zhì)) (％)培養(yǎng) 21,600 100細胞破碎后的上清液 17,500 0.14 81用(NH4)SO4鹽析后的透析溶液 15,700 0.41 73離子交換柱洗脫物 12,600 6.5 58疏水柱洗脫物 8,820 98 41凝膠過濾柱洗脫物 5,290 201 24注符號“*”表示一種非還原性糖類生成酶。
以表9中凝膠過濾洗脫物形式獲得的純化酶制劑用實施例2類似的電泳方法分析其純度，發(fā)現(xiàn)僅一條蛋白質(zhì)帶，這表明這種酶制劑是一種在電泳時具有單一譜帶的較高純度的酶。
實施例11酶的特性用SDS-PAGE測定實施例10中所獲純化酶制劑的分子量，結(jié)果約為76,000-86,000道爾頓。用與實施例3相似的等電電泳法確定該酶制劑的PI所得PI約為3.6～4.6。以與實施例3相似的方式分析溫度和pH對酶制劑的影響，以及酶的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性。有關(guān)溫度、pH、熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性的結(jié)果分別示出圖5、6、7和8中。
從上述諸圖中可以看出，該酶制劑的最適溫度約為40℃；最適pH約為6.5-7.0；熱穩(wěn)定性在40℃左右pH穩(wěn)定性大約為6.0-9.5。
實施例12非還原性糖類的制備采用實施例10所獲得的純化酶制劑，按照實施例4和6的方法實驗非還原性糖類的制備和結(jié)構(gòu)的確定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)其作用于具有3個或3個以上葡萄糖聚合度的一種或多種還原性淀粉部分水解產(chǎn)物時，這種酶能生成一種或多種以海藻糖結(jié)構(gòu)為末端單元且具有3個或3個以上葡萄糖聚合度的非還原性糖類。
實施例13由已知微生物制備非還原性糖類生成酶以及這種酶的特性將那些已被證實能產(chǎn)生這種非還原性糖類生成酶的、已知微生物中列于表10中的微生物，以與實施例1類似方法用發(fā)酵罐在27℃培養(yǎng)72小時，只不過有一種微生物-恥垢分枝桿菌(MycobacteriumSmegma-tis)(ATCC19420)是在37℃培養(yǎng)。將18L每種所得培養(yǎng)物用細胞破碎裝置處理，所得上清液用(NH4)2SO4鹽析、透析并用離子交換柱層析，以得到部分純化的酶制劑，隨后分析其特性。
結(jié)果制成表10。
表 10離子交換柱洗 最適 最適 熱穩(wěn) pH微生物 脫物的酶活 溫度 pH 定性 穩(wěn)定性(單位) (℃) (℃)Brevibacterium 約 約 高達約 約helovolum 2,700 35 6.5 35 5.5-11.0(ATCC 11822)Flavobacterium 約 約 高達約 約aquatile 216 35 6.5-6.9 35 6.0-9.5(IFO 3772)micrococcus 約 約 高達約 約luteus 1,730 35 6.4-6.8 35 6.5-8.0(IFO 3064)Micrococcus 約 約 高達約 約roseus 1,340 35 6.8-7.2 35 6.0-11.0(ATCC 186)Curtobacterium 約 約 高達約 約citreum 1,290 30 6.4-6.8 35 6.5-7.8(IFO 15231)Mycobacterium 約 約 高達約 約smegmatis 35 8 35 6.5 35 6.0-9.0(ATCC 19420)
Terrabacter 約 約 高達約 約tumescens 1,050 35 6.5-7.0 35 6.0-9.5(IFO 12960)Rhizobium Sp. 約 約 高達約 約M-11 11,300 40 7.0 40 6.0-9.0(FERM BP-4310)Arthrobacter 約 約 高達約 約Sp.Q36 12,600 40 6.5-7.0 40 6.0-9.5(FERM BP-4316)按照實施例12的方法，采用由這些已知的微生物制得的部分純化酶制劑制備非還原性糖類，對其結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)，與來自Rhizobium Sp.M-11的非還原性糖類生成酶相似，當(dāng)每種酶制劑作用于一種或多種具有3個或3個以上葡萄糖聚合度的還原性淀粉部分水解產(chǎn)物時，生成以海藻糖結(jié)構(gòu)為末端單元的具有3個或3個以上葡萄糖聚合度的非還原性糖類。
實例14非還原性糖類生成酶的部分氨基酸序列實例14(1)含有N-末端的氨基酸序列將一部分用實施例2方法得到來自Rhizobium Sp.M-11的純化酶制劑，和一部分用實施例10方法得到的來自Arthrobacter Sp.Q36的純化酶制劑用蒸餾水透析，并將所得每種制劑的80μg蛋白質(zhì)用作樣品，測定其含有N-末端的氨基酸序列。該氨基酸序列用“蛋白質(zhì)測定儀Model 473A”(Applied Biosytem，Inc.的一種裝置，福斯特市，美國)分析，以弄清其N-末端的10個氨基酸殘基。這些酶制劑的含有N-末端的氨基酸序列示于表11中。
表11來源 含有N-末端的部分氨基酸序列Rhizobium Sp.M-11 纈氨酸(或甲硫氨酸)-精氨基-蘇氨酸-脯氨酸-丙氨酸-絲氨酸-蘇氨酸-酪氨酸-精氨酸-亮氨酸-Arthrobacter Sp.Q36 甲硫氨酸-精氨酸-蘇氨酸-脯氨酸-纈氨酸-絲氨酸-蘇氨酸-酪氨酸-精氨酸-亮氨酸從表11可以看出，來自Rhizobium Sp.M-11的酶制劑的含有N-末端的部分氨基酸序列與來自Arthrobacter Sp.q36的含有N-末端的部分氨基酸序列的不同點在于前者的N-末端氨基酸殘基是纈氨酸或甲硫氨酸，而后者為甲硫氨酸，但是它們在所分析的10個氨基酸殘基中有8個是相同的。更具體地說，它們在位于N-末端起第二個氨基酸殘基的精氨酸和位于N-末端起第四個氨基酸殘基的脯氨酸之間的三個氨基酸殘基組成的序列是完全一致的；而且在位于N-末端起第六個氨酸殘基L-絲氨酸與第十個氨基酸殘基L-亮氨酸之間的五個氨基酸殘基組成的序列也是一樣的。這說明這些酶制劑的含有N-末端的序列是部分相同的X1-精氨酸-蘇氨酸-脯氨酸-X2-絲氨酸-蘇氨酸-酪氨酸-精氨酸-亮氨酸(其中“X1”指纈氨酸或甲硫氨酸，“X2”指丙氨酸或纈氨酸)。
實施例14(2)內(nèi)部部分氨基酸序列將一部分用實施例2方法得到的來自Rhizobium Sp.M-11的純化酶制劑，和一部分用實施例10方法得到的來自Arthrobacter Sp.Q36的純化酶制劑用10mM的Tris-HCL緩沖液(pH9.0)透析，所得產(chǎn)物分別用同一種新配制的緩沖液稀釋至大約1mg/ml的濃度。向所得溶液的1ml等分式樣中加入10μg“賴氨酰內(nèi)肽酶”(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.的產(chǎn)品，日本，東京)，并在30℃反應(yīng)22小時以生成肽。所得混合物用反相高效液相色譜(反相HPLC)處理，以分離肽差。用于分離來自Rhizobium Sp.M-11的酶制劑的肽的反相HPLC裝置是直徑4.6mm、長250mm的“CAPCELLPAK C18”(Shisendo有限公司的產(chǎn)品，日本，東京)流速0.6ml/分溫度為環(huán)境溫度；洗脫時間60分鐘以含有0.1v/v％三氟乙酸和乙腈的濃度在16-48v/v％之間的梯度，線性梯度溶液為洗脫液。用于在反相HPLC分離來自Arthobacter SpQ36的酶制劑的裝置和條件為直徑2.1mm、長150mm的“μ-Bondapak C18柱”(Waters ChromatographyDiv.，Millipore Corp.，Milford，USA)流速0.9ml/分；溫度為環(huán)境溫度；洗脫時間60分鐘以含有0.1v/v ％三氟乙酸和乙腈的濃度在30-55v/v％的梯度、線性梯度溶液洗脫。通過監(jiān)視210nm液長的吸光度檢測從柱上洗脫的肽。在分離并存的肽類之后，從來自Rhizobium Sp.M-11的酶制劑中回收到滯留時間分別為37、40、42的三種名為R37、R40、R42的肽，從來自Arthrobacter Sp.Q36的酶制劑中回收到滯留時間分別為17、22和40的三種名為A17、A22和A40的肽，隨后真空干燥所得到的肽，并將其溶解在具有不同濃度的0.1～0.5％乙腈的200μl的等分溶液中。由此獲得的每種肽的樣品用蛋白質(zhì)測序儀分析其10個氨基酸殘基的氨基酸順序。所分析的內(nèi)部部分氨基酸順序示于表12中。
表12來源 肽 內(nèi)部部分氨基酸序列R37 Gly-Val-Glu-Asp-Thr-Ala-Phe-Phe-Arg-Tyr-Rhizobium Sp. R40 Leu-Val-Glu-Leu-Thr-Met-Pro-Gly-Val-Pro-M-11 R42 Glu-Glu-Arg-Gly-Ser-Pro-Tyr-Ala-Val-Ala-A17 Gly-Val-Glu-Asp-Thr-Ala-Phe-Phe-Arg-Tyr-Arthrobacter A22 Leu-Val-Glu-Leu-Thr-Met-Pro-Gly-Val-Pro-Sp.Q36 A40 Glu-Gly-Arg-Glu-Ser-Arg-Tyr-Ala-Glu-Ala-從表12可以看出，來自Rhizobium Sp.M-11的酶制劑的肽R37的部分氨基酸序列與肽A17的氨基酸序列完全一致，而肽R40與肽A22的氨基酸序列完全一致。就肽R42和A40而論，在所分析的10個氨基酸殘基中有7個殘基是相同的；即肽R42和A40具有部分相同的氨基酸序列Glu-Gly-Arg-X3-Ser-X4-Tyr-Ala-X5-Ala(其中“X3”指Gly或Glu“X4”指Pro或Arg“X5”指Val或Glu)。
隨后的實施例A說明這種非還原性糖類、含有這種糖的還原性較低的糖類和海藻糖的制備；實施例B說明含有一種或多種這些糖類和海藻糖的組合物。
實例A-1按照實施例1中所述方法，將Rhizobium Sp.M-11(FERMBP-4130)的菌種培養(yǎng)物接種在營養(yǎng)培養(yǎng)基中，并用一發(fā)酵罐培養(yǎng)36小時。在培養(yǎng)結(jié)束后，將所得培養(yǎng)物過濾，用SF-膜過濾除去細胞，獲得大約18L濾液，然后用UF-膜濃縮成約1L含有17.7單位/ml這種糖類生成酶的濃縮溶液。
將6％的馬鈴薯淀粉懸浮液(d.s.b.)加熱凝膠化，調(diào)整至pH4.5和50℃，與異化淀粉酶(Hayashibara BiochemicalLaboratories Inc.，的產(chǎn)品Okayama，日本)以2,500單位/克淀粉的比例混合，并酶促反應(yīng)20小時。所得混合物的pH調(diào)至6.0在120℃高壓滅菌10分鐘，冷卻至45℃，與150單位/g淀粉的“Termamyl 60L”(一種由Novo Industri A/S出售的α-淀粉酶，哥本哈根，丹麥)混合并酶促反應(yīng)24小時。
將反應(yīng)混合物在120℃高壓滅菌20分鐘，冷卻至45℃，以1單位/g淀粉的用量與上述非還原性糖類生成酶混合，酶促反應(yīng)96小時。所得混合物在95℃保持10分鐘，冷卻并過濾。所得濾液以常規(guī)方法用活性碳脫色，并用H-形或OH-形的離子交換樹脂脫鹽純化。將所得溶液濃縮成70％的糖漿，產(chǎn)率約為91％(d.s.b.)。
該產(chǎn)品表現(xiàn)出DE18.8的還原力，并含有8.3％PI、5.5％PII、37.7％PIII、1.4％PIV和1.3％PV(d.s.b.)。該產(chǎn)品具有適中的高質(zhì)量甜度，以及適當(dāng)?shù)恼扯群捅啬芰ΑＲ虼?，可將其適當(dāng)用作食品、化妝品和藥品的增甜劑、增味劑、質(zhì)量改善劑、穩(wěn)定劑和填充劑。
實施例A-2將實施例A1中所獲糖溶液作為供料液采用裝有“XT-1016(Na+-形，聚合度4％)”(一種堿金屬強酸性陽離子交換樹脂，東京有機化學(xué)工業(yè)有限公司出品，東京，日本)的柱分級分離。該方法如下將樹脂裝入4根內(nèi)徑為5.4cm的夾層不銹鋼柱，并將4根柱串接在一起使凝膠床的總厚度達20m。將柱子加熱至柱內(nèi)溫度55℃，加注5v/v％的糖類溶液同時保持55℃的溫度，通過向柱中注入55℃的熱水對糖溶液進行分級分離，除去富含葡萄糖和麥芽糖的餾分，隨后回收富含非還原性糖的餾分。將富含非還原性糖的餾分合并、純化、濃縮、真空干燥并粉碎，以獲得含有非還原性糖類的粉狀制品，產(chǎn)率61％(d.s.b.)。
該制品表現(xiàn)出DE5.7的還原力，含有9.3％PI、7.4％PII、55.5％PIII、2.1％PIV和1.9％PV(d.s.b.)。與例A-1中產(chǎn)品類似。該產(chǎn)品也具有適中的高質(zhì)量甜度，以及適當(dāng)?shù)恼扯鹊谋ＫΓ虼耸蛊淠軌蜻m當(dāng)用作食品、化妝品和藥品的甜味劑、增味劑、質(zhì)量改善劑、穩(wěn)定劑和填料。
實例A-3將33％的玉米淀粉懸浮液(d.s.b.)與CaCO4混合達到0.1％(d.s.b.)的最終濃度，將所得混合物調(diào)至pH6.5，并以每克淀粉0.2％(d.s.b.)的用量混入“Teramyl 60L”(一種由XoVo Industri A/S 生產(chǎn)的α-淀粉酶，哥本哈根，丹麥)，在95℃酶促反應(yīng)15分鐘。反應(yīng)混合物在120℃高壓滅菌10分鐘，冷卻至55℃，以每克淀粉5個單位的比例與麥芽糖生成淀粉酶(Hayashibara BiochemicalLaboratories Inc.出品，Okayama，日本)混合，酶促反應(yīng)6小時。所得混合物以每克淀粉30個單位的比例與“α-淀粉酶 2A”(Ueda Chemical Co.Ltd，出品，Osaka，日本)混合，并在65℃酶促反應(yīng)4小時。反應(yīng)混合物在120℃酶促反應(yīng)10分鐘，冷卻至45℃，以每克淀粉2單位的比例與例A-1中所獲非還原性糖類生成酶混合，并酶促反應(yīng)64小時。所得混合物在95℃保持10分鐘，冷卻并過濾，得到濾液，以常規(guī)方法用活性碳使其濾液脫色，用H-和OH-形的離子交換樹脂使其脫鹽純化，隨后濃縮所得溶液，得到70％的糖漿，產(chǎn)率約為90％(d.s.b.)。
所得產(chǎn)品表現(xiàn)出DE10.5的還原力，并含有3.7％PI、43.7％PII、1.2％PIII、1.1％PIV和0.6％PV(d.s.b.)。該產(chǎn)品具有適中的高品質(zhì)甜度，以及適當(dāng)?shù)恼扯群捅Ｋ?，因此使得它能夠適當(dāng)用作食品、化妝品和藥品的甜味劑、增味劑、品質(zhì)改善劑、穩(wěn)定劑和填充劑。
實例A-4由實施例A-3方法所得到的作為補充液的糖溶液按照實施例A-2方法進行柱色譜，不同的是，采用“50W-X4(Mg++-形)“(一種強酸性陽離子交換樹脂，Dow chemical Co.出品，Midland，Michigan，美國)作為分離樹脂，以提高非還原性糖PII(DP4)的含量并獲得富含PII非還原性糖類的餾分。將該餾分提純、濃縮并噴霧干燥，以獲得富含非還原性糖類的粉狀制品，產(chǎn)率約為40％(d.s.b.)。
該產(chǎn)品含有8.5％PI、68.0％PII和1.4％PIII(d.s.b.)的非還原性糖，并表現(xiàn)出DE3.5，且基本上沒有或較低的還原力。與實施例A-3中的產(chǎn)品相似，該產(chǎn)品具有適中的高品質(zhì)和甜度，以及適當(dāng)?shù)恼扯群捅Ｋ?，這使其能夠適當(dāng)用作食品、化妝品和藥品的甜味劑、增味劑、品質(zhì)改善劑、穩(wěn)定劑和填充劑。
實施例A-5向20％的麥芽戊糖水溶液(Hayasibara BiochemicalLaboratories Inc.出品，Okayama，日本)中加入1.0單位/克麥芽戊糖量的實施例A-1方法制備的非還原性糖類生成酶，并在45℃酶促反應(yīng)48小時。該酶促反應(yīng)的結(jié)果將約93％(d.s.b.)的麥芽戊糖轉(zhuǎn)化為非還原性糖PIII。將反應(yīng)混合物在95℃保溫10分鐘，冷卻并過濾，得到濾液并以常規(guī)方法用活性碳脫色，用H-和OH-形的離子交換樹脂脫鹽并濃縮。為了提高非還原性PIII(DP5)的含量，所得濃縮物以與實施例A-2類似的柱色譜法、采用堿金屬強酸性陽離子交換樹脂分離得到富含PIII的餾分。將該餾分提純、濃縮并噴霧干燥，以獲得含有高純度非還原性糖類的粉狀制品，產(chǎn)率約為55％(d.s.b.)。
該產(chǎn)品含有99.0％的PIII非還原性糖(d.s.b.)，并表現(xiàn)出低于0.2的DE值，其還原力極低。該產(chǎn)品具有較輕的甜度，并可適當(dāng)用作食品、化妝品和藥品的甜味劑、增味劑、品質(zhì)改善劑和穩(wěn)定劑。
實例A-6將40份重量的“PINE-DEX #4”(MatsutaniChemical Inc.出品的一種淀粉部分水解產(chǎn)物，東京，日本)溶解在60份重量的水中，并將所得溶液加熱至45℃，調(diào)至pH6.5，將每克淀粉部分水解產(chǎn)物與1單位的由實施例A-1方法制備的非還原性糖類生成酶混合，酶促反應(yīng)96小時，同時保持45℃的溫度和pH6.5。隨后，將反應(yīng)混合物加熱至100℃保持10分鐘，以使殘余的酶失活，稀釋至大約20％(d.s.b.)的濃度，將每克淀粉部分水解產(chǎn)物與10單位的“GLUCOZYME”(由Nagase Biochemicals，Ltd.出品的葡糖淀粉酶，Kyoto，日本)，酶促反應(yīng)40小時，隨后加熱所得混合物使殘余的酶失活。由此獲得的混合物以常規(guī)方法用活性碳脫色，用離子交換樹脂脫鹽，濃縮至大約60％的濃度(d.s.b.)。
由此獲得的糖溶液含有29.5％的海藻糖(d.s.b.)。該糖溶液按照實施例A-2的方法進行柱色譜，不同的是將“CG6000(Na+-形)”(一種強酸性陽離子交換樹脂，由日本Organo Co.，Ltd.出品，東京，日本)用作分離樹脂，接著回收富含海藻糖餾分。該餾分含有大約90％海藻糖(d.s.b.)。將該餾分濃縮成約75％的溶液。然后放入結(jié)晶器中，與作為晶種的約2％(d.s.b.)的有水結(jié)晶海藻糖混合并逐步冷卻，得到結(jié)晶度約為45％的糖膏。該糖膏由裝在噴霧塔上的噴嘴以150Kg/cm2的壓力噴霧。在噴霧步驟中，糖膏由從噴霧塔頂部吹送來的85℃的熱空氣同步烘干，所得的結(jié)晶粉由裝在塔底部的金屬線網(wǎng)織的輸送帶收集并逐步離開噴霧塔，同時一般40℃的氣流向上吹過金屬線網(wǎng)。所得結(jié)晶粉被注入老化塔中老化10小時，以完成結(jié)晶和干燥。隨后回收粉狀有水結(jié)晶海藻糖。
該產(chǎn)品基本上未表現(xiàn)出吸濕性并具有令人滿意的可處理性，因而使其能夠適當(dāng)用作食品、化妝品和藥品的甜味劑、增味劑、質(zhì)量改善劑、穩(wěn)定劑和填充劑。
實施例A-7通過攪拌將1份重量的馬鈴薯淀粉與6份重量含有0.01％“NEO-SPIIASE”(一種由Negase Biochemicals，Ltd.出品的α-淀粉酶，Kyoto.日本)/克淀粉的水混合，將所得懸浮液調(diào)整至pH6.0，加熱至85-90℃，在此溫度下同時凝膠化和液化。隨后，馬上將所得產(chǎn)物加熱至120℃保持5分鐘以保持DE值在1.0以下，迅速冷卻至55℃，調(diào)整至pH7.0，每克淀粉與150單位“PullulANASE(EC3.2.1.41)”(由HayashibaraBiochemical Labovatories，Inc.出的一種酶.Okayama，日本)和8單位的實施例A-3所述的麥芽糖生成酶混合，在pH7.0、50℃條件下酶促反應(yīng)36小時。
將反應(yīng)混合物高壓滅菌120℃ 10分鐘，冷卻至45℃，以每克淀粉2單位的比例與按實施例13中方法從Brevibacteriumhelovolum ATCC 11822中制備的非還原性糖類生成酶混合，并進行酶促反應(yīng)64小時。該反應(yīng)混合物加熱至95℃10分鐘，冷卻并過濾。將所得過濾液用活性炭以常規(guī)方式脫色，用H-和OH-形離子交換樹脂脫鹽并純化。將所得溶液濃縮并噴霧干燥以獲得一種粉狀非還原性糖類，收率大約90％，d.s.b.，該產(chǎn)物表現(xiàn)出一種DE11.2，含有2.9％PI，61.5 ％PII，和0.8％PIII，(d.s.b.)，并具有中等的高品質(zhì)甜味，以及滿意的粘度和保濕能力，并且這些特性使得該產(chǎn)品可適宜地用作如食品、化妝品和藥物的組合物中的甜味劑、調(diào)味劑、品質(zhì)改善劑和穩(wěn)定劑。
實施例A-8將一種微生物Arthrobacter Sp.Q36(FERM BP-4316)的種菌培養(yǎng)物接種到一種營養(yǎng)培養(yǎng)基中，并按照實施例9中的方法在一個發(fā)酵罐中培養(yǎng)72小時。將所得培養(yǎng)物離心以去除細胞，再用一種UF膜將所得上清液濃縮10倍，獲得一種含有約15.2單位/ml本發(fā)明非還原性糖類生成酶的酶溶液。
按照實施例A-3的方法，用α-淀粉酶樣品(NoVo IndustriA/S出品，哥本哈根，丹麥)、麥芽糖生成淀粉酶樣品(HayashibaraBiochemical Laboratories，Inc.出品，Okayama，日本)和α-淀粉酶樣品(Ueda Chemical Co.，Ltd，出品，Osaka，日本)處理30％的玉米淀粉懸浮液。將所得混合物在120℃高壓滅菌，冷卻至45℃，將每克淀粉與2單位由上述方法制備的非還原性糖類生成酶混合，并酶促反應(yīng)64小時。將反應(yīng)混合物在100℃保持10分鐘以使殘余的酶失活。按照實施例A-6的方法。所得溶液用葡糖淀粉酶(Nagase Biochemicals.Ltd.，出品，Kyoto，日本)處理，脫色、脫鹽并濃縮成大約60％的溶液，由此獲得的糖溶液含有約25％(d.s.b.)的海藻糖。這種糖溶液由采用強酸性陽離子交換樹脂的柱色譜進行分離。獲得富含海藻糖的餾分。合并這些餾分，并放入一容器中減壓熬煮成水分含量為4.0％的糖漿。將該糖漿放入結(jié)晶器中，并混入作為種品的無機結(jié)晶海藻糖1％(相對糖漿的d.s.b.)，隨后在95℃結(jié)晶無水結(jié)晶海藻糖5分鐘，同時攪拌。將所得產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到鋁質(zhì)容器中在100℃老化6小時，以使其結(jié)成團塊。所得團塊由切割機粉碎，并進行流化床干燥，以獲得含水量約為0.3％的粉狀無水結(jié)晶海藻糖。
該產(chǎn)品可適當(dāng)用作有水物質(zhì)如食品、化妝品和藥品及其材料和中間制品的脫水劑，并可作為高品質(zhì)、甜度適中的甜味劑。
實施例B-1甜味劑向一份重量的用實施例A-4方法獲得的富含非還原性糖類的粉狀制品中均勻混入0.01份重量的“αG sweet”(α-糖基蛇菊苷，Toyo Sugar Refining Co.，Ltd.的產(chǎn)品，東京，日本)和0.01份重量的L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯(AjinomotoCo.，Ltd.產(chǎn)品)，將該混合物裝入顆粒機得到粒狀甜味劑。該制品具有令人滿意的甜度，其增甜能力比蔗糖高2倍，而熱量僅為蔗糖的1/2。
該產(chǎn)品具有令人滿意的穩(wěn)定性，當(dāng)它同甜度較高的增甜劑混合時即不會對后者有影響又不會使之分解，因此，可將其用作專供肥胖者和糖尿病患者那些限于低熱攝入量者食用的低熱食品的低熱增甜劑。
當(dāng)牙載微生物對其起作用時，該產(chǎn)品極少產(chǎn)生酸和不溶性葡聚糖，這使得它能用于保護牙齒的食物。
實例B-2硬糖果將100份重量的55％蔗糖溶液與30份重量的含有用實施例A-3方法所得非還原性糖類的糖漿混合，將所得混合物在真空中加熱濃縮至水分含量低于2％。該濃縮液與1份重量檸檬酸和足量的檸檬香料及著色劑混合，所得混合物以常規(guī)方法成形，得到所需產(chǎn)品。
該產(chǎn)品是一種優(yōu)質(zhì)硬糖，具有令人滿意的味道和咀嚼性能，而且不用擔(dān)心變形和引起蔗糖結(jié)晶化。
實例B-3香口膠將3份重量的樹膠基加熱軟化至熔化，所得產(chǎn)物與4份重量的蔗糖和3份重量的用實施例A-6方法所得的有水結(jié)晶海藻糖粉混合，并進一步與足量的香料和著色劑混合。所得混合物以常規(guī)方法滾動攪拌，成形并包裝，以獲得需要的產(chǎn)品。
該產(chǎn)品是一種具有令人滿意的織地和味道的口香膠。
實例B-4增甜煉乳將3份重量的用實施例A-1方法所獲得的含有非還原性糖類的糖漿和1份重量的蔗糖溶解在100份重量的鮮奶中，所得溶液由一平底加熱器加熱消毒，并濃縮成70％的溶液，隨后將產(chǎn)物無菌包裝成所需產(chǎn)品。
該產(chǎn)品具有適中的甜度和令人滿意的味道，可適當(dāng)用作嬰兒食品、水果、咖啡、可可和茶的調(diào)味劑。
實施例B-5含有乳酸菌的飲料將175份重量的脫脂牛奶、80份重量的用實施例A-2方法所獲高含非還原性糖量的粉和50份重量的在日本專利公開號281,795/92中所公開的高乳蔗糖(Lactosucrose)含量的粉溶于1,200份重量的水中，將得溶液在65℃加熱30分鐘消毒，冷卻至40℃，以常規(guī)方法與30份重量的作為促酵物的乳酸菌混合并在37℃培養(yǎng)8小時，得到含有乳酸菌的飲料。
該產(chǎn)品是一種含有乳酸菌、具有令人滿意的味道和香味的飲料。這種含有低聚糖類的產(chǎn)品可穩(wěn)定維持乳酸菌并促進雙歧桿菌的生長。
實例B-6果汁粉劑飲料將33份重量通過噴霧干燥制備的橙汁粉與用實施例A-2方法所獲得的50份重量的富含非還原性糖類的粉、10份重量的蔗糖、0.65份重量的無水檸檬酸、0.1份重量的蘋果酸、0.1份重量的L-抗壞血酸、0.1份重量的檸檬酸鈉、0.5份重量的葡聚糖和足量的香料粉在攪拌條件下混合均勻。將所得混合物粉碎，送入流化床制粒機內(nèi)?；?0分鐘，向其噴灑用實施例1方法所獲作為粘接劑的含有非還原性糖類的糖漿，同時向內(nèi)容物吹送40℃的空氣對所獲顆粒稱重并包裝，獲得所需產(chǎn)品。
該產(chǎn)品含有30％(d.s.b.)的橙汁。該產(chǎn)品在相當(dāng)長的時期內(nèi)都是穩(wěn)定的，不會產(chǎn)生不良的味道和氣味。
實施例B-7乳蛋糕乳脂將100份重量的玉米淀粉，100份重量由實施例A-3方法得到的合有非還原性糖類的糖漿，80份重量的麥芽糖，20份重量的蔗糖和一份重量的鹽均勻混合。所得混合物與280份重量的雞蛋混合，并逐漸加入1000份重量的沸牛奶。加熱由此得到的混合物，同時不停攪拌，當(dāng)該混合物中的玉米淀粉完全膠凝化使所有內(nèi)容物呈半透明狀時停止加熱，隨后冷卻所得產(chǎn)物并加入適量的香草香料。將所得混合物稱重、注塑并包裝，以得到所需產(chǎn)品。
該產(chǎn)品具有光滑的表面和光澤，還有適中的味道和甜度。
實施例B-8An(豆糊)以10份重量的紅豆為原料用常規(guī)方法加水煮熟，隨后除去豆子的收斂性和粗糙度，以及水溶性雜質(zhì)，獲得約21Kg的“adzuki-an”。向所得產(chǎn)物中加入14份重量的蔗糖、5份重量用實施例A-3方法得到的含有非還原性糖類的糖漿和4份重量的水，將所得混合物沸煮，與少量的色拉油混合，小心攪拌，以免粘貼豆子。這樣，獲得了產(chǎn)量約為35Kg的理想產(chǎn)品。
該產(chǎn)品不會發(fā)生因煮沸所致的褪色，具有令人滿意的味道和香味，這使可用作豆醬面包、豆醬餡面包、湯元、豆醬餡薄脆餅、果汁飲料和冰淇凌的材料an。
實施例B-9面包將100份重量的小麥粉、2份重量的酵母、5份重量的糖、1份重量由實施例A-7方法獲得的含有非還原性糖類的粉和0.1份重量的無機酵母食品以常規(guī)方法與水拌和，在26℃發(fā)酵2小時，進一步老化30分鐘，隨后焙烤所得產(chǎn)物。
該產(chǎn)品是一種優(yōu)質(zhì)面包，具有令人滿意的色調(diào)和膨脹度，以及令人滿意的彈性和適中的甜度。
實施例B-10火腿向1000份重量的火腿肉片中加入15份重量的鹽、3份重量的KNO3并研磨均勻，將所得肉片堆積起來并在冷藏室中放置過夜。隨后，先將所得肉片在由500份重量的水、100份重量的鹽、3份重量的KNO3、40份重量用實施例A-7方法獲得的含有非還原性糖的粉和適量薄荷組成的鹽溶液中放在冷藏室浸泡7天，然后用常規(guī)方法用冷水沖洗，包扎、熏制、蒸煮、冷卻并包裝，以獲得所需產(chǎn)品。該產(chǎn)品是一種具有理想的色調(diào)、味道和香味的優(yōu)質(zhì)火腿。
實施例B-11粉狀肽將40％“Hinute S ”(一種食用大豆的肽溶液，F(xiàn)uji Oil CO.出品，東京，日本)與2份重量的由實施例A-6方法制備的含有水結(jié)晶海藻糖的粉混合。將所得混合物放入塑料容器中，在50℃溫度下真空干燥，粉碎得到粉狀肽。該產(chǎn)品具有令人滿意的味道和香味可適當(dāng)用作甜味食品如預(yù)混合物、果汁凍和冰淇凌的材料，還可用作嬰兒食品、口服和插管喂食形式的治療營養(yǎng)液的材料。
實施例B-12蛋黃粉由鮮蛋制得的蛋黃用平底加熱器在60-64℃加熱消毒，所得液體以1份重量該液體4份重量由實施例A-8方法制得的粉狀無水結(jié)晶海藻糖的比例使兩者混合。將所到混合物轉(zhuǎn)移到一容器中，放置過夜使其結(jié)塊，同時無水結(jié)晶海藻糖也轉(zhuǎn)化成有水結(jié)晶海藻糖。由此獲得的團塊用切碎機粉碎，得到蛋黃粉。
該產(chǎn)品可適當(dāng)用作甜味食品如預(yù)混合物、果汁凍、水淇凌和乳化劑的材料，還可用作嬰兒食品、口服和插管喂養(yǎng)液的材料。該產(chǎn)品還可用作皮膚精煉油和頭發(fā)恢復(fù)劑。
實例B-13化妝品乳膏將2份重量的聚氧乙烯乙二醇-硬脂酸酯、5份重量的單硬脂酸甘油酯、自乳化，2份重量實施例A-2方法獲得的富合非還原性糖類的粉、1份重量的α-糖基蕓香苷、1份重量的液體凡士林，10份重量的三-2-乙基己酸甘油酯，以及適量防腐劑以常規(guī)方法加熱溶解。所得溶液與2份重量的L-乳酸、5份重量的1，3-丁二醇和66份重量的純化水混合，所得混合物由勻漿器乳化并與適量的香料攪拌混合，以得到化妝品乳膏。
該產(chǎn)品表現(xiàn)出抗氧化劑的活性并具有較高的穩(wěn)定性。這使其可適當(dāng)用作優(yōu)質(zhì)防曬霜、皮膚嫩化劑和皮膚增白劑。
實施例B-14固體藥品以常規(guī)方法向?qū)⒐潭丝谷梭w干擾素-α抗體的柱中加注天然人體干擾素-α制劑(由Cosmo Bio.出品，東京，日本)，以吸附干擾素-α，并注入以牛血清白蛋白為穩(wěn)定劑和緩沖液，隨后除去多余的白蛋白。此后，用含有5％(d.s.b)用實施例A-5方法得到的高純度非還原性糖類的生理鹽水洗脫干擾素-α，同時改變生理鹽水的pH。
將所得洗脫液進行膜過濾。所得濾液用20倍體積的“FINETOSE”(由Hayashibara Shoji Znc.出品的一種無水結(jié)晶麥芽糖，Okayama，日本)脫水，隨后粉碎脫水的產(chǎn)品，并用制片機將其制成每片含有約150單位的天然人體干擾素-α的片劑，每片重200mg。
該產(chǎn)品可作為含片由病人口服，劑量為1-10片/成人/天，并可適當(dāng)用于治療素性疾病、變態(tài)反應(yīng)、風(fēng)濕病、糖尿病和惡性腫瘤。更特別地是，該產(chǎn)品可以適當(dāng)用作艾滋病(AIDS)和肝炎的治療劑，此類患者的發(fā)病率明顯上升。由于將這種非還原性糖和無水結(jié)晶麥芽糖摻在該產(chǎn)品中作為天然人體干擾素-α的穩(wěn)定劑，所以其活性即使在環(huán)境溫度下也可保持較長時間。
實施例B-15糖衣片劑以重150mg的粗制片劑為核心，用由40份重量的實施例A-6方法得到的粉狀有水結(jié)晶海藻糖、2份重量平均分子量為200,000的葡聚糖、30份重量的水、25份重量的滑石和3份重量的二氧化鈦組成的溶液包衣，直至總重量達到230mg。所得產(chǎn)物用由65份重量的同一種新制備的粉狀有水結(jié)晶海藻糖、1份重量的葡聚糖和34份重量的水組成的溶液進一步包衣，并用液體蠟上光，得到具有令人滿意的光澤和外觀的糖衣片劑。該產(chǎn)品具有較高的抗沖擊性能，并且能較長時間地保持其高品質(zhì)。
由上述內(nèi)容可以看出，這種新的非還原性糖類生成酶能在較為溫和的酶促反應(yīng)條件下以令人滿意的高產(chǎn)率將還原性淀粉部分水解產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成非還原性糖類，而不會改變還原性淀粉部分水解產(chǎn)物的葡萄糖的聚合度。這種非還原性糖類易于分離和提純，而且含有這種糖的還原性較低的糖類以及由這種糖制成的海藻糖具有令人滿意的穩(wěn)定性、品質(zhì)和適中的甜度。當(dāng)口服時，這種產(chǎn)品可被身體吸收并用作能源。這種非還原性糖類、含有這種糖的還原性較低的糖類以及由這種糖制成的海藻糖可適當(dāng)用作組合物如食品、化妝品和藥品的增甜劑、增味劑、品質(zhì)改變劑、穩(wěn)定劑和填充劑。
因此，本發(fā)明提供了一種以工業(yè)規(guī)模和較低費用生產(chǎn)非還原性糖類的新技術(shù)，這種糖不易獲得，盡管其需求量極大。該方法以由淀粉制備的還原性淀粉部分水解產(chǎn)物這一廉價、豐富的資源為原料制備這種非還原性糖，以及含有這種糖的還原性較低的糖類和由這種糖制成的海藻糖。本發(fā)明對于淀粉-、酶-、和生物科學(xué)這些領(lǐng)域有著重大影響；而且對于其它領(lǐng)域，特別是食品工業(yè)、化妝品工業(yè)和藥品業(yè)，以及林業(yè)、漁業(yè)、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)和化學(xué)工業(yè)都有重大影響。因此，本發(fā)明對這些領(lǐng)域的影響是不可估量的。
盡管說明了目前被認(rèn)為是本發(fā)明的優(yōu)選的實施例，但是，應(yīng)當(dāng)清楚，可對其做出各種改變，因此，在所附的權(quán)利要求
中所限定的保護范圍內(nèi)的所有此類改進均視為落在本發(fā)明的實質(zhì)和范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種糖類組合物，其含有α，α-海藻糖和如下式所示的非還原性糖類Gn-T其中，符號“G”表示葡萄糖殘基“n”表示一個或多個整數(shù)；“T”表示α，α-海藻糖殘基。
2.權(quán)利要求
1的組合物，其基本上由所述α，α-海藻糖和所述非還原糖類組成。
3.權(quán)利要求
2的組合物，其中所述非還原性糖如下式所示Gn-T其中，符號“G”表示葡萄糖殘基；“n”表示1；“T”表示α，α-海藻糖殘基。
4.權(quán)利要求
1，2或3的組合物，其中所述α，α-海藻糖和所述非還原性糖中的葡萄糖殘基通過α-1，4鍵或α-1，6鍵結(jié)合。
5.一種高α，α-海藻糖含量的產(chǎn)物，其通過如下方法獲得(a)提供含有權(quán)利要求
1-4中任一項糖類組合物的溶液；(b)將選自α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶和α-糖苷酶的一種或多種酶作用于該溶液；(c)將所得到的混合物經(jīng)柱層析以除去雜質(zhì)，增加α，α-海藻糖的含量；和(d)收集高α，α-海藻糖含量的產(chǎn)物，其具有以干固體物計的至少65w/w％的α，α-海藻糖。
6.一種制備α，α-海藻糖的方法，包括a)部分水解淀粉性物質(zhì)以獲得還原性部分淀粉水解物，其含有直鏈淀粉和/或麥芽寡糖；b)使形成如下式所示非還原性糖的酶Gn-T其中，符號“G”表示葡萄糖殘基；“n”表示一個或多個整數(shù)，“T”表示α，α-海藻糖殘基；c)水解所述非還原性糖以形成α，α-海藻糖；以及d)收集所得的α，α-海藻糖。
7.權(quán)利要求
6的方法，其中步驟c)中的水解通過使用一種或多種選自α-淀粉酶，β-淀粉酶，葡糖淀粉酶和α-糖苷酶的酶來實現(xiàn)。
8.權(quán)利要求
6的方法，其中步驟c)還包括氫化所得混合物中剩余還原糖為糖醇的步驟。
9.權(quán)利要求
6的方法，其中步驟c)還包括將所得混合物經(jīng)過帶有離子交換劑的柱層析的步驟以除去雜質(zhì)。
10.權(quán)利要求
6的方法，其中步驟c)還包括將所得混合物中的所述α，α-海藻糖結(jié)晶的步驟。
11.一種純化α，α-海藻糖的方法，包括(a)提供水性α，α-海藻糖溶液；(b)濃縮水性α，α-海藻糖溶液；(c)將所得濃縮物中的α，α-海藻糖結(jié)晶；和(d)分離并收集結(jié)晶的α，α-海藻糖。
12.權(quán)利要求
11的方法，其中步驟b)中所述水性α，α-海藻糖的濃度為范圍約65-90w/w％，且所述α，α-海藻糖在所述水性α，α-海藻糖溶液中的含量為以干固體物計至少65w/w％。
專利摘要
公開了一種新的非還原性糖類生成酶及其制備和應(yīng)用。這種酶可從Rhizobium sp.M－11(FERMBP4130)和Arthrobacter sp.Q36(FERMBP－4316)等微生物的培養(yǎng)物中獲取，當(dāng)其作用于還原性淀粉部分水解產(chǎn)物時可生成具有海藻糖結(jié)構(gòu)的非還原性糖類。當(dāng)葡萄糖淀粉酶和α－葡糖苷酶作用于這種非還原性糖類時，易于產(chǎn)生海藻糖。這種非還原性糖類和海藻糖可廣泛應(yīng)用于食品、化妝品和藥品中。
文檔編號C12P19/14GKCN1514005SQ03122564
公開日2004年7月21日 申請日期1994年6月27日
發(fā)明者丸田和彥, 久保田倫夫, 杉本利行, 三宅俊雄, 倫夫, 行, 雄 申請人:株式會社林原生物化學(xué)研究所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan