專利名稱:樟芝大規(guī)模液體深層發(fā)酵生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種樟芝大規(guī)模液體深層發(fā)酵生產(chǎn)工藝。
技術(shù)背景樟芝(Antrodia camphorata)是臺(tái)灣一種著名的中藥。野生子實(shí)體生長(zhǎng)在臺(tái)灣保護(hù)樹(shù)種牛樟樹(shù)樹(shù)干腐朽之心材內(nèi)壁，或枯死倒伏之牛樟木材陰暗潮濕之表面，很不容易被發(fā)現(xiàn)。樟芝在臺(tái)灣有悠久的使用歷史，原住民皆將樟芝視為是最珍貴的藥材。野生上品在物以稀為貴的預(yù)期心理作用之下，天然樟芝的價(jià)格也日漸地水漲船高，目前被稱為是全世界市場(chǎng)上最昂貴的野生真菌，市價(jià)往往高達(dá)每臺(tái)斤新臺(tái)幣十多萬(wàn)元至數(shù)十萬(wàn)元不等，野生上品可達(dá)15000美元/公斤，可說(shuō)是藥材中的王中之王。目前，還不能人工培育樟芝子實(shí)體。在臺(tái)灣，近幾年已有十幾家公司開(kāi)發(fā)出用樟芝發(fā)酵菌絲體和發(fā)酵菌粉為主要原料的保健食品，可以調(diào)節(jié)生理功能、滋補(bǔ)強(qiáng)身、增強(qiáng)體力、增加免疫力、精神旺盛、促進(jìn)新陳代謝、減少疲勞感。
現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，樟芝發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化能力很強(qiáng)。臺(tái)灣學(xué)者對(duì)樟芝菌絲體水提物在體外保護(hù)正常人紅血球抗氧化的能力進(jìn)行了考察。由水溶性過(guò)氧化基二鹽酸化2，2’-偶氮雙(2-咪基丙烷)[2，2’-Azobis(2-amidinopropane)dihydrochloride，AAPH]所導(dǎo)致的紅血球氧化溶血和脂質(zhì)/蛋白過(guò)氧化被樟芝菌絲體以一種時(shí)間和濃度依賴的方式抑制。樟芝菌絲體也能阻止紅血球胞質(zhì)中抗氧化的谷胱甘肽(GSH)和三磷酸腺苷(ATP)的損耗。而且，由AAPH導(dǎo)致的人內(nèi)皮細(xì)胞的損害也能被樟芝菌絲體抑制。令人感興趣的是，樟芝菌絲體展示出白血病HL-60細(xì)胞顯著的細(xì)胞毒性，但對(duì)人內(nèi)皮細(xì)胞沒(méi)影響。這些結(jié)果表明樟芝菌絲體具有防過(guò)氧化和抗癌的成分。臺(tái)灣學(xué)者也對(duì)液體深層培養(yǎng)的樟芝培養(yǎng)基干物質(zhì)(DMCM)，濾出物(DMF)和菌絲體中不同溶劑提取物的生物活性物質(zhì)的抗氧化能力、自由基清除能力作了研究。DMF表現(xiàn)出對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的最強(qiáng)抑制，該活性與濃度成函數(shù)關(guān)系。在0.2mg/mL時(shí)，其抗氧化的活性能與丁基羥基茴香醚(BHA)相同。菌絲體正己烷提取物的抗氧化能力最低，反之，其他菌絲體提取物有一些抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的活性。DMF和菌絲體水提取物(WEM)表現(xiàn)出顯著的自由基清除活性。濾出物和菌絲體提取物的抗氧化活性與所含的多酚、總?cè)坪涂偠嗵侵械鞍?多糖比例有關(guān)。在不同的模型研究中發(fā)現(xiàn)，DMCM的抗氧化能力比DMF低，這指出DMF中主要的抗氧化成分是菌絲體的次生代謝產(chǎn)物。以上結(jié)果表明，DMF可被開(kāi)發(fā)成化學(xué)防護(hù)劑用于治療與自由基有關(guān)的疾病。
近年研究發(fā)現(xiàn)，樟芝子實(shí)體和液體深層發(fā)酵菌絲體中粗多糖具有強(qiáng)的抗乙肝病毒表面抗原的活性，50ug/ml多糖濃度抗乙肝病毒(HBV)表面抗原的活性強(qiáng)于α-干擾素1000U/ml的劑量。而樟芝子實(shí)體和某些菌株液體深層發(fā)酵菌絲體產(chǎn)生的多糖還具有抗乙肝病毒e抗原的活性。這是首次發(fā)現(xiàn)來(lái)源于食用真菌中多糖具有在細(xì)胞水平抗HBV活性。
目前，樟芝子實(shí)體的人工栽培尚未成功。在臺(tái)灣省銷售的多種保健食品幾乎為液體發(fā)酵法生產(chǎn)。中國(guó)大陸有關(guān)樟芝液體發(fā)酵專利僅有一項(xiàng)，由臺(tái)灣食品工業(yè)發(fā)展研究所申請(qǐng)(公開(kāi)號(hào)CN1309176A)，其發(fā)酵是在搖瓶水平。臺(tái)灣省2000年農(nóng)委會(huì)科技計(jì)劃成果報(bào)告中提到，以5升發(fā)酵罐培養(yǎng)，在259.5h菌絲產(chǎn)量為1.712g/L。目前，尚無(wú)樟芝大規(guī)模液體深層發(fā)酵工藝方面的論文和專利報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是以生產(chǎn)樟芝菌絲體為目標(biāo)，發(fā)明一種廉價(jià)高效的樟芝大規(guī)模液體深層發(fā)酵工藝，為今后樟芝的大規(guī)模液體深層發(fā)酵生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案以樟芝真菌為出發(fā)菌株，采用斜面菌種進(jìn)行液體搖瓶培養(yǎng)、液體搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)、一級(jí)種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)。本菌株購(gòu)自山東金鄉(xiāng)真菌研究所。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的具體步驟如下(1)取出斜面菌種接入配制的新鮮斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度25-33℃，培養(yǎng)240-312小時(shí)。
(2)將步驟1中的斜面菌種轉(zhuǎn)接入裝有搖瓶培養(yǎng)基的搖瓶中，25-33℃培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速120-180rpm/min，培養(yǎng)30-48小時(shí)后進(jìn)行搖瓶的擴(kuò)大培養(yǎng)。
(3)將步驟2中的搖瓶菌種轉(zhuǎn)接入裝有搖瓶培養(yǎng)基的搖瓶再進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，25-33℃培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速120-180rpm/min，培養(yǎng)20-28小時(shí)后接入一級(jí)種子罐進(jìn)行培養(yǎng)，接種量為4-10％。
(4)將步驟3中的搖瓶菌種轉(zhuǎn)接入一個(gè)裝有種子培養(yǎng)基的一級(jí)種子罐中，保持罐溫25-33℃，罐壓0.5-0.9kPa，攪拌速率80-150rpm/min，通氣量1∶0.3-0.5，發(fā)酵30-48小時(shí)，然后轉(zhuǎn)接入發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)，接種量為4-10％。
(5)將一級(jí)種子罐中的菌種轉(zhuǎn)接入一個(gè)裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，保持罐溫25-33℃，罐壓0.5-0.9kPa，攪拌速率80-150rpm/min，通氣量1∶0.3-0.5，發(fā)酵35-48小時(shí)。在還原糖含量降低到0.05％左右時(shí)放罐。
本發(fā)明中斜面培養(yǎng)基的配方是(g/100ml)馬鈴薯15-20，葡萄糖1-2，蛋白胨0.1-1，KH2PO40.1-0.5，MgSO40.01-0.1，瓊脂1.5-2.5，加水定容至所需體積，pH值為5.0。
本發(fā)明中搖瓶培養(yǎng)基和搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)基的配方是(g/100ml)葡萄糖2-4，蛋白胨0.5-1.5，黃豆粉0.5-2，麩皮汁1.5-2.5，KH2PO40.1-0.5，MgSO40.01-0.1，加水定容至所需體積，pH值為5.0。
本發(fā)明中100L發(fā)酵罐的一級(jí)種子培養(yǎng)基配方是(g/100ml)葡萄糖2-4，蛋白胨0.5-1.5，黃豆粉0.5-2，麩皮汁0.1-0.5，KH2PO40.1-0.5，MgSO40.05-0.15，加水定容至所需體積，pH值為5.0。
本發(fā)明中1500L發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)基配方是(g/100ml)葡萄糖2-6，蛋白胨0.5-1.5，黃豆粉0.5-2，麩皮汁0.3-0.8，KH2PO40.1-0.5，MgSO40.05-0.15，加水定容至所需體積，pH值為5。
本發(fā)明步驟2中搖瓶培養(yǎng)基與搖瓶容積比為1∶5，步驟3中搖瓶培養(yǎng)基與搖瓶容積比為1∶5。
本發(fā)明步驟4中一級(jí)種子罐的容積為100-300L，在該一級(jí)種子罐中裝有的發(fā)酵培養(yǎng)基相應(yīng)為50-180L；步驟5中發(fā)酵罐的容積為1000-5000L，在該發(fā)酵罐中裝有的發(fā)酵培養(yǎng)基相應(yīng)為500-3500L。
本發(fā)明的放罐標(biāo)準(zhǔn)是發(fā)酵液開(kāi)始變得粘稠，還原糖含量降低到0.05％左右，鏡檢發(fā)現(xiàn)菌絲體開(kāi)始衰老。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明適用于大規(guī)模液體深層發(fā)酵生產(chǎn)樟芝，解決了樟芝大規(guī)模生產(chǎn)培養(yǎng)放大的難題，對(duì)于樟芝今后的工業(yè)化生產(chǎn)和相關(guān)的應(yīng)用產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。本發(fā)明在發(fā)酵結(jié)束后得到的發(fā)酵產(chǎn)物顏色呈鮮艷的玫瑰紅色，散發(fā)出誘人的香味，發(fā)酵液具有苦澀味。干燥菌絲體呈玫瑰紅色。發(fā)酵菌絲體的干重為1-1.5％，發(fā)酵菌絲體中多糖含量為6-8％。本發(fā)酵菌絲體干粉的抗氧化能力很強(qiáng)。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。
實(shí)施例1在斜面培養(yǎng)基中接種樟芝菌絲體，培養(yǎng)溫度28℃，培養(yǎng)時(shí)間264小時(shí)。將新鮮的斜面菌種接入裝有100ml培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，28℃搖床培養(yǎng)40小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速150rpm/min。然后將所得搖瓶菌種轉(zhuǎn)接入裝有100ml培養(yǎng)基的500ml三角搖瓶中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，28℃搖床培養(yǎng)22小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速150rpm/min。然后將三角瓶擴(kuò)大的菌種2200ml轉(zhuǎn)接入裝有50L種子培養(yǎng)基的100L一級(jí)種子罐中，保持罐溫28℃，罐壓0.7kPa，攪拌速率100 rpm/min，通氣量1∶0.5，發(fā)酵時(shí)間45小時(shí)。將一級(jí)種子罐菌種轉(zhuǎn)接入裝有800L發(fā)酵培養(yǎng)基的1500L發(fā)酵罐中，保持罐溫28℃，罐壓0.7kPa，攪拌速率100rpm/min，通氣量1∶0.5，發(fā)酵時(shí)間42小時(shí)。
本實(shí)施例1中斜面培養(yǎng)基組成是(g/100ml)馬鈴薯15，葡萄糖2，蛋白胨0.5，KH2PO40.1，MgSO40.05，瓊脂2，加水定容至所需體積，pH值為5.0。
本實(shí)施例1中搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基和搖瓶擴(kuò)大發(fā)酵培養(yǎng)基組成是(g/100ml)葡萄糖3，蛋白胨1，黃豆粉1，麩皮汁2，KH2PO40.2，MgSO40.1，加水定容至所需體積，pH值為5.0。
本實(shí)施例1中100L一級(jí)種子罐培養(yǎng)基組成是(g/100ml)葡萄糖3，蛋白胨1，黃豆粉1，麩皮汁0.2，KH2PO40.2，MgSO40.1，加水定容至50L，pH值為5.0。
本實(shí)施例1中1500L發(fā)酵罐的培養(yǎng)基配方是(g/100ml)葡萄糖5，蛋白胨1.2，黃豆粉1.2，麩皮汁0.5，KH2PO40.25，MgSO40.125，加水定容至800L，pH值為5.0。
本實(shí)施例中發(fā)酵結(jié)束標(biāo)準(zhǔn)是發(fā)酵液開(kāi)始變得粘稠，還原糖含量降低到0.05％，鏡檢發(fā)現(xiàn)菌絲體開(kāi)始衰老。
權(quán)利要求
1.一種樟芝液體深層發(fā)酵生產(chǎn)工藝，其特征是以樟芝真菌為出發(fā)菌株，采用斜面菌種進(jìn)行液體搖瓶培養(yǎng)、液體搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)、一級(jí)種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的樟芝液體深層發(fā)酵生產(chǎn)工藝，其特征是以購(gòu)自山東金鄉(xiāng)真菌研究所樟芝真菌為出發(fā)菌株。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的樟芝液體深層發(fā)酵生產(chǎn)工藝，其特征是所述的斜面菌種培養(yǎng)基組成是(g/100ml)馬鈴薯15-20，葡萄糖1-2，蛋白胨0.1-1，KH2PO40.1-0.5，MgSO40.01-0.1，瓊脂1.5-2.5，加水定容至所需體積，pH值為5.0，斜面菌種培養(yǎng)溫度25-33℃，培養(yǎng)240-312小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的樟芝液體深層發(fā)酵生產(chǎn)工藝，其特征是所述的搖瓶培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成是(g/100ml)葡萄糖2-4，蛋白胨0.5-1.5，黃豆粉0.5-2，麩皮汁1.5-2.5，KH2PO40.1-0.5，MgSO40.01-0.1，加水定容至所需體積，pH值為5.0，培養(yǎng)條件是培養(yǎng)溫度25-33℃，轉(zhuǎn)速120-180rpm/min，培養(yǎng)30-48小時(shí)，然后轉(zhuǎn)接入搖瓶進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的樟芝液體深層發(fā)酵生產(chǎn)工藝，其特征是所述的搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成是(g/100ml)葡萄糖2-4，蛋白胨0.5-1.5，黃豆粉0.5-2，麩皮汁1.5-2.5，KH2PO40.1-0.5，MgSO40.01-0.1，加水定容至所需體積，pH值為5.0，培養(yǎng)條件是培養(yǎng)溫度25-33℃，轉(zhuǎn)速120-180rpm/min，培養(yǎng)20-28小時(shí)，然后轉(zhuǎn)接入一級(jí)種子培養(yǎng)，接種量為4-10％。
6.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的樟芝液體深層發(fā)酵生產(chǎn)工藝，其特征是所述的一級(jí)種子培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成是(g/100ml)葡萄糖2-4，蛋白胨0.5-1.5，黃豆粉0.5-2，麩皮汁0.1-0.5，KH2PO40.1-0.5，MgSO40.05-0.15，加水定容至所需體積，pH值為5.0，培養(yǎng)條件是培養(yǎng)溫度25-33℃，攪拌速率80-150rpm/min，發(fā)酵30-48小時(shí)，然后轉(zhuǎn)接入發(fā)酵罐發(fā)酵，接種量為4-10％。
7.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的樟芝液體深層發(fā)酵生產(chǎn)工藝，其特征是所述的發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基組成是(g/100ml)葡萄糖2-6，蛋白胨0.5-1.5，黃豆粉0.5-2，麩皮汁0.3-0.8，KH2PO40.1-0.5，MgSO40.05-0.15，加水定容至所需體積，pH值為5.0，培養(yǎng)條件是培養(yǎng)溫度25-33℃，攪拌速率80-150rpm/min，發(fā)酵35-48小時(shí)。
8.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的樟芝液體深層發(fā)酵生產(chǎn)工藝，其特征是所述的發(fā)酵培養(yǎng)，可選擇1000-5000L的發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。
9.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的樟芝液體深層發(fā)酵生產(chǎn)工藝，其特征是所述的發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵液中菌絲體以干重計(jì)可達(dá)1-1.5％。
專利摘要
樟芝大規(guī)模液體深層發(fā)酵生產(chǎn)工藝。珍稀藥用真菌樟芝人工培養(yǎng)子實(shí)體尚未成功，也難于液體發(fā)酵培養(yǎng)。本發(fā)明以大規(guī)模液體深層發(fā)酵生產(chǎn)樟芝菌絲體為目標(biāo)，以山東金鄉(xiāng)樟芝真菌為出發(fā)菌株，采用斜面菌種進(jìn)行液體搖瓶培養(yǎng)、液體搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)、一級(jí)種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)，最終發(fā)酵罐體積達(dá)1000－5000L。利用本發(fā)酵工藝，在1500L發(fā)酵罐中發(fā)酵42h，發(fā)酵液中菌絲體以干重計(jì)可達(dá)1－1.5％。
文檔編號(hào)C12N1/14GKCN1456661SQ03131678
公開(kāi)日2003年11月19日 申請(qǐng)日期2003年6月3日
發(fā)明者敖宗華, 符慧子, 鄒錫良 申請(qǐng)人:江南大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan