專利名稱:新的半乳糖寡糖組合物及其制備的制作方法
本發(fā)明涉及產(chǎn)生新的半乳糖苷酶酶活性的雙歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)新菌株，該酶活性能夠?qū)⑷樘寝D(zhuǎn)化為半乳糖寡糖(galactooligosaccharides)的新混合物。半乳糖寡糖是不可消化的碳水化合物，它抵抗哺乳動(dòng)物胃腸消化酶，但是通過特殊的結(jié)腸細(xì)菌發(fā)酵。本發(fā)明也涉及雙歧桿菌菌株制備能夠促進(jìn)腸中雙歧桿菌生長(zhǎng)的新半乳糖寡糖組合物的用途。它也涉及半乳糖寡糖產(chǎn)物的新組合物。
人腸菌群包括致病的、良性的和有益的微生物屬。前者占優(yōu)勢(shì)可以引起腸紊亂，可以是急性的(如胃腸炎)和慢性的(如炎性腸病、過敏性腸綜合征和一些腸癌)。已經(jīng)嘗試向適當(dāng)?shù)氖称份d體添加一種或多種有益微生物菌株來影響腸菌群的平衡有利于有益的微生物，如雙歧桿菌。這種活微生物飼料添加劑被稱為是益生菌制劑。然而，很難保證活細(xì)菌在食品中以及消化后的存活。
飲食操作腸菌群的可選擇方法是使用益生素，其定義為不可消化的食品成分，通過選擇性刺激結(jié)腸中一種或有限數(shù)目的細(xì)菌的生長(zhǎng)和/或活性，而有益地影響宿主，由此引起宿主健康改善。
人大腸的菌群在出生時(shí)獲得。母乳喂養(yǎng)的嬰兒具有雙歧桿菌優(yōu)勢(shì)，容易地競(jìng)爭(zhēng)超過其它屬。這是因?yàn)槿巳槌煞质谴碳ば缘?。相比之下，配方喂養(yǎng)的嬰兒具有更復(fù)雜的菌群，它類似成年人腸，在于類桿菌、梭狀芽孢桿菌、雙歧桿菌、乳桿菌、革蘭氏陽性球菌、大腸桿菌和其它群全部表現(xiàn)出相當(dāng)平等的比例。通常認(rèn)為雙歧桿菌在大腸感染方面是保護(hù)性的，這個(gè)差異可能解釋了與以配方奶為食的嬰兒相比，母乳喂養(yǎng)的嬰兒感染發(fā)生率低得多。
腸菌群的某些成分和腸疾病的病因?qū)W有牽連。例如，分枝桿菌與節(jié)段性回腸炎有關(guān)，硫酸鹽還原細(xì)菌可以觸發(fā)潰瘍性結(jié)腸炎和在腸癌發(fā)生中可能有細(xì)菌涉及。如果通過益生素的攝取可以助長(zhǎng)固有有益腸細(xì)菌的選擇性生長(zhǎng)，顯然將有益。這將具有致病菌群被抑制的進(jìn)行性效果。
被分類為益生素的一組化合物是半乳糖寡糖，它是含半乳糖的寡糖，形式為Glc α1-4[βGal 1-6]n，其中n＝2-5，是利用酶β-半乳糖苷酶的轉(zhuǎn)半乳糖基酶活性，從乳糖糖漿制備的(Crittenden，(1999)ProbioticsA Critical Review.Tannock，G.(ed)HorizonScientific Press，Wymondham，pp.141-156)。當(dāng)前市場(chǎng)上可買到三種產(chǎn)品，具有稍有不同的組成。這些中的第一個(gè)，轉(zhuǎn)半乳糖基寡糖(TOS)是使用來自米曲霉的β-半乳糖苷酶制備的(Tanaka等人，(1983)Bifidobacteria Microflora，2，17-24)，由三、四、五和六-半乳糖-寡糖組成。第二個(gè)是Oligomate 55，它是使用來自米曲霉和嗜熱鏈球菌的β-半乳糖苷酶制備的(Ito等人，(1990)，Microbial Ecologyin Health and Disease，3，285-292)，含有36％三、四、五和六-半乳糖-寡糖，16％二糖-半乳糖基葡萄糖和半乳糖基半乳糖，38％單糖和10％乳糖。最后，轉(zhuǎn)半乳糖基二糖(TD)制劑是使用來自嗜熱鏈球菌的β-半乳糖苷酶制備的(Ito等人，(1993)，J.Nutritional Science andVitaminolog 39，279-288)。
眾所周知雙歧桿菌成員產(chǎn)生涉及乳糖細(xì)菌代謝的β-半乳糖苷酶。Moller，P.L.等人在Appl.& Environ.Microbiol.，(2001)，62，(5)，2276-2283描述了來自雙歧雙歧桿菌菌株的三個(gè)β-半乳糖苷酶基因的分離和表征。
美國(guó)專利公開號(hào)US 2002/0086358描述了來自雙歧雙歧桿菌的新β-半乳糖苷酶，尤其是具有高轉(zhuǎn)半乳糖基活性的酶的截短形式。雖然據(jù)說乳糖培養(yǎng)可以在0.5-60％乳糖存在下發(fā)生，但是轉(zhuǎn)半乳糖基反應(yīng)產(chǎn)生的半乳糖寡糖的最大示例產(chǎn)量是44％(每毫克添加的乳糖產(chǎn)生的毫克寡糖)。此外，根據(jù)該美國(guó)專利公開中的寡糖定義，顯然該產(chǎn)品由至少三個(gè)連接的糖分子組成。
Dumortier等人在in Carbohydrate Research，201，(1990)，115-123描述了通過用雙歧雙歧桿菌DSM 20456進(jìn)行乳糖水解過程中的轉(zhuǎn)半乳糖基反應(yīng)形成寡糖。其對(duì)產(chǎn)生的寡糖混合物的結(jié)構(gòu)分析表明連鍵是β-(1→3)、β-(1→6)和β-(1→4)-D-半乳糖基鍵。Dumortier提示雙歧雙歧桿菌產(chǎn)生的化合物參與大腸中細(xì)菌的粘附。
現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌菌株不僅能夠產(chǎn)生將乳糖轉(zhuǎn)化為半乳糖寡糖混合物的半乳糖苷酶酶活性，而且能夠產(chǎn)生含有多達(dá)35％二糖galabiose(Gal(α1-6)-Gal)的半乳糖寡糖混合物。已知后者(見Paton，J.C.&Paton，A.W.(1989)，Clin.Microbiol.Revs.，11，450-479；Carlsson，K.A.(1989)，Ann.Reviews Biochem.，58，309-350.)是抗粘著劑，能夠阻止毒素如志賀毒素和病原體如大腸桿菌粘附于腸壁。
根據(jù)本發(fā)明，提供了能夠產(chǎn)生半乳糖苷酶酶活性的雙歧雙歧桿菌菌株，該酶活性將乳糖轉(zhuǎn)化為半乳糖寡糖混合物，包含至少一個(gè)二糖，至少一個(gè)三糖，至少一個(gè)四糖和至少一個(gè)戊糖。優(yōu)選該混合物包含20至35％w/v的二糖，20至35％w/v的三糖，15至25％w/v的四糖和10至20％w/v的戊糖。
關(guān)于本發(fā)明半乳糖苷酶酶活性中使用的術(shù)語“酶活性”是由至少一個(gè)半乳糖苷酶引起的活性。
一方面，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)半乳糖寡糖混合物包含二糖Gal-Gal、三糖Gal-Gal-Glc、四糖Gal-Gal-Gal-Glc和戊糖Gal-Gal-Gal-Gal-Glc，其中Gal表示半乳糖殘基和Glc表示葡萄糖殘基。
使用甲基化分析和酶水解，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)半乳糖寡糖混合物包含Gal(β1-6)-Gal(β1-6)-Gal(β1-4)-Glc四糖；Gal(β1-6)-Gal(β1-4)-Glc和Gal(β1-3)-Gal(β1-4)-Glc三糖；Gal(β1-3)-Glc、Gal(β1-3)-Gal、Gal(β1-6)-Gal和Gal(α1-6)-Gal二糖。
如上定義的能夠產(chǎn)生將乳糖轉(zhuǎn)化為半乳糖寡糖混合物的半乳糖苷酶酶活性的雙歧雙歧桿菌菌株已經(jīng)于2003年3月31日保藏在亞伯丁國(guó)立工業(yè)和海洋微生物保藏有限公司，保藏號(hào)為NCIMB 41171。
這種保藏的雙歧雙歧桿菌菌株或其生物學(xué)功能等效物可用于制備如上定義的半乳糖寡糖混合物。半乳糖寡糖混合物可以形成通過促進(jìn)腸中雙歧桿菌的生長(zhǎng)而改善腸健康的產(chǎn)品的一部分，特別是起源生產(chǎn)菌株。這種產(chǎn)品可以選自乳制品(例如鮮奶、干奶粉如全脂奶粉、脫脂奶粉、換脂(fat-filled)奶粉、乳清粉、嬰兒奶、冰淇淋、酸乳、乳酪、發(fā)酵乳制品)、飲料、嬰兒食品、谷類、面包、餅干、糖果、蛋糕、食品添加劑、營(yíng)養(yǎng)添加劑、動(dòng)物飼料、家禽飼料或?qū)嶋H上任何其它食品或飲料。
寡糖混合物也可以用于預(yù)防病原體或病原體產(chǎn)生的毒素粘附于腸壁的藥物的制備?；旌衔锟梢栽诳股刂委煰煶毯蠼o予患者，抗生素治療常常改變乃至破壞正常的健康腸菌群，或在腸手術(shù)后給予，為了在腸中“重新播種”或重建健康腸的正常菌群。半乳糖寡糖混合物可以與上面提及的雙歧雙歧桿菌菌株或生物學(xué)功能等效物組合使用。
短語“生物學(xué)功能等效物”被解釋為指能夠產(chǎn)生半乳糖苷酶酶活性的雙歧雙歧桿菌菌株，該酶活性將乳糖轉(zhuǎn)化為如上定義的半乳糖寡糖混合物。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面提供了促進(jìn)雙歧桿菌生長(zhǎng)的半乳糖寡糖組合物，包含作為有效組分的至少一個(gè)二糖、至少一個(gè)三糖、至少一個(gè)四糖和至少一個(gè)戊糖。
半乳糖寡糖組合物優(yōu)選包含如在上文中描述的半乳糖寡糖混合物。
優(yōu)選半乳糖寡糖組合物包含20至35％w/v的二糖，20至35％w/v的三糖，15至25％w/v的四糖和10至20％w/v的戊糖。
根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)方面提供了制備促進(jìn)雙歧桿菌生長(zhǎng)的物質(zhì)的方法，其特征在于用如上定義的雙歧雙歧桿菌菌株處理乳糖或含有乳糖的材料。
合適的含有乳糖的材料可以選自市場(chǎng)上可買到的乳糖、全脂奶、半脫脂乳、脫脂乳、乳清和換脂奶。這種乳品可以從母牛、水牛、綿羊或山羊獲得。換脂奶定義為已經(jīng)被脫脂而除去乳脂肪，隨后添加植物油脂或油來替代的全脂奶。
使用補(bǔ)充除乳糖以外的碳水化合物底物的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的雙歧雙歧桿菌可以利用麥芽糖、棉子糖、木聚糖和果糖。在補(bǔ)充這些碳水化合物之一的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌分別誘導(dǎo)α-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶、木糖苷酶和β-呋喃果糖苷酶的表達(dá)并由此導(dǎo)致α-葡糖寡糖、α-半乳糖寡糖、木糖寡糖和果糖寡糖的產(chǎn)生。
在引出本發(fā)明的研究中，篩選能夠產(chǎn)生半乳糖苷酶并由此具有產(chǎn)生半乳糖寡糖最高潛力的源自腸的細(xì)菌。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)屬于雙歧桿菌屬的某些細(xì)菌，尤其是雙歧雙歧桿菌，不僅能夠產(chǎn)生半乳糖苷酶酶活性，而且該酶可以將乳糖轉(zhuǎn)化為包含20至35％w/v的二糖、20至35％w/v的三糖、15至25％w/v的四糖、10至20％w/v的戊糖的半乳糖寡糖混合物。雙歧雙歧桿菌的具體實(shí)例于2003年3月31日保藏在亞伯丁NCIMB，保藏號(hào)為41171。
為了培養(yǎng)這些細(xì)菌，可以利用任何營(yíng)養(yǎng)源，只要它可以被細(xì)菌同化?？梢杂美缣妓衔锶缛樘?、蔗糖或葡萄糖；含氮無機(jī)或有機(jī)營(yíng)養(yǎng)源如酵母抽提物、胰胨、肉浸汁(Lab Lemco)等等；無機(jī)營(yíng)養(yǎng)源如磷酸鹽、鉀等等配制適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基。對(duì)于培養(yǎng)，營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的pH應(yīng)該在6.0至8.0的范圍內(nèi)，優(yōu)選7.0，和在35至40℃，優(yōu)選37℃的溫度范圍下厭氧培養(yǎng)40至64小時(shí)，優(yōu)選50小時(shí)。
可以用任何已知培養(yǎng)方法培養(yǎng)該菌株，如靜置相培養(yǎng)、厭氧深層培養(yǎng)或振蕩培養(yǎng)。離心或過濾收獲細(xì)菌細(xì)胞并且該細(xì)胞可以就這樣被用作反應(yīng)催化劑，不用進(jìn)一步處理?？蛇x擇地，該細(xì)胞可以通過適當(dāng)固定操作以固定狀態(tài)使用。
本發(fā)明的雙歧雙歧桿菌可以用來將乳糖本身或乳制品中包含的乳糖轉(zhuǎn)化為本發(fā)明的新的半乳糖寡糖組合物。轉(zhuǎn)化后，可以離心除去細(xì)菌細(xì)胞。可以采用例如與釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)培養(yǎng)除去存在的任何單糖。隨后該混合物可以受到離心和微量過濾。接著所得的GOS溶液可以被噴霧干燥制備粉劑。
含有用這種方法制備的本發(fā)明半乳糖寡糖組合物的奶可以直接給予兒童、成人或動(dòng)物?；蛘撸梢杂糜谥苽洚a(chǎn)品如面包、糖果等等，酸性和高溫條件下半乳糖寡糖的穩(wěn)定性使其能夠使用而不分解?；蛘呖梢詫OS粉劑添加到如上列出的產(chǎn)品中。
GOS粉劑可以給予罹患腸紊亂如炎性腸病和過敏性腸綜合征的患者，在這樣的情況下該患者可以攝取2至20g的日劑量，優(yōu)選5至10g，最優(yōu)選7g，以分開的兩劑服用。
或者，本發(fā)明的半乳糖寡糖組合物可以與根據(jù)本發(fā)明的雙歧雙歧桿菌的培養(yǎng)物混合制備改善腸健康的混合物。這種混合物被分類為synbiotic，其定義為“通過改善活微生物營(yíng)養(yǎng)添加劑在胃腸道的生存和植入而有益影響宿主的益生菌與益生素的混合物”(見Gibson andRoberfroid，1995，Dietary modulation of the human microbiotaintroducing the concept of prebiotics.Journal of Nutrition125，1401-1412)。這種組合通過提供可利用的選擇性底物來增強(qiáng)益生菌在結(jié)腸有害環(huán)境中的生存。細(xì)菌益生菌可被微囊包封在半乳糖寡糖益生素中來制備例如粉劑，接著該粉劑可以添加到乳制品如酸乳中，或用作營(yíng)養(yǎng)添加劑。
攝入含有本發(fā)明半乳糖寡糖組合物的奶或其它產(chǎn)品的優(yōu)點(diǎn)是它促進(jìn)腸中有益雙歧桿菌水平增加，以腸菌群中存在的其它不那么令人期望的細(xì)菌為代價(jià)，如梭狀芽孢桿菌。因此，對(duì)個(gè)體健康可能具有有害作用的某些固有細(xì)菌減少。于是這將導(dǎo)致胃腸道感染減少。它有助于預(yù)防或治療結(jié)腸炎，縮短腹瀉事件和降低慢性腸疾病如潰瘍性結(jié)腸炎和癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。它還可有助于減輕過敏性腸綜合征的癥狀。
飼以補(bǔ)充例如粉劑形式的本發(fā)明的半乳糖寡糖組合物的飲食的農(nóng)畜可顯示出其飼料重量轉(zhuǎn)化改善。
將參考下列實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。
實(shí)施例1含有10.0g/l胰胨、5.0g/l Lab-LEMCO(肉浸汁)、5.0g/l酵母抽提物、3.0g/l KHPO、0.05g/l半胱氨酸 HCL、10g/l乳糖和1ml/l吐溫80的1L培養(yǎng)基(pH 7.0)在121℃滅菌15分鐘。滅菌之后，培養(yǎng)基接種1.0％(v/v)新鮮雙歧雙歧桿菌NCIMB 41171培養(yǎng)物并在厭氧條件下37℃培養(yǎng)50小時(shí)。離心(30000g，20分鐘)收獲細(xì)菌細(xì)胞。磷酸鹽緩沖液(0.02M，pH 7.0)洗兩次之后，細(xì)胞隨時(shí)可用于寡糖合成反應(yīng)。
細(xì)菌細(xì)胞(40單位的β-半乳糖苷酶活性)重懸于含有50g乳糖的100ml磷酸鹽緩沖液(0.02M，pH 7.0)中。允許反應(yīng)在40℃進(jìn)行，7小時(shí)后，混合物由35％(w/v)水解產(chǎn)物(葡萄糖、半乳糖)、37％(w/v)乳糖和18％(w/v)半乳糖寡糖組成，聚合度在2-5之間。離心(3000g，20分鐘)除去細(xì)菌細(xì)胞之后，與釀酒酵母培養(yǎng)除去單糖(葡萄糖和半乳糖)。隨后離心(10000g，10分鐘)除去酵母，然后為了保證產(chǎn)物的微生物學(xué)質(zhì)量，混合物通過0.1μm微量過濾器過濾。然后為了獲得粉劑形式，噴霧干燥該糖溶液。通過高效液相色譜，使用配備有APEX碳水化合物柱(Jones Chromatography，Mid Glamorgan，UK)和Merck-Hitachi LaChrom RI檢測(cè)器的Merck-Hitachi LaChrom系統(tǒng)(Merck，Poole，Dorset，UK)定量分析產(chǎn)物。在25℃ 70％(v/v)乙腈用作洗脫劑和流速是0.8ml/分鐘。半乳糖寡糖混合物由25％ Gal-Gal、35％ Gal-Gal-Glc、24％ Gal-Gal-Gal-Glc和16％ Gal-Gal-Gal-Gal-Glc組成。
實(shí)施例2根據(jù)實(shí)施例1制備雙歧雙歧桿菌NCIMB 41171細(xì)胞并添加到攪拌箱中的500ml脫脂乳中，添加(300單位β-半乳糖苷酶活性)。允許乳糖轉(zhuǎn)化在40℃進(jìn)行。8小時(shí)后，半乳糖寡糖濃度是22％(w/v)和混合物包含28％ Gal-Gal、32％ Gal-Gal-Glc、21％ Gal-Gal-Gal-Glc和19％Gal-Gal-Gal-Gal-Glc。
實(shí)施例3體外腸模型在接種來自健康人志愿者的10％(w/v)糞便勻漿于不含和含根據(jù)實(shí)施例1制備的1％(w/v)GOS混合物的生長(zhǎng)培養(yǎng)基的三級(jí)連續(xù)發(fā)酵罐(Macfarlane等人，1998，Microbial Ecology，35，180-187)中仿制結(jié)腸中的條件(表2)。該模型由三個(gè)容器V1、V2和V3組成，各自運(yùn)行體積是270、300和300ml。溫度設(shè)置在37℃，連同pH自動(dòng)控制。三個(gè)容器中的培養(yǎng)物pH分別維持在5.5、6.2和6.8。磁力攪拌每個(gè)發(fā)酵罐并通過連續(xù)噴射無O2的N2(15ml/分鐘)保持在厭氧條件下。生長(zhǎng)培養(yǎng)基含有下列成分淀粉8g/l、粘蛋白4g/l、酪蛋白3g/l、蛋白胨水5g/l、胰胨水5g/l、膽汁N°3 0.4g/l、酵母4.5g/l、FeSO40.005g/l、NaCl 4.5g/l、KCl 4.5g/l、KH2PO40.5g/l、MgSO4·7H2O1.25g/l、CaCl2.6H2O 0.15g/l、NaHCO31.5g/l、吐溫80 1ml、氯化血紅素0.05g/l，半胱氨酸.HCl 0.8g/l。培養(yǎng)基通過蠕動(dòng)泵送到Vl，V1順序地通過一系列管供應(yīng)V2和V3。該系統(tǒng)以約36小時(shí)的保留時(shí)間運(yùn)行。在接通培養(yǎng)基泵之前，腸模型放置平衡過夜，引入含有試驗(yàn)底物的培養(yǎng)基之前運(yùn)行至少10天，然后進(jìn)一步放置10天。在每個(gè)循環(huán)首尾取出樣品。取出的樣品體積是5ml，這個(gè)量用于細(xì)菌組計(jì)數(shù)。熒光原位雜交(FISH)通過使用FISH，用設(shè)計(jì)對(duì)準(zhǔn)16S rRNA診斷區(qū)域的寡核苷酸探針估計(jì)細(xì)菌群體的差異。商業(yè)合成這些探針并用熒光染料Cy3(由Eurogentec UK Ltd提供)標(biāo)記。表1給出所利用的分子探針。對(duì)于總細(xì)菌計(jì)數(shù)，使用核酸染料4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)。從發(fā)酵容器獲得的樣品稀釋于4％(w/v)仲甲醛并在4℃固定過夜。然后細(xì)胞以1500xg離心5分鐘，用磷酸緩沖鹽水(PBS；0.1M，pH 7.0)洗滌兩次，重懸于PBS/99％乙醇(1∶1w/v)的混合物中并在-20℃保存至少1小時(shí)。然后向雜交混合物中添加細(xì)胞懸液并留置在每個(gè)探針適當(dāng)?shù)臏囟认码s交過夜。使用0.2μm Isopore膜濾器(Millipore Corporation，Herts，UK)真空過濾雜交混合物。取出濾器，置于帶有SlowFade(Molecular Probes，Eugan，OR，USA)的玻片上并在熒光顯微鏡(NiconEclipse，E400)下檢查。在紫外線燈下檢查DAPI染色的細(xì)胞并使用DM510濾光片觀察雜交的細(xì)胞。對(duì)于每個(gè)玻片，計(jì)數(shù)至少15個(gè)不同的視野。
表1.使用FISH用于表征腸菌群的寡核苷酸探針
結(jié)果表2.當(dāng)商品化GOS(Vivinal(RTM))用作底物，每天7g時(shí)，F(xiàn)ISH測(cè)定的體外腸模型中的細(xì)菌群。
表3.當(dāng)本發(fā)明的合成GOS用作底物，每天7g時(shí)，F(xiàn)ISH測(cè)定的體外腸模型中的細(xì)菌群。
結(jié)論從表3可見本發(fā)明的GOS混合物顯示出更好的益生素性能(即與商品化的GOS等同物相比，雙歧桿菌增加較高，以及類桿菌減少)(見表2)。容器1(V1)和2(V2)中益生素效果更強(qiáng)，這可由本發(fā)明GOS由低分子量寡糖組成的事實(shí)來解釋。
實(shí)施例4甲基化分析在以每分鐘3ml用水洗脫的Biogel P2(Pharmacia)柱上凝膠過濾來純化根據(jù)實(shí)施例1制備的半乳糖寡糖合成產(chǎn)物。
甲基化分析測(cè)定各個(gè)半乳糖寡糖制劑的連鍵位置。用氬沖洗后，冷凍干燥樣品(5-6mg)在20℃分散于無水二甲基亞砜(DMSO)中16小時(shí)。通過順序添加粉末氫氧化鈉(0.5g)和碘代甲烷(4ml)(Ciucanu和Kerek，1984；MacCormick等人，1993)對(duì)它們進(jìn)行甲基化。在C18鍵合柱(Sep-Pak，Waters，Watford，UK)上洗脫提取之后，干燥甲基化碳水化合物，提取入CHCl3/CH3OH(1∶1，v∶v)并蒸干。使用三氟乙酸(Blakeney等人，1983)水解樣品，并通過NaBD4還原作用和用乙酸酐和N-甲基咪唑乙酰化而轉(zhuǎn)化為部分甲基化的糖醇醋酸酯(PMAAs)(Alberscheim等人，1967)。
通過GC在交聯(lián)的50％氰基丙基甲基-50％苯基甲基聚硅氧烷柱(Thames Chromatrography，Maidenhead，UK)上，使用火焰電離檢測(cè)器和溫度程序55℃(2分鐘)，+45℃分鐘-1(1.9分鐘)，140℃(2分鐘)，+2℃分鐘-1(35分鐘)，210℃(40分鐘)，分析PMAAs。通過測(cè)量它們相對(duì)于肌醇六乙酸鹽的保留時(shí)間并將相對(duì)保留時(shí)間與外部標(biāo)準(zhǔn)比較而鑒定PMAAs。通過甲基糖苷的慎重甲基化制備對(duì)于每種糖的標(biāo)準(zhǔn)的混合物(Doares等人，1991)。峰面積代表使用有效碳響應(yīng)因子的相對(duì)摩爾量(Sweet等人，1975)。
通過它們的電子電離質(zhì)譜(Carpita和Shia，1989)證實(shí)PMAAs的身份。在連接Fisons Analytical Trio 1S質(zhì)譜儀的相同GC上，使用200℃的源溫度和70eV的電離電位進(jìn)行GC-MS分析。
為了測(cè)定合成產(chǎn)物的端基異構(gòu)構(gòu)型，用α-半乳糖苷酶或β-半乳糖苷酶(Melibiase；Sigma)在建議的最佳條件下處理寡糖30分鐘。HPLC分析反應(yīng)產(chǎn)物。
結(jié)果從上面的分析估計(jì)寡糖結(jié)構(gòu)是四糖部分Gal(β1-6)-Gal(β1-6)-Gal(β1-4)-Glc、三糖部分Gal(β1-6)-Gal(β1-4)-Glc；Gal(β1-3)-Gal(β1-4)-Glc和二糖部分Gal(β1-4)-Glc(乳糖底物)；Gal(β1-3)-Glc；Gal(β1-3)-Gal；Gal(β1-6)-Gal；Gal(α1-6)-Gal(galabiose)。
Gal半乳糖，Glc葡萄糖參考文獻(xiàn)1.Albersheim P.D.，D.J.Nevins，P.D.English和A.Karr.1967.A methodfor the analysis of sugars on plant cell-wall polysaccharides by gas-liquidchromatography.Carbohydr Res 5340-3452.Blakeney A.B.，P.J.Harris，R.J.Henry和B.A.Stone.1983.A simple andrapid preparation of alditol acetates for monosaccharide analysis.CarbohydrRes 113291-2993.Carpita N.C.和E.M.Shia.1989.Linkage structure of carbohydrates by gaschromatography-mass spectroscopy(GC-MS)for partially methylated alditolacetates，p.157-216.In C.J.Biermann and G.D.McGinnis(ed.)，Analysis ofcarbohydrates by gas-liquid chromatography and mass spectroscopy.CRC PressPoca Raton，F(xiàn)la.
4.Ciucanu I.和F.Kerek.1984.A simple and rapid method for thepermethylationof carbohydrates.Carbohydr Res 131209-2175.Doares S.H.，P.Albersheim和A.G.Darvill.1991.An improved method forthe preparation of standards for the glycosyl-linkage analysis of complexcarbohydrates.Carbohydr Res 210311-3176.MacCormick C.A.，J.E.Harris，A.P.Cunning和V.J.Morris.1993.Characterization of a variant of polysaccharide acetan produced by a mutan ofAcetobacter xylinumstrain CR 1/4.J Appl Bacteriol 74196-1997.Sweet D.P.，R.Shapiro和P.Albersheim.1975.Quantitative analysis byvarious GLC response-factor theories for partially methylated and partiallyethylated alditol acetates.Carbohydr Res 40217-225實(shí)施例5材料和方法HT29細(xì)胞系從歐洲應(yīng)用微生物學(xué)和研究細(xì)胞培養(yǎng)保藏中心獲得。細(xì)胞原種在37℃潮濕5％CO2下，補(bǔ)充5％(v/v)胎牛血清(FBS)、100mM青霉素、0.1M鏈霉素、非必需氨基酸(NEAA x100)和200mM α-谷氨酰胺的含高葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基Dulbecco′s改良Eagle′s培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng)。每48小時(shí)再次喂飼細(xì)胞并在達(dá)到融合前傳代。
寡糖敏感性測(cè)定補(bǔ)充不同濃度寡糖(0.01、0.1、1、10、100mM)的血清標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基(1％v/v)用于根據(jù)Olano-Martin等人2003的寡糖敏感性試驗(yàn)。每日給細(xì)胞再喂飼實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基(含有感興趣的寡糖)，通過除去實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基并用無鈣磷酸鹽緩沖鹽水(pH 7，9.6gL-1)洗去細(xì)胞而進(jìn)行粘附細(xì)胞的測(cè)定。胰蛋白酶消化粘附細(xì)胞并用等體積血清標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中和。細(xì)胞懸液稀釋于Isoton II中，并在Coulter Counter中對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)。如下計(jì)算細(xì)胞存活百分比(
圖1)生存％＝(處理的細(xì)胞的平均吸光度/對(duì)照的平均吸光度)×100粘附試驗(yàn)HT29細(xì)胞在12孔組織培養(yǎng)平板中生長(zhǎng)至＞90％融合，使用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基。對(duì)于進(jìn)行試驗(yàn)前的最后一次細(xì)胞喂飼，使用無抗生素的培養(yǎng)基。
病原體厭氧生長(zhǎng)在無抗生素的細(xì)胞培養(yǎng)基中至少三次繼代培養(yǎng)。試驗(yàn)當(dāng)天，新鮮預(yù)還原組織培養(yǎng)基中接種10％過夜病原體培養(yǎng)物并在試驗(yàn)前培養(yǎng)4小時(shí)。
測(cè)試寡糖的原液制備成磷酸鹽緩沖鹽水中5M的濃度并過濾除菌。
在PBS中制備1/1000稀釋的4小時(shí)病原體培養(yǎng)物并通過平板計(jì)數(shù)來計(jì)數(shù)。從組織培養(yǎng)平板中吸出培養(yǎng)基，細(xì)胞在PBS(1ml)中洗一次。
對(duì)于每個(gè)試驗(yàn)寡糖，向三個(gè)孔中添加0.5ml寡糖(5M)溶液。無任何寡糖的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)包括在內(nèi)作為對(duì)照。向所有孔中添加0.5ml培養(yǎng)懸液，搖動(dòng)混合平板并在37℃有氧培養(yǎng)2小時(shí)。
吸出培養(yǎng)物，所有孔在無菌PBS(每孔1ml)中洗滌三次。最后一次洗滌之后，吸出PBS并向每孔添加70μl胰蛋白酶/EDTA溶液，混合并在37℃靜置5分鐘。
每孔添加1ml PBS并用吸管混合以保證所有細(xì)胞從孔底部移除并打碎凝塊。
用吸管將1ml細(xì)胞懸液吸入通用的MRD(最大回收稀釋)瓶并酌情進(jìn)一步稀釋。稀釋液在平板計(jì)數(shù)瓊脂(PCA)上鋪開，并在37℃培養(yǎng)24小時(shí)。
培養(yǎng)后，對(duì)菌落計(jì)數(shù)并以樣品中存在的細(xì)菌(c.f.u ml-1)與對(duì)照(PBS)的比率計(jì)算粘附抑制(圖2)。
結(jié)論圖2中顯示的結(jié)果表明在二糖部分存在下，對(duì)大腸桿菌EPEC和鼠傷寒沙門氏菌粘附的強(qiáng)烈抑制，在GOS混合物中也存在這種抑制。在混合物中高于三糖(＞三)部分的存在下，對(duì)抗鼠傷寒沙門氏菌的抗粘附作用較低。
進(jìn)行寡糖敏感性試驗(yàn)以保證寡糖混合物對(duì)HT29細(xì)胞沒有毒性(圖1)。
參考文獻(xiàn)Olano-Martin E.，Williams M.R.，Gibson G.R，Rastall RA.2003.Pectins and pecticoligosaccharides inhibit Escherichiacoli0157H7 Shiga toxin as directed towards the human coloniccell line HT29.FEMS Microbiol Letters 218(1)101-105圖1.添加不同寡糖濃度(0.01-100mM)培養(yǎng)24和48小時(shí)后影響的細(xì)胞存活率。
寡糖敏感性測(cè)定
圖2.寡糖混合物(ALL)和混合物的不同部分對(duì)大腸桿菌EPEC、大腸桿菌VTEC和鼠傷寒沙門氏菌與HT29細(xì)胞粘附的作用。
實(shí)施例6如前所述(實(shí)施例1)制備該試驗(yàn)中使用的GOS產(chǎn)物，菊粉從Orafti(比利時(shí))獲得。
四十頭斷奶未去勢(shì)豬購自JSR Genetics Ltd，Southburn，Driffield，Yorkshire.Y025 9ED到達(dá)Reading University時(shí)，將豬以每組十頭豬的四組分組圈養(yǎng)七天的時(shí)間以允許豬在運(yùn)送后定居下來和適應(yīng)單元和飲食。交貨時(shí)豬的平均體重是14.70公斤。
七天適應(yīng)期后，將豬轉(zhuǎn)入單獨(dú)的圈欄，相同單元內(nèi)。單獨(dú)圈欄時(shí)豬的平均體重是17.46公斤。
通過獨(dú)特的耳刺花辨認(rèn)豬，也使用防水stock記號(hào)筆對(duì)它們進(jìn)行單獨(dú)編號(hào)。用與用于標(biāo)記每頭豬的相同標(biāo)識(shí)號(hào)對(duì)每個(gè)單圈欄進(jìn)行編號(hào)。
給十頭豬分配四種飲食之一對(duì)照飲食(NEG)、向?qū)φ诊嬍逞a(bǔ)充根據(jù)實(shí)施例1制備的1.6％(w/w)GOS的飲食、向?qū)φ诊嬍逞a(bǔ)充4％(w/w)GOS的飲食或向?qū)φ诊嬍逞a(bǔ)充1.6％(w/w)菊粉的飲食。
貫穿該研究，豬睡在鋸屑上，也提供稻草豐富環(huán)境以及提供玩具以幫助減輕厭倦。
貫穿該研究，豬接受Deltawean 15 NGP pellets(ABN，ABN House，PO Box 250，Oundle Rd，Woodston，Peterborough.PE 9QF)，這是一種隨意喂給生長(zhǎng)中的豬的完全飼料。
Deltawean 15 NGP的營(yíng)養(yǎng)物/礦物質(zhì)組成
豬食也含有允許的抗氧化劑、丁化羥基苯甲醚(BHA)、丁化羥基甲苯(BHT)和乙氧喹。
將豬隨機(jī)分配進(jìn)行處理，但相同飲食處理的二或三頭豬單獨(dú)圈養(yǎng)在相同組圈欄區(qū)域。如果豬逃離各自的圈欄，用這種方法對(duì)豬進(jìn)行分組可以避免處理混淆，即其僅僅能夠偷取含有對(duì)該特定豬的正確飲食處理的食物。單獨(dú)圈養(yǎng)的豬，以每組兩頭或三頭，接受相同處理，貫穿整個(gè)單元都隨機(jī)分配。
喂養(yǎng)試驗(yàn)飲食開始和四周后，從每頭豬收集糞便樣品，并使用如前所述(實(shí)施例3)的FISH確定糞便微生物群(表4)。在實(shí)驗(yàn)結(jié)尾，屠殺豬獲得近端和遠(yuǎn)端結(jié)腸內(nèi)容物樣品。測(cè)定近端和遠(yuǎn)端結(jié)腸內(nèi)容物的pH值(表5)、短鏈脂肪酸(SCFA)(表6)和微生物群(表7)。數(shù)據(jù)顯示為均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。用Student′st檢驗(yàn)分析差異。P＜0.05認(rèn)為差異顯著。
表4開始和四周實(shí)驗(yàn)期后，益生素處理和飲食對(duì)豬糞便中微生物群的作用
cfu log10/g糞便；每個(gè)值是均值±SD，*n＝40，+n＝10；Student′st檢驗(yàn)分析差異。行中具有上標(biāo)的均值與aNEG、bGOS 1.6％、00時(shí)間有顯著差異(P＜0.05)。
表5益生素處理和飲食對(duì)近端和遠(yuǎn)端結(jié)腸樣品pH的作用。
每個(gè)值是均值±SD，n＝10。Student′st檢驗(yàn)分析差異。具有上標(biāo)的行中的均值與aNEG，bGOS 1.6％，c菊粉有顯著差異(P＜0.05)。
表6益生素處理和飲食對(duì)近端和遠(yuǎn)端結(jié)腸樣品SCFA濃度*的作用。
每個(gè)值是均值±SD，n＝10。Student′st檢驗(yàn)分析差異。具有上標(biāo)的行中的均值與aNEG，bGOS 1.6％，c菊粉有顯著差異(P＜0.05)。ND未檢測(cè)；*基于濕物質(zhì)的μmol/g。
表7益生素處理和飲食對(duì)近端和遠(yuǎn)端結(jié)腸樣品中微生物群的作用。
cfu log10/g(以濕物質(zhì)為基礎(chǔ))；每個(gè)值是均值±SD，n＝10；Student′st檢驗(yàn)分析差異。具有上標(biāo)的行中的均值與aNEG，bGOS 1.6％，c菊粉有顯著差異(P＜0.05)。
結(jié)論表5GOS(1.6％和特別是4％)存在下近端結(jié)腸pH有下降，其結(jié)合SCFA數(shù)據(jù)(表6)提示GOS產(chǎn)物到達(dá)近端結(jié)腸(發(fā)酵產(chǎn)物增加)。
表7GOS(4％)存在顯示近端結(jié)腸中有益細(xì)菌(雙歧桿菌、乳桿菌)的種群數(shù)量顯著增加。遠(yuǎn)端部分和糞便樣品中種群數(shù)量的這種增加較低，GOS產(chǎn)物似乎主要在近端結(jié)腸發(fā)酵的事實(shí)可以解釋該結(jié)果。1.6％GOS處理顯示類似的趨勢(shì)。
在近端結(jié)腸中可以看到雙歧桿菌種群數(shù)量增加，以及乙酸(雙歧桿菌的主要發(fā)酵產(chǎn)物)產(chǎn)生增加。這提示GOS產(chǎn)物對(duì)雙歧桿菌物種非常有選擇性。
實(shí)施例7病例研究病例研究1-炎性腸病(IBD)引用診斷為潰瘍性結(jié)腸炎(2種主要形式IBD中之一)的一名43歲女性患者作為病例研究根據(jù)實(shí)施例1制備的GOS產(chǎn)物的作用。
該患者罹患潰瘍性結(jié)腸炎5年并在測(cè)試期前和期間未進(jìn)行藥物治療。以前使用過抗炎劑柳氮磺胺吡啶，但是沒有陽性效果?；颊呦澄镉欣щy，接受標(biāo)準(zhǔn)飲食，有惡心、腹瀉和腹痛。后者是左側(cè)大腸，與基于結(jié)腸炎的降結(jié)腸炎癥的診斷有關(guān)。
每日攝取GOS 7g/天的總劑量(分開的2劑)。攝入4天內(nèi)，癥狀開始改善?；颊吣芨孟娘嬍?，腸痛開始減弱和惡心減輕。雖然沒有內(nèi)窺鏡檢查的臨床分析，但是患者的健康感覺明顯改善。飲食的唯一改變是GOS的添加。六周以后，這種作用得以維持。
雖然不是設(shè)安慰劑對(duì)照的多患者研究，但是這個(gè)病例研究為益生素GOS在一種主要形式IBD中的積極效果提供了軼事證據(jù)。
病例研究2-過敏性腸綜合征(IBS)已罹患IBS 3年的27歲男性攝取7g/天根據(jù)實(shí)施例1制備的GOS(以分開的兩劑)3周。這個(gè)時(shí)期之前，他經(jīng)歷了腫脹、便秘、腸痛和疲乏。這些是與IBS有關(guān)的經(jīng)典癥狀。該患者6個(gè)月未曾攝取抗生素并接受小麥/面筋和無糖飲食。
攝取益生素后，3天內(nèi)這些癥狀明顯減輕并得以維持住。該受試者報(bào)道了總體健康和腸健康的戲劇性改善，即“我現(xiàn)在準(zhǔn)備跑馬拉松”。他能夠無困難地?cái)z取正常飲食。
這個(gè)報(bào)告不是有對(duì)照的試驗(yàn)，但是確實(shí)充當(dāng)了表明GOS可改善IBS病情和使患病者恢復(fù)較好生活質(zhì)量的軼事證據(jù)。
權(quán)利要求
1.一種能夠產(chǎn)生半乳糖苷酶酶活性的雙歧雙歧桿菌菌株，該酶活性將乳糖轉(zhuǎn)化為半乳糖寡糖混合物，所述半乳糖寡糖混合物包含至少一個(gè)二糖，至少一個(gè)三糖，至少一個(gè)四糖和至少一個(gè)戊糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1的菌株，其中在半乳糖寡糖混合物中，二糖是Gal-Gal，三糖是Gal-Gal-Glc，四糖是Gal-Gal-Gal-Glc和戊糖是Gal-Gal-Gal-Gal-Glc，其中Gal表示半乳糖殘基和Glc表示葡萄糖殘基。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1或權(quán)利要求
2的菌株，其中半乳糖寡糖混合物包含Gal(α1-6)-Gal、Gal(β1-6)-Gal(β1-4)-Glc、Gal(β1-3)-Gal(β1-4)-Glc、Gal(β1-6)-Gal(β1-6)-Gal(β1-4)-Glc和Gal(β1-6)-Gal(β1-6)-Gal(β1-6)-Gal(β1-4)-Glc。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1至3任一項(xiàng)的菌株，其中半乳糖寡糖混合物包含20至35％w/v的二糖，20至35％w/v的三糖，15至25％w/v的四糖和10至20％w/v的戊糖。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1至4任一項(xiàng)的菌株或其生物學(xué)功能等效物，該菌株于2003年3月31日保藏在英國(guó)亞伯丁國(guó)立工業(yè)和海洋微生物保藏有限公司，保藏號(hào)為NCIMB 41171。
6.促進(jìn)雙歧桿菌特異性生長(zhǎng)的半乳糖寡糖組合物，包含作為有效組分的至少一個(gè)二糖、至少一個(gè)三糖、至少一個(gè)四糖和至少一個(gè)戊糖的混合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求
6的組合物，其中二糖是Gal-Gal，三糖是Gal-Gal-Glc，四糖是Gal-Gal-Gal-Glc和戊糖是Gal-Gal-Gal-Gal-Glc。
8.根據(jù)權(quán)利要求
6或權(quán)利要求
7的組合物，包含Gal(α1-6)-Gal、Gal(β1-6)-Gal(β1-4)-Glc、Gal(β1-3)-Gal(β1-4)-Glc、Gal(β1-6)-Gal(β1-6)-Gal(β1-4)-Glc和Gal(β1-6)-Gal(β1-6)-Gal(β1-6)-Gal(β1-4)-Glc。
9.根據(jù)權(quán)利要求
6至8任一項(xiàng)的組合物，包含20至35％w/v的二糖，20至35％w/v的三糖，15至25％w/v的四糖和10至20％w/v的戊糖。
10.一種改善腸健康的組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求
1至5任一項(xiàng)的雙歧雙歧桿菌菌株的培養(yǎng)物與根據(jù)權(quán)利要求
6至9任一項(xiàng)的組合物組合。
11.根據(jù)權(quán)利要求
6至9任一項(xiàng)的促進(jìn)雙歧桿菌生長(zhǎng)的組合物，用在通過治療而治療人或動(dòng)物的方法中。
12.根據(jù)權(quán)利要求
6至10任一項(xiàng)的組合物在制備預(yù)防病原體或病原體生產(chǎn)的毒素粘附于腸壁的藥物中的用途。
13.根據(jù)權(quán)利要求
6至10任一項(xiàng)的組合物用于制備抗生素治療或手術(shù)后重建正常腸菌群的藥物的用途。
14.根據(jù)權(quán)利要求
1至5任一項(xiàng)的雙歧雙歧桿菌菌株用于制備權(quán)利要求
6至9任一項(xiàng)中定義的半乳糖寡糖混合物的用途。
15.根據(jù)權(quán)利要求
5的菌株用于制備權(quán)利要求
8中定義的半乳糖寡糖混合物的用途。
16.根據(jù)權(quán)利要求
14或權(quán)利要求
15的用途，其中半乳糖寡糖混合物是改善腸健康的產(chǎn)品的一部分。
17.根據(jù)權(quán)利要求
16的用途，其中所述產(chǎn)品選自乳制品、飲料、嬰兒食品、谷類、餅干、糖果、蛋糕、食品添加劑、營(yíng)養(yǎng)添加劑、動(dòng)物飼料、家禽飼料或任何其它食物或飲料組成的組。
18.一種制備促進(jìn)雙歧桿菌生長(zhǎng)的物質(zhì)的方法，其特征在于用根據(jù)權(quán)利要求
1至5任一項(xiàng)的雙歧雙歧桿菌菌株處理乳糖或含有乳糖的材料。
19.根據(jù)權(quán)利要求
18的方法，其中含有乳糖的材料選自市場(chǎng)上可買到的乳糖、全脂奶、半脫脂奶、脫脂乳、乳清和換脂奶組成的組。
20.根據(jù)權(quán)利要求
19的方法，其中奶從牛、水牛、綿羊或山羊獲得。
21.根據(jù)權(quán)利要求
18至20任一項(xiàng)的方法，其中除去雙歧雙歧桿菌細(xì)胞后，噴霧干燥該物質(zhì)而制備粉劑。
專利摘要
能夠產(chǎn)生新的半乳糖苷酶酶活性的雙歧雙歧桿菌新菌株，該酶活性將乳糖轉(zhuǎn)化為半乳糖寡糖的新混合物。寡糖混合物可以摻入多種食品或動(dòng)物飼料，通過促進(jìn)腸中雙歧桿菌的生長(zhǎng)和抑制致病微生物菌群的生長(zhǎng)而改善腸健康。
文檔編號(hào)C12P19/00GKCN1777671SQ200480010853
公開日2006年5月24日 申請(qǐng)日期2004年6月30日
發(fā)明者A·G·溫, G·吉布森, J·W·斯魯賓斯基, G·楚特斯 申請(qǐng)人:科拉薩多公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan