專利名稱:半連續(xù)固態(tài)發(fā)酵—浸提耦合生產(chǎn)纖維素酶方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物酶制備技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種半連續(xù)固態(tài)發(fā)酵—浸提耦合生產(chǎn)纖維素酶方法。
背景技術(shù)：
隨著人類社會的進步，人類經(jīng)濟可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略中的能源、糧食、環(huán)境等諸多重大問題都與可再生性資源的利用有關(guān)，現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)的重點也是要解決可再生性資源的利用和環(huán)境污染問題。利用纖維素酶將植物纖維原料水解成單糖，繼而發(fā)酵成酒精或單細(xì)胞蛋白，是合理利用可再生資源的一條有效途徑，其關(guān)鍵環(huán)節(jié)是纖維素酶的生產(chǎn)。目前普遍采用液體深層發(fā)酵工藝生產(chǎn)纖維素酶，但設(shè)備投資大，生產(chǎn)成本高。固態(tài)發(fā)酵是一種歷史悠久的傳統(tǒng)技術(shù)，由于其特有的經(jīng)濟性和實用性，近年來該技術(shù)在纖維素酶的生產(chǎn)方面已經(jīng)引起了廣泛的重視。
固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的原料通常是含有纖維素的基質(zhì)，包括純纖維素和經(jīng)過一定預(yù)處理的廉價的木質(zhì)纖維原料(主要成分為纖維素、半纖維素和木質(zhì)素)，如秸稈等。公開號為CN1493682A(申請?zhí)枮?2149485.1)的專利中開發(fā)了浸提式半連續(xù)固態(tài)發(fā)酵方法及裝置，在該專利的實施例中，采用汽爆方法預(yù)處理木質(zhì)纖維素原料，通過發(fā)酵培養(yǎng)、浸提、分離浸提液等過程的循環(huán)實現(xiàn)浸提式半連續(xù)固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶。但實驗結(jié)果表明，采用該過程以不經(jīng)過預(yù)處理、或只經(jīng)過簡單預(yù)處理(如堿法預(yù)處理)的木質(zhì)纖維素原料(如稻殼等)為發(fā)酵基質(zhì)時，由于基質(zhì)利用率低而導(dǎo)致發(fā)酵基質(zhì)的可循環(huán)發(fā)酵次數(shù)非常有限。汽爆預(yù)處理后的木質(zhì)纖維素原料雖更容易被微生物所利用，但該過程的設(shè)備投資較大，運行成本也較高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種半連續(xù)固態(tài)發(fā)酵—浸提耦合生產(chǎn)纖維素酶方法。其特征在于以稻殼、甘蔗渣或秸稈粉等木質(zhì)纖維素原料和麩皮為發(fā)酵基質(zhì)，菌種為纖維素酶產(chǎn)生菌，通過發(fā)酵與浸提過程的耦合，降低發(fā)酵產(chǎn)物的積累對發(fā)酵過程的抑制作用，并以浸提后的發(fā)酵基質(zhì)中的纖維素酶產(chǎn)生菌菌體為菌種，通過添加滅菌后的新鮮發(fā)酵基質(zhì)繼續(xù)發(fā)酵以實現(xiàn)半連續(xù)化生產(chǎn)纖維素酶。
所述的發(fā)酵基質(zhì)中木質(zhì)纖維素原料和麩皮的質(zhì)量比為(0.05-50)∶1。
所述的纖維素酶產(chǎn)生菌為木霉(Trichoderma)、青霉(Penicillum)、曲霉(Aspergillus)或根霉(Rhizopus)等。
所述的浸提過程是通過取樣監(jiān)測到發(fā)酵基質(zhì)中纖維素酶活性接近最高時加入0.02mol/L、pH值為4.8的醋酸緩沖液作為無菌浸提液，浸提液與發(fā)酵基質(zhì)的質(zhì)量比為(0.1-20)∶1，攪拌均勻、浸泡0.2-5小時，過濾、分離發(fā)酵基質(zhì)和浸提液，浸提液用于提取產(chǎn)物纖維素酶，浸提后的發(fā)酵基質(zhì)與滅菌后的新鮮發(fā)酵基質(zhì)以(0.05-50)∶1質(zhì)量比混合后繼續(xù)發(fā)酵，當(dāng)監(jiān)測到發(fā)酵基質(zhì)中纖維素酶活性接近最高時再次重復(fù)上述浸提、補料及發(fā)酵過程。
本發(fā)明的有益效果是克服了現(xiàn)有固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶工藝中，采用經(jīng)過簡單預(yù)處理的木質(zhì)纖維素為發(fā)酵基質(zhì)生產(chǎn)纖維素酶效率低、不能連續(xù)生產(chǎn)、以及纖維素酶生產(chǎn)成本較高等缺點。本發(fā)明提供的包括浸提、補料等過程的固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶新技術(shù)，采用只經(jīng)過簡單預(yù)處理的木質(zhì)纖維素為原料，就可提高發(fā)酵基質(zhì)和反應(yīng)器利用率，降低纖維素酶的生產(chǎn)成本，并且工藝過程簡單、易于實現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用。
具體實施方式
實施例1本發(fā)明按以下步驟實現(xiàn)半連續(xù)固態(tài)發(fā)酵—分離耦合生產(chǎn)纖維素酶，具體步驟如下(1)按無菌操作將發(fā)酵基質(zhì)接入10％(指相對于發(fā)酵基質(zhì)的種子液質(zhì)量百分比)綠色木霉(Trichoderma sp.3.2942)菌種，發(fā)酵基質(zhì)組成為在4％NaOH溶液40℃下浸泡24小時的堿處理稻殼、麩皮和無機鹽水溶液(按質(zhì)量百分比濃度包括1％ (NH4)2SO4、0.3％KH2PO4和0.5％MgSO4)，稻殼與麩皮的質(zhì)量比為3∶7，稻殼與麩皮的總質(zhì)量與無機鹽水溶液的質(zhì)量比1∶2，pH自然，培養(yǎng)溫度30℃；(2)發(fā)酵培養(yǎng)96小時后，在發(fā)酵基質(zhì)中加入0.02mol/L、pH值為4.8的醋酸緩沖液作為無菌浸提液，固液比為1∶10，浸提20分鐘后，過濾分離浸提液和發(fā)酵基質(zhì)，浸提后的發(fā)酵基質(zhì)與新鮮發(fā)酵基質(zhì)以1∶5質(zhì)量比補料后繼續(xù)發(fā)酵，實驗結(jié)果表明第二次發(fā)酵過程中纖維素酶達(dá)到最高酶活時間可縮短2倍，其最高酶活(濾紙酶活)可達(dá)到第一次發(fā)酵中最高酶活的90％左右。
實施例2依實施例1中的步驟(1)和(2)，浸提后的發(fā)酵基質(zhì)與新鮮培養(yǎng)基以1∶1質(zhì)量比繼續(xù)發(fā)酵，實驗結(jié)果表明與第一次發(fā)酵相比，第二次發(fā)酵過程中纖維素酶達(dá)到最高酶活時間可縮短1倍，其最高酶活(濾紙酶活)與第一次發(fā)酵中最高酶活相當(dāng)。
實施例3依實施例1中的步驟(1)和(2)，發(fā)酵基質(zhì)與新鮮培養(yǎng)基以1∶1質(zhì)量比繼續(xù)發(fā)酵。實驗結(jié)果表明與第一次發(fā)酵相比，第三次發(fā)酵過程中纖維素酶達(dá)到最高酶活時間可縮短1倍，其最高酶活(濾紙酶活)與第一次發(fā)酵中最高酶活相當(dāng)。
上述發(fā)酵過程共經(jīng)過七次補料，共八次發(fā)酵過程，發(fā)酵時間為18天，發(fā)酵后每克底物可得到的酶活(濾紙酶活)是常規(guī)批式發(fā)酵1.36倍；反應(yīng)器發(fā)酵效率是常規(guī)批式發(fā)酵1.36倍。
權(quán)利要求
1.一種半連續(xù)固態(tài)發(fā)酵—浸提耦合生產(chǎn)纖維素酶方法，其特征在于以稻殼、甘蔗渣或秸稈粉等木質(zhì)纖維素原料和麩皮為發(fā)酵基質(zhì)，菌種為纖維素酶產(chǎn)生菌，通過發(fā)酵與浸提過程的耦合，降低發(fā)酵產(chǎn)物的積累對發(fā)酵過程的抑制作用，并以浸提后的發(fā)酵基質(zhì)中的纖維素酶產(chǎn)生菌菌體為菌種，通過添加滅菌后的新鮮發(fā)酵基質(zhì)繼續(xù)發(fā)酵以實現(xiàn)半連續(xù)化生產(chǎn)纖維素酶；其工藝過程是通過取樣監(jiān)測到發(fā)酵基質(zhì)中纖維素酶活性接近最高時加入無菌浸提液，浸提液與發(fā)酵基質(zhì)的質(zhì)量比為(0.1-20)∶1，攪拌均勻、浸泡0.2-5小時，過濾、分離發(fā)酵基質(zhì)和浸提液，浸提液用于提取產(chǎn)物纖維素酶，浸提后的發(fā)酵基質(zhì)與滅菌后的新鮮發(fā)酵基質(zhì)以(0.05-50)∶1質(zhì)量比混合后繼續(xù)發(fā)酵，當(dāng)監(jiān)測到發(fā)酵基質(zhì)中纖維素酶活性接近最高時再次重復(fù)上述浸提、補料及發(fā)酵過程。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述半連續(xù)固態(tài)發(fā)酵—浸提耦合生產(chǎn)纖維素酶方法，其特征在于所述的發(fā)酵基質(zhì)中木質(zhì)纖維素原料和麩皮的質(zhì)量比為(0.05-50)∶1。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述半連續(xù)固態(tài)發(fā)酵—浸提耦合生產(chǎn)纖維素酶方法，其特征在于所述纖維素酶產(chǎn)生菌為木霉(Trichoderma)、青霉(Penicillum)、曲霉(Aspergillus)或根霉(Rhizopus)。
專利摘要
本發(fā)明公開了屬于固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶技術(shù)領(lǐng)域：
的一種半連續(xù)固態(tài)發(fā)酵—浸提耦合生產(chǎn)纖維素酶方法。以稻殼等木質(zhì)纖維素原料和麩皮為發(fā)酵基質(zhì)，開發(fā)了包括發(fā)酵、浸提、補料等過程的半連續(xù)固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶新工藝，該工藝可采用只經(jīng)過簡單預(yù)處理的木質(zhì)纖維素為原料，并且發(fā)酵基質(zhì)和反應(yīng)器利用率高、成本低、易于實現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用。
文檔編號C12N9/42GKCN1632111SQ200510002222
公開日2005年6月29日 申請日期2005年1月18日
發(fā)明者周玉杰, 陳書峰, 張建安, 劉德華 申請人:清華大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan