專利名稱:檢測物質(zhì)之間相互作用的檢測表面,具有檢測表面的傳感器芯片和傳感裝置,以及檢測方法
發(fā)明背景本發(fā)明涉及一項檢測物質(zhì)之間相互作用的技術(shù)。更具體地說，本發(fā)明涉及一種為檢測物質(zhì)之間相互作用而設(shè)計的檢測表面，具有該檢測表面組件(constituent)的傳感器芯片(sensor chip)和傳感裝置(sensing device)，以及檢測方法。
分子生物學(xué)、以納米技術(shù)(nanotechnology)為代表的微細(xì)加工技術(shù)(microfabrication)以及生物信息學(xué)(bioinformatics)近來的顯著發(fā)展有賴于新興發(fā)展的技術(shù)，即基于各種檢測原理在非常小的表面上檢測物質(zhì)之間的相互作用(下文中將此項技術(shù)稱為“傳感器技術(shù)(sensor technique)”)。
傳感器技術(shù)被廣泛地用于生物信息諸如基因組學(xué)(genomics)等的分析，對基因組轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄組分析(transcriptome analysis)，對在活生物體和細(xì)胞中翻譯并產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的表達(dá)的蛋白質(zhì)組(proteome)分析，對代謝的代謝組分析(metabolome analysis)，以及對活生物體中信號的信號組分析(signalomeanalysis)。所述技術(shù)在諸如新藥物開發(fā)、臨床診斷、藥理學(xué)基因組學(xué)(pharmacological genomics)和法醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域是有力的工具。
以下列出了已知的具有檢測物質(zhì)之間相互作用能力的數(shù)種傳感器技術(shù)。第一項技術(shù)涉及用于生物實驗的集成基板(integrated substrate)(稱為DNA芯片或DNA微陣列)，其通過微陣列技術(shù)將預(yù)定數(shù)量的DNA分子固定在基板上。(參見專利文獻(xiàn)1和2。)該技術(shù)允許在整合于玻璃或硅基板上的多種大量的寡DNA鏈或者cDNA(互補(bǔ)DNA)鏈的輔助下進(jìn)行雜交分析。因此，其被用于基因突變分析，SNP(單核苷酸多態(tài)性)分析，和基因表達(dá)頻率分析。
第二項技術(shù)涉及由微芯片基板和排列在該基板表面上的純化蛋白質(zhì)構(gòu)成的蛋白質(zhì)芯片(或蛋白質(zhì)陣列芯片)。蛋白質(zhì)芯片能夠分析兩種蛋白質(zhì)之間或者蛋白質(zhì)和其它化學(xué)物質(zhì)之間的相互作用，但蛋白質(zhì)芯片可能會損害固定化蛋白質(zhì)的活性(參見專利文獻(xiàn)3和4)。
第三項技術(shù)是基于表面胞質(zhì)團(tuán)共振團(tuán)(surface plasmon resonance)(SPR)原理，該技術(shù)允許進(jìn)行不同物質(zhì)之間相互作用的實時分析。(參見專利文獻(xiàn)5和6)。該SPR傳感器是由作為吸著部位(absorber)，基板，和棱鏡的三個層組成。其設(shè)計成通過入射線全反射的臨界角變化來測定物質(zhì)之間的相互作用。對全反射臨界角的改變真正起作用的是由相互作用引起的介電常數(shù)(dielectric constant)的變化。最近報導(dǎo)這種SPR傳感器允許通過以下的方式進(jìn)行內(nèi)分泌擾亂物質(zhì)(endocrine disrupting chemicals)的篩選。傳感器芯片具有固定于其上的雙鏈DNA。該雙鏈DNA具有雌激素應(yīng)答基因的啟動子區(qū)域內(nèi)的激素應(yīng)答元件。傳感器芯片加載雌激素受體α，且所述激素應(yīng)答元件與該雌激素受體α之間的相互作用可無需經(jīng)過標(biāo)記而進(jìn)行實時測定(參見非專利文獻(xiàn)1)。
第四項技術(shù)是通過測定水晶振蕩器(quarts oscillator)的頻率變化來分析生物聚合物的結(jié)構(gòu)改變。(參見專利文獻(xiàn)7)。已提出了通過所述檢測來分析受體和配體之間相互作用的技術(shù)(參見專利文獻(xiàn)8)。
專利號為Hei 4-505763的PCT日語譯本[專利文獻(xiàn)2]專利號為Hei 10-503841的PCT日語譯本[專利文獻(xiàn)3]公開號為2003-130877的日語專利[專利文獻(xiàn)4]公開號為2003-155300的日語專利[專利文獻(xiàn)5]專利號為Hei 4-501462的PCT日語譯本[專利文獻(xiàn)6]專利號為Hei 11-512518的PCT日語譯本[專利文獻(xiàn)7]公開號為2003-083864的日語專利[專利文獻(xiàn)8]公開號為2003-083973的日語專利[非專利文獻(xiàn)1]
BUNSEKI KAGAKU，第51卷，第6期，389-396頁(2002)發(fā)明概述設(shè)計上述提到的傳感器技術(shù)是為了檢測固定的檢測物質(zhì)和目標(biāo)物質(zhì)之間的相互作用，該相互作用發(fā)生在為進(jìn)行檢測而制備的表面上。如果很好地選擇對物質(zhì)特性以及分析目的最為適宜的檢測原理，就可以進(jìn)行高精度的檢測。
然而，有的情況下，由于待測物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和分子大小，很難對相互作用進(jìn)行靈敏的檢測。處理這種情況是亟待解決的技術(shù)問題之一。例如，對于低分子量物質(zhì)(如疏水性激素)，由于相互作用引起的質(zhì)量和介電常數(shù)的改變非常小，使得難以進(jìn)行高精度檢測。在這些情況下，就迫切需要一種技術(shù)能精確并連續(xù)地檢測激素(或激素樣物質(zhì))作為實施信號傳導(dǎo)的物質(zhì)，應(yīng)用在基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、藥學(xué)、新藥物開發(fā)，以及環(huán)境激素檢測領(lǐng)域中。
本發(fā)明的一個主要目的是提供一種能夠高精度測定低分子量物質(zhì)之間的相互作用的傳感器技術(shù)。這個目的是通過在檢測表面上形成新的檢測體系而實現(xiàn)的。
本發(fā)明提供了一種用于檢測物質(zhì)之間相互作用的檢測表面。該檢測表面包括與其一端固定在該檢測表面的單鏈DNA形成互補(bǔ)連接的雙鏈DNA，使得該雙鏈DNA對所述相互作用發(fā)生響應(yīng)而解離成單鏈DNA。本發(fā)明還提供了用于相互作用的傳感器芯片，其具有至少上述的檢測表面。本發(fā)明還提供了具有上述檢測表面以及用于檢測雙鏈DNA解離成單鏈DNA的解離作用的手段的傳感裝置，其中所述解離發(fā)生在所述檢測表面上。
本發(fā)明使用的術(shù)語“檢測表面(detecting surface)”是指功能為用作物質(zhì)之間發(fā)生相互作用的區(qū)域或空間的基板、粒狀物、膜體或纖維狀物的表面，以及該表面上的區(qū)域或空間。
根據(jù)本發(fā)明的檢測表面的技術(shù)特征在于有效地利用了雙鏈DNA解離成單鏈DNA的現(xiàn)象。換句話說，該檢測表面構(gòu)成一種實驗系統(tǒng)，所述實驗系統(tǒng)與傳統(tǒng)DNA芯片完全不同，所述傳統(tǒng)DNA芯片是通過雜交使單鏈DNA形成雙鏈DNA來研究基因表達(dá)和類似問題的。
DNA芯片上的雜交由于位阻而效率低下，其中位阻是DNA鏈形成隨機(jī)卷曲的高度有序結(jié)構(gòu)造成的。而且誤雜交(mishybridization)是不可避免的問題，其降低了檢測的精確度。相反地，雙鏈DNA解離成單鏈DNA的解離沒有這些問題，并且基于這個原理的檢測具有易操作和檢測條件易控制的優(yōu)勢。
本發(fā)明中使用的術(shù)語“相互作用(interaction)”廣泛地包含非共價鍵，共價鍵，氫鍵，化學(xué)鍵，和解離作用。它也包括將樣品加入，注射，或者輸注到檢測表面上的區(qū)域時，發(fā)生在“該檢測表面上的目標(biāo)物質(zhì)”和“結(jié)合在預(yù)先固定化的雙鏈DNA序列的規(guī)定位點的檢測物質(zhì)”之間的相互作用。
術(shù)語“目標(biāo)物質(zhì)(target substance)”廣泛地包含了相互作用中涉及的物質(zhì)或者相互作用中可能涉及的待篩選物質(zhì)。目標(biāo)物質(zhì)例如，包括激素和內(nèi)分泌擾亂物質(zhì)。
術(shù)語“激素”指這樣的物質(zhì)，其由特定細(xì)胞對活生物體的內(nèi)部和外部信息發(fā)生響應(yīng)而得以產(chǎn)生和分泌，并且其通過體液將這種信息傳遞給其它細(xì)胞。激素根據(jù)它們作用的受體分為以下種類。
·作用于細(xì)胞膜滲透型受體的激素(如蛋白-肽激素和兒茶酚胺)。
·作用于細(xì)胞內(nèi)受體的激素(如類固醇激素)。
·直接作用于細(xì)胞核內(nèi)受體的激素(如甲狀腺激素，視黃醛衍生物，和維生素D)。
術(shù)語“內(nèi)分泌擾亂物質(zhì)”指稱為“環(huán)境激素”的任何物質(zhì)，其以與雌激素(人類性激素)或其類似物相同的方式對活生物體起作用。該化學(xué)物質(zhì)進(jìn)入活生物體內(nèi)與激素受體相結(jié)合(其中原本存在于活生物體內(nèi)的激素本應(yīng)與所述受體相結(jié)合)，從而產(chǎn)生激素樣效應(yīng)(激動劑作用)或者抑制原來的(original)激素效應(yīng)(拮抗劑作用)。比如，已知雙酚，壬基酚(nonyphenol)和DDT能結(jié)合雌激素受體，從而產(chǎn)生類似雌激素的反應(yīng)。另外的例子包括二噁英(產(chǎn)生抗雌激素作用)，乙烯菌核利(vinclozolin)和DDE(產(chǎn)生抗雄性激素作用)，及TCDD和PCB(擾亂甲狀腺激素)。參考《Application of DNA chip，II》(93-95頁)，K.Matsunaga編輯，C.M.C出版。
“檢測物質(zhì)(detecting substance)”定義為與上述目標(biāo)物質(zhì)產(chǎn)生直接或間接相互作用的任何物質(zhì)。檢測物質(zhì)至少包括配體非依賴性的激素受體和配體依賴性激素受體。換句話說，在測定開始時配體非依賴性激素受體首先與雙鏈DNA序列的規(guī)定位點直接或間接結(jié)合，而不需考慮其與目標(biāo)物質(zhì)(配體)的相互作用。配體依賴性激素受體包括這樣的物質(zhì)，其一旦與目標(biāo)物質(zhì)(配體)發(fā)生相互作用，三級結(jié)構(gòu)即發(fā)生改變，并直接或間接地結(jié)合于序列的規(guī)定位點。“檢測物質(zhì)”包括轉(zhuǎn)錄激活因子。雙鏈DNA解離成單鏈DNA可表現(xiàn)為由轉(zhuǎn)錄激活導(dǎo)致的狀態(tài)改變。
雙鏈DNA中的“序列的規(guī)定位點(specific site of sequence)”指檢測物質(zhì)可結(jié)合的序列位點。它包括激素應(yīng)答基因上游的啟動子區(qū)域中的激素應(yīng)答元件。起檢測物質(zhì)作用的激素受體與該激素應(yīng)答元件結(jié)合。
固定在檢測表面的“雙鏈DNA”是經(jīng)人工修飾或調(diào)節(jié)的“脫氧核糖核酸的互補(bǔ)結(jié)合體”，使得當(dāng)檢測物質(zhì)(如激素受體)結(jié)合在該雙鏈DNA序列的規(guī)定位點時，該雙鏈DNA解離成單鏈DNA。它還可包括經(jīng)人工修飾或調(diào)節(jié)的“脫氧核糖核酸的互補(bǔ)結(jié)合體”，使得該雙鏈DNA對檢測物質(zhì)引起的轉(zhuǎn)錄激活信號發(fā)生響應(yīng)而解離成為單鏈。
本發(fā)明包括的一個實施方案中，雙鏈DNA中插入了嵌入劑(如熒光嵌入劑)。當(dāng)雙鏈DNA解離成單鏈DNA時，熒光嵌入劑將自身釋放到檢測表面上，從而其顯色發(fā)生改變?！盁晒馇度雱笔且环N依靠其結(jié)合特性而嵌入雙鏈DNA的互補(bǔ)結(jié)合體中的熒光物質(zhì)。
本發(fā)明還包括了一個實施方案，其中固定在所述檢測表面的DNA鏈的末端標(biāo)記有熒光物質(zhì)(諸如熒光染料等)。當(dāng)雙鏈DNA解離成單鏈DNA時，該熒光物質(zhì)在檢測表面上釋放被標(biāo)記的DNA鏈，從而改變所述熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度。
本發(fā)明還包括了一個實施方案，其中固定在所述檢測表面的DNA鏈的末端標(biāo)記有介電物質(zhì)，當(dāng)雙鏈DNA解離成單鏈DNA時，該介電物質(zhì)和檢測表面之間的距離改變，導(dǎo)致介電常數(shù)的改變。“介電物質(zhì)(dielectricsubstance)”在靜電場中發(fā)生電極化，但是不產(chǎn)生持續(xù)電流。
本發(fā)明還包括了一個實施方案，其中由目標(biāo)物質(zhì)和嵌入劑組成的復(fù)合物與雙鏈DNA的互補(bǔ)堿基對結(jié)合。在這種情況下，目標(biāo)物質(zhì)的一個常見例子是激素。嵌入劑可以是熒光物質(zhì)或非熒光物質(zhì)。
本發(fā)明還提供檢測物質(zhì)之間相互作用的方法。該方法包括將雙鏈DNA固定到檢測表面的步驟，雙鏈DNA對物質(zhì)間的相互作用發(fā)生響應(yīng)而解離成單鏈DNA的步驟，以及檢測該解離作用的步驟。
根據(jù)本發(fā)明的方法可以改進(jìn)為還包括將由待檢測目標(biāo)物質(zhì)(如激素)和嵌入劑組成的結(jié)合體結(jié)合在雙鏈DNA的互補(bǔ)堿基對部位的步驟，以及當(dāng)雙鏈DNA解離成單鏈DNA時所述結(jié)合體自身釋放到所述檢測表面上的介質(zhì)中的步驟，以及構(gòu)成被釋放結(jié)合體的目標(biāo)物質(zhì)通過與受體結(jié)合而促進(jìn)解離的步驟。
根據(jù)改進(jìn)的實施方案，通過下述方法使大量的雙鏈DNA分子連續(xù)地解離成單鏈將雙鏈DNA分子有規(guī)則地固定在檢測表面上，利用嵌入劑特性將結(jié)合體嵌入到雙鏈DNA的互補(bǔ)堿基對中，以及將待檢測的目標(biāo)物質(zhì)引入雙鏈DNA。連續(xù)解離成單鏈的過程呈指數(shù)倍地放大了最初的待測信號，從而實現(xiàn)高靈敏度的檢測。
用于檢測的測定原理并沒有特別的限制。在一些情況下，運用表面胞質(zhì)團(tuán)共振(以下簡稱為SPR)原理是可取的。還可以運用任何其它光學(xué)原理或者檢測水晶振蕩器頻率改變的原理。
具體地說，基于表面胞質(zhì)團(tuán)共振原理，可通過檢測介電常數(shù)的改變來實現(xiàn)檢測，其中當(dāng)雙鏈DNA解離成單鏈DNA時，檢測表面與雙鏈DNA的固定DNA鏈末端的標(biāo)記性介電物質(zhì)之間的距離發(fā)生改變，介電常數(shù)發(fā)生變化。
通過本發(fā)明的方法檢測相互作用是利用光學(xué)方法測定以下兩項(1)或(2)之一實現(xiàn)的。(1)用于標(biāo)記雙鏈DNA的熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度的變化。(2)插入雙鏈DNA中的熒光嵌入劑的顯色變化。
因此，本發(fā)明允許高精度的檢測，即使是對于低分子量物質(zhì)的任何水平的相互作用。
附圖簡述結(jié)合附圖，參考說明書將理解本發(fā)明的這些和其它的目的，其中
圖1圖示了本發(fā)明一個基本機(jī)制的概念；圖2圖示了本發(fā)明另一個基本機(jī)制的概念；圖3圖示了適合于檢測雙鏈DNA解離成單鏈DNA的第一個實施方案的概念；圖4圖示為上述相同目的的第二個實施方案的概念；圖5圖示為上述相同目的的第三個實施方案的概念；圖6A是表示激素(如糖皮質(zhì)激素)如何起作用的示意圖；圖6B是表示激素(如甲狀腺激素)如何起作用的示意圖；
圖7是說明激素-受體復(fù)合物如何作用于DNA中的GRE，從而引起DNA解離成單鏈的示意圖；圖8圖示了顯示以規(guī)則間隔固定到檢測表面的雙鏈DNA分子；圖9是說明激素受體復(fù)合物如何作用于激素應(yīng)答元件(GRE)，從而引起雙鏈DNA解離成單鏈DNA并釋放結(jié)合體的示意圖；圖10是顯示從第一個單鏈DNA中釋放出來的結(jié)合體嵌入第二個雙鏈DNA中的互補(bǔ)堿基對中以后所發(fā)生情況的示意圖；圖11是示意圖，表示構(gòu)成從雙鏈DNA中釋放出來的結(jié)合體的目標(biāo)物質(zhì)(諸如類皮質(zhì)激素等)，是如何形成激素-受體復(fù)合物，其中所述復(fù)合物隨后作用于另一個雙鏈DNA的GRE；圖12是簡化圖，顯示本發(fā)明所述傳感裝置的基本結(jié)構(gòu)。
優(yōu)選實施例的詳細(xì)說明本發(fā)明的優(yōu)選實施例將參考附圖在下文說明。
圖1圖示了本發(fā)明一個基本機(jī)制的概念。圖2圖示了本發(fā)明另一個基本機(jī)制的概念。在附圖1和圖2中箭頭“X”表示從雙鏈DNA到單鏈DNA的轉(zhuǎn)變。(這適用于其它附圖)。
圖1和圖2中標(biāo)記數(shù)字1表示本發(fā)明的檢測表面的一個實施方案。所示用于檢測相互作用的檢測表面1是由玻璃、透明合成樹脂、無定形碳等制成的基板11的表面(和其上一些區(qū)域或空間)。在利用表面胞質(zhì)團(tuán)共振原理檢測相互作用的情況下，檢測表面1可以是通過汽相沉積(vapor deposition)形成的金屬薄膜(比如金的)。
檢測表面1并不總是限于平坦表面11，它包括各種基板(包括粒狀的(如塑料珠)、膜體、和纖維狀物)的表面(以及其上的一些區(qū)域或者空間)。
檢測表面1具有預(yù)先固定在其上的雙鏈DNA2。雙鏈DNA2根據(jù)需要可排列在檢測表面1上。固定在檢測表面1上的雙鏈DNA2是脫氧核糖核酸的互補(bǔ)雙鏈，其由末端固定在檢測表面1上的單鏈DNA21和具有與單鏈DNA21互補(bǔ)的堿基序列的單鏈DNA22組成。(參見圖1)。
雙鏈DNA2可以以任何方式固定在檢測表面1上而沒有具體限制。然而為確保雙鏈DNA2的固定，對檢測表面的適當(dāng)處理通常是必要的。
使用鏈霉抗生物素蛋白處理的表面適合于固定生物素化的DNA末端。同樣地，使用巰基(SH)基團(tuán)處理的表面適合于通過二硫鍵(-S-S-鍵)固定具有巰基修飾的末端的DNA。
雙鏈DNA2具有堿基序列的特定部分，其中存在與檢測物質(zhì)D結(jié)合的應(yīng)答元件3。除外，本發(fā)明不排除雙鏈DNA2本身是應(yīng)答元件3的實施方案。
圖1表示的例子中檢測物質(zhì)D已經(jīng)在檢測開始時結(jié)合在應(yīng)答元件3上。圖1還示意性地顯示了使檢測物質(zhì)D和被加入、注射或者輸注入的目標(biāo)物質(zhì)T發(fā)生相互作用的機(jī)制。
圖1還顯示根據(jù)以下機(jī)制的例子。當(dāng)目標(biāo)物質(zhì)T與和雙鏈DNA2的應(yīng)答元件3相連的檢測物質(zhì)D結(jié)合時，雙鏈DNA2由于轉(zhuǎn)錄因子的作用而發(fā)生轉(zhuǎn)錄激活。該機(jī)制導(dǎo)致雙鏈DNA2下游解離成單鏈DNA21和22。
圖1中表示的機(jī)制通過以下例子來闡述，其中目標(biāo)物質(zhì)T是激素或者激素樣內(nèi)分泌擾亂物質(zhì)，檢測物質(zhì)D是不依賴于作為配體的目標(biāo)物質(zhì)T的激素受體。
在這種情況下，在檢測表面1上的雙鏈DNA2具有激素受體，所述受體能與預(yù)先連接在該檢測表面的視黃醛衍生物(激素)特異性結(jié)合，并且一旦視黃醛衍生物和激素受體形成復(fù)合物，雙鏈DNA2就發(fā)生轉(zhuǎn)錄激活，從而解離成單鏈DNA21和22。
圖2表示了本發(fā)明另一個基本機(jī)制的概念。這個機(jī)制是如下起作用的。目標(biāo)物質(zhì)T與檢測物質(zhì)d1反應(yīng)產(chǎn)生另一待測物質(zhì)d2，d2的三維結(jié)構(gòu)不同于d1，并與雙鏈DNA2的應(yīng)答元件3上結(jié)合。
如圖2所示的實例基于如下的機(jī)制進(jìn)行。雙鏈DNA2響應(yīng)于檢測物質(zhì)d2與應(yīng)答元件3之間的結(jié)合由于轉(zhuǎn)錄因子的作用而發(fā)生轉(zhuǎn)錄激活，然后所述雙鏈DNA2在下游解離成單鏈DNA21和22。
如圖2中表示的機(jī)制通過以下例子來闡述，其中目標(biāo)物質(zhì)T是激素或者激素樣內(nèi)分泌擾亂物質(zhì)，而檢測物質(zhì)d1是激素受體，其依賴于作為配體的目標(biāo)物質(zhì)T。
在這種情況下，雌激素應(yīng)答基因的啟動子區(qū)域內(nèi)的激素應(yīng)答元件(相當(dāng)于雙鏈DNA)被預(yù)先固定在檢測表面1上。將雌激素(激素)和雌激素受體α(相當(dāng)于檢測物質(zhì)d1)給予激素應(yīng)答元件，使它們彼此反應(yīng)。這種反應(yīng)改變了雌激素受體α的三維結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致它與激素應(yīng)答元件結(jié)合。由此雌激素應(yīng)答基因由于轉(zhuǎn)錄因子而被轉(zhuǎn)錄激活，從而解離成單鏈DNA。
目前，L.L.Looger等人發(fā)現(xiàn)大腸桿菌的五種受體(分別與葡萄糖，核糖，阿拉伯糖，谷氨酰胺，和組氨酸結(jié)合的蛋白質(zhì))，其被修飾成特異性結(jié)合于與天然配體不同的分子。這些受體說明(i)它們具有顯著的特異性(使得可檢測相似的分子結(jié)構(gòu)和光學(xué)異構(gòu)體)，(ii)它們具有與天然配體大致上相同的親和性，以及(iii)即使它們成為復(fù)合物仍然保持著其功能性。而且，它們也顯示了將候選物縮小到實際的時間范圍內(nèi)的可能性。(L.L.Looger，M.A.Dwyet，J.J.Smith，H.W.Hellinga“Computational design of receptor and sensorproteins with novel functions”，Nature，423，185-190
)L.L.Looger等人的上述文章表明所述受體在保持與配體反應(yīng)以使雙鏈DNA2解離成為單鏈DNA的功能的同時，可能與不同的配體特異性結(jié)合。這意味著所述受體在保持其內(nèi)在功能時，能夠與人工選擇的目標(biāo)物質(zhì)T反應(yīng)。換句話說，可以使受體起檢測物質(zhì)的作用。這樣在圖1和圖2中顯示的機(jī)制對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是可行的。
修飾上述的作為受體的檢測物質(zhì)D或者d1在理論上是可行的，使得當(dāng)它與作為配體的目標(biāo)物質(zhì)T反應(yīng)并與雙鏈DNA2的應(yīng)答元件3結(jié)合時，激活雙鏈DNA2的轉(zhuǎn)錄，從而使雙鏈DNA解離成單鏈DNA。如此圖1和圖2中顯示的機(jī)制對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是可行的。
圖3是表示適合檢測雙鏈DNA2解離成單鏈DNA的第一個實施方案的示意圖。圖4是表示與上述目的相同的第二個實施方案的示意圖。圖5是表示與上述目的相同的第三個實施方案的示意圖。
圖3中表示的第一個實施方案將在以下闡述。
在基板11上形成的檢測表面1具有雙鏈DNA2，其中的單鏈DNA21固定在該檢測表面上。固定的單鏈DNA21的上端用介電物質(zhì)4(諸如介電晶體等)標(biāo)記。
雙鏈DNA2具有應(yīng)答元件3，其與檢測物質(zhì)D(或者d2)如激素受體等反應(yīng)。雙鏈DNA2響應(yīng)于這個反應(yīng)經(jīng)轉(zhuǎn)錄激活解離成單鏈DNA21和22。
這種反應(yīng)的過程改變了基板11和介電物質(zhì)4之間的距離。具體地說，距離L2(在解離之后)大于距離L1(在解離之前)，或者L1＜L2。距離的變化改變了介電常數(shù)，并因此改變了反射光的強(qiáng)度峰值。檢測該變化，就可以判斷檢測物質(zhì)與應(yīng)答元件之間是否發(fā)生相互作用。用于檢測的入射光線和反射光線在圖3中分別以P1和P2標(biāo)識。
圖4中表示的第二個實施方案將在以下闡述。
在基板11上形成的檢測表面1具有雙鏈DNA2，其中的單鏈DNA22固定在該檢測表面上。固定的單鏈DNA22的上端標(biāo)記有熒光物質(zhì)5(如稱為Cy-3或者Cy-5的熒光染料，從Amersham Pharmacia Inc.購得)。
雙鏈DNA 2具有應(yīng)答元件3，其與檢測物質(zhì)D(或者d2)如激素受體發(fā)生反應(yīng)。雙鏈DNA2響應(yīng)于這個反應(yīng)經(jīng)轉(zhuǎn)錄激活解離成單鏈DNA21和22。
結(jié)果，標(biāo)記的單鏈DNA22自身從檢測表面1上釋放出來，并且透射光的強(qiáng)度峰值消失。檢測所述消失，就可以判斷目標(biāo)物質(zhì)T和檢測物質(zhì)D(或者D1)是否發(fā)生相互作用。入射光(如用于檢測相互作用的激光束)在圖4中用P1標(biāo)識。
圖5中表示的第三個實施方案在以下闡述。
在基板11上形成的檢測表面1具有雙鏈DNA2。該雙鏈DNA2中插入了熒光嵌入劑I。嵌入劑I可以是POPO-1，TOTO-3，和SYBR(注冊商標(biāo))Green I中的任何一種。
雙鏈DNA2具有應(yīng)答元件3，其與檢測物質(zhì)D(或d2)如激素受體發(fā)生反應(yīng)。雙鏈DNA2響應(yīng)于這個反應(yīng)經(jīng)轉(zhuǎn)錄激活解離成單鏈DNA21和22。
結(jié)果，熒光嵌入劑I從檢測表面1上釋放出來，并且因此它的顯色發(fā)生改變。用光學(xué)方法檢測該變化，就可以判斷目標(biāo)物質(zhì)T和檢測物質(zhì)D(或者d1)之間是否發(fā)生相互作用。
參考圖6A至11，第四個實施方案將在下文闡述。
這個實施方案的原理是基于當(dāng)活生物體接受外界環(huán)境的應(yīng)激物的應(yīng)激時，腎上腺皮質(zhì)釋放出稱為糖皮質(zhì)激素(脂溶性小激素)的類固醇激素進(jìn)入血液。它與水溶性運輸?shù)鞍捉Y(jié)合并在血液中運行，使其直接作用于細(xì)胞中的受體。
圖6A是說明激素(如糖皮質(zhì)激素)如何起作用的示意圖。應(yīng)當(dāng)指出的是激素(H)與受體(R)結(jié)合形成復(fù)合物，所述復(fù)合物遷移到細(xì)胞核內(nèi)，并作用于DNA的激素應(yīng)答元件[在所述情況下是GRE(糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件)]。所述復(fù)合物促進(jìn)下游的DNA編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)。已知甲狀腺激素，視黃醛衍生物，維生素D等等遷移到細(xì)胞核內(nèi)并作用于受體。(參見圖6B。)眾所周知，蛋白質(zhì)的表達(dá)是由雙鏈DNA解離成單鏈DNA以及隨后轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄過程而激發(fā)的。圖7用來幫助理解本發(fā)明。它示意性地表示了當(dāng)激素-受體復(fù)合物C作用于上述雙鏈DNA2的GRE，雙鏈DNA2如何解離成單鏈DNA。
嵌入劑I有時被用于常規(guī)技術(shù)來檢測雜交。第四個實施方案的特征在于使用了嵌入劑I以及雙鏈DNA響應(yīng)于激素而解離成單鏈DNA的反應(yīng)，所述解離反應(yīng)在轉(zhuǎn)錄時發(fā)生。
如下所述，第四個實施方案中的檢測表面將參考圖8更為詳細(xì)地描述。第四個實施方案是一個測定系統(tǒng)，用于檢測皮質(zhì)醇(糖皮質(zhì)激素的一種)。然而，本發(fā)明的范圍不局限于這樣的測定系統(tǒng)。本實施方案建立在檢測是通過SPR(表面胞質(zhì)團(tuán)共振)來實現(xiàn)的這一推定的基礎(chǔ)上。然而，本發(fā)明的范圍不局限于這種檢測方法。
根據(jù)第四個實施方案，檢測表面1包被有適于SPR分析的金屬薄膜。大量的雙鏈DNA分子2a，2b，2c，...2n(每個具有GRE)固定在該金屬薄膜上。預(yù)先制備好的皮質(zhì)醇Tc(作為待測目標(biāo)物質(zhì))與嵌入劑I的結(jié)合體M被嵌入雙鏈DNA2中。在檢測表面1上引入一種介質(zhì)，并隨后在其中摻入皮質(zhì)醇受體R和所需的轉(zhuǎn)錄因子E。(參見圖8。)一旦引入檢測表面1上的區(qū)域后，皮質(zhì)醇Tc特異性地與受體R(處于游離狀態(tài))結(jié)合形成復(fù)合物C。這種復(fù)合物C(以二聚物的形式)作用于雙鏈DNA(諸如標(biāo)為2a的雙鏈DNA)中的GRE。這種作用在轉(zhuǎn)錄因子E協(xié)同下使雙鏈DNA2a解離為單鏈。(參見圖9。)在解離成單鏈的過程中，已嵌入雙鏈DNA2a中的結(jié)合體Ma釋放到介質(zhì)中(如圖9中虛線箭頭所示)。該釋放的結(jié)合體Ma嵌入雙鏈DNA2b的互補(bǔ)堿基對中，所述雙鏈DNA2b仍然保持雙鏈狀態(tài)并仍固定于固定有雙鏈DNA2a的檢測表面1上。參見圖10，其顯示了從第一條雙鏈DNA2a上釋放出來的結(jié)合體Ma嵌入第二條雙鏈DNA2b的互補(bǔ)堿基對以后所發(fā)生的情況。在圖10中的標(biāo)記數(shù)字Mb指預(yù)先嵌入雙鏈DNA2b中的結(jié)合體。
另一個反應(yīng)如下發(fā)生。在解離成單鏈時從雙鏈DNA2a釋放出來的結(jié)合體Ma與受體R結(jié)合，其中構(gòu)成復(fù)合物Ma的皮質(zhì)醇Tc保持游離狀態(tài)，形成激素-受體復(fù)合物C。該復(fù)合物C作用于另一雙鏈DNA2c的GRE。此作用在轉(zhuǎn)錄因子E協(xié)同下引發(fā)雙鏈DNA2c解離成單鏈。(參見圖11)。
在解離成單鏈DNA的過程中，已嵌入雙鏈DNA2c的互補(bǔ)堿基對中的結(jié)合體Mc釋放到介質(zhì)中。該釋放的結(jié)合體Mc以與上述結(jié)合體Ma相同的方式起作用。Tc嵌入到其它雙鏈DNA的互補(bǔ)堿基對中，或者與受體R結(jié)合形成激素-受體復(fù)合物C，該復(fù)合物作用于其它雙鏈DNA的GRE上，這樣就與轉(zhuǎn)錄因子E協(xié)同啟動了解離成單鏈的過程(參見圖11)。
如上詮釋，通過前述方法雙鏈DNA的分子(2a到2n)連續(xù)解離成單鏈，所述方法包括將雙鏈DNA分子(2a到2n)有規(guī)律地固定在檢測表面1，將待測目標(biāo)物質(zhì)T(諸如激素等)與嵌入劑I的結(jié)合體M預(yù)先嵌入到每個雙鏈DNA分子(2a到2n)，以及將待測的目標(biāo)物質(zhì)T引入所述雙鏈DNA。
連續(xù)解離成單鏈的過程呈指數(shù)倍地放大了樣品的初始信號，從而可以進(jìn)行高靈敏度的檢測。雙鏈DNA到單鏈的變化可以通過SPR以介電常數(shù)變化的形式來測定。然而也可以使用除SPR外的任何方法。比如可以使用熒光嵌入劑作為嵌入劑I，然后檢測當(dāng)熒光嵌入劑從被嵌入的狀態(tài)變?yōu)橛坞x狀態(tài)時的熒光變化。
如上所述，可通過以下方法檢測或測定物質(zhì)間的相互作用，所述方法包括將預(yù)先制備好的雙鏈DNA2固定到檢測表面的步驟，雙鏈DNA2響應(yīng)于物質(zhì)間的相互作用而解離成單鏈DNA21和22的步驟，以及檢測所述解離的步驟。
上述的檢測表面1可以用于制備基于現(xiàn)有已知技術(shù)的傳感器芯片或者微陣列。還可以制備傳感裝置，所述傳感裝置包括檢測表面1以及用于檢測雙鏈DNA2在檢測表面1上解離成單鏈DNA21和22的檢測裝置。該傳感裝置包括那些分類為生物傳感器的裝置。在這種情況下，檢測表面1可指提供“生物元件(bioelement)”的裝置。
圖12是附圖標(biāo)記為U的傳感裝置的基本結(jié)構(gòu)的簡化圖。該傳感器具有至少檢測表面1(或具有該檢測表面1的傳感器芯片(沒有示出))和檢測主單(detection principle unit)6，檢測主單元6能夠檢測當(dāng)檢測表面1上的介電常數(shù)變化時出現(xiàn)的反射光強(qiáng)度峰值的變化時(如圖3所示的第一個實施方案中)，檢測透射光強(qiáng)度峰值的消失(如圖4所示的第二個實施方案中)，或檢測顯色的變化(如圖5中所示的第三個實施例中)。該傳感裝置還包括用于分析來自于檢測單元6的數(shù)據(jù)的分析單元7以及以恒定流速提供樣品的微流系統(tǒng)8。
檢測主單元6可包括由激光束發(fā)射裝置，共焦透鏡和共焦掃描裝置，CCD相機(jī)，基于表面胞質(zhì)團(tuán)共振原理的裝置，檢測水晶振蕩器頻率變化的裝置，以及轉(zhuǎn)換器(transducer)組成的組中的任何，其應(yīng)當(dāng)根據(jù)檢測原理進(jìn)行適當(dāng)?shù)倪x擇。
傳感裝置U按如下方式工作。檢測表面1上通過注射，滴加，或類似方式加入包含目標(biāo)物質(zhì)T的樣品，以使目標(biāo)物質(zhì)T和檢測物質(zhì)D之間發(fā)生相互作用。然后，通過檢測單元6檢測所述相互作用，并且通過數(shù)據(jù)分析單元7進(jìn)行分析。
本發(fā)明將應(yīng)用于檢測物質(zhì)間相互作用的分析技術(shù)，以及利用活生物體反應(yīng)諸如激素應(yīng)答反應(yīng)等的傳感裝置(包括傳感器芯片，微陣列，和生物傳感器)。
本發(fā)明可用于新藥物和內(nèi)分泌擾亂物質(zhì)的篩選。它也可用于動力學(xué)分析，親和性分析，多分子復(fù)合物的功能分析，結(jié)構(gòu)-功能相關(guān)性分析，以及結(jié)合特異性的分析。
本發(fā)明也可用于生物信息學(xué)，諸如基因組學(xué)等，對基因組轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄組分析，對在活生物體和細(xì)胞中翻譯并產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的表達(dá)的蛋白質(zhì)組分析，對代謝的代謝組學(xué)分析，以及對活生物體中信號的信號組分析。它也可應(yīng)用于測量，檢測，或診斷情緒及壓力的傳感器技術(shù)。
盡管用具體的術(shù)語來描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，然而這些說明目的只是作解釋，應(yīng)當(dāng)明白在不偏離下述權(quán)利要求
范圍的精神和范圍的條件下可以作出改變和變化。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測物質(zhì)之間相互作用的檢測表面，所述檢測表面包括雙鏈DNA，該雙鏈DNA與一端固定在所述檢測表面的單鏈DNA形成互補(bǔ)連接，從而使得所述雙鏈DNA對所述相互作用發(fā)生應(yīng)答而解離成單鏈DNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的檢測表面，其中所述相互作用是發(fā)生在引入所述檢測表面上的目標(biāo)物質(zhì)與直接或間接作用于所述雙鏈DNA序列規(guī)定位點的檢測物質(zhì)之間的作用。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的檢測表面，其中所述目標(biāo)物質(zhì)是激素，所述檢測物質(zhì)是激素受體，而所述序列的規(guī)定位點是激素應(yīng)答元件。
4.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的檢測表面，其中所述檢測物質(zhì)是轉(zhuǎn)錄激活因子，所述雙鏈DNA解離為單鏈DNA是由轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致的狀態(tài)變化。
5.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的檢測表面，其中所述檢測物質(zhì)是具有如下性質(zhì)的物質(zhì)，其一旦與存在于該檢測表面的目標(biāo)物質(zhì)發(fā)生相互作用，其三維結(jié)構(gòu)就發(fā)生變化并且其作用于所述序列的規(guī)定位點。
6.根據(jù)權(quán)利要求
4所述的檢測表面，其中所述目標(biāo)物質(zhì)是激素，所述檢測物質(zhì)是配體依賴型激素受體，且所述序列的規(guī)定位點是激素應(yīng)答元件。
7.根據(jù)權(quán)利要求
1的檢測表面，其中所述雙鏈DNA具有插入其中的熒光嵌入劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的檢測表面，其中未固定在該檢測表面的DNA鏈的末端由熒光物質(zhì)標(biāo)記。
9.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的檢測表面，其中固定在該檢測表面的DNA鏈的末端由介電物質(zhì)標(biāo)記。
10.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的檢測表面，其中所述雙鏈DNA具有由所述目標(biāo)物質(zhì)和嵌入劑組成的復(fù)合物，所述復(fù)合物結(jié)合在互補(bǔ)堿基對的部位。
11.根據(jù)權(quán)利要求
10所述的檢測表面，其中所述目標(biāo)物質(zhì)是激素。
12.傳感器芯片，其包含權(quán)利要求
1的檢測表面。
13.一種傳感裝置，其包括權(quán)利要求
1所述的檢測表面以及用于檢測雙鏈DNA解離成單鏈DNA的裝置，所述解離發(fā)生在該檢測表面上。
14.一種檢測物質(zhì)之間相互作用的方法，包括將雙鏈DNA固定在檢測表面的步驟，使該雙鏈DNA對物質(zhì)之間相互作用發(fā)生應(yīng)答而解離成單鏈DNA的步驟，以及檢測所述解離的步驟。
15.根據(jù)權(quán)利要求
14所述的方法，進(jìn)一步包括將由待檢測目標(biāo)物質(zhì)與嵌入劑組成的結(jié)合體結(jié)合到所述雙鏈DNA互補(bǔ)堿基對的部位。
16.根據(jù)權(quán)利要求
15所述的方法，進(jìn)一步包括當(dāng)所述雙鏈DNA解離成單鏈DNA時，所述結(jié)合體自身釋放到檢測表面上的介質(zhì)中的步驟，以及構(gòu)成被釋放的結(jié)合體的目標(biāo)物質(zhì)通過與受體結(jié)合而促進(jìn)解離的步驟。
17.根據(jù)權(quán)利要求
15所述的方法，其中所述目標(biāo)物質(zhì)是激素。
18.根據(jù)權(quán)利要求
14所述的方法，其中所述檢測是通過基于表面胞質(zhì)團(tuán)共振原理的過程來實現(xiàn)的。
19.根據(jù)權(quán)利要求
14所述的方法，其中所述檢測是通過設(shè)計為基于表面胞質(zhì)團(tuán)共振原理而檢測介電常數(shù)改變的方法來實現(xiàn)的，其中當(dāng)所述雙鏈DNA解離成單鏈DNA時，所述檢測表面與標(biāo)記在所述雙鏈DNA的固定化DNA鏈末端的介電物質(zhì)之間的距離改變，介電常數(shù)發(fā)生改變。
20.根據(jù)權(quán)利要求
14所述的方法，其中所述的檢測可選通過測量以下兩項(1)或(2)之一來實現(xiàn)，(1)標(biāo)記所述雙鏈DNA的熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度的變化，(2)插入所述雙鏈DNA中的熒光嵌入劑的顯色的變化。
專利摘要
本文公開了一種能夠檢測物質(zhì)之間相互作用的表面。該表面具有與一端固定在該表面的單鏈DNA形成互補(bǔ)連接的雙鏈DNA，從而使所述雙鏈DNA應(yīng)答于前述相互作用而解離成單鏈DNA。本文還公開了一種傳感器芯片和傳感裝置，以及一種檢測物質(zhì)之間相互作用的方法。
文檔編號C12Q1/68GKCN1699601SQ200510074187
公開日2005年11月23日 申請日期2005年2月8日
發(fā)明者渡部佑己 申請人:索尼株式會社導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan