專利名稱:一種大腸桿菌表達(dá)載體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說，本發(fā)明涉及一種大腸桿菌 (Escherichia coli)表達(dá)載體，其不產(chǎn)生β _內(nèi)酰胺酶，該表達(dá)載體可用于高效表達(dá)在制 備7-氨基頭孢霉烷酸時(shí)所需的酶。
背景技術(shù)：
酶法制備7-氨基頭孢霉烷酸包括兩個(gè)步驟(1) D-氨基酸氧化酶氧化頭孢菌素C 生成戊二酰-7-氨基頭孢霉烷酸；( 戊二酰-7-氨基頭孢霉烷酸酰化酶水解戊二酰-7-氨 基頭孢霉烷酸產(chǎn)生7-氨基頭孢霉烷酸。目前，上述兩種酶的表達(dá)載體大多用氨芐青霉素抗 性基因作為篩選標(biāo)記。但其基因產(chǎn)物內(nèi)酰胺酶，除降解氨芐青霉素外，對(duì)內(nèi)酰胺類 化合物頭孢菌素C、戊二酰-7-氨基頭孢霉烷酸和7-氨基頭孢霉烷酸均有降解。所以，使用 含氨芐青霉素抗性基因的表達(dá)載體，其發(fā)酵產(chǎn)物因含大量?jī)?nèi)酰胺酶，會(huì)大大降低7-氨 基頭孢霉烷酸的產(chǎn)率。而且，目前上述表達(dá)載體在大腸桿菌中的穩(wěn)定性不高，在發(fā)酵過程中 容易丟失，從而影響了目的蛋白的表達(dá)。
具體而言，目前報(bào)導(dǎo)的D-氨基酸氧化酶表達(dá)水平較低，約為2，300酶單位每升發(fā) 酵液(Pollegioni, L. et al.，1997，J. Biotechnol. 58，115-123 :800 酶單位每升發(fā)酵液； Molla, G.et al.，1998，Protein Exp. Purif. 14，289-294)；目前報(bào)導(dǎo)的戊二酰 _7_ 氨基頭 孢霉烷酸?；副磉_(dá)水平也較低，約為1 酶單位每升發(fā)酵液_2，500酶單位每升發(fā)酵液 (Ishiye, M.和 Niwa，Μ.，1992，BioChim. Biophys. Acta 1132,233-239 ；楊蘊(yùn)劉等，2001，中 國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)CN 1301813A ；許崗和朱敏，2003，中國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)CN1^8424A)。因 而目前酶法制備7-氨基頭孢霉烷酸具有成本高、產(chǎn)率低的缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種穩(wěn)定、高效的大腸桿菌表達(dá)載體，其不產(chǎn)生內(nèi)酰 胺酶。它可用于高效表達(dá)在制備7-氨基頭孢霉烷酸時(shí)所需的酶，從而既能提高酶法制備 7-氨基頭孢霉烷酸的產(chǎn)率，又能降低其成本。本發(fā)明的目的還在于提供一種使用所述表達(dá) 載體在大腸桿菌中高效表達(dá)所需目的蛋白的方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的一個(gè)技術(shù)方案提供了一種大腸桿菌表達(dá)載體，所述表 達(dá)載體含有在啟動(dòng)子控制下的目的蛋白基因，其特征在于，所述表達(dá)載體由載體PRSET-A 構(gòu)建而來，其中所述載體pRSET-A中的氨芐青霉素抗性基因被卡那霉素抗性基因代替。
在所述技術(shù)方案的表達(dá)載體中，所述啟動(dòng)子優(yōu)選為Iac啟動(dòng)子，所述表達(dá)載 體優(yōu)選含有可表達(dá)的hok/sok基因，更優(yōu)選含有有助于蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)譯的核蛋白體結(jié)合 位點(diǎn)AGAAGGA。所述目的蛋白基因優(yōu)選為D-氨基酸氧化酶基因，更優(yōu)選為三角酵母 (Tr i gonops i s var iab i 1 i s) D-氨基酸氧化酶突變體基因，本發(fā)明提供的表達(dá)載體進(jìn)一步優(yōu) 選為pHS-GHA(見圖1)，具有序列號(hào)1所示的序列。
上面所述hok/sok基因編碼hok RNA (靶RNA)和sok RNA (反義RNA)。hok基因產(chǎn)物破壞細(xì)胞膜，引起細(xì)胞死亡。但sok RNA抑制hok RNA的轉(zhuǎn)譯，防止hok基因產(chǎn)物產(chǎn)生。在 含有hok/sok基因片段的質(zhì)粒存在下，大腸桿菌能正常生長(zhǎng)；反之，由于hok RNA比sokRNA 更穩(wěn)定，因此，載體一經(jīng)缺失，缺失載體的大腸桿菌便無法生存(Pec0ta，D.C. et al.，1997， Appl.Environ. Microbiol. 63，1917—1924)。
在本發(fā)明的另一個(gè)技術(shù)方案的表達(dá)載體中，所述目的蛋白基因優(yōu)選為戊二 酰-7-氨基頭孢霉烷酸?；富?，所述戊二酰-7-氨基頭孢霉烷酸?；富騼?yōu)選來自 假單孢菌O^seudomonas sp.) SE83，本發(fā)明提供的表達(dá)載體進(jìn)一步優(yōu)選為pT7-kan-ACY (見 圖2)，具有序列號(hào)2所示的序列。
本發(fā)明的又一個(gè)技術(shù)方案提供了一種在大腸桿菌中表達(dá)目的蛋白的方法，所述大 腸桿菌是由含有所述目的蛋白的基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的，并且所述目的蛋白基因在啟動(dòng)子 控制之下，其特征在于，該表達(dá)載體由載體pRSET-A構(gòu)建而來，其中所述載體pRSET-A中的 氨芐青霉素抗性基因被卡那霉素抗性基因代替。其中所述目的蛋白基因優(yōu)選為D-氨基 酸氧化酶基因或戊二酰-7-氨基頭孢霉烷酸?；富颍龃竽c桿菌優(yōu)選在含有濃度為 50-100微克/毫升的卡那霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。


圖1為表達(dá)載體pHS-GHA。
圖2 為表達(dá)載體 pT7-kan_ACY。
圖 3 為表達(dá)載體 pRSET-lac-GI-hok/sok-kan。
圖4為來自BL-HS-GHA的D-氨基酸氧化酶GHA對(duì)頭孢菌素C/戊二酰_7_氨基頭 孢霉烷酸降解的HPLC圖譜。
圖5為來自BL-T7K-GHA的D-氨基酸氧化酶GHA對(duì)頭孢菌素C/戊二酰-7-氨基 頭孢霉烷酸降解的HPLC圖譜。
圖6為來自BL-T7A-GHA的D-氨基酸氧化酶GHA對(duì)頭孢菌素C/戊二酰-7-氨基 頭孢霉烷酸降解的HPLC圖譜。
圖7為來自BL-T7K-ACY的假單孢菌SE83戊二酰_7_氨基頭孢霉烷酸?；笇?duì)戊 二酰-7-氨基頭孢霉烷酸/7-氨基頭孢霉烷酸降解的HPLC圖譜。
圖8為來自BL-T7A-ACY的假單孢菌SE83戊二酰_7_氨基頭孢霉烷酸?；笇?duì)戊 二酰-7-氨基頭孢霉烷酸/7-氨基頭孢霉烷酸降解的HPLC圖譜。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 表達(dá)載體pRSET-kan的構(gòu)建
根據(jù)pRSET-A的序列設(shè)計(jì)PCR引物，具體為
上游引物VET-F :5，-CTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAG-3，；
下游引物VET-R :5，-ACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGC-3，。
根據(jù)ρΕΤ2^3的序列設(shè)計(jì)PCR引物，具體為上游引物KAN-F 5，-ATGAGCCATATTCMCGGGAMC-3‘；下游引物 KAN-R :5，-TTAGMMACTCATCGAGCATCMATG-3，。
擴(kuò)增去除氨芐青霉素抗性基因的pRSET-A片段的PCR條件為50ng pRSET-A (Invitrogen), 0. 4 μ M VET-F,0. 4μ M VET-R, 50 μ M dATP,50y M dTTP,50 μ MdCTP,50yM dGTP,20mM Tris-HCl (pH8. 8), IOmM KCl, IOmM (NH4) 2S04, 2mM MgSO4,0. 1 % Triton X-100,2. 5U Pfu DNA聚合酶(Promega)，用無菌水調(diào)反應(yīng)體積至50 μ L。PCR擴(kuò)增 反應(yīng)程序?yàn)?MV，5分鐘；940C，1分鐘，50°C，1分鐘，72VA分鐘，循環(huán)35次；720C，10分鐘。
擴(kuò)增卡那霉素抗性基因的PCR條件為50ng pET28b (Novagen), 0. 4 μ M KAN-F, 0. 4μ M KAN-R, 50 μ M dATP,50yM dTTP,50yM dCTP,50yM dGTP，20mM Tris-HCl (ρΗ 8. 8), IOmM KCl, IOmM (NH4) 2S04, 2mM MgSO4,0. 1 % Triton X-100,2. 5U Pfu DNA 聚合酶 (Promega)，用無菌水調(diào)反應(yīng)體積至50 μ L。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4°C，5分鐘；94°C，1分 鐘，50°C，1分鐘，72°C，4分鐘，循環(huán)35次；72°C，10分鐘。
用0. 8%瓊脂糖電泳提純PCR產(chǎn)物(去除氨芐青霉素抗性基因的pRSET-A片段的 PCR產(chǎn)物長(zhǎng)2，036bp ；卡那霉素抗性基因的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)816bp)，連接該兩片段得pRSET-kan。 將pRSET-kan轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21 (DE3) pLysS (Novagen)，在卡那霉素(50 μ g/mL) LB (1%氯化鈉，蛋白胨，0.5%酵母浸膏)平板上于37 °C培養(yǎng)過夜。按照Molecular Cloning-Α Laboratory Manual (Sambrook, J. et al.，1989，CSHL Press)描述的方法提取 質(zhì)粒。
實(shí)施例2 載體pRSET-lac-kan的構(gòu)建
根據(jù)pGEMT-Easy (!Iomega)的序列設(shè)計(jì)PCR引物，具體為上游引物RBS-NdeI 5 -CATATGTATATC TCCTTCT； TGTGTGAAATTG-3，(NdeI酶切位點(diǎn)以下劃線表示，外加的核蛋白 體結(jié)合位點(diǎn)以下間虛線表示)；下游引物RBS-AIwNI 5’-CAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTC-3’ (AlwNI酶切位點(diǎn)以下劃線表示)。
以pGEMT-Easy (Promega)為模板，用上述引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增得到一 755bp產(chǎn) 物。PCR 條件為50ng pGEMT-Easy (Promega), 0. 4 μ MRBS-NdeI, 0. 4 μ M RBS-AlwNI, 50 μ M dATP,50yM dTTP,50yM dCTP,50yM dGTP,20mM Tris-HCl (ρΗ 8. 8)，IOmM KCl, IOmM (NH4)2S04,2mM MgSO4,0. 1% Triton X-100,2. 5U Pfu DNA聚合酶(Promega)，用無菌水調(diào)反 應(yīng)體積至50 μ L0 PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?94°C，5分鐘；94°C，1分鐘，50°C，1分鐘，72V,4分 鐘，循環(huán)35次；72 °C，10分鐘。
該P(yáng)CR產(chǎn)物(75^p)在5，端含有NdeI酶切位點(diǎn)和核蛋白體結(jié)合位點(diǎn)及在3， 端含有AlwNI酶切位點(diǎn)。用0. 8%瓊脂糖電泳提純，NdeI和AlwNI酶切后，與經(jīng)NdeI和 AlwNI 酶切的 pRSETA (Invitrogen)連接，得 pRSET-lac。將 pRSET_lac 轉(zhuǎn)化感受態(tài)大 腸桿菌BL21(DE3)pLysS (Novagen)，在氨芐青霉素(100 μ g/mL) LB (1 %氯化鈉，1 %蛋白 胨，0. 5%酵母浸膏)平板上于37°C培養(yǎng)過夜。按照MolecularCloning-A Laboratory Manual (Sambrook, J. et al.，1989，CSHLPress)描述的方法提取質(zhì)粒。
用AlwNI和EcoRI酶切pRSET-lac和pRSET-kan，用0. 8 %瓊脂糖電泳提純各 DNA片段并連接，得pRSET-lac-kan。將pRSET_lac_kan轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21 (DE3) pLysS (Novagen)，在卡那霉素(50 μ g/mL) LB瓊脂平板上于37°C培養(yǎng)過夜。按照Molecular Cloning-Α LaboratoryManual (Sambrook, J. et al.，1989，CSHL Press)描述的方法提取質(zhì) 粒。
實(shí)施例3 載體pGEMT-Easy-GI的構(gòu)建
*艮據(jù)已知的 Thermoanaerobacterium saccharoIyticum glucoseisomerase DNA序列(GenBank L09699)，設(shè)計(jì)PCR引物，具體為上游引物(GI-NdeI)
5，-CATATGAATAAATATTTTGAGAACGTATCTAAAATA-3> (NdeI 酶切位點(diǎn)以下劃線表 示)；
下游引物(GI-EcoRI)5‘ -GATATCTTAA GGCGCGCC TTATTCTGCAAAC-3‘ (EcoRI 酶切 位點(diǎn)以下劃線表示，AscI酶切位點(diǎn)以雙下劃線表示)。
以 Thermoanaerobacterium saccharolyticum(購(gòu)自 ATCC，USA) DNA 為模板,用上 述引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增得到一 1，336bp產(chǎn)物。PCR條件為50ng Τ. saccharolyticum DNA, 0. 4μ M GI-NdeI，0. 4μ M GI-EcoRI, 50 μ M dATP,50yM dTTP,50yM dCTP,50yM dGTP, 20mM Tris-HCl(pH 8. 8), IOmM KCl, IOmM (NH4) 2S04, 2mM MgSO4,0. 1% Triton X-100,2. 5U Platinum Taq High Fidelity DNA 聚合酶 Gnvitrogen)，用無菌水調(diào)反應(yīng)體積至 50 μ L。 PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?5°C，5分鐘；94°C，1分鐘，50°C，1分鐘，72°C，3分鐘，循環(huán)35次； 72 °C，10 分鐘。
該P(yáng)CR產(chǎn)物(1，336bp)在5，和3，端分別含有NdeI和EcoRI酶切位點(diǎn)。PCR 產(chǎn)物經(jīng)0. 8 %瓊脂糖電泳提純，利用TA克隆方法，與pGEMT-Easy (Promega)連接，得 pGEMT-Easy-GI。將 pGEMT-Easy-GI 轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌 DH5 α (Invitrogen)，在氨 芐青霉素(100yg/mL)LB瓊脂平板上于37°C培養(yǎng)過夜。按照Molecular Cloning-A LaboratoryManual (Sambrook, J. et al.，1989，CSHL Press)描述的方法提取質(zhì)粒。
實(shí)施例4 載體 pRSET-lac-GI-hok/sok-kan (見圖 3)的構(gòu)建
用NdeI和EcoRI酶切pGEMT-Easy-GI，經(jīng)0. 8 %瓊脂糖電泳提純，與經(jīng)NdeI和 EcoRI 酶切的 pRSET-lac-kan 連接，得 pRSET-lac-GI-kan。將 pRSET-lac-GI-kan 轉(zhuǎn)化感 受態(tài)大腸桿菌BL21 (DE3) pLysS (Novagen)，在卡那霉素(50 μ g/mL) LB瓊脂平板上于37°C in1 ff ^οMolecularCloning-A Laboratory Manual (Sambrook, J. et al. , 1989, CSHLPress)描述的方法提取質(zhì)粒。
根據(jù)已知hok/sok基因片段序列(GenBank X05813)設(shè)計(jì)10條引物(見表1)。 PCR基因構(gòu)造根據(jù)Kikuchi，Μ. et al.，1999，Gene236 :159-167所述，唯具體步驟有變 更。PCR 條件為20ng 各個(gè)引物，50 μ M dATP,50yM dTTP,50yM dCTP,50yM dGTP,20mM Tris-HCl(pH 8. 8), IOmM KCl, IOmM (NH4) 2S04, 2mM MgSO4,0. 1% Triton X-100,2. 5U Pfu DNA聚合酶(ftOmega)，用無菌水調(diào)反應(yīng)體積至50 μ L。
PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?95°C，4分鐘；94°C，1. 5分鐘；50°C，1. 5分鐘；72°C，5分鐘； 循環(huán)30次；72°C，10分鐘，得一 PCR產(chǎn)物長(zhǎng)580bp，在其5，和3，端分別含有AscI及EcoRI 酶切位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物經(jīng)0. 8%瓊脂糖電泳提純，AscI及EcoRI酶切后，與經(jīng)AscI及EcoRI 酶切的 pRSET-lac-GI-kan 連接，得 pRSET-lac-GI-hok/sok-kan。將 pRSET-lac-GI-hok/ sok-kan轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21 (DE3) pLysS (Novagen)，在卡那霉素(50 μ g/mL) LB瓊 脂平板上于 37°C培養(yǎng)過夜。按照 Molecular Cloning-Α Laboratory Manual (Sambrook, J. et al.，1989，CSHL Press)描述的方法提取質(zhì)粒，測(cè)定其DNA序列如序列3所示。其中 數(shù)個(gè)核苷酸有變異1368 (C->G) ；1513(缺失了 Τ) ； 1804(Α->Τ) ； 1826(C->T) ； 2479(G->T)； 2555 (T->A) ； 3860(C->T)。
表 1
權(quán)利要求
1.一種大腸桿菌(Escherichia coli)表達(dá)載體，所述表達(dá)載體含有在啟動(dòng)子控制 下的目的蛋白基因，其特征在于，所述表達(dá)載體由載體PRSET-A構(gòu)建而來，其中所述載體 pRSET-A中的氨芐青霉素抗性基因被卡那霉素抗性基因代替，并且其中所述表達(dá)載體為 pHS-GHA，其序列為序列號(hào)1所示的序列。
2.一種用大腸桿菌表達(dá)目的蛋白的方法，所述大腸桿菌是由含有所述目的蛋白基因的 表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的，所述目的蛋白基因在啟動(dòng)子控制之下，該方法包括使所述大腸桿菌在培 養(yǎng)基中生長(zhǎng)并表達(dá)所述的目的蛋白，其特征在于，所述表達(dá)載體由載體pRSET-A構(gòu)建而來， 其中所述載體PRSET-A中的氨芐青霉素抗性基因被卡那霉素抗性基因代替，并且其中所述 表達(dá)載體為PHS-GHA，其序列為序列號(hào)1所示的序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的方法，其中所述大腸桿菌在含有濃度為50-100微克/毫升的 卡那霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
專利摘要
本發(fā)明提供了一種大腸桿菌(Escherichia coli)表達(dá)載體，以及使用該表達(dá)載體在大腸桿菌中穩(wěn)定、高效表達(dá)所需目的蛋白的方法。其中，該表達(dá)載體由載體pRSET-A構(gòu)建而來，所述載體pRSET-A中的氨芐青霉素抗性基因被卡那霉素抗性基因代替。該表達(dá)載體可用于高效表達(dá)在制備7-氨基頭孢霉烷酸時(shí)所需的酶而又不產(chǎn)生降低7-氨基頭孢霉烷酸產(chǎn)率的β-內(nèi)酰胺酶。本發(fā)明還具體提供了兩個(gè)表達(dá)載體，即基因產(chǎn)物為D-氨基酸氧化酶突變體GHA的表達(dá)載體pHS-GHA和基因產(chǎn)物為假單孢菌(Pseudomonas sp.)SE83戊二酰-7-氨基頭孢霉烷酸?；傅谋磉_(dá)載體pT7-kan-ACY。
文檔編號(hào)C12N15/70GKCN1912127 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請(qǐng)?zhí)朇N 200510089966
公開日2011年5月25日 申請(qǐng)日期2005年8月8日
發(fā)明者劉兆明, 葉康堅(jiān), 曾偉基, 曾實(shí)現(xiàn), 王駿, 肖游龍 申請(qǐng)人:百瑞全球有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (1), 非專利引用 (1),