專(zhuān)利名稱(chēng):具有產(chǎn)生l－氨基酸能力的埃希氏菌屬細(xì)菌以及生產(chǎn)l－氨基酸的方法
本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?9127522.5、申請(qǐng)日為1999年12月30、發(fā)明名稱(chēng)為“生產(chǎn)L-氨基酸的方法”的發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
本發(fā)明涉及生產(chǎn)氨基酸的方法。具體而言，本發(fā)明涉及屬于埃希氏菌屬的產(chǎn)L-氨基酸細(xì)菌和使用該細(xì)菌生產(chǎn)L-氨基酸的方法，更具體而言是生產(chǎn)L-谷氨酸、L-賴(lài)氨酸、L-蘇氨酸、L-丙氨酸、L-組氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-纈氨酸和L-異亮氨酸的方法。
為了通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸，使用了分離自自然界的菌株或該菌株的人工突變體來(lái)提高產(chǎn)量。例如，在生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸時(shí)，已知有多種產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的人工突變體，其中大多數(shù)是S-2-氨乙基半胱氨酸(AEC)抗性突變體，屬于短桿菌屬、棒桿菌屬、芽孢桿菌屬或埃希氏菌屬。而且，已提出了一些增加氨基酸產(chǎn)量的途徑，如使用通過(guò)重組DNA法獲得的轉(zhuǎn)化體(美國(guó)專(zhuān)利4,278,765)。
這些途徑多數(shù)基于提高參與氨基酸生物合成途徑的酶的活性，使該酶轉(zhuǎn)變成對(duì)抑制不敏感等(關(guān)于埃希氏菌屬細(xì)菌，參見(jiàn)日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)56-18596(1981)和國(guó)際公開(kāi)WO 95/16042)。
另一方面，作為通過(guò)增加氨基酸分泌蛋白而提高氨基酸產(chǎn)率的例子，已知有一種屬于棒桿菌屬的細(xì)菌，其中L-賴(lài)氨酸分泌蛋白基因LysE被增加。然而，對(duì)于屬于埃希氏菌的細(xì)菌，甚至還不知道是否存在L-氨基酸分泌蛋白。因此，使用埃希氏菌屬細(xì)菌時(shí)，不知道增加L-氨基酸分泌蛋白對(duì)L-氨基酸生產(chǎn)是否有效。
盡管屬于埃希氏菌屬的大腸桿菌K-12菌株的全部核苷酸序列已經(jīng)確定(Science，277，1453-1474，1997)，但其中有大量蛋白的功能還不知道。
本發(fā)明的目的是獲得參與L-氨基酸分泌的蛋白，從而提供L-氨基酸產(chǎn)率提高的菌株和通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸的改良方法。
發(fā)明人已對(duì)參與L-氨基酸分泌的蛋白進(jìn)行了篩選。結(jié)果，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)當(dāng)增強(qiáng)一種特定基因時(shí)，基于消耗的糖的L-氨基酸產(chǎn)量增加了?；谶@一發(fā)現(xiàn)完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明提供了具有產(chǎn)生L-氨基酸能力的埃希氏菌屬細(xì)菌，其中產(chǎn)L-氨基酸的能力通過(guò)增加至少一種選自以下(A)到(H)的蛋白的表達(dá)量而得到提高(以下稱(chēng)為“本發(fā)明的細(xì)菌”)(A)具有序列表中SEQ ID NO10所示的氨基酸序列的蛋白；(B)具有在序列表中SEQ ID NO10所示氨基酸序列中有一個(gè)或幾個(gè)氨基酸缺失、置換、插入、增加或倒位的氨基酸序列的蛋白，該蛋白具有增加含該蛋白的細(xì)菌產(chǎn)生L-氨基酸的能力的活性；(C)具有序列表中SEQ ID NO12所示的氨基酸序列的蛋白；(D)具有在序列表中SEQ ID NO12所示氨基酸序列中有一個(gè)或幾個(gè)氨基酸缺失、置換、插入、增加或倒位的氨基酸序列的蛋白，該蛋白具有增加含該蛋白的細(xì)菌產(chǎn)生L-氨基酸的能力的活性；(E)具有序列表中SEQ ID NO14所示的氨基酸序列的蛋白；(F)具有在序列表中SEQ ID NO14所示氨基酸序列中有一個(gè)或幾個(gè)氨基酸缺失、置換、插入、增加或倒位的氨基酸序列的蛋白，該蛋白具有增加含該蛋白的細(xì)菌產(chǎn)生L-氨基酸的能力的活性；(G)具有序列表中SEQ ID NO16所示的氨基酸序列的蛋白；或(H)具有在序列表中SEQ ID NO16所示氨基酸序列中有一個(gè)或幾個(gè)氨基酸缺失、置換、插入、增加或倒位的氨基酸序列的蛋白，該蛋白具有增加含該蛋白的細(xì)菌產(chǎn)生L-氨基酸的能力的活性。
本發(fā)明的細(xì)菌優(yōu)選一種產(chǎn)L-賴(lài)氨酸細(xì)菌，其中選自(A)到(D)，(G)和(H)的至少一種蛋白的表達(dá)量增加；一種產(chǎn)L-谷氨酸細(xì)菌，其中選自(A)到(H)的至少一種蛋白的表達(dá)量增加；一種產(chǎn)L-丙氨酸細(xì)菌，其中選自(C)和(D)的至少一種蛋白的表達(dá)量增加；一種產(chǎn)L-纈氨酸細(xì)菌，其中選自(C)和(D)的至少一種蛋白的表達(dá)量增加；一種產(chǎn)L-組氨酸細(xì)菌，其中選自(C)到(F)的至少一種蛋白的表達(dá)量增加；一種產(chǎn)L-脯氨酸細(xì)菌，其中選自(A)到(F)的至少一種蛋白的表達(dá)量增加；一種產(chǎn)L-蘇氨酸細(xì)菌，其中選自(E)和(F)的至少一種蛋白的表達(dá)量增加；一種產(chǎn)L-精氨酸細(xì)菌，其中選自(G)和(H)的至少一種蛋白的表達(dá)量增加；或一種產(chǎn)L-異亮氨酸細(xì)菌，其中選自(C)和(D)的至少一種蛋白的表達(dá)量增加。
優(yōu)選，本發(fā)明的細(xì)菌中編碼細(xì)胞中所述蛋白的DNA的拷貝數(shù)量增加。該DNA優(yōu)選攜帶于細(xì)胞中的多拷貝質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子上。
本發(fā)明還提供了生產(chǎn)L-氨基酸的方法，包括以下步驟在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的細(xì)菌，在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累L-氨基酸；由培養(yǎng)基中回收L-氨基酸(以下也稱(chēng)為“本發(fā)明的細(xì)菌”)。
本發(fā)明的方法優(yōu)選一種使用產(chǎn)L-賴(lài)氨酸細(xì)菌生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的方法，所述細(xì)菌中選自(A)到(D)，(G)和(H)的至少一種蛋白的表達(dá)量增加；一種使用產(chǎn)L-谷氨酸細(xì)菌生產(chǎn)L-谷氨酸的方法，所述細(xì)菌中選自(A)到(H)的至少一種蛋白的表達(dá)量增加；一種使用產(chǎn)L-丙氨酸細(xì)菌生產(chǎn)L-丙氨酸的方法，所述細(xì)菌中選自(C)和(D)的至少一種蛋白的表達(dá)量增加；一種使用產(chǎn)L-纈氨酸細(xì)菌生產(chǎn)L-纈氨酸的方法，所述細(xì)菌中選自(C)和(D)的至少一種蛋白的表達(dá)量增加；一種使用產(chǎn)L-組氨酸細(xì)菌生產(chǎn)L-組氨酸的方法，所述細(xì)菌中選自(C)到(F)的至少一種蛋白的表達(dá)量增加；一種使用產(chǎn)L-脯氨酸細(xì)菌生產(chǎn)L-脯氨酸的方法，所述細(xì)菌中選自(A)到(F)的至少一種蛋白的表達(dá)量增加；一種使用產(chǎn)L-蘇氨酸細(xì)菌生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法，所述細(xì)菌中選自(E)和(F)的至少一種蛋白的表達(dá)量增加；一種使用產(chǎn)L-精氨酸細(xì)菌生產(chǎn)L-精氨酸的方法，所述細(xì)菌中選自(G)和(H)的至少一種蛋白的表達(dá)量增加；或一種使用產(chǎn)L-異亮氨酸細(xì)菌生產(chǎn)L-異亮氨酸的方法，所述細(xì)菌中選自(C)和(D)的至少一種蛋白的表達(dá)量增加。
優(yōu)選，本發(fā)明的方法中編碼細(xì)菌細(xì)胞中所述蛋白的DNA的拷貝數(shù)量增加。該DNA優(yōu)選攜帶于細(xì)胞中的多拷貝質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子上。
根據(jù)本發(fā)明，埃希氏菌屬細(xì)菌產(chǎn)L-氨基酸的能力可以被提高。生產(chǎn)L-氨基酸的方法的L-氨基酸的產(chǎn)率也可以被提高。
以下詳述本發(fā)明。以下除非另外說(shuō)明氨基酸指L-構(gòu)型。
(1)本發(fā)明的細(xì)菌本發(fā)明的細(xì)菌是具有產(chǎn)生氨基酸能力的埃希氏菌屬細(xì)菌，其中產(chǎn)生氨基酸的能力通過(guò)增加一種蛋白的表達(dá)量得以提高，所述蛋白具有增加所述細(xì)菌產(chǎn)生氨基酸能力的活性，或增加對(duì)氨基酸或氨基酸類(lèi)似物的抗性的活性。以下，為方便起見(jiàn)該蛋白被稱(chēng)為“氨基酸分泌蛋白”。但使用該術(shù)語(yǔ)并不意味著該蛋白的功能僅限于氨基酸分泌。
氨基酸分泌蛋白的實(shí)例包括具有SEQ ID NO10所示氨基酸序列的蛋白，具有SEQ ID NO12所示氨基酸序列的蛋白，具有SEQ ID NO14所示氨基酸序列的蛋白，具有SEQ ID NO16所示氨基酸序列的蛋白。
氨基酸分泌蛋白對(duì)氨基酸可以具有選擇性。適合于每一種氨基酸的氨基酸分泌蛋白可以通過(guò)以下方法確定讓氨基酸分泌蛋白在屬于埃希氏菌屬并具有產(chǎn)氨基酸能力的細(xì)菌中表達(dá)，測(cè)定氨基酸產(chǎn)量的增加或者氨基酸或氨基酸類(lèi)似物的最小抑制濃度(MIC)的增加。
例如，在氨基酸為賴(lài)氨酸時(shí)，具有SEQ ID NO10，12或16所示氨基酸序列的蛋白是有效的；在氨基酸為谷氨酸時(shí)，具有SEQ IDNO10，12，14或16所示氨基酸序列的蛋白是有效的；在氨基酸為丙氨酸時(shí)，具有SEQ ID NO12所示氨基酸序列的蛋白是有效的；在氨基酸為纈氨酸時(shí)，具有SEQ ID NO12所示氨基酸序列的蛋白是有效的；在氨基酸為組氨酸時(shí)，具有SEQ ID NO12或14所示氨基酸序列的蛋白是有效的；在氨基酸為脯氨酸時(shí)，具有SEQ ID NO10，12或14所示氨基酸序列的蛋白是有效的；在氨基酸為蘇氨酸時(shí)，具有SEQ ID NO14所示氨基酸序列的蛋白是有效的；在氨基酸為精氨酸時(shí)，具有SEQ ID NO16所示氨基酸序列的蛋白是有效的；在氨基酸為異亮氨酸時(shí)，具有SEQ ID NO12所示氨基酸序列的蛋白是有效的。
本文中術(shù)語(yǔ)“表達(dá)量增加”通常是指表達(dá)量大于大腸桿菌野生型菌株如MG1655或W3110的表達(dá)量。該術(shù)語(yǔ)也包括當(dāng)通過(guò)遺傳工程技術(shù)等手段修飾得到一種菌株時(shí)，表達(dá)量大于修飾前。氨基酸分泌蛋白的表達(dá)量可通過(guò)測(cè)定氨基酸分泌蛋白直接確定，或通過(guò)測(cè)定氨基酸或氨基酸類(lèi)似物的MIC，或者屬于埃希氏菌屬并具有氨基酸分泌蛋白的細(xì)菌的氨基酸產(chǎn)量間接確定。
增加氨基酸分泌蛋白表達(dá)量的方法的實(shí)例可以是增加細(xì)菌細(xì)胞中編碼氨基酸分泌蛋白的DNA的拷貝數(shù)。
為了增加細(xì)胞中的拷貝數(shù)，編碼氨基酸分泌蛋白的DNA片段可以與在埃希氏菌屬細(xì)菌中有功能的載體連接，產(chǎn)生重組DNA，將其導(dǎo)入宿主中使宿主轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化菌株的細(xì)胞中編碼氨基酸分泌蛋白的基因(氨基酸分泌蛋白基因)的拷貝數(shù)增加，從而增加氨基酸分泌蛋白的表達(dá)量。該載體優(yōu)選為多拷貝載體。
在細(xì)胞中增加拷貝數(shù)可以通過(guò)允許宿主染色體DNA上存在氨基酸分泌蛋白基因的多個(gè)拷貝實(shí)現(xiàn)。向埃希氏菌屬細(xì)菌染色體DNA上引入氨基酸分泌蛋白基因的多個(gè)拷貝可以通過(guò)同源重組實(shí)現(xiàn)，使用在染色體DNA上有多個(gè)拷貝的序列作為靶。在染色體DNA上有多個(gè)拷貝的序列可以使用轉(zhuǎn)座因子末端存在的重復(fù)DNA和倒轉(zhuǎn)重復(fù)?；蛘?，優(yōu)選如日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2-109985(1990)中公開(kāi)的，多個(gè)拷貝可以通過(guò)以下方法引入染色體DNA使氨基酸分泌蛋白基因攜帶于轉(zhuǎn)座子上，讓轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座。根據(jù)上述任一種方法，在轉(zhuǎn)化體菌株中氨基酸分泌蛋白基因的拷貝數(shù)增加，從而增加氨基酸分泌蛋白的表達(dá)量。
多拷貝載體的實(shí)例可以是pBR322，pMW118，pUC19等質(zhì)粒載體和λ1059，λBF101，M13mp9等噬菌體載體。轉(zhuǎn)座子的實(shí)例可以是Mu，Tn10，Tn5等。
向埃希氏菌屬細(xì)菌引入DNA可以通過(guò)以下方法進(jìn)行D.M.Morrison(酶學(xué)方法68，326，1979)的方法，或受體細(xì)菌細(xì)胞用氯化鈣處理以增加DNA的通透性的方法(Mandel，M.&Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159，1970)等。
除了上述基因擴(kuò)增方法，增加氨基酸分泌蛋白的表達(dá)量也可以通過(guò)用作用較強(qiáng)的表達(dá)調(diào)節(jié)序列取代氨基酸分泌蛋白基因的啟動(dòng)子等表達(dá)調(diào)節(jié)序列來(lái)實(shí)現(xiàn)(參見(jiàn)日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)1-215280(1989))。例如，已知lac啟動(dòng)子、trp啟動(dòng)子、tac啟動(dòng)子、λ噬菌體PR啟動(dòng)子和PL啟動(dòng)子等為強(qiáng)啟動(dòng)子。取代啟動(dòng)子提高了氨基酸分泌蛋白的表達(dá)，從而增加了氨基酸分泌蛋白的表達(dá)量。表達(dá)調(diào)節(jié)序列的增強(qiáng)可以與增加氨基酸分泌蛋白基因的拷貝數(shù)聯(lián)合使用。
在本發(fā)明的細(xì)菌中，多種氨基酸分泌蛋白的表達(dá)量可以增加。
氨基酸分泌蛋白已知由yahN基因、yeaS基因、yfiK基因和yggA基因編碼，其功能還不清楚。因此，編碼氨基酸分泌蛋白的DNA可以通過(guò)以下方法獲得根據(jù)已知序列(例如大腸桿菌K-12菌株的全部核苷酸序列已經(jīng)確定(Science，277，1453-1474(1997)))合成引物，使用埃希氏菌屬細(xì)菌的染色體DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。目標(biāo)DNA片段也可以根據(jù)已知序列制備探針，再通過(guò)雜交從埃希氏菌屬細(xì)菌的染色體DNA文庫(kù)中選擇?；蛘?，編碼氨基酸分泌蛋白的DNA可根據(jù)已知序列合成。編碼氨基酸分泌蛋白的DNA的核苷酸序列的實(shí)例見(jiàn)序列表中SEQ ID NO9，11，13或15。
制備染色體DNA、制備染色體DNA文庫(kù)、雜交、PCR、制備質(zhì)粒DNA、消化和連接DNA、轉(zhuǎn)化、選擇作為引物的寡核苷酸等的方法可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的普通方法。這些方法可參見(jiàn)Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.，&Maniatis，T.《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)等。
氨基酸分泌蛋白可以在一個(gè)或多個(gè)位置有一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的置換、缺失、插入、增加或倒位，只要增加屬于埃希氏菌屬并含有該蛋白的細(xì)菌產(chǎn)氨基酸能力的活性未被破壞即可。“幾個(gè)”取決于蛋白立體結(jié)構(gòu)中的位置和氨基酸殘基的種類(lèi)可以有所變化。這是因?yàn)橛行┌被崛绠惲涟彼岷屠i氨酸彼此高度類(lèi)似，這些氨基酸之間的差異不會(huì)明顯影響蛋白的立體結(jié)構(gòu)。
編碼作為上述氨基酸分泌蛋白的基本相同蛋白的DNA可以通過(guò)以下方法獲得例如利用定點(diǎn)誘變修飾核苷酸序列使得特定位點(diǎn)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基發(fā)生置換、缺失、插入、增加或倒位。如上修飾的DNA可以通過(guò)常規(guī)的已知突變處理獲得。突變處理包括用羥胺體外處理編碼氨基酸分泌蛋白的DNA的方法，和用紫外輻射或N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(NG)和亞硝酸等常用于誘變處理的誘變劑處理攜帶有編碼氨基酸分泌蛋白的DNA的微生物的方法，所述微生物如埃希氏菌屬細(xì)菌。
一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的置換、缺失、插入、增加或倒位包括天然產(chǎn)生的突變或變異，它是由具有氨基酸分泌蛋白的單個(gè)微生物之間和種、菌株等之間的差異產(chǎn)生的。
編碼作為氨基酸分泌蛋白的基本相同蛋白的DNA可以通過(guò)以下方法獲得讓具有上述突變的DNA在屬于埃希氏菌屬的合適細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)，確定細(xì)胞中氨基酸產(chǎn)量的增加。
編碼作為氨基酸分泌蛋白的基本相同蛋白的DNA也可以通過(guò)以下方法獲得由編碼具有突變的氨基酸分泌蛋白的DNA或含所述DNA的細(xì)胞中，分離在嚴(yán)緊條件下與具有序列表中SEQ ID NO9、11、13或15所示核苷酸序列的DNA雜交的DNA，該DNA編碼具有增加埃希氏菌屬細(xì)菌產(chǎn)氨基酸能力的活性的蛋白。本文中“嚴(yán)緊條件”指形成特異雜交體而不形成非特異雜交體的條件。該條件難以用數(shù)值明確地表示。但是，嚴(yán)緊條件包括例如彼此具有高同源性的DNA可雜交而低于該同源性的DNA不能雜交的條件，所述高同源性DNA如同源性不低于70％，或相當(dāng)于普通Southern雜交洗滌條件的60℃，1×SSC，0.1％SDS，優(yōu)選0.1×SSC，0.1％SDS的鹽濃度的條件。
盡管在上述條件下雜交的基因中可能存在終止密碼子位于中間的基因，或編碼由于活性中心突變而失去活性的蛋白的基因，但這些基因通過(guò)以下方法易于消除將基因與市售活性表達(dá)載體連接，確定增加上述埃希氏菌屬細(xì)菌產(chǎn)生氨基酸能力的活性。
本文中“編碼蛋白的DNA”是指雙鏈DNA中一條鏈編碼該蛋白的DNA。
通過(guò)在上述屬于埃希氏菌屬、產(chǎn)氨基酸的細(xì)菌中增加氨基酸分泌蛋白的表達(dá)量，可增加氨基酸的產(chǎn)生量。作為其中氨基酸分泌蛋白的表達(dá)量待增加的埃希氏菌屬細(xì)菌，使用具有產(chǎn)生所需氨基酸能力(氨基酸生產(chǎn)力)的菌株。此外，可以將產(chǎn)生某種氨基酸的能力賦予其中氨基酸分泌蛋白表達(dá)量已增加的細(xì)菌。屬于埃希氏菌屬的產(chǎn)氨基酸細(xì)菌的實(shí)例包括大腸桿菌AJ13199(法國(guó)專(zhuān)利2747689)和可從已知材料獲得的菌株(例如以下實(shí)施例中所述的大腸桿菌W3110(tyrA)/pCABD2，大腸桿菌VL614，大腸桿菌VL2054，大腸桿菌VL2160，大腸桿菌VL2151，大腸桿菌W3350argE∷Tn10/pKA10)。
作為參考，本發(fā)明的氨基酸分泌蛋白如下文所述首次進(jìn)行鑒定。
發(fā)明人鑒定了埃希氏菌屬細(xì)菌的rhtB和rhtC作為蘇氨酸分泌蛋白基因。發(fā)明人根據(jù)氨基酸分泌蛋白可能具有共同的結(jié)構(gòu)這一設(shè)想進(jìn)行了檢索。即對(duì)GenBank CDS，PDB，SWISS-PROT，Spupdate和PIR進(jìn)行了rhtB編碼蛋白同源性的BLAST和PSI-BLAST檢索(Altschul，S.F.etal.，Nucleic Acid Res.，25，3389-3402(1997))。對(duì)未完成的微生物基因組進(jìn)行了Tblastn檢索。對(duì)SWALL數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了BLITZ檢索(Sturrock，S.S.&Collins，J.F.，Mpsch版本1.3.生物計(jì)算機(jī)研究小組，愛(ài)丁堡大學(xué)，英國(guó)，1993)。對(duì)翻譯本和SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了SMART檢索(Ogiwara，I.etal.，Protein Sci.，5，1991-1999，1996)。從找到的60多個(gè)序列樣品中，YeaS(相當(dāng)于GenBank入藏號(hào)AE000274的f212)，YahN(相當(dāng)于GenBank入藏號(hào)AE000140的f223)，YfiK(相當(dāng)于GenBank入藏號(hào)AE000344的o195)，YggA(相當(dāng)于GenBank入藏號(hào)AE000375的f211)在來(lái)自大腸桿菌的蛋白中為與RhtB功能類(lèi)似的蛋白。由于這些基因的功能均為未知，實(shí)際獲得這些基因，其對(duì)氨基酸和氨基酸類(lèi)似物的MIC和氨基酸產(chǎn)生的影響通過(guò)提高其活性進(jìn)行研究。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)YeaS，YfiK，YahN和YggA增加某些氨基酸和類(lèi)似物的MIC。進(jìn)一步研究證實(shí)，這些基因編碼的蛋白具有增加氨基酸積累的作用，但它們可能具有某些氨基酸選擇性。
(2)本發(fā)明的方法本發(fā)明的方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的細(xì)菌，在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累氨基酸，由培養(yǎng)基中回收氨基酸。
合適的氨基酸包括賴(lài)氨酸、谷氨酸、丙氨酸、纈氨酸、高絲氨酸、脯氨酸和蘇氨酸。
本發(fā)明的方法中，培養(yǎng)埃希氏菌屬細(xì)菌、由液體培養(yǎng)基中收集和純化氨基酸可以按照與使用細(xì)菌通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸的常規(guī)方法類(lèi)似的方式進(jìn)行。培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)基可以是合成培養(yǎng)基或天然培養(yǎng)基，只要培養(yǎng)基包括所用的細(xì)菌生長(zhǎng)必需的適量碳源、氮源和礦物質(zhì)，必要時(shí)含有營(yíng)養(yǎng)素。碳源可以包括葡萄糖和蔗糖等碳水化合物和各種有機(jī)酸。根據(jù)所用的細(xì)菌的同化能力，包括乙醇和甘油的醇類(lèi)也可以使用。氮源可以使用氨、硫酸銨等銨鹽、胺等含氮化合物、蛋白胨、大豆水解物和消化的發(fā)酵微生物等天然氮源。礦物質(zhì)可以使用磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、碳酸鈣。
培養(yǎng)優(yōu)選在好氣條件下進(jìn)行，如振蕩培養(yǎng)、通氣培養(yǎng)和攪動(dòng)培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度通常為20到40℃，優(yōu)選30到38℃。培養(yǎng)pH通常為5到9，優(yōu)選6.5到7.2。培養(yǎng)液的pH可以用氨、碳酸鈣、各種酸、各種堿和緩沖劑調(diào)節(jié)。通常，培養(yǎng)1到3天可在培養(yǎng)基中積累目標(biāo)氨基酸。
回收氨基酸可按以下方法進(jìn)行培養(yǎng)后通過(guò)離心或膜過(guò)濾除去細(xì)胞等固體物質(zhì)，然后通過(guò)離子交換、濃縮和結(jié)晶分級(jí)等方法收集和純化目標(biāo)氨基酸。
以下參考實(shí)施例更具體地解釋本發(fā)明。
實(shí)施例1制備編碼氨基酸分泌蛋白的DNA片段大腸桿菌K-12菌株染色體的全部核苷酸序列已經(jīng)確定(Science，277，1453-1474，1997)。根據(jù)報(bào)導(dǎo)的核苷酸序列，合成引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增yahN，yfiK，yeaS和yggA基因。
(1)使用大腸桿菌MG1655菌株染色體DNA作為模板通過(guò)常規(guī)方法制備染色體DNA(Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch E.F.&Maniatis T.(1989)《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》第2版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)。在PCR反應(yīng)中，使用文獻(xiàn)中所述的標(biāo)準(zhǔn)條件(《PCR操作方法和應(yīng)用》White，B.A編輯，Humana Press，Totowa，New Jersey，1993)。所得的PCR產(chǎn)物如下所述通過(guò)常規(guī)方法純化和用限制酶消化。
使用引物1和引物2擴(kuò)增yahN基因。
引物1gtgtggaaccgacgccggat(互補(bǔ)于GenBank入藏號(hào)AE000140的登記核苷酸序列1885到1904號(hào)堿基，SEQ ID NO17)，引物2tgttgtatggtacggggttcgag(上述序列中223到245號(hào)堿基，SEQ ID NO18)。純化后所得的PCR產(chǎn)物用限制酶PstI和StuI消化，使用連接試劑盒與PstI和EcoRV消化的載體pUC21連接(Vieira，Messing，Gene，100，189-194，1991)。然后用產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1感受態(tài)細(xì)胞(Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch E.F.&Maniatis T.(1989)《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》第2版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.)，將細(xì)胞涂布于含有10mg/mlIPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)和40mg/ml X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)以及100mg/ml氨芐西林的L培養(yǎng)基(10g/l細(xì)菌用胰胨，5g/l酵母提取物，5g/l NaCl，15g/l瓊脂，pH7.0)，培養(yǎng)過(guò)夜。挑取出現(xiàn)的白色菌落，進(jìn)行單菌落分離以獲得轉(zhuǎn)化子。使用堿抽提法由轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，命名為pYAHN。
使用引物3和引物4擴(kuò)增yeaS基因引物3ctttgccaatcccgtctccc(互補(bǔ)于GenBank入藏號(hào)AE000274的登記核苷酸序列7683到7702號(hào)堿基，SEQ ID NO19)；引物4gccccatgcataacggaaag(上述序列中5542到5561號(hào)堿基，SEQ ID NO19)。純化后所得的PCR產(chǎn)物用限制酶AvaI消化，并與載體pUC19連接。同上轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1后，獲得稱(chēng)為pYEAS的質(zhì)粒。
使用引物5和引物6擴(kuò)增yfiK基因引物5gaagatcttgtaggccggataaggcg(GenBank入藏號(hào)AE000344的登記核苷酸序列4155到4177號(hào)堿基，在其5’端加上了限制酶BglII位點(diǎn)，SEQ ID NO21)引物6tggttttaccaattggccgc(互補(bǔ)于上述序列的6307到6326號(hào)堿基，SEQ ID NO22)。
純化后獲得的PCR產(chǎn)物用限制酶BglII和MunI消化，并與限制酶BglII和EcoRI消化的載體pUC21連接。同上轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1后，獲得稱(chēng)為pYFIK的質(zhì)粒。
使用引物7和引物8擴(kuò)增yggA基因引物7acttctcccgcgagccagttc(互補(bǔ)于GenBank入藏號(hào)AE000375的登記核苷酸序列9606到9626號(hào)堿基，SEQ ID NO23)。
引物8ggcaagcttagcgcctctgtt(上述序列的8478到8498號(hào)堿基，SEQ ID NO24)。
純化后獲得的PCR產(chǎn)物用限制酶HindIII和ClaI消化，與用同樣限制酶消化的載體pOK12連接(Vieira，Messing，Gene，100，189-194，1991)。同上轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1，獲得稱(chēng)為pYGGA的質(zhì)粒。
(2)用大腸桿菌W3110菌株的染色體DNA作為模板使用引物9(SEQ ID NO1)和引物10(SEQ ID NO2)擴(kuò)增yahN基因。
使用引物11(SEQ ID NO3)和引物12(SEQ ID NO4)擴(kuò)增yeaS基因。
使用引物13(SEQ ID NO5)和引物14(SEQ ID NO6)擴(kuò)增yfiK基因。
使用引物15(SEQ ID NO7)和引物16(SEQ ID NO8)擴(kuò)增yggA基因。
純化所獲得的PCR產(chǎn)物，用限制酶SacI和XbaI(yggA則為EcoRI和PstI)消化，并與質(zhì)粒pMW118連接(Nippon Gene)。插入了序列與報(bào)導(dǎo)的序列相同的DNA片段的質(zhì)粒稱(chēng)為攜帶yahNpMW118∷yahN攜帶yeaSpMW118∷yeaS攜帶yfiKpMW118∷yfiK
攜帶yggApMW118∷yggA實(shí)施例2某些氨基酸和氨基酸類(lèi)似物抗性的大腸桿菌中yahN，yeaS，yfiK和yggA DNA片段擴(kuò)增的作用yahN，yeaS，yfiK和yggA基因產(chǎn)物與谷氨酸棒桿菌賴(lài)氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)者LysE(Vrljic etal.，Mol.Microbiol.，22，815-826，1996)和參與高絲氨酸分泌的RhtB蛋白的同源性，表明這些蛋白的功能類(lèi)似。已知增加與抗生素和重金屬外排有關(guān)的基因的表達(dá)導(dǎo)致對(duì)藥物的抗性增加(Nikaido，H.J.Bacteriology，178，5853-5859，1996)。因此，測(cè)試了pYEAS，pYAHN，pYFIK和pYGGA質(zhì)粒對(duì)TG1菌株對(duì)某些氨基酸和氨基酸類(lèi)似物敏感性的作用。大腸桿菌TG1/pYEAS，TG1/pYAHN，TG1/pYFIK，TG1/pYGGA和對(duì)照菌株TG1/pUC21，TG1/pUC19和TG1/pOK12在含有合適抗生素的M9基本培養(yǎng)基中在搖床上過(guò)夜培養(yǎng)(109cfu/ml)，用M9基本培養(yǎng)基1∶100稀釋?zhuān)谕慌囵B(yǎng)基中再培養(yǎng)5小時(shí)。這樣獲得的對(duì)數(shù)期培養(yǎng)物稀釋?zhuān)蠹s104活細(xì)胞涂布于含雙倍量氨基酸或類(lèi)似物的M9瓊脂的干的測(cè)試平板上。獲得這些化合物的最小抑制濃度(MIC)。
結(jié)果示于表1。由表1可見(jiàn)，多個(gè)拷貝的yfiK基因使得對(duì)脯氨酸、高絲氨酸、組氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、賴(lài)氨酸、α-氨基-β-羥基戊酸(AHVA)、S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸(AEC)和α-氨基丁酸的抗性增加；多個(gè)拷貝的yahN基因使得對(duì)脯氨酸的抗性增加；多個(gè)拷貝的yeaS基因使得對(duì)蘇氨酸、高絲氨酸、賴(lài)氨酸、谷氨酸、組氨酸、脯氨酸和α-氨基丁酸的抗性增加；多個(gè)拷貝的yggA基因使得對(duì)S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸(AEC)、賴(lài)氨酸和精氨酸的抗性增加。這些結(jié)果表明，除了YahN，每一種推定的轉(zhuǎn)運(yùn)者均對(duì)幾種底物(氨基酸和氨基酸類(lèi)似物)有特異性，或由于擴(kuò)增顯示非特異性作用。
表1
實(shí)施例3yeaS，yahN和yfiK DNA片段擴(kuò)增對(duì)谷氨酸生成的影響大腸桿菌AJ13199菌株(法國(guó)專(zhuān)利2747689)用載體pUC21和質(zhì)粒pYAHN，pYEAS和pYFIK分別轉(zhuǎn)化。獲得菌株AJ13199/pUC21(VKPMB-7728)，AJ13199/pYAHN(VKPM B-7729)，AJ13199/pYEAS(VKPMB-7731)和AJ13199/pYFIK(VKPM B-7730)。
這些菌株在37℃分別于含有100mg/l氨芐西林的營(yíng)養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)18小時(shí)，0.3ml所得的培養(yǎng)物接種20×200mm試管中的3ml含有100mg/l氨芐西林的發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)后，通過(guò)已知方法確定培養(yǎng)基中積累的谷氨酸量。
發(fā)酵培養(yǎng)基的組成(g/l)葡萄糖 80硫酸銨 22磷酸氫二鉀 2氯化鈉 0.8七水硫酸鎂 0.8七水硫酸亞鐵 0.02
五水硫酸錳 0.02鹽酸硫胺素 0.0002酵母提取物 1.0碳酸鈣 30.0180℃干熱滅菌2小時(shí)，葡萄糖和磷酸氫二鉀單獨(dú)滅菌。
所得結(jié)果示于表2。如表2所示，菌株AJ13199/pYAHN，AJ13199/pYEAS和AJ13199/pYFIK積累的谷氨酸較氨基酸分泌蛋白的表達(dá)量未提高的AJ13199/pUC21更高。
表2
實(shí)施例4yeaS，yahN和yfiK DNA片段擴(kuò)增對(duì)賴(lài)氨酸生成的影響(1)作為產(chǎn)賴(lài)氨酸的埃希氏菌屬細(xì)菌，使用引入了質(zhì)粒pCABD2(國(guó)際公開(kāi)WO 95/16042)的大腸桿菌W3110(TyrA)(歐洲專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)488424)。具體而言，質(zhì)粒pCABD2和pMW118∷yahN，pMW118∷yeaS，pMW118∷yfiK和pMW118分別引入大腸桿菌菌株W3110(TyrA)以獲得下列菌株W3110(tyrA)/pCABD2+pMW118∷yahNW3110(tyrA)/pCABD2+pMW118∷yeaSW3110(tyrA)/pCABD2+pMW118∷yfiKW3110(tyrA)/pCABD2+pMW118這些菌株的賴(lài)氨酸生產(chǎn)力通過(guò)培養(yǎng)估計(jì)。所用的培養(yǎng)基的組成如下(g/l)葡萄糖 40.0七水硫酸鎂 1.0硫酸銨 16.0磷酸氫二鉀 1.0
七水硫酸亞鐵 0.01七水硫酸錳 0.01酵母提取物(Difco) 2.0酪氨酸 0.1調(diào)pH為7.0，115℃高壓滅菌10分鐘。(葡萄糖和七水硫酸鎂單獨(dú)滅菌)藥用級(jí)碳酸鈣 25g/l(180℃干熱滅菌2小時(shí)根據(jù)質(zhì)粒的種類(lèi)，加入20mg/l鏈霉素和50mg/l氨芐西林。在37℃以115rpm振蕩培養(yǎng)30小時(shí)。結(jié)果示于表3。
表3
表3結(jié)果表明，由于YahN和YeaS增強(qiáng)，賴(lài)氨酸的產(chǎn)生量和基于消耗的糖的產(chǎn)量增加了。
(2)作為產(chǎn)賴(lài)氨酸的埃希氏菌屬細(xì)菌，使用大腸桿菌VL614。該菌株是已知的大腸桿菌VL613(SU Patent No.1354458)的衍生菌株。菌株VL613從已知菌株Gif102(Theze，J.&Saint Girons.J.Bacteriol.，118，990-998，1974)分三步獲得第一步，選擇對(duì)2mg/ml S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸有抗性的突變體，其中發(fā)現(xiàn)菌株VL611能產(chǎn)生L-賴(lài)氨酸。
第二步，利用噬菌體P1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)將參與蔗糖利用、定位于轉(zhuǎn)座子Tn2555(Doroshenko et al.，Mol.Biologiya，22，645-658，1988)的基因引入VL611，獲得菌株VL612。
第三步，來(lái)自菌株VKPM B-3996的突變r(jià)htA23賦予對(duì)蘇氨酸和高絲氨酸的抗性(美國(guó)專(zhuān)利5,175,107)，通過(guò)噬菌體P1轉(zhuǎn)導(dǎo)將其引入VL612，獲得菌株VL613。
大腸桿菌菌株VL614通過(guò)將來(lái)自大腸桿菌菌株VKPM B-6204(MG1655 zbi3058∷Tn10)rhtA基因的野生型等位基因轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入VL613獲得。轉(zhuǎn)導(dǎo)子在含有10mg/l四環(huán)素的L-培養(yǎng)基中選擇，其中發(fā)現(xiàn)有對(duì)10g/l高絲氨酸敏感的菌株VL614(rhtA+)。
菌株VL614用pYGGA質(zhì)?；騪OK12載體轉(zhuǎn)化，獲得菌株VL614/pYGGA(VKPM B-7719)和VL614/pOK12(VKPM B-7722)。
這些菌株在37℃分別于含50mg/l卡那霉素的營(yíng)養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)18小時(shí)，0.3ml所得的培養(yǎng)物接種20×200mm試管中的3ml含有0.3g/l蘇氨酸、0.3g/l甲硫氨酸和50mg/l卡那霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基(實(shí)施例3)，37℃振蕩培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)后，通過(guò)已知方法確定培養(yǎng)基中積累的賴(lài)氨酸和谷氨酸量。
結(jié)果示于表4。
表4
如表4所示，菌株VL614/pYGGA較yggA基因未增強(qiáng)的菌株VL614/pOK12積累的賴(lài)氨酸更多。此外，菌株VL614/pYGGA較菌株VL614/pOK12積累的谷氨酸更多。
實(shí)施例5yeaS，yahN和yfiK DNA片段擴(kuò)增對(duì)蘇氨酸、丙氨酸、纈氨酸和異亮氨酸生成的影響作為產(chǎn)蘇氨酸的埃希氏菌屬細(xì)菌，使用大腸桿菌菌株VL2054。該菌株按如下方法由已知的大腸桿菌菌株VKPM B-3996(美國(guó)專(zhuān)利5,175,107)衍生。
最初，新的受體菌株由幾個(gè)步驟構(gòu)建●菌株VKPM B-3996的無(wú)質(zhì)粒衍生物在自發(fā)消除pVIC40質(zhì)粒后選擇。
●來(lái)自大腸桿菌菌株VKPM B-6204(MG1655 zbi3058∷Tn10)的rhtA基因的野生型等位基因通過(guò)實(shí)施例4中的噬菌體P1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)引入所得的菌株。
●在NG誘變和選擇仍能不降解蘇氨酸的卡那霉素敏感細(xì)胞后，獲得插入tdh基因中的Tn5轉(zhuǎn)座子中kan基因滅活的突變。因而獲得VL2053菌株。
另一方面，來(lái)自pVIC40的蘇氨酸操縱子被克隆進(jìn)入λ噬菌體的PR啟動(dòng)子控制下的整合Mud載體。此外，賦予對(duì)氯霉素抗性的Tn9的cat基因被克隆進(jìn)同一載體。由此獲得的構(gòu)建物通過(guò)已知方法(美國(guó)專(zhuān)利5,595,889)插入大腸桿菌C600菌株的染色體，并由所獲得的菌株轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入VL2053，得到新的無(wú)質(zhì)粒產(chǎn)蘇氨酸菌株VL2054。該菌株也在培養(yǎng)液中積累丙氨酸、纈氨酸和異亮氨酸。
菌株VL2054用質(zhì)粒pYEAS，pYFIK和載體pUC21分別轉(zhuǎn)化，獲得大腸桿菌菌株VL2054/pYEAS(VKPM B-7707)，VL2054/pYFIK(VKPMB-7712)和VL2054/pUC21(VKPM B-7708)。
這些菌株分別在37℃于含有100mg/l氨芐西林的營(yíng)養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)18小時(shí)，0.3ml所得的培養(yǎng)物接種20×200mm試管中含100mg/l氨芐西林的3ml發(fā)酵培養(yǎng)基(實(shí)施例3)，37℃振蕩培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)后，培養(yǎng)基中積累的蘇氨酸、丙氨酸、纈氨酸和異亮氨酸量通過(guò)已知方法確定。
結(jié)果示于表5。
如表5所示，菌株VL2054/pYFIK積累的蘇氨酸較yfiK基因未被增強(qiáng)的菌株VL2054/pUC21更多。此外，菌株VL2054/pYEAS積累的丙氨酸、纈氨酸和異亮氨酸較yeaS基因未被增強(qiáng)的菌株VL2054/pUC21更多。
表5
實(shí)施例6yeaS和yfiK DNA片段擴(kuò)增對(duì)組氨酸生成的影響作為產(chǎn)組氨酸的埃希氏菌屬細(xì)菌，使用大腸桿菌菌株VL2160。該菌株是通過(guò)噬菌體P1介導(dǎo)將hisGR突變自菌株CC46轉(zhuǎn)導(dǎo)至已知菌株NK5526 hisG∷Tn10(VKPM B-3384)獲得，所述突變使ATP磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶脫敏(Astvatsaturianz et al.，Genetika，24，1928-1934，1988)。大腸桿菌菌株VL2160用質(zhì)粒pYEAS，pYFIK和載體pUC21分別轉(zhuǎn)化獲得大腸桿菌菌株VL2160/pYEAS(VKPM B-7753)，VL2160/pYFIK(VKPM B-7754)和VL2160/pUC21(VKPM B-7752)。
這些菌株分別在37℃于含有100mg/l氨芐西林的營(yíng)養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)18小時(shí)，0.3ml所得的培養(yǎng)物接種20×200mm試管中含有濃度提高的酵母提取物(3g/l)和100mg/l氨芐西林的3ml發(fā)酵培養(yǎng)基(實(shí)施例3)，34℃振蕩培養(yǎng)68小時(shí)。
培養(yǎng)后，培養(yǎng)基中組氨酸的積累量通過(guò)已知方法確定。結(jié)果示于表6。
表6
如表6所示，大腸桿菌菌株VL2160/pYEAS和VL2160/pYFIK積累的組氨酸較yeaS和yfiK基因未被增強(qiáng)的菌株VL2160/pUC21更多。
實(shí)施例7yahN，yeaS和yfiK DNA片段擴(kuò)增對(duì)脯氨酸生成的影響作為產(chǎn)脯氨酸的埃希氏菌屬細(xì)菌，使用大腸桿菌菌株VL2151(W3350proB*ΔputAP Tn10)。該菌株通過(guò)以下方法獲得將與Tn10連鎖的ΔputAP突變轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入W3350，選擇不能利用脯氨酸作為唯一碳源的四環(huán)素抗性轉(zhuǎn)導(dǎo)子。將所獲得的菌株W3350ΔputAP Tn10用NG誘變，選擇對(duì)20mg/l 3，4-脫氫-DL-脯氨酸有抗性的突變體。其中，發(fā)現(xiàn)菌株VL2151(W3350proB*ΔputAP Tn10)能夠產(chǎn)生脯氨酸。
大腸桿菌菌株VL2151用質(zhì)粒pYEAS，pYFIK，pYAHN和載體pUC21分別轉(zhuǎn)化獲得大腸桿菌菌株VL2151/pYEAS(VKPM B-7714)，VL2151/pYFIK(VKPM B-7713)，VL2151/pYAHN(VKPM B-7748)和VL2151/pUC21(VKPM B-7715)。
這些菌株分別在37℃于含有100mg/l氨芐西林的營(yíng)養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)18小時(shí)，0.3ml所得的培養(yǎng)物接種20×200mm試管中含有100mg/l氨芐西林的3ml發(fā)酵培養(yǎng)基(實(shí)施例3)，37℃振蕩培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)后，培養(yǎng)基中脯氨酸的積累量通過(guò)已知方法確定。結(jié)果示于表7。
表7
如表7所示，大腸桿菌菌株VL2151/pYFIK、VL2151/pYAHN和VL2151/pYEAS積累的脯氨酸較yfiK，yahN和yeaS基因未被增強(qiáng)的菌株VL2151/pUC21更多。yfiK基因的擴(kuò)增效果最明顯。
實(shí)施例8yggA DNA片段擴(kuò)增對(duì)精氨酸生成的影響作為產(chǎn)精氨酸的埃希氏菌屬細(xì)菌，使用大腸桿菌菌株W3350argE∷Tn10/pKA10。該菌株攜帶質(zhì)粒pKA10，其中含有來(lái)自黃色棒桿菌(短桿菌)的DNA區(qū)，它至少與受體菌株大腸桿菌K12中的argA和argE突變互補(bǔ)(Kharitonov A.&Tarasov A.P.MolecularGenetics，Microbiology and Virology，No.9，29-33，1986)。
大腸桿菌菌株W3350argE∷Tn10/pKA10用質(zhì)粒pYGGA或載體pOK12分別轉(zhuǎn)化獲得大腸桿菌菌株W3350argE∷Tn10/pKA10，pYGGA(VKPM B-7716)和W3350argE∷Tn10/pKA10，pOK12(VKPM B-7718)。
所得的轉(zhuǎn)化子分別在37℃于含有100mg/l氨芐西林和50mg/l卡那霉素的營(yíng)養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)18小時(shí)，0.3ml所得的培養(yǎng)物接種20×200mm試管中含有100mg/l氨芐西林和50mg/l卡那霉素的3ml發(fā)酵培養(yǎng)基(實(shí)施例3)，37℃振蕩培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)后，培養(yǎng)基中精氨酸的積累量通過(guò)已知方法確定。
結(jié)果示于表8。
表8
如表7所示，大腸桿菌菌株W3350argE∷Tn10/pKA10，pYGGA積累的精氨酸較yggA基因未被增強(qiáng)的菌株W3350argE∷Tn10/pKA10，pUC21更多。
根據(jù)國(guó)際保藏的布達(dá)佩斯條約，下列大腸桿菌菌株于1998年11月29日保藏在俄羅斯國(guó)立工業(yè)微生物保藏中心(VKPM)，括號(hào)中為保藏號(hào)。
AJ13199/pUC21(VKPM B-7728)AJ13199/pYAHN(VKPM B-7729)AJ13199/pYEAS(VKPM B-7731)AJ13199/pYFIK(VKPM B-7730)VL614/pYGGA(VKPM B-7719)VL614/pOK12(VKPM B-7722)VL2054/pYEAS(VKPM B-7707)VL2054/pYFIK(VKPM B7712)VL2054/pUC21(VKPM B7708)VL2160/pYEAS(VKPM B-7753)VL2160/pYFIK(VKPM B-7754)VL2160/pUC21(VKPM B-7752)VL2151/pYFIK(VKPM B-7713)VL2151/pYEAS(VKPM B-7714)VL2151/pYAHN(VKPM B-7748)VL2151/pUC21(VKPM B-7715)W3350argE∷Tn10/pKA10，pYGGA(VKPM B-7716)W3350argE∷Tn10/pKA10，pOK12(VKPM B-7718)
序列表(110)Livshits，Vitaliy ArkadievichZakataeva，Natalia PavlovnaNakanishi，KazuoAleshin，Vladimir VeniaminovichTroshin，Petr VladimirovichTokhmakova，Irina Lyvovna(120)生產(chǎn)L-氨基酸的方法(130)(160)24(210)1(211)27(212)DNA(213)人工序列(220)(223)人工序列描述擴(kuò)增大腸桿菌yahN基因的引物(400)1ggcgagctcc cagtaaccgg aaataag 27(210)2(211)27(212)DNA(213)人工序列(220)(223)人工序列描述擴(kuò)增大腸桿菌yahN基因的引物
(400)2cgctctagaa aggaccacgc attacgg 27(210)3(211)27(212)DNA(213)人工序列(220)(223)人工序列描述擴(kuò)增大腸桿菌yeaS基因的引物(400)3ggcgagctca gattggttag catattc 27(210)4(211)27(212)DNA(213)人工序列(220)(223)人工序列描述擴(kuò)增大腸桿菌yeaS基因的引物(400)4cggtctagaa tcagcgaaga atcaggg 27(210)5(211)27(212)DNA(213)人工序列(220)(223)人工序列描述擴(kuò)增大腸桿菌yfiK基因的引物
(400)5ggcgagctca tgttccgtgt cgggtac 27(210)6(211)27(212)DNA(213)人工序列(220)(223)人工序列描述擴(kuò)增大腸桿菌yfiK基因的引物(400)6ggctctagat agcaagttac taagcgg 27(210)7(211)35(212)DNA(213)人工序列(220)(223)人工序列描述擴(kuò)增大腸桿菌yggA基因的引物(400)7ctctgaattc tctcttatta gtttttctga ttgcc 35(210)8(211)38(212)DNA(213)人工序列(220)(223)人工序列描述擴(kuò)增大腸桿菌yggA基因的引物
(400)8cgtgacctgc agcgttctca cagcgcggta gcctttaa 38(210)9(211)672(212)DNA(213)大腸桿菌(220)(221)CDS(222)(1)..(672)(400)9atg atg cag tta gtt cac tta ttt atg gat gaa atc act atg gat cct 48Met Met Gln Leu Val His Leu Phe Met Asp Glu Ile Thr Met Asp Pro1 5 10 15ttg cat gcc gtt tac ctg acc gta gga ctg ttc gtg att act ttt ttt 96Leu His Ala Val Tyr Leu Thr Val Gly Leu Phe Val Ile Thr Phe Phe20 25 30aat ccg gga gcc aat ctc ttt gtg gta gta caa acc agc ctg gct tcc 144Asn Pro Gly Ala Asn Leu Phe Val Val Val Gln Thr Ser Leu Ala Ser35 40 45ggt cga cgc gca ggg gtg ctg acc ggg ctg ggc gtg gcg ctg ggc gat 192Gly Arg Arg Ala Gly Val Leu Thr Gly Leu Gly Val Ala Leu Gly Asp50 55 60gca ttt tat tcc ggg ttg ggt ttg ttt ggt ctt gca acg cta att acg 240Ala Phe Tyr Ser Gly Leu Gly Leu Phe Gly Leu Ala Thr Leu Ile Thr65 70 75 80cag tgt gag gag att ttt tcg ctt atc aga atc gtc ggc ggc gct tat 288Gln Cys Glu Glu Ile Phe Ser Leu Ile Arg Ile Val Gly Gly Ala Tyr85 90 95ctc tta tgg ttt gcg tgg tgc agc atg cgc cgc cag tca aca ccg caa 336Leu Leu Trp Phe Ala Trp Cys Ser Met Arg Arg Gln Ser Thr Pro Gln100 105 110atg agc aca cta caa caa ccg att agc gcc ccc tgg tat gtc ttt ttt 384Met Ser Thr Leu Gln Gln Pro Ile Ser Ala Pro Trp Tyr Val Phe Phe115 120 125
cgc cgc gga tta att acc gat ctc tct aac ccg caa acc gtt tta ttt 432Arg Arg Gly Leu Ile Thr Asp Leu Ser Asn Pro Gln Thr Val Leu Phe130 135 140ttt atc agt att ttc tca gta aca tta aat gcc gaa aca cca aca tgg 480Phe Ile Ser Ile Phe Ser Val Thr Leu Asn Ala Glu Thr Pro Thr Trp145 150 155 160gca cgt tta atg gcc tgg gcg ggg att gtg ctc gca tca att atc tgg 528Ala Arg Leu Met Ala Trp Ala Gly Ile Val Leu Ala Ser Ile Ile Trp165 170 175cga gtt ttt ctt agt cag gcg ttt tct ttg ccc gct gtg cgt cgt gct 576Arg Val Phe Leu Ser Gln Ala Phe Ser Leu Pro Ala Val Arg Arg Ala180 185 190tat ggg cgt atg caa cgc gtt gcc agt cgg gtt att ggt gca att att 624Tyr Gly Arg Met Gln Arg Val Ala Ser Arg Val Ile Gly Ala Ile Ile195 200 205ggt gta ttc gcg cta cgc ctg att tac gaa ggg gtg acg cag cgg tga 672Gly Val Phe Ala Leu Arg Leu Ile Tyr Glu Gly Val Thr Gln Arg210 215 220(210)10(211)223(212)PRT(213)大腸桿菌(400)10Met Met Gln Leu Val His Leu Phe Met Asp Glu Ile Thr Met Asp Pro1 5 10 15Leu His Ala Val Tyr Leu Thr Val Gly Leu Phe Val Ile Thr Phe Phe20 25 30Asn Pro Gly Ala Asn Leu Phe Val Val Val Gln Thr Ser Leu Ala Ser35 40 45Gly Arg Arg Ala Gly Val Leu Thr Gly Leu Gly Val Ala Leu Gly Asp50 55 60Ala Phe Tyr Ser Gly Leu Gly Leu Phe Gly Leu Ala Thr Leu Ile Thr65 70 75 80Gln Cys Glu Glu Ile Phe Ser Leu Ile Arg Ile Val Gly Gly Ala Tyr85 90 95Leu Leu Trp Phe Ala Trp Cys Ser Met Arg Arg Gln Ser Thr Pro Gln100 105 110
Met Ser Thr Leu Gln Gln Pro Ile Ser Ala Pro Trp Tyr Val Phe Phe115 120 125Arg Arg Gly Leu Ile Thr Asp Leu Ser Asn Pro Gln Thr Val Leu Phe130 135 140Phe Ile Ser Ile Phe Ser Val Thr Leu Asn Ala Glu Thr Pro Thr Trp145 150 155 160Ala Arg Leu Met Ala Trp Ala Gly Ile Val Leu Ala Ser Ile Ile Trp165 170 175Arg Val Phe Leu Ser Gln Ala Phe Ser Leu Pro Ala Val Arg Arg Ala180 185 190Tyr Gly Arg Met Gln Arg Val Ala Ser Arg Val Ile Gly Ala Ile Ile195 200 205Gly Val Phe Ala Leu Arg Leu Ile Tyr Glu Gly Val Thr Gln Arg210 215 220(210)11(211)639(212)DNA(213)大腸桿菌(220)(221)CDS(223)(1)..(639)(400)11gtg ttc gct gaa tac ggg gtt ctg aat tac tgg acc tat ctg gtt ggg 48Met Phe Ala Glu Tyr Gly Val Leu Ash Tyr Trp Thr Tyr Leu Val Gly1 5 10 15gcc att ttt att gtg ttg gtg cca ggg cca aat acc ctg ttt gta ctc 96Ala Ile Phe Ile Val Leu Val Pro Gly Pro Asn Thr Leu Phe Val Leu20 25 30aaa aat agc gtc agt agc ggt atg aaa ggc ggt tat ctt gcg gcc tgc 144Lys Asn Ser Val Ser Ser Gly Met Lys Gly Gly Tyr Leu Ala Ala Cys35 40 45ggt gta ttt att ggc gat gcg gta ttg atg ttt ctg gca tgg gct gga 192Gly Val Phe Ile Gly Asp Ala Val Leu Met Phe Leu Ala Trp Ala Gly50 55 60
gtg gcg aca tta att aag acc acc ccg ata tta ttc aac att gta cgt 240Val Ala Thr Leu Ile Lys Thr Thr Pro Ile Leu Phe Asn Ile Val Arg65 70 75 80tat ctt ggt gcg ttt tat ttg ctc tat ctg ggg agt aaa att ctt tac 288Tyr Leu Gly Ala Phe Tyr Leu Leu Tyr Leu Gly Ser Lys Ile Leu Tyr85 90 95gcg acc ctg aag ggt aaa aat agc gag gcc aaa tcc gat gag ccc caa 336Ala Thr Leu Lys Gly Lys Asn Ser Glu Ala Lys Ser Asp Glu Pro Gln100 105 110tac ggt gct att ttt aaa cgc gcg tta att ttg agc ctg act aat ccg 384Tyr Gly Ala Ile Phe Lys Arg Ala Leu Ile Leu Ser Leu Thr Asn Pro115 120 125aaa gcc att ttg ttc tat gtg tcg ttt ttc gta cag ttt atc gat gtt 432Lys Ala Ile Leu Phe Tyr Val Ser Phe Phe Val Gln Phe Ile Asp Val130 135 140aat gcc cca cat acg gga att tca ttc ttt att ctg gcg gcg acg ctg 480Asn Ala Pro His Thr Gly Ile Ser Phe Phe Ile Leu Ala Ala Thr Leu145 150 155 160gaa ctg gtg agt ttc tgc tat ttg agc ttc ctg att ata tct ggt gct 528Glu Leu Val Ser Phe Cys Tyr Leu Ser Phe Leu Ile Ile Ser Gly Ala165 170 175ttt gtc acg cag tac ata cgt acc aaa aag aaa ctg gct aaa gtt ggc 576Phe Val Thr Gln Tyr Ile Arg Thr Lys Lys Lys Leu Ala Lys Val Gly180 185 190aac tca ctg att ggt ttg atg ttc gtg ggt ttc gct gcc cga ctg gcg 624Asn Ser Leu Ile Gly Leu Met Phe Val Gly Phe Ala Ala Arg Leu Ala195 200 205acg ctg caa tcc tga 639Thr Leu Gln Ser210(210)12(211)212(212)PRT(213)大腸桿菌
(400)12Met Phe Ala Glu Tyr Gly Val Leu Asn Tyr Trp Thr Tyr Leu Val Gly1 5 10 15Ala Ile Phe Ile Val Leu Val Pro Gly Pro Asn Thr Leu Phe Val Leu20 25 30Lys Asn Ser Val Ser Ser Gly Met Lys Gly Gly Tyr Leu Ala Ala Cys35 40 45Gly Val Phe Ile Gly Asp Ala Val Leu Met Phe Leu Ala Trp Ala Gly50 55 60Val Ala Thr Leu Ile Lys Thr Thr Pro Ile Leu Phe Asn Ile Val Arg65 70 75 80Tyr Leu Gly Ala Phe Tyr Leu Leu Tyr Leu Gly Ser Lys Ile Leu Tyr85 90 95Ala Thr Leu Lys Gly Lys Asn Ser Glu Ala Lys Ser Asp Glu Pro Gln100 105 110Tyr Gly Ala Ile Phe Lys Arg Ala Leu Ile Leu Ser Leu Thr Asn Pro115 120 125Lys Ala Ile Leu Phe Tyr Val Ser Phe Phe Val Gln Phe Ile Asp Val130 135 140Asn Ala Pro His Thr Gly Ile Ser Phe Phe Ile Leu Ala Ala Thr Leu145 150 155 160Glu Leu Val Ser Phe Cys Tyr Leu Ser Phe Leu Ile Ile Ser Gly Ala165 170 175Phe Val Thr Gln Tyr Ile Arg Thr Lys Lys Lys Leu Ala Lys Val Gly180 185 190Asn Ser Leu Ile Gly Leu Met Phe Val Gly Phe Ala Ala Arg Leu Ala195 200 205Thr Leu Gln Ser210(210)13(211)588(212)DNA(213)大腸桿菌(220)(221)CDS(222)(1)..(588)(400)13
gtg aca ccg acc ctt tta agt gct ttt tgg act tac acc ctg att acc 48Met Thr Pro Thr Leu Leu Ser Ala Phe Trp Thr Tyr Thr Leu Ile Thr1 5 10 15gct atg acg cca gga ccg aac aat att ctc gcc ctt agc tct gct acg 96Ala Met Thr Pro Gly Pro Asn Asn Ile Leu Ala Leu Ser Ser Ala Thr20 25 30tcg cat gga ttt cgt caa agt acc cgc gtg ctg gca ggg atg agt ctg 144Ser His Gly Phe Arg Gln Ser Thr Arg Val Leu Ala Gly Met Ser Leu35 40 45gga ttt ttg att gtg atg tta ctg tgt gcg ggc att tca ttt tca ctg 192Gly Phe Leu Ile Val Met Leu Leu Cys Ala Gly Ile Ser Phe Ser Leu50 55 60gca gtg att gac ccg gca gcg gta cac ctt ttg agt tgg gcg ggg gcg 240Ala Val Ile Asp Pro Ala Ala Val His Leu Leu Ser Trp Ala Gly Ala65 70 75 80gca tat att gtc tgg ctg gcg tgg aaa atc gcc acc agc cca aca aag 288Ala Tyr Ile Val Trp Leu Ala Trp Lys Ile Ala Thr Ser Pro Thr Lys85 90 95gaa gac gga ctt cag gca aaa cca atc agc ttt tgg gcc agc ttt gct 336Glu Asp Gly Leu Gln Ala Lys Pro Ile Ser Phe Trp Ala Ser Phe Ala100 105 110ttg cag ttt gtg aac gtc aaa atc att ttg tac ggt gtt acg gca ctg 384Leu Gln Phe Val Asn Val Lys Ile Ile Leu Tyr Gly Val Thr Ala Leu115 120 125tcg acg ttt gtt ctg ccg caa aca cag gcg tta agc tgg gta gtt ggc 432Ser Thr Phe Val Leu Pro Gln Thr Gln Ala Leu Ser Trp Val Val Gly130 135 140gtc agc gtt ttg ctg gcg atg att ggg acg ttt ggc aat gtg tgc tgg 480Val Ser Val Leu Leu Ala Met Ile Gly Thr Phe Gly Asn Val Cys Trp145 150 155 160gcg ctg gcg ggg cat ctg ttt cag cga ttg ttt cgc cag tat ggt cgc 528Ala Leu Ala Gly His Leu Phe Gln Arg Leu Phe Arg Gln Tyr Gly Arg165 170 175cag tta aat atc gtg ctt gcc ctg ttg ctg gtc tat tgc gcg gta cgc 576Gln Leu Asn Ile Val Leu Ala Leu Leu Leu Val Tyr Cys Ala Val Arg180 185 190att ttc tat taa 588Ile Phe Tyr195(210)14(211)195
(212)PRT(213)大腸桿菌(400)14Met Thr Pro Thr Leu Leu Ser Ala Phe Trp Thr Tyr Thr Leu Ile Thr1 5 10 15Ala Met Thr Pro Gly Pro Asn Asn Ile Leu Ala Leu Ser Ser Ala Thr20 25 30Ser His Gly Phe Arg Gln Ser Thr Arg Val Leu Ala Gly Met Ser Leu35 40 45Gly Phe Leu Ile Val Met Leu Leu Cys Ala Gly Ile Ser Phe Ser Leu50 55 60Ala Val Ile Asp Pro Ala Ala Val His Leu Leu Ser Trp Ala Gly Ala65 70 75 80Ala Tyr Ile Val Trp Leu Ala Trp Lys Ile Ala Thr Ser Pro Thr Lys85 90 95Glu Asp Gly Leu Gln Ala Lys Pro Ile Ser Phe Trp Ala Ser Phe Ala100 105 110Leu Gln Phe Val Asn Val Lys Ile Ile Leu Tyr Gly Val Thr Ala Leu115 120 125Ser Thr Phe Val Leu Pro Gln Thr Gln Ala Leu Ser Trp Val Val Gly130 135 140Val Ser Val Leu Leu Ala Met Ile Gly Thr Phe Gly Asn Val Cys Trp145 150 155 160Ala Leu Ala Gly His Leu Phe Gln Arg Leu Phe Arg Gln Tyr Gly Arg165 170 175Gln Leu Asn Ile Val Leu Ala Leu Leu Leu Val Tyr Cys Ala Val Arg180 185 190Ile Phe Tyr195(210)15(211)636(212)DNA(213)大腸桿菌(220)(221)CDS(222)(1)..(636)
(400)15gtg ttt tct tat tac ttt caa ggt ctt gca ctt ggg gcg gct atg atc 48Met Phe Ser Tyr Tyr Phe Gln Gly Leu Ala Leu Gly Ala Ala Met Ile1 5 10 15cta ccg ctc ggt cca caa aat gct ttt gtg atg aat cag ggc ata cgt 96Leu Pro Leu Gly Pro Gln Asn Ala Phe Val Met Asn Gln Gly Ile Arg20 25 30cgt cag tac cac att atg att gcc tta ctt tgt gct atc agc gat ttg 144Arg Gln Tyr His Ile Met Ile Ala Leu Leu Cys Ala Ile Ser Asp Leu35 40 45gtc ctg att tgc gcc ggg att ttt ggt ggc agc gcg tta ttg atg cag 192Val Leu Ile Cys Ala Gly Ile Phe Gly Gly Ser Ala Leu Leu Met Gln50 55 60tcg ccg tgg ttg ctg gcg ctg gtc acc tgg ggc ggc gta gcc ttc ttg 240Ser Pro Trp Leu Leu Ala Leu Val Thr Trp Gly Gly Val Ala Phe Leu65 70 75 80ctg tgg tat ggt ttt ggc gct ttt aaa aca gca atg agc agt aat att 288Leu Trp Tyr Gly Phe Gly Ala Phe Lys Thr Ala Met Ser Ser Asn Ile85 90 95gag tta gcc agc gcc gaa gtc atg aag caa ggc aga tgg aaa att atc 336Glu Leu Ala Ser Ala Glu Val Met Lys Gln Gly Arg Trp Lys Ile Ile100 105 110gcc acc atg ttg gca gtg acc tgg ctg aat ccg cat gtt tac ctg gat 384Ala Thr Met Leu Ala Val Thr Trp Leu Asn Pro His Val Tyr Leu Asp115 120 125act ttt gtt gta ctg ggc agc ctt ggc ggg caa ctt gat gtg gaa cca 432Thr Phe Val Val Leu Gly Ser Leu Gly Gly Gln Leu Asp Val Glu Pro130 135 140aaa cgc tgg ttt gca ctc ggg aca att agc gcc tct ttc ctg tgg ttc 480Lys Arg Trp Phe Ala Leu Gly Thr Ile Ser Ala Ser Phe Leu Trp Phe145 150 155 160ttt ggt ctg gct ctt ctc gca gcc tgg ctg gca ccg cgt ctg cgc acg 528Phe Gly Leu Ala Leu Leu Ala Ala Trp Leu Ala Pro Arg Leu Arg Thr165 170 175gca aaa gca cag cgc att atc aat ctg gtt gtg gga tgt gtt atg tgg 576Ala Lys Ala Gln Arg Ile Ile Asn Leu Val Val Gly Cys Val Met Trp180 185 190ttt att gcc ttg cag ctg gcg aga gac ggt att gct cat gca caa gcc 624Phe Ile Ala Leu Gln Leu Ala Arg Asp Gly Ile Ala His Ala Gln Ala195 200 205ttg ttc agt tag 636Leu Phe Ser210
(210)16(211)211(212)PRT(213)大腸桿菌(400)16Met Phe Ser Tyr Tyr Phe Gln Gly Leu Ala Leu Gly Ala Ala Met Ile1 5 10 15Leu Pro Leu Gly Pro Gln Asn Ala Phe Val Met Asn Gln Gly Ile Arg20 25 30Arg Gln Tyr His Ile Met Ile Ala Leu Leu Cys Ala Ile Ser Asp Leu35 40 45Val Leu Ile Cys Ala Gly Ile Phe Gly Gly Ser Ala Leu Leu Met Gln50 55 60Ser Pro Trp Leu Leu Ala Leu Val Thr Trp Gly Gly Val Ala Phe Leu65 70 75 80Leu Trp Tyr Gly Phe Gly Ala Phe Lys Thr Ala Met Ser Ser Asn Ile85 90 95Glu Leu Ala Ser Ala Glu Val Met Lys Gln Gly Arg Trp Lys Ile Ile100 105 110Ala Thr Met Leu Ala Val Thr Trp Leu Asn Pro His Val Tyr Leu Asp115 120 125Thr Phe Val Val Leu Gly Ser Leu Gly Gly Gln Leu Asp Val Glu Pro130 135 140Lys Arg Trp Phe Ala Leu Gly Thr Ile Ser Ala Ser Phe Leu Trp Phe145 150 155 160Phe Gly Leu Ala Leu Leu Ala Ala Trp Leu Ala Pro Arg Leu Arg Thr165 170 175Ala Lys Ala Gln Arg Ile Ile Asn Leu Val Val Gly Cys Val Met Trp180 185 190Phe Ile Ala Leu Gln Leu Ala Arg Asp Gly Ile Ala His Ala Gln Ala195 200 205Leu Phe Ser210(210)17(211)20(212)DNA(213)人工序列
(220)(223)人工序列描述擴(kuò)增大腸桿菌yahN基因的引物(400)17gtgtggaacc gacgccggat 20(210)18(211)23(212)DNA(213)人工序列(220)(223)人工序列描述擴(kuò)增大腸桿菌yahN基因的引物(400)18tgttgtatgg tacggggttc gag 23(210)19(211)20(212)DNA(213)人工序列(220)(223)人工序列描述擴(kuò)增大腸桿菌yeaS基因的引物(400)19ctttgccaat cccgtctccc 20(210)20(211)20(212)DNA(213)人工序列
(220)(223)人工序列描述擴(kuò)增大腸桿菌yeaS基因的引物(400)20gccccatgca taacggaaag 20(210)21(211)26(212)DNA(213)人工序列(220)(223)人工序列描述擴(kuò)增大腸桿菌yfiK基因的引物(400)21gaagatcttg taggccggat aaggcg 26(210)22(211)20(212)DNA(213)人工序列(220)(223)人工序列描述擴(kuò)增大腸桿菌yfiK基因的引物(400)22tggttttacc aattggccgc 20(210)23(211)21(212)DNA(213)人工序列
(220)(223)人工序列描述擴(kuò)增大腸桿菌yggA基因的引物(400)23acttctcccg cgagccagtt c 21(210)24(211)21(212)DNA(213)人工序列(220)(223)人工序列描述擴(kuò)增大腸桿菌yggA基因的引物(400)24ggcaagctta gcgcctctgt t 21
權(quán)利要求
1.具有產(chǎn)生L-氨基酸能力的埃希氏菌屬細(xì)菌，其中產(chǎn)生L-氨基酸能力通過(guò)增加選自以下(C)和(D)蛋白的至少一種蛋白的表達(dá)量得到提高(C)具有序列表中SEQ ID NO12所示的氨基酸序列的蛋白；和(D)具有在序列表中SEQ ID NO12所示氨基酸序列中有一個(gè)或幾個(gè)氨基酸缺失、置換、插入、增加或倒位的氨基酸序列的蛋白，該蛋白具有增加含該蛋白的細(xì)菌產(chǎn)生L-氨基酸的能力的活性。
2.權(quán)利要求
1的細(xì)菌，其中所述L-氨基酸為L(zhǎng)-賴(lài)氨酸，并且選自所述蛋白(C)和(D)的至少一種蛋白的表達(dá)量增加。
3.權(quán)利要求
1的細(xì)菌，其中所述L-氨基酸為L(zhǎng)-谷氨酸，并且選自所述蛋白(C)和(D)的至少一種蛋白的表達(dá)量增加。
4.權(quán)利要求
1的細(xì)菌，其中所述L-氨基酸為L(zhǎng)-丙氨酸，并且選自所述蛋白(C)和(D)的至少一種蛋白的表達(dá)量增加。
5.權(quán)利要求
1的細(xì)菌，其中所述L-氨基酸為L(zhǎng)-纈氨酸，并且選自所述蛋白(C)和(D)的至少一種蛋白的表達(dá)量增加。
6.權(quán)利要求
1的細(xì)菌，其中所述L-氨基酸為L(zhǎng)-組氨酸，并且選自所述蛋白(C)和(D)的至少一種蛋白的表達(dá)量增加。
7.權(quán)利要求
1的細(xì)菌，其中所述L-氨基酸為L(zhǎng)-脯氨酸，并且選自所述蛋白(C)和(D)的至少一種蛋白的表達(dá)量增加。
8.權(quán)利要求
1的細(xì)菌，其中所述L-氨基酸為L(zhǎng)-異亮氨酸，并且選自所述蛋白(C)和(D)的至少一種蛋白的表達(dá)量增加。
9.權(quán)利要求
1到8任一項(xiàng)的細(xì)菌，其中細(xì)胞中編碼所述蛋白的DNA的拷貝數(shù)增加。
10.權(quán)利要求
9的細(xì)菌，其中所述DNA攜帶在細(xì)胞中的多拷貝載體上。
11.權(quán)利要求
9的細(xì)菌，其中所述DNA攜帶在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)座子上。
12.生產(chǎn)L-氨基酸的方法，包括下列步驟在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求
1的細(xì)菌，以便在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累L-氨基酸，和從培養(yǎng)基中回收L-氨基酸。
13.權(quán)利要求
12的方法，其中所述L-氨基酸是L-賴(lài)氨酸，所述細(xì)菌是其中選自所述蛋白(C)和(D)的至少一種蛋白的表達(dá)量增加的細(xì)菌。
14.權(quán)利要求
12的方法，其中所述L-氨基酸為L(zhǎng)-谷氨酸，所述細(xì)菌是其中選自所述蛋白(C)和(D)的至少一種蛋白的表達(dá)量增加的細(xì)菌。
15.權(quán)利要求
12的方法，其中所述L-氨基酸為L(zhǎng)-丙氨酸，所述細(xì)菌是其中選自所述蛋白(C)和(D)的至少一種蛋白的表達(dá)量增加的細(xì)菌。
16.權(quán)利要求
12的方法，其中所述L-氨基酸為L(zhǎng)-纈氨酸，所述細(xì)菌是其中選自所述蛋白(C)和(D)的至少一種蛋白的表達(dá)量增加的細(xì)菌。
17.權(quán)利要求
12的方法，其中所述L-氨基酸為L(zhǎng)-組氨酸，所述細(xì)菌是其中選自所述蛋白(C)和(D)的至少一種蛋白的表達(dá)量增加的細(xì)菌。
18.權(quán)利要求
12的方法，其中所述L-氨基酸為L(zhǎng)-脯氨酸，所述細(xì)菌是其中選自所述蛋白(C)和(D)的至少一種蛋白的表達(dá)量增加的細(xì)菌。
19.權(quán)利要求
12的方法，其中所述L-氨基酸為L(zhǎng)-異亮氨酸，所述細(xì)菌是其中選自所述蛋白(C)和(D)的至少一種蛋白的表達(dá)量增加的細(xì)菌。
20.權(quán)利要求
12到19任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)菌細(xì)胞中編碼所述蛋白的DNA的拷貝數(shù)增加。
21.權(quán)利要求
20的方法，其中所述DNA攜帶在細(xì)胞中的多拷貝載體上。
22.權(quán)利要求
20的方法，其中所述DNA攜帶在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)座子上。
專(zhuān)利摘要
本發(fā)明涉及具有產(chǎn)生L－氨基酸能力的埃希氏菌屬細(xì)菌和使用該細(xì)菌生產(chǎn)L－氨基酸的方法，其中所述細(xì)菌產(chǎn)生L－氨基酸的能力通過(guò)增加L－氨基酸分泌蛋白的表達(dá)量得以提高。
文檔編號(hào)C12N15/69GKCN1737119SQ200510103610
公開(kāi)日2006年2月22日 申請(qǐng)日期1999年12月30日
發(fā)明者V·A·利夫希茨, N·P·扎卡塔瓦, 中西一夫, V·V·阿列申, P·V·特羅申, I·L·托克馬科瓦 申請(qǐng)人:味之素株式會(huì)社導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan