專利名稱:與前列腺疾病相關(guān)的基因及其編碼的多肽以及它們的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域和制藥領(lǐng)域，尤其涉及一種與前列腺疾病相關(guān)的基因及其編碼的多肽，以及它們的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
當(dāng)今男性及其家庭所面臨的三種最常見的前列腺疾病是前列腺增生、前列腺癌和前列腺炎。這些疾病對(duì)前列腺的影響各不相同。其中前列腺癌是老年男性的易發(fā)病，在歐美是男性癌癥死亡的主要原因；在我國發(fā)病率雖比歐美國家低，但近年來其發(fā)病呈上升趨勢(shì)。 關(guān)于前列腺癌的治療，可選用手術(shù)、放療、內(nèi)分泌治療和化療等不同方法。上述療法對(duì)于改善患者遠(yuǎn)期預(yù)后，提高生存率并不理想。近年來，針對(duì)前列腺癌的基因治療逐步顯示出其良好療效，目的基因包括癌基因、抑癌基因、自殺基因、程序性細(xì)胞死亡基因等，最終通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞程序性死亡，達(dá)到治療目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種多核苷酸。
本發(fā)明的另一目的是提供一種含有本發(fā)明的多核苷酸的載體。
本發(fā)明的另一目的是提供一種含有本發(fā)明的載體的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的另一目的是提供一種利用含有本發(fā)明的載體生產(chǎn)多肽的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供一種本發(fā)明的多核苷酸片段。
本發(fā)明的另一目的是提供一種多肽。
本發(fā)明的另一目的是提供一種藥物組合物，該藥物組合物含有本發(fā)明的多核苷酸或其藥物可接受的鹽、和/或包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，和/或包含本發(fā)明的多核苷酸的宿主細(xì)胞，以及一種或一種以上藥物可接受的鹽或藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
本發(fā)明的另一目的是提供本發(fā)明的多核苷酸在制備預(yù)防和/或診斷和/或治療前列腺疾病的藥劑中的應(yīng)用。
本發(fā)明的另一目的是提供一種檢測(cè)本發(fā)明的多核苷酸的表達(dá)水平的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供檢測(cè)待測(cè)樣品中本發(fā)明的多核苷酸的表達(dá)水平是否變化的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供一種單克隆或多克隆抗體，其與本發(fā)明的多肽或其具有抗原性的片段特異性結(jié)合。
本發(fā)明的另一目的是提供一種治療前列腺腫瘤的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供一種診斷前列腺腫瘤的方法。
本發(fā)明提供一種多核苷酸，該多核苷酸包含
(1)編碼如SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的多核苷酸；或
(2)與⑴具有至少90%同源性的多核苷酸，該多核苷酸編碼的多肽與⑴編碼的多肽具有相同的功能。[0019]如SEQ ID N0:2所述的氨基酸序列為趨化素樣因子超家族(chemokine-like factorsuper family)的一個(gè)成員，本文定義為CKLFSF5_vl，全長(zhǎng)156個(gè)氨基酸。prosite 計(jì)算機(jī)軟件分析，其具有4個(gè)跨膜區(qū)，分別位于氨基酸殘基35-56，60-82，95-114，119-136。
本發(fā)明的多核苷酸序列可以只編碼SEQ ID NO :2所示的多肽，也可以在上述多肽的編碼序列的基礎(chǔ)上，增加非編碼序列，例如內(nèi)含子、編碼序列5'或3'端的非編碼序列等。本發(fā)明的多核苷酸序列最好是以分離形式提供的。本發(fā)明的多核苷酸是“分離”形式的，其不僅已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開，而且已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列分離出來。
本發(fā)明的多核苷酸序列可以是DNA或RNA，其中DNA包括cDNA、基因組DNA以及合成的DNA，DNA可以是雙鏈或是單鏈形式，單鏈DNA可以是編碼鏈或是非編碼鏈(反義鏈)。 本發(fā)明所述的反義鏈可以為如SEQ ID NO :1所示的序列的互補(bǔ)序列。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知，反義鏈或者其一部分(反義寡核苷酸)可用于抑制細(xì)胞內(nèi)本發(fā)明CKLFSF5-V1的表達(dá)。本發(fā)明的CKLFSF5-V1的核苷酸序列可以來自任何物種，特別是哺乳動(dòng)物，包括牛、羊、 豬、鼠、馬，優(yōu)選人類。
本發(fā)明還包括與編碼CKLFSF5-V1的多核苷酸具有至少70%，至少80%，優(yōu)選至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，更優(yōu)選至少95%，至少96%，至少 97%，至少98%，進(jìn)一步優(yōu)選至少99%，最優(yōu)選至少99. 5 %同源性或同一性的多核苷酸序列。這樣的序列可以是天然存在或人工產(chǎn)生的，可以包括CKLFSF5-V1多核苷酸序列的等位基因變異體、也可以包括CKLFSF5-V1多核苷酸序列中堿基的缺失、插入及置換。這樣的序列編碼的多肽可以在功能上與本發(fā)明的CKLFSF5-V1相同、相似、或不同，但最好是編碼與 CKLFSF5-V1生物學(xué)活性基本相同的多肽。
本發(fā)明多核苷酸優(yōu)選包含如SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。其中如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列來源于人前列腺癌cDNA文庫，全長(zhǎng)988個(gè)核苷酸，其包含編碼 CKLFSF5-vl多肽的序列(即編碼序列(CDS)或完整開放讀碼框架(ORF)核苷酸191-661) 和5'非編碼區(qū)(核苷酸1-190)及3'非編碼區(qū)(核苷酸662-988)?；蛘?，更優(yōu)選一種核苷酸序列，其只包含編碼CKLFSF5-V1多肽的序列，例如SEQ ID NO :1所示的編碼序列核苷酸 191-661。本發(fā)明如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列在Genbank中的登錄號(hào)為AF47^62。本發(fā)明的基因，或者各種DNA片段的核苷酸序列可以用常規(guī)方法，如雙脫氧鏈終止法(Sanger 等人，PNAS，1977，74 5463-5467)測(cè)定。這類核苷酸序列測(cè)定也可用商業(yè)測(cè)序試劑盒等。
本發(fā)明還提供一種含有編碼本發(fā)明CKLFSF5-V1多肽的多核苷酸的基因工程載體。所述基因工程載體可以是普通載體或表達(dá)載體。具體地說，適用于原核細(xì)胞的市售表達(dá)載體一般均帶有可選擇標(biāo)志和細(xì)胞復(fù)制原點(diǎn)，帶有l(wèi)acl、T7、入？1^和^1)等細(xì)菌啟動(dòng)子，以及已知克隆載體pBR322(ATCC37017)的其他遺傳元件。這樣的市售載體包括 pGEM(Promega)和pKK223_3 (Wiarmacia)?？筛鶕?jù)所選用的適當(dāng)啟動(dòng)子和待表達(dá)的結(jié)構(gòu)基因序列來選擇衍生于PBR322的適當(dāng)載體。GST原核表達(dá)系統(tǒng)也可用于本發(fā)明。適用于真核細(xì)胞的載體帶有真核細(xì)胞啟動(dòng)子如CMV、SV40等，這樣的載體包括pMT-hIL-3 (馬大龍，狄春輝，龐健等(1991)高技術(shù)通訊 11 :26-29), pQE-9 (Qiagen), pDIO, pNH18A (Stratagene), PKK233-3、pDR540、pRIT5 (Pharmacia)，以及 pcDNA3、pCI、pWLNEO、pSG (Stratagene)、 pSVL(Pharmacia)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中(參見實(shí)施例1)，本發(fā)明的CKLFSF5_vl的多核苷酸序列是利用將PCR產(chǎn)物克隆至pGEM-T fesy質(zhì)粒(ftOmega)中，獲得測(cè)序質(zhì)粒 pGEM-T Easy-CKLFSF5-Vl ；在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中(參見實(shí)施例2)，構(gòu)建本發(fā)明攜帶 CKLFSF5-vl 的真核表達(dá)載體 pcDNA3. 1/Myc-Hi s (-) _CKLFSF5_vl。
本發(fā)明的載體可以是質(zhì)粒、粘粒，還可以是病毒載體。許多基于病毒的系統(tǒng)已用作基因遞送。例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)，代表性的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包括但不限于美國專利第 5，219，740號(hào)描述的LHL、N2、LNSAL、LSHL和LHL2載體，這些載體已全部引入本文作為參考。 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)構(gòu)建。參見，例如，美國專利第5，219，740號(hào)； Marm等，(1983)Cell 33:153-159。另外，病毒載體還可以例如是腺病毒載體系統(tǒng)。人的腺病毒是雙鏈的DNA病毒，通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。因?yàn)橄俨《究蓪⒆陨淼幕蚪M遞送到細(xì)胞核中，并且高效率地復(fù)制，所以本發(fā)明將腺病毒作為表達(dá)和傳遞治療基因的主要載體，并證明其為有效的攜帶本發(fā)明的多核苷酸的載體。目前可將腺病毒分為三個(gè)屬， 進(jìn)一步可分為6個(gè)種(或稱為亞屬或亞群)，編號(hào)從A到F。主要基于免疫學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的人血清型的劃分，已經(jīng)由于歷史原因而成為腺病毒分類的基礎(chǔ)(Benk0 et al. , 1999 ； Lukashok & Horwitz，1998 ；Mautner, 1989)。因?yàn)樗麄內(nèi)菀咨L(zhǎng)和操作，并且在體內(nèi)和體外表現(xiàn)出寬闊的宿主范圍，例如，腺病毒可以感染人的造血、淋巴和骨髓起源的細(xì)胞。此外，腺病毒可以感染靜態(tài)和復(fù)制的靶細(xì)胞。不像逆轉(zhuǎn)錄病毒整合進(jìn)入宿主基因組之內(nèi)，腺病毒在染色體外存留，因此將和插入突變關(guān)聯(lián)的危險(xiǎn)減到最小。腺病毒容易以高的滴度產(chǎn)生并且是穩(wěn)定的， 以至于它可以被純化和儲(chǔ)存。甚至在有復(fù)制能力的情況下，腺病毒僅僅引起低水平的發(fā)病率并且不與人的腫瘤相關(guān)聯(lián)。因此，本發(fā)明優(yōu)選腺病毒載體。對(duì)于腺病毒載體的描述和它們的用途，參見，例如，Haj-Ahmad 和 Graham (1986) J.Virol. 57 :267-274 ；Bett 等，(1993) J. Virol. 67 :5911-5921 ;Mittereder 等，(1994)Human GeneTherapy 5 :717-729 Jeth 等， (1994) J. Virol. 68 :933-940 ；Barr 等，(1994) Gene Therapyl :51-58 ；Berkner,K. L. (1988) BioTechniques 6 :616-629 ;Rich 等，(1993)Human GeneTherapy 4:461-476。在本發(fā)明的實(shí)施方式中(參見實(shí)施例10)，采用腺病毒為載體。腺相關(guān)病毒載體(AAV)也可以用來施用本文描述的多核苷酸序列。AAV載體可以來自任何AAV血清類型，包括但不限于，AAV-1、 AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAVX7 等。
本發(fā)明同時(shí)提供一種含有本發(fā)明的載體的宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞可以用于表達(dá)本發(fā)明多肽，所述宿主包括但不限于原核宿主，諸如大腸桿菌、芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬等； 真核宿主，諸如酵母屬、曲霉屬、昆蟲細(xì)胞如果蠅S2和草地夜蛾Sf9，動(dòng)物細(xì)胞如CH0、 COS (猴腎成纖維細(xì)胞系，Gluzman (Cell 23 =175,1981)人類細(xì)胞系如PC-3細(xì)胞系，DU145 細(xì)胞系及其它能表達(dá)相容載體的細(xì)胞系。本發(fā)明的宿主細(xì)胞也可以是來自待治療個(gè)體自身并回輸給該個(gè)體的細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員周知將含有本發(fā)明的多核苷酸的構(gòu)建體導(dǎo)入上述宿主細(xì)胞的方法，包括但不限于病毒感染、氯化鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔(電擊)、顯微注射、粒子轟擊法或基因槍方法(Sambrook，J. (1989)， Molecular Cloning,a Laboratory ManualiCold Spring Harbor Press ；Plainview,N. Y.； Ausubel, F. Μ. (1989)Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons， N. Y. ；Hobbs, S.等人，McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992) ,McGraw Hill, N. Y. 191-196 ；Engelhard, E. K.等人，PNAS，91 :3224-3227 ；Logan，J.等人，PNAS，81 3655-3659)。在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件與培養(yǎng)基中培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主菌株或細(xì)胞，使其生長(zhǎng)到恰
5當(dāng)?shù)募?xì)胞密度之后，用適當(dāng)?shù)姆椒?例如溫度轉(zhuǎn)變或化學(xué)藥品誘導(dǎo))誘導(dǎo)所選擇的啟動(dòng)子， 并將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。針對(duì)不同的宿主菌株或細(xì)胞以及所表達(dá)的目的多肽的性質(zhì)選擇相應(yīng)的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基在本領(lǐng)域技術(shù)人員知識(shí)范圍之內(nèi)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中 (參見實(shí)施例2)，采用的大腸桿菌XL-IBlue菌作為宿主細(xì)胞，在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中 (參見實(shí)施例 3、10)，采用 PC-3 細(xì)胞(ATCC-CRL-1435)、DU145 細(xì)胞(ATCC-HTB-B1)作為宿主細(xì)胞，可以直接利用腺病毒感染的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化或可以利用電擊法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明還提供一種生產(chǎn)多肽的方法，其包括以下步驟
(1)在適于表達(dá)的條件下，培養(yǎng)含有編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的宿主細(xì)胞；
(2)從所述細(xì)胞培養(yǎng)物中獲得多核苷酸編碼的多肽。
具體地說，在轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞并在被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用適當(dāng)?shù)姆椒?如溫度變動(dòng)或化學(xué)特質(zhì)誘導(dǎo))誘導(dǎo)啟動(dòng)子，然后繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)完成后，可用離心法收集細(xì)胞，并用任何已知的方法，如凍融法、超聲處理法、溶菌酶溶解法或機(jī)械破碎法破碎細(xì)胞?？梢杂酶鞣N已知的方法從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化本發(fā)明的CKLFSF5-V1 的多肽或其片段或融合多肽，這些方法包括硫酸銨或乙醇沉淀法、酸萃取法、超濾法、離子交換層析法、磷酸纖維層析法、疏水相互作用層析法、凝膠過濾法、親和層析法及高壓液柱層析法。
本發(fā)明CKLFSF5-V1多核苷酸序列的片段也應(yīng)包含在本發(fā)明范圍內(nèi)，這些多核苷酸片段為本發(fā)明多核苷酸的至少10個(gè)，例如至少20個(gè)，至少30個(gè)，至少50個(gè)連續(xù)核苷酸序列的片段。這些片段可以用作引物或者雜交探針，用于檢測(cè)編碼本發(fā)明的多核苷酸序列。此外，本發(fā)明的多核苷酸的片段，也可以是如SEQ ID NO :1所示的多核苷酸或其互補(bǔ)序列的一部分，例如，小分子干擾核糖核酸(iRNA)或反義寡核苷酸可用于抑制細(xì)胞內(nèi)本發(fā)明 CKLFSF5-vl 的表達(dá)。
另一方面，本發(fā)明提供一種多肽，該多肽包含
(1)如SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列；或
(2)與(1)具有至少90%同源性的多肽，該多肽的功能與(1)的功能相同。
本發(fā)明還包括與SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列具有至少70%，至少80%，優(yōu)選至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，更優(yōu)選至少95%，至少96%，至少 97%,至少98%，進(jìn)一步優(yōu)選至少99%，最優(yōu)選至少99. 5%同源性或同一性的多肽。其中如 SEQ ID NO :2所示序列全長(zhǎng)156個(gè)氨基酸。prosite計(jì)算機(jī)軟件分析，其具有4個(gè)跨膜區(qū)， 分別位于氨基酸殘基；35-56，60-82，95-114，119-136。
本發(fā)明CKLFSF5-V1多肽可以是天然的、合成的、半合成的、或者重組產(chǎn)生。本發(fā)明 CKLFSF5-V1多肽可按常規(guī)的生物工程方法由宿主細(xì)胞中的重組DNA序列編碼產(chǎn)生多肽產(chǎn)物(具體參見實(shí)施例 1)。也可按照 Meward 和 Young (Meward，J. Μ.和 Young，J. D. ,Solid Phase Peptide Synthesis,2nd Ed. , Pierce Chemical Company, Rockford,111., (1984)) 描述的方法用Applied Biosystem合成儀或PioneerTM肽合成儀按固相化學(xué)技術(shù)合成，或者可使用衍生于本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的mRNA，在無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)中產(chǎn)生所需的多肽。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知，本發(fā)明所述的多肽可以同其它的多肽或多肽的編碼序列形成融合多肽。其它多肽或多肽的編碼序列一般是已知的，有些可以以載體形式購買得到，或者可以按常規(guī)方法合成或從已知生物體中克隆得到。[0038]本發(fā)明提供一種藥物組合物，其含有本發(fā)明治療有效量的多核苷酸、載體、宿主細(xì)胞；和必要時(shí)藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
在所述藥物組合物中，可以含有本發(fā)明治療有效量的CKLFSF5-V1多核苷酸、含有其的載體、含有其的宿主細(xì)胞，也可以含有本發(fā)明的多核苷酸的藥物可接受的鹽。“藥物可接受的鹽”指適于與人或動(dòng)物的組織接觸，而無過多的毒性、刺激、變態(tài)反應(yīng)等的鹽。本發(fā)明的藥物可接受的鹽是本領(lǐng)域藥劑學(xué)常規(guī)組分。這種鹽可以在本發(fā)明多核苷酸的最終分離和純化的過程中制備，也可以將多核苷酸與適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)或無機(jī)酸或堿反應(yīng)單獨(dú)制備。藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑指無毒固態(tài)、半固態(tài)或液態(tài)填充劑、稀釋劑、包囊材料或其他制劑輔料。
本發(fā)明還提供所述多核苷酸在制備預(yù)防和/或診斷和/或治療前列腺疾病的藥劑中的應(yīng)用。
本發(fā)明人通過大量的實(shí)驗(yàn)，以充分地證據(jù)證明本發(fā)明的多核苷酸可以用于預(yù)防和 /或診斷和/或治療前列腺疾病，尤其可以用于預(yù)防和/或診斷和/或治療前列腺腫瘤，例如前列腺增生或前列腺癌。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，利用RT-PCR方法和免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)，均發(fā)現(xiàn)CKLFSF5-V1在正常前列腺中高表達(dá)，而在前列腺腫瘤組織中不表達(dá)或表達(dá)量低，二者具有顯著差異。在此基礎(chǔ)上，以充分的實(shí)驗(yàn)證據(jù)證明了本發(fā)明CKLFSF5-V1具有使腫瘤細(xì)胞發(fā)生增殖抑制、遷移能力降低、對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)粘附能力降低等功能。
在直接反映細(xì)胞的增殖的[3H]_TdR摻入實(shí)驗(yàn)中，三個(gè)CKLFSF5-V1/PC-3克隆的 [3H] -TdR摻入值普遍低于空載體對(duì)照，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0. 05)，具體參見實(shí)施例 4。
腫瘤細(xì)胞的侵襲性生長(zhǎng)與其遷移能力密切相關(guān)，PC-3細(xì)胞是來源于前列腺癌骨轉(zhuǎn)移部位的腫瘤細(xì)胞系，具有很強(qiáng)的遷移及浸潤(rùn)能力。CKLFSF5-V1/PC-3的三個(gè)克隆，細(xì)胞遷移能力比空載體的兩個(gè)克隆及野生型PC-3細(xì)胞均明顯降低，發(fā)生遷移的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0. 05)，具體參見實(shí)施例5。
粘附實(shí)驗(yàn)(參見實(shí)施例6)用于檢測(cè)細(xì)胞對(duì)胞外基質(zhì)的粘附能力，穩(wěn)定表達(dá) CKLFSF5-vl的PC-3細(xì)胞，對(duì)纖粘連蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)和層連粘蛋白(Laminin，LN) 的粘附能力降低，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0. 05)。
從上述功能研究可以看出，在前列腺腫瘤細(xì)胞中超表達(dá)CKLFSF5-V1，可以使腫瘤細(xì)胞發(fā)生增殖抑制、遷移能力降低、對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)粘附能力降低等良性化改變，說明在前列腺癌細(xì)胞中恢復(fù)CKLFSF5-V1的表達(dá)，可以抑制其惡性行為。而且，對(duì)于腺病毒介導(dǎo)的 CKLFSF5-V1，其同樣具有使腫瘤細(xì)胞發(fā)生增殖抑制(實(shí)施例11)、對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)粘附能力降低(實(shí)施例12)、遷移能力降低(實(shí)施例13)等良性化改變而且效果更明顯。尤其重要的是，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，腺病毒介導(dǎo)的CKLFSF5-V1過表達(dá)能抑制前列腺癌細(xì)胞系(例如PC-3細(xì)胞，DU145細(xì)胞)在裸鼠體內(nèi)的成瘤(實(shí)施例14)。對(duì)前列腺疾病細(xì)胞系的上述作用顯示本發(fā)明的CKLFSF5-V1基因可作為治療和/或預(yù)防和/或診斷前列腺疾病的新的候選基因，具有重要的潛在應(yīng)用前景。本發(fā)明的多核苷酸在制備預(yù)防和/或診斷和/或治療前列腺疾病的藥劑中具有重要應(yīng)用，尤其在預(yù)防和/或診斷和/或治療前列腺腫瘤中具有重要應(yīng)用。
本發(fā)明還提供一種檢測(cè)本發(fā)明多核苷酸表達(dá)水平的方法，該方法為利用RT-PCR 方法檢測(cè)本發(fā)明的CKLFSF5-V1多核苷酸在核酸水平的表達(dá)水平；或利用CKLFSF5-V1特異性單克隆或多克隆抗體檢測(cè)所述多核苷酸在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)水平。
可以利用本領(lǐng)域已知的任何方法檢測(cè)本發(fā)明的核苷酸在核酸水平的表達(dá)水平，例如經(jīng)與用放射性同位素標(biāo)記的反義RNA或DNA探針與擴(kuò)增后的DNA序列雜交，這樣可根據(jù)放射性的有無及強(qiáng)度來定性或定量檢測(cè)CKLFSF5-V1的表達(dá)水平。也可以采用非放射性標(biāo)記物例如生物素、異羥洋地黃毒苷配基、二硝基苯甲醛、光生物素、乙酰氨基芴等。當(dāng)上述方法與PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))方法結(jié)合后，其檢測(cè)的靈敏度和特異性顯著提高，也可使用衍生于PCR方法檢測(cè)，例如反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)。反轉(zhuǎn)錄PCR不僅可以檢測(cè)DNA，也能對(duì)RNA 進(jìn)行分析和研究。反應(yīng)的第一步是提取總RNA，加入一個(gè)與mRNA 3’端互補(bǔ)的引物，在反轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA ；第二步是以cDNA為模板，再加入與cDNA互補(bǔ)的另一引物(兩引物應(yīng)位于不同的外顯子上，以避免基因組DNA的污染)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，提供一種利用半定量RT-PCR的方法檢測(cè)本發(fā)明的多核苷酸CKLFSF5-V1在核酸水平的表達(dá)水平。作為選擇，可以原位直接在從活組織檢查或切除術(shù)得到的患者組織的組織切片(固定和/或冰凍)上來檢測(cè)本發(fā)明CKLFSF5-V1多核苷酸的表達(dá)，此時(shí)不需要純化核酸。這些分析技術(shù)包括DNA或RNA印跡分析、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析、原位雜交分析以及聚合酶鏈反應(yīng)分析。這些分析既可揭示CKLFSF5-V1表達(dá)模式的定量方面的情況，也可揭示 CKLFSF5-V1表達(dá)和/或組合物的定性方面的情況。例如可以采用Southern雜交分析檢測(cè)任何方法檢測(cè)本發(fā)明的多核苷酸在核酸水平的表達(dá)水平。Southern雜交的主要方法是用一種或多種限制酶消化基因組DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳按大小分離所得的片段，隨后使DNA 在原位發(fā)生變性，并從凝膠轉(zhuǎn)移到一固相支持體(通常是硝酸纖維素濾膜或尼龍膜)上。將 DNA轉(zhuǎn)移至固相支持體的過程中，DNA片段的相對(duì)位置保持不變，用放射性標(biāo)記的DNA或RNA 與固著于濾膜的DNA雜交，經(jīng)放射性自顯影確定與探針互補(bǔ)的電泳條帶的位置，從而確定待測(cè)多核苷酸的表達(dá)水平。
也可以在蛋白質(zhì)水平檢測(cè)所述的多核苷酸的表達(dá)水平。檢測(cè)方法也可以采用本領(lǐng)域已知的方法，例如利用本發(fā)明CKLFSF5-V1多肽的特異性單克隆抗體或多克隆抗體利用直接或間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(直接或間接ELISA法)、免疫熒光法、Western Blot等檢測(cè)。在ELISA中，常用的酶為辣根過氧化物酶(horserad-ish Peroxidase, HRP)和堿性磷酸酶(alkaline phosphatease, AP) 0也可以使用葡萄糖氧化酶，β _D_半乳糖苷酶和脲酶等。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知，針對(duì)不同的酶，可使用不同的底物，HRP作用的底物包括，但不限于鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和ABTS等。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物，再用這種熒光抗體 (或抗原)作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體)。在細(xì)胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光(黃綠色或桔紅色)，可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測(cè)定含量。Western Blot是檢測(cè)基因能否有效表達(dá)及表達(dá)活性的常用方法。該法常通過聚丙烯酰胺凝膠電泳區(qū)分不同組分，并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，通過特異性試劑(例如特異性抗體)作為探針對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。
本發(fā)明提供一種檢測(cè)待測(cè)樣品中本發(fā)明所述的多核苷酸的表達(dá)水平是否變化的方法，該方法包括
(1)檢測(cè)待測(cè)樣品中所述多核苷酸的表達(dá)水平；[0051](2)將待測(cè)樣品中所述多核苷酸的表達(dá)水平與正常樣品的多核苷酸的表達(dá)水平進(jìn)行比較；
(3)確定待測(cè)樣品中多核苷酸的表達(dá)水平是否變化。
所述待測(cè)樣品可以從來自受試者的細(xì)胞獲得，如來自血液、尿、唾液、胃液、頭發(fā)， 活組織檢查和尸體解剖材料的細(xì)胞。優(yōu)選來自前列腺活組織的細(xì)胞。所述正常樣品可以從已知未患病的正常人的細(xì)胞獲得，該細(xì)胞應(yīng)與待測(cè)樣品細(xì)胞的組織來源一致；正常樣品的多核苷酸的表達(dá)水平可以是從所述正常人的細(xì)胞獲得的具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的多核苷酸的表達(dá)水平。其中所述檢測(cè)待測(cè)樣品中多核苷酸水平的方法可以為上述任何檢測(cè)方法，優(yōu)選利用RT-PCR檢測(cè)所述多核苷酸在核酸水平的表達(dá)水平；或利用特異性單克隆或多克隆抗體檢測(cè)所述多核苷酸在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)水平。
本發(fā)明還提供對(duì)本發(fā)明CKLFSF5-V1多肽或其片段具有特異性的多克隆和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里所述的“特異性”是指抗體能結(jié)合于本發(fā)明的CKLFSF5-V1 基因產(chǎn)物或片段。優(yōu)選那些能與本發(fā)明的CKLFSF5-V1的基因產(chǎn)物結(jié)合但不識(shí)別并不與其它非相關(guān)抗原分子結(jié)合的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制本發(fā)明CKLFSF5-V1 多肽基因產(chǎn)物的抗體，也包括那些并不影響本發(fā)明CKLFSF5-V1多肽功能的抗體。上述抗體不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或 (Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利 No. 4，946，778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的各種方法來制備。例如，純化的本發(fā)明CKLFSF5-V1多肽基因產(chǎn)物或其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例(參見實(shí)施例7)中，提供一種本發(fā)明具有抗原性的片段N-IYRTE MAPGASQ⑶QQ-C(SEQ ID NO :2的氨基酸序列141-156)。本發(fā)明的抗體優(yōu)選單克隆抗體，其可利用雜交瘤技術(shù)制備(見Kohler等人，Nature 256 :495 ； Kohler 等人，Eur. J. Immunol. 6 :511,1976 ；Hammer ling 等人，In Monoclonal Antibodies and T cellHybridaomad，Elsevier，N. Y.，1981)。本發(fā)明的各類抗體可以利用本發(fā)明的 CKLFSF5-V1基因產(chǎn)物或其片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得，這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與本發(fā)明CKLFSF5-V1多肽的基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如，E. Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而產(chǎn)生； 與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的多肽或多肽片段)，可以用真核細(xì)胞 (例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而獲得。
本發(fā)明還提供了一種治療前列腺疾病的方法，該方法包括給病人施用治療有效量的本發(fā)明的多核苷酸或其藥物可接受的鹽、和/或本發(fā)明的載體、和/或本發(fā)明的宿主細(xì)胞。施用本發(fā)明的多核苷酸或其藥物可接受的鹽、和/或本發(fā)明的載體、和/或本發(fā)明的宿主細(xì)胞的方法可以采用本領(lǐng)域已知的任何方法，例如包括但不限于，注射、灌注、口服等。所述方法適合治療前列腺疾病，更適合治療前列腺腫瘤，例如前列腺癌和前列腺增生；最適合治療前列腺癌。
本發(fā)明還提供一種診斷前列腺腫瘤危險(xiǎn)性的方法，該方法包括
(1)檢測(cè)待測(cè)個(gè)體的前列腺組織中本發(fā)明的多核苷酸的表達(dá)水平；[0059](2)將(1)所述多核苷酸的表達(dá)水平與正常個(gè)體前列腺組織中的多核苷酸的表達(dá)水平進(jìn)行比較；
前列腺組織中多核苷酸的表達(dá)水平在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著低于正常個(gè)體的前列腺組織中多核苷酸的表達(dá)水平的個(gè)體患前列腺腫瘤的危險(xiǎn)性增高。所述方法尤其適于診斷前列腺癌的危險(xiǎn)性。


圖1顯示PC-3/CKLFSF5-V1細(xì)胞克隆的篩選和鑒定。其中，圖IA為RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果，圖IB為Western印跡檢測(cè)結(jié)果。
圖2顯示細(xì)胞的[3H]-TdR摻入。
圖3顯示遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
圖4顯示粘附實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)。其中，圖4A為對(duì)纖粘連蛋白(FN)粘附能力；圖4B 為對(duì)層粘連蛋白(LN)的粘附能力。
圖5為CKLFSF5-V1 —級(jí)結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)分析圖。
圖6顯示ELISA檢測(cè)抗CKLFSF5_vl多克隆抗體效價(jià)。
圖7顯示W(wǎng)festern blot檢測(cè)抗CKLFSF5_vl多克隆抗體特異性。
圖8顯示RT-PCR檢測(cè)CKLFSF5_vl的表達(dá)。
圖9為免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)CKLFSF5-V1的表達(dá)。其中，A、B為正常前列腺；C、 D為高分化的前列腺癌；E、F為低分化的前列腺癌。
圖lOS^festern blot檢測(cè)腺病毒介導(dǎo)的CKLFSF5_vl在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，其中， A為在PC-3細(xì)胞中的表達(dá)，B為DU145細(xì)胞中的表達(dá)。
圖11為MTT法檢測(cè)Ad-CKLFSF5-vl感染后細(xì)胞的增殖。其中，A為PC-3細(xì)胞；B 為DU145細(xì)胞。
圖12為腺病毒介導(dǎo)的CKLFSF5-V1超表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的粘附作用。其中，A為PC-3細(xì)胞；B為DU145細(xì)胞。
圖13為腺病毒介導(dǎo)的CKLFSF5-V1超表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的遷移能力。其中，A為 PC-3細(xì)胞；B為DU145細(xì)胞。
圖14為腺病毒介導(dǎo)的CKLFSF5-V1超表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)成瘤(ex vivotumorigenesis)。其中，A 為 PC-3 細(xì)胞，B 為 DU145 細(xì)胞。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(New York =Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1、全長(zhǎng)cDNA的克隆化和特性分析
1、CKLFSF5-vl 全長(zhǎng) cDNA 的 EST 拼接
利用CKLF2 (Genbank登記號(hào)AF135380)多肽序列對(duì)多肽數(shù)據(jù)庫(NCBI的blastp) 和人的表達(dá)序列標(biāo)簽(Expression Sequence Tag，簡(jiǎn)稱EST)進(jìn)行數(shù)據(jù)檢索和同源性比較，發(fā)現(xiàn)多組 EST 序歹Ij (BF530674, BF346190, AI147740, AA452430, AI553750, AI567497, AW296102，AA452257，AI471151)，通過 EST Assembly machine (網(wǎng)址為 http //www. tigem. it)進(jìn)行EST拼接，形成重疊群(contig)再次進(jìn)行BLAST拼接，找到完整的讀碼框架。
2、CKLFSF5-vl 的 cDNA 克隆化
利用引物上游引物GCCTCCATCTCTGCCTACATG(SEQID NO 3)
下游引物GGCTCCACTGTCCTCTCTGC(SEQID NO 4)
對(duì)前列腺癌的單鏈cDNA文庫(購自Clontech)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，(94 °C，5分鐘；94 0C，20秒，58 0C，20秒，72 °C，30秒，35循環(huán)；72 °C，7分鐘)。純化PCR產(chǎn)物，克隆至 pGEM-TEasy載體中(ftOmega)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化XL-1 Blue菌，用藍(lán)白斑篩選陽性克隆獲得 pGEM-T-Easy-CKLFSF5-vl。pGEM-T-Easy-CKLFSF5-vl 測(cè)序質(zhì)粒用 Tip-20Mini_pr印aration 試劑盒Oliagen)進(jìn)行純化，用3100測(cè)序儀進(jìn)行DNA序列分析，證明EST拼接正確。
實(shí)施例2、CKLFSF5-vl 真核表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA3. 1/Myc-HisB (-) _CKLFSF5_vl 的質(zhì)粒構(gòu)建
1、EcoRI 酶切 CKLFSF5_vl 的測(cè)序質(zhì)粒 pGEM_T easy-CKLFSF5_vl，釋放 CKLFSF5_vl 的完整ORF (開放讀碼框架，即SEQ ID NO 1所示序列的191-661)；
2、電泳(垂直板蛋白電泳裝置，購自美國Bio-Rad公司)，回收、純化CKLFSF5-V1 片段,連接至EcoRI，CIAP處理的pcDNA3. 1/Myc-HisB (-)載體(購自hvitrogen公司)中， 獲得真核表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA3. 1/Myc-HisB (-) -CKLFSF5-vl ；
3、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-I Blue,挑單克隆菌落，提取質(zhì)粒，用載體多克隆位點(diǎn)上游的 T7 引物(5，-TAATACGACTCACTATAGGG-3，(SEQ ID NO :5))和 CKLFSF5_vl 的下游引物(即SEQ ID NO 4)進(jìn)行PCR篩選正向插入的克隆，測(cè)序驗(yàn)證后，以Qiagen Tip 100提取重組質(zhì)粒，用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。
實(shí)施例3、細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和單細(xì)胞克隆的篩選
1、PC_3細(xì)胞(ATCC號(hào)CRL_1435)是來源于人前列腺癌骨轉(zhuǎn)移腺癌的傳代細(xì)胞系， 以 10 % FCS, RPMI 1640 (4. 5g/L 葡萄糖，4mM L-谷氨酸(L-glutamine)，100U/ml 青霉素， 100 μ g/ml鏈霉素)(購自hvitrogen公司)培養(yǎng)。
2、PC-3細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前一天以l-2X105/ml的密度接種于IOOmrn細(xì)胞培養(yǎng)皿中， 18-M小時(shí)以后，消化液(胰蛋白酶+EDTA)消化細(xì)胞，無血清RPMI 1640洗細(xì)胞3遍，調(diào)細(xì)胞密度為 6-10X 106/ml，300 μ 1/樣品。
3、線性化質(zhì)粒量為5 μ g，采用2mm電轉(zhuǎn)杯，140v，20ms。
4、電擊后，室溫靜置5-10分鐘，將細(xì)胞以1X 105/100_ dish鋪碟。
5、36小時(shí)后，加入800ug/ml的G418(購自hvitrogen公司)進(jìn)行篩選。篩選過
程持續(xù)16天，中間每3天更換一次新鮮培養(yǎng)基。
6、2周以后，細(xì)胞克隆形成，挑取單個(gè)細(xì)胞克隆進(jìn)行培養(yǎng)，建立穩(wěn)定高表達(dá) CKLFSF5-vl的單克隆PC-3細(xì)胞株。
克隆篩選過程中，隨機(jī)挑選10個(gè)pcDNA3. 1/Myc-HisB (-)/PC-3的單細(xì)胞克隆，分別命名為5B1至5B10，10個(gè)克隆順利獲得，在后繼的實(shí)驗(yàn)中，隨機(jī)挑選5B1、5B2這兩個(gè)載體克隆作為對(duì)照。同時(shí)隨機(jī)挑選12個(gè)CKLFSF5-V1/PC-3的單細(xì)胞克隆，分別命名為5A1至 5A12，其中4個(gè)克隆(5A1，5A6，5A9，5A11)未能成功增殖，1個(gè)克隆(5A3)污染，所余7個(gè)克隆以半定量RT-PCR和Wfestern印跡分析CKLFSF5_vl的表達(dá)(方法見下)
a) RNA提取和半定量RT-PCR
利用TRIZ0L 試劑提取細(xì)胞總RNA，利用hvitrogen公司的SuperScript II試劑盒合成單鏈cDNA。利用以下引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增
上游引物GCCTCCATCTCTGCCTACATG(SEQID NO 3),
下游引物GGCTCCACTGTCCTCTCTGC(SEQID NO 4)。
PCR 條件為94°C，5 分鐘；94°C，20 秒，56 °C，20 秒，72 °C，30 秒，35 循環(huán)；72 °C，7 分鐘。純化PCR產(chǎn)物，3100測(cè)序儀進(jìn)行DNA序列分析，證明PCR產(chǎn)物的正確性。
b) Western Blot 方法
收取全細(xì)胞裂解液，將蛋白進(jìn)行12.5% SDS-PAGE，按照常規(guī)方法在Bio-Rad電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉/0. 1% TBS-T在室溫封閉lh， 加入用5%脫脂奶粉/0.1% TBS-T進(jìn)行1 2000稀釋后的多克隆抗體(制備方法參見實(shí)施例7)，室溫作用2h，0. 1 % TBS-T洗膜3次，每次5-10min,隨后加入IRDye800標(biāo)記的 anti-chickenlgY 二抗，室溫避光反應(yīng) lh，0. 1% TBS-T 洗膜 3 次后，用 Odyssay hfrared Imaging System 觀察結(jié)果。
結(jié)果半定量RT-PC檢測(cè)結(jié)果(如圖IA所示)和Wiesteren blot的檢測(cè)結(jié)果(圖 IB所示)表明，克隆5A2、5A4、5A10能夠穩(wěn)定高表達(dá)CKLFSF5_vl。
實(shí)施例4、細(xì)胞增殖指標(biāo)的測(cè)定
1、方法[3H]-TdR摻入的測(cè)定
將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以2500細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板，48小時(shí)后，加入 [3H]_TdR(購自Amersham Biosciences公司)，濃度為1 μ Ci/ml，繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)后，收集細(xì)胞至 96-孔 Filtermat 上，MicroBeta Windows Workstation (Wallac)測(cè)定[3H]-TdR ^ 摻入情況。
2、結(jié)果CKLFSF5_vl的過量表達(dá)抑制了細(xì)胞的增殖
如圖2所示，[力]1(11 摻入實(shí)驗(yàn)表明，三個(gè)0(1^5 511/ (-3克隆的[3H]_TdR摻入值普遍低于空載體對(duì)照，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0. 05)。
實(shí)施例5、遷移試驗(yàn)(Migration assay)
1、方法采用Boyden小室(NP公司)法進(jìn)行遷移實(shí)驗(yàn)。用NIH 3T3條件培養(yǎng)基 (由對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NIH 3T3細(xì)胞(ATCC number :CRL_1658)用無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)M小時(shí)獲得)作為趨化物(chemoattractant)，采用8μπι孔徑的PVPF膜。消化液消化收獲對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，0. 1 % BSA/RPMI 1640洗細(xì)胞2遍，調(diào)整細(xì)胞密度至5 XlO5Ail，50 μ 1/孔， 每種細(xì)胞3個(gè)平行復(fù)孔。37°C，5% CO2孵育M小時(shí)后，收膜，甲醇固定細(xì)胞，用棉簽輕輕刮去上層未遷移的細(xì)胞，HE染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察。每孔隨機(jī)選取3個(gè)高倍鏡視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，將每種細(xì)胞3孔9個(gè)高倍鏡視野的計(jì)數(shù)值取算術(shù)平均數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。
2、結(jié)果CKLFSF5-Vl的過量表達(dá)抑制了細(xì)胞的遷移能力
腫瘤細(xì)胞的侵襲性生長(zhǎng)與其遷移能力密切相關(guān)，PC-3細(xì)胞是來源于前列腺癌骨轉(zhuǎn)移部位的腫瘤細(xì)胞系，具有很強(qiáng)的遷移及浸潤(rùn)能力。如圖3所示，CKLFSF5-V1/PC-3的三個(gè)克隆，細(xì)胞遷移能力比空載體的兩個(gè)克隆及野生型PC-3細(xì)胞(PC-3wt)均明顯降低，發(fā)生遷移的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0. 05)。
12[0112]實(shí)施例6、粘附實(shí)驗(yàn)(Adhesion Assay)
1、方法分別檢測(cè)細(xì)胞對(duì)纖粘連蛋白(Fibr0nectin，F(xiàn)N)和層粘連蛋白(Laminin， LN)兩種不同細(xì)胞外基質(zhì)的粘附能力，二者采用不同的方法包被。對(duì)于層粘連蛋白，實(shí)驗(yàn)前一天，分別用25 μ g/ml和50 μ g/ml層連粘蛋白(LN)(購自BD公司)于4°C過夜包被96孔板，實(shí)驗(yàn)前用PBS洗板后，再用1 % BSA/PBS于室溫封閉30分鐘，用前再用大量PBS洗板2 次。對(duì)于纖粘連蛋白，實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，分別用5 μ g/ml和10 μ g/ml的纖粘連蛋白(FN)(購自BD 公司)于室溫包被96孔板1小時(shí)，PBS洗板后，用BSA/PBS于室溫封閉30分鐘，用前再用大量PBS洗板2次。以多聚賴氨酸(poly-L-lysine，PLL)作為陽性對(duì)照，于室溫包被 96孔板5分鐘，晾干后備用。調(diào)細(xì)胞密度至5X IO5細(xì)胞/ml，100 μ 1/孔，每種細(xì)胞設(shè)8個(gè)復(fù)孔。加入細(xì)胞后，于37°C，5% CO2孵育10分鐘后，PBS 100 μ 1/孔洗板4次，3. 7%甲醛 /PBS室溫固定10分鐘后，直接計(jì)數(shù)；或結(jié)晶紫室溫染色10分鐘，大量PBS洗板后，SDS 裂解細(xì)胞，ELISA Reader 570nm測(cè)量光密度值。
2、結(jié)果CKLFSF5-vl的過量表達(dá)降低了 PC-3細(xì)胞對(duì)纖粘連蛋白(Fibronectin， FN)和層連粘蛋白(Laminin，LN)等細(xì)胞外基質(zhì)的粘附
粘附實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)細(xì)胞對(duì)胞外基質(zhì)的粘附能力，本實(shí)施例檢測(cè)了穩(wěn)定株細(xì)胞對(duì)兩種胞外基質(zhì)纖粘連蛋白和層連粘蛋白的粘附能力。統(tǒng)計(jì)結(jié)果以不同組與陽性對(duì)照PLL 相比后的百分?jǐn)?shù)表示。如圖4所示，穩(wěn)定表達(dá)CKLFSF5-V1的PC-3細(xì)胞，對(duì)纖粘連蛋白 (Fibronectin, FN)和層連粘蛋白(Laminin，LN)的粘附能力降低，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P <0.05)。其中，在FN(5 μ g/ml)和LN(50 μ g/ml)包被濃度下，粘附降低尤為明顯。
實(shí)施例7、CKLFSF5-V1多克隆抗體的制備及其鑒定
1、方法:
1.1多克隆抗體的制備
利用DNAMar軟件對(duì)CKLFSF5_vl蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行生物信息學(xué)分析(如圖 5所示)ο
綜合考慮氨基酸組成、疏水性、抗原性、表面暴露性等因素，本發(fā)明選取了 CKLFSF5-vl 羧基端的 16 個(gè)氨基酸(N-IYRTEMAPGASQGDQQ-C) (SEQ ID NO 2 的氨基酸序列 141-156)合成多肽(圖5中黑色標(biāo)記部分)，偶聯(lián)KLH (keyhole limpethemocyanin，鑰孔蜮血藍(lán)蛋白)后與弗氏完全佐劑混合，免疫雞，制備多克隆抗體。
初次免疫用Img KLH-CKLFSF5-V1完全抗原，每2-3周用0. 5mg進(jìn)行增強(qiáng)免疫。抽取雞翅根淺表靜脈血，制備多克隆抗體，倍比稀釋后進(jìn)行ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)，Westernblot 檢測(cè)特異性。
1. 2抗CKLFSF5-V1多克隆抗體的鑒定
用偶聯(lián)OVA的CKLFSF5-V1羧基端多肽作為抗原，包被96孔板，進(jìn)行ELISA檢測(cè)效價(jià)。ELISA實(shí)驗(yàn)方法將OVA偶聯(lián)的CKLFSF5-V1羧基端多肽用磷酸鹽緩沖液稀釋至2_5 μ g/ ml，按照100 μ 1/孔的量包被NUNC 96孔酶標(biāo)板，4°C包被過夜。用PBS-T (0. 05 % Tween 20)洗滌3次，然后按照200 μ 1/孔的量加入封閉液(3% BSA+PBS)，4°C封閉24-36小時(shí)，用 PBS-T洗滌3次。將多克隆抗體及正常雞血清陰性對(duì)照，用0. 1 % BSA/PBS進(jìn)行1 500、 1 IOOOU 5000,1 10000稀釋，每孔加入100 μ 1倍比稀釋后的樣品，每個(gè)樣品設(shè)3 個(gè)平行復(fù)孔，37°C孵育lh。用PBS-T洗滌3次，每孔加入100μ 1用0. BSA/PBS稀釋的anti-chicken IgY-HRP-conjugated 二抗，37°C孵育 lh。用 PBS-T 洗滌 3 次，加入 100 μ 1 OPD顯色液，室溫避光顯色10-15min，用50 μ 1 2Μ的硫酸終止反應(yīng)。在490nm波長(zhǎng)下用 EL-311SX ELISA Reader 讀數(shù)。
選取滴度較高的抗體，用pcDNA3. 1/MyC-HisB (-)-CKLFSF5-vl瞬時(shí)轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的全細(xì)胞裂解液作為抗原，進(jìn)行Western blot (具體方法參見實(shí)施例3中b)所述的方法)， 檢測(cè)抗CKLFSF5-V抗體的特異性。
2、結(jié)果ELISA檢測(cè)抗CKLFSF5_vl多克隆抗體效價(jià)結(jié)果如圖6所示，與陰性對(duì)照相比，抗體893和894效價(jià)均很高，893滴度達(dá)1 2500，894滴度可達(dá)1 5000。選取滴度較高的抗體894，利用Wfestern blot檢測(cè)抗CKLFSF5_vl多克隆抗體特異性的結(jié)果如圖 7所示，在各種稀釋度下，空載體轉(zhuǎn)染組均未檢測(cè)到特異的陽性條帶，而CKLFSF5-V1轉(zhuǎn)染組均可在17kDa處觀察到特異的條帶，與預(yù)計(jì)大小一致。
實(shí)施例8、利用RT-PCR檢測(cè)CKLFSF5在正常前列腺和PC_3、DU145、LNCaP等前列腺癌來源的細(xì)胞系中的表達(dá)。
1、方法
利用引物上游引物GCCTCCATCTCTGCCTACATG(SEQID NO 3)
下游引物GGCTCCACTGTCCTCTCTGC(SEQID NO 4)
分別對(duì)正常前列腺(購自Clontech)和PC-3細(xì)胞、DU145細(xì)胞和LNCap細(xì)胞(ATCC 號(hào)CRL-1740)的單鏈cDNA文庫進(jìn)行PCR擴(kuò)增(RNA提取、RT-PCR的具體方法詳見實(shí)施例 3)。純化PCR產(chǎn)物，3100測(cè)序儀進(jìn)行DNA序列分析，證明PCR產(chǎn)物的正確性。
2、結(jié)果如圖8所示，在正常前列腺文庫可獲得與預(yù)計(jì)大小一致的PCR擴(kuò)增條帶， 而在PC-3、DU145、LNCaP細(xì)胞文庫中未見擴(kuò)增條帶(陽性條帶)。回收PCR產(chǎn)物，測(cè)序證實(shí)為 CKLFSF5-vl。
實(shí)施例9、免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)CKLFSF5-V1的表達(dá)
1、方法人前列腺正常及腫瘤組織石蠟切片購自西安超英生物芯片公司。二甲苯脫蠟后，逐級(jí)用100% -95% -90% -80% -70%的乙醇進(jìn)行水化，PBS洗后，H2A室溫作用10 分鐘去除內(nèi)源性過氧化物酶，用檸檬酸緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，羊血清工作液室溫封閉20分鐘，然后加入1 100稀釋的抗CKLFSF5-V1多克隆抗體，4°C反應(yīng)過夜，PBS充分洗后，加入 1 200稀釋的二抗，37°C反應(yīng)40-45分鐘，PBS洗，DAB顯色，鏡下觀察。自來水終止反應(yīng)， 蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，70% -80% -90% -95% -100%乙醇-二甲苯逐級(jí)脫水，樹膠封片。
2、結(jié)果用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)CKLFSF5-V1的表達(dá)，如圖9所示，在多數(shù)正常前列腺組織中，可以見到明確的陽性信號(hào)，而在大部分前列腺癌組織，未見陽性信號(hào)。用 Fisher’ s精確雙尾法(Fisher’ s exact two-tailed test)分析免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。可以發(fā)現(xiàn)，如表1所示，在前列腺腫瘤組織中CKLFSF5-V1的表達(dá)比正常前列腺組織明顯降低，陽性率僅為48. 39%，而正常前列腺組織中CKLFSF5-V1的表達(dá)陽性率為100%，二者具有明顯的差異，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0. 001)。
表1免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)CKLFSF5-V1表達(dá)結(jié)果統(tǒng)計(jì)
權(quán)利要求
1.編碼如SEQID NO :2所示氨基酸序列的多核苷酸在制備預(yù)防和/或診斷和/或治療前列腺疾病的藥劑中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求
1所述的應(yīng)用，其中所述的多核苷酸為如SEQID NO :1所示的多核苷酸或如SEQ ID NO 1所示的多核苷酸191-661。
3.如權(quán)利要求
1或2所述的應(yīng)用，其中所述的多核苷酸包含于基因工程載體中。
4.如權(quán)利要求
3所述的應(yīng)用，其中所述的基因工程載體為質(zhì)?；蛳俨《据d體。
5.如權(quán)利要求
1或2所述的應(yīng)用，其中所述的多核苷酸包含于宿主細(xì)胞中。
6.如權(quán)利要求
1所述的應(yīng)用，其中所述的前列腺疾病為前列腺癌或前列腺增生。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種編碼如SEQ ID NO2所示的多肽(稱為CKLFSF5-v1)的多核苷酸、包含該多核苷酸的基因工程載體、宿主細(xì)胞以及利用所述宿主細(xì)胞生產(chǎn)由本發(fā)明的多核苷酸編碼的多肽的方法。本發(fā)明還涉及一種多肽，其包含如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。本發(fā)明還涉及一種藥物組合物，其含有本發(fā)明所述的多核苷酸、基因工程載體和/或宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涉及所述多核苷酸在制備預(yù)防和/或診斷和/或治療前列腺疾病的藥劑中的應(yīng)用、和治療前列腺腫瘤或診斷前列腺腫瘤危險(xiǎn)性的方法等。本發(fā)明的CKLFSF5-vl基因可作為預(yù)防和/或診斷和/或治療前列腺疾病的新的候選基因，具有重要的潛在應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C07H21/00GKCN1993467 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請(qǐng)?zhí)朇N 200580026010
公開日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2005年8月17日
發(fā)明者劉雅楠, 宋泉聲, 張穎妹, 邱曉彥, 韓文玲, 馬大龍 申請(qǐng)人:北京大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (3),