專利名稱:一種反應(yīng)與分離耦合酶促合成紅景天苷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及天然產(chǎn)物紅景天苷的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
紅景天苷，或稱紅景天甙，是紅景天植物的有效成分之一，在實(shí)際研究中又常以紅景天甙的含量高低來比較紅景天的品質(zhì)優(yōu)劣。紅景天具有增強(qiáng)記憶、改善心腦血管系統(tǒng)功能、增強(qiáng)免疫、抗疲勞、耐缺氧、抗腫瘤、降血糖、擾病毒、抗微波輻射、保護(hù)器官免受自由基損傷等多方面藥理作用，應(yīng)用前景廣闊。在應(yīng)用范圍方面由“適應(yīng)原樣”藥物發(fā)展到紅景天口服液、紅景天食品、紅景天飲料等。紅景天制劑能改善志愿受試者的體力和智力，增大工作能力指數(shù)，特別是在疲乏情況下使工作錯(cuò)誤率減少。健康人服用紅景天制劑一療程后就能提高注意力、記憶力和興奮過程的強(qiáng)度，對(duì)于患有神經(jīng)官能癥的患者服用一療程后能增強(qiáng)患者的興奮和抑制過程，使靈活性恢復(fù)正常。
目前，主要通過提取的方法從紅景天屬植物根莖中分離得到紅景天苷，包括浸泡、醇回流提取、有機(jī)溶劑萃取、吸附樹脂和硅膠柱層析。提取步驟復(fù)雜，一般產(chǎn)率在0.4％～0.8％。而化學(xué)合成的方法步驟較多，必須經(jīng)過羥基保護(hù)與脫保護(hù)步驟。近年來人們開始利用微生物或酶進(jìn)行天然產(chǎn)物的生物轉(zhuǎn)化和生物催化合成。Journal of Biotechnology 1998，6169-73公開了一種采用人工培養(yǎng)的Rhodiola sachalinensis細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化合成紅景天苷的方法，通過添加對(duì)羥基苯乙醇，其產(chǎn)物紅景天苷的最終產(chǎn)率為0.93g/L。Tetrahedron Asymmetry 1999，102429-2439公開了一種采用杏仁β-葡萄糖苷酶(Sigma G-0395)催化轉(zhuǎn)糖苷化反應(yīng)，合成一系列天然β-葡萄糖苷包括紅景天苷的方法。但該方法采用價(jià)格昂貴的活性葡萄糖苷(如對(duì)硝基苯基葡萄糖苷)作為葡萄糖基供體，成本很高。Process Biochemistry 2005，403143-3147公開了一種利用Aspergillas niger β-葡萄糖苷酶，以1.5％對(duì)羥基苯乙醇和6％葡萄糖為底物，在水溶液體系中催化合成紅景天苷的方法，產(chǎn)率為10％，產(chǎn)物濃度僅為1.5g/L。
發(fā)明人在文獻(xiàn)Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2004，142095-2097以及申請(qǐng)?zhí)枮?00410016652.0，公開號(hào)為CN1560268A的中國(guó)專利申請(qǐng)書中公開了一種在水-二氧六環(huán)體系中，利用蘋果籽粉催化糖苷逆向水解反應(yīng)合成紅景天苷的方法，產(chǎn)物濃度達(dá)10g/L，但底物對(duì)羥基苯乙醇的濃度高達(dá)345g/L，并采用常規(guī)的分離方法從反應(yīng)液中收集產(chǎn)品-紅景天苷，因此，生產(chǎn)的效率受到了影響，需要進(jìn)一步的改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是公開一種反應(yīng)與分離耦合酶促合成紅景天苷的方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷。
本發(fā)明的構(gòu)思是這樣的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，含有底物、產(chǎn)物、水及有機(jī)溶劑的反應(yīng)液經(jīng)過吸附劑吸附后，大部分的底物醇未被吸附，而產(chǎn)物糖苷基本被吸附，然后根據(jù)不同解吸劑極性的不同，將少量吸附的醇和糖苷分別解吸下來，以達(dá)到底物醇與糖苷的分離，從而實(shí)現(xiàn)過剩底物醇的循環(huán)再利用，并簡(jiǎn)化產(chǎn)物糖苷的純化過程。
本發(fā)明的方法包括如下步驟(1)將吸附劑與反應(yīng)液接觸，20～40℃的溫度下吸附1～5h，減壓抽濾，獲得濾餅；所說的反應(yīng)液為蘋果籽粉、底物葡萄糖和對(duì)羥基苯乙醇在含有緩沖溶液的有機(jī)溶劑中反應(yīng)所獲得的產(chǎn)物，可參照發(fā)明人在公開號(hào)為CN1560268A的中國(guó)專利申請(qǐng)書中公開的方法進(jìn)行制備；其中
底物葡萄糖的濃度為2～100g/L，對(duì)羥基苯乙醇的濃度為100～500g/L，紅景天苷的濃度為5～20g/L；所說的吸附劑選自氧化鋁、Amberlite系列樹脂或Dowex系列樹脂中的一種，吸附劑的用量為0.01～1kg/L反應(yīng)液，吸附形式可以是靜態(tài)吸附或動(dòng)態(tài)吸附，如將加有吸附劑的反應(yīng)液在40～100rpm的搖床上吸附1～5h，或者將反應(yīng)液通入吸附劑填充柱；所說的Amberlite系列樹脂或Dowex系列樹脂為一種高分子吸附交換樹脂，可以市售產(chǎn)品，如羅門哈斯公司牌號(hào)為Amberlite XAD-7的產(chǎn)品；(2)用反應(yīng)體系中采用的含水有機(jī)溶劑淋洗濾餅，以洗下未吸附的底物醇，用量為0.1～5ml/g吸附劑；優(yōu)選體積濃度為70～95％的叔丁醇水溶液；(3)然后用底物醇解吸劑浸泡濾餅，浸泡時(shí)間為0.5～2小時(shí)，以解吸被吸附在樹脂上的底物醇，過濾，獲得濾餅，底物醇解吸劑的用量為1～10ml/g吸附劑；所說的底物醇解吸劑選自乙酸乙酯、乙醇、正己烷或叔丁醇；(4)將步驟(3)的濾餅浸泡在糖苷解吸劑中，浸泡時(shí)間為0.5～2小時(shí)，糖苷解吸劑的用量為1～10ml/g吸附劑，以解吸被吸附在樹脂上的產(chǎn)物糖苷，過濾，獲得含有產(chǎn)物糖苷的濾液；所說的糖苷解吸劑選自體積濃度為35～95％的乙醇水溶液、水、叔丁醇或體積濃度40～80％的叔丁醇水溶液中的一種，優(yōu)選體積濃度為35～95％的乙醇水溶液；(5)然后從步驟(4)的濾液中收集紅景天苷。
按照本發(fā)明，步驟(3)收集的濾液，即含有底物醇的底物醇解吸劑，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去底物醇解吸劑，得到未反應(yīng)的底物醇，循環(huán)使用。
按照本發(fā)明，從步驟(4)的濾液中收集紅景天苷的方法優(yōu)選包括如下步驟將步驟(4)的濾液蒸干，經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑為乙酸乙酯∶甲醇＝13∶1，體積比)層析，重結(jié)晶(溶劑為乙酸乙酯∶甲醇＝13∶1，體積比)，獲得產(chǎn)物紅景天苷。
本發(fā)明的反應(yīng)可在常規(guī)的反應(yīng)器中進(jìn)行，其形式并不十分重要，可以是攪拌釜、填充柱或鼓泡柱式反應(yīng)器中的一種。
采用本發(fā)明所公開的酶促合成與分離耦合放大生產(chǎn)紅景天苷的方法，不僅能獲得高濃度、高純度的珍稀天然產(chǎn)物紅景天苷，而且簡(jiǎn)化了底物醇的回收再利用。同時(shí)酶催化劑在反應(yīng)器中很容易重復(fù)使用，是一種極具工業(yè)應(yīng)用潛力的工藝方法，可以以較低的成本生產(chǎn)高品質(zhì)、高附加值的天然保健品紅景天苷。以下將通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容做進(jìn)一步的描述。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1蘋果籽粉的制備從果脯廠取蘋果籽廢棄物1kg，研磨或搗碎成粉，先用酸乙酯洗3次(300ml×3)，再用300ml丙酮洗1次，抽干后置于真空干燥箱干燥，共得蘋果籽干粉350g，置4℃冰箱待用。
實(shí)施例2將49mg葡萄糖加入0.1mL磷酸鉀緩沖液(50mmol/L，pH6.5)中加熱溶解，糖在1mL反應(yīng)體系中的終濃度為0.25mol/L；將0.383g對(duì)羥基苯乙醇加入0.9mL叔丁醇中加熱溶解，醇在1mL反應(yīng)體系中的終濃度為2.5mol/L，冷卻后加蘋果籽粗酶粉15mg(1.52U)，在50℃振蕩反應(yīng)192小時(shí)后，分析測(cè)得紅景天苷的最終產(chǎn)率為28.2％。
實(shí)施例3在50ml磨口三角瓶中依次加入250mg蘋果籽粉，272mg葡萄糖，0.5ml磷酸緩沖液(70mmol/L Na2HPO4-KH2PO4，pH6.0)，2.28g對(duì)羥基苯乙醇，5.0ml二氧六環(huán)，塞緊磨口瓶塞，并用生料帶封口，在45℃，160rpm搖床上反應(yīng)120h.
反應(yīng)結(jié)束后加入甲醇10ml，過濾除去酶，濾出的酶再用甲醇洗滌(20ml×3)，在濾液中加入無水硫酸鈉干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，快速柱層析(乙酸乙酯∶甲醇＝13∶1)，獲得紅景天苷66mg，相對(duì)于葡萄糖的產(chǎn)率為15.8％.
實(shí)施例4在250ml磨口三角瓶中依次加入2.45g葡萄糖，5ml磷酸緩沖液(50mmol/L磷酸鉀緩沖液，pH7.0)，8.625g對(duì)羥基苯乙醇，45ml叔丁醇，2.0g蘋果籽粉，于52℃，以120rpm的轉(zhuǎn)速機(jī)械攪拌反應(yīng)72h。
待反應(yīng)結(jié)束后停止攪拌并靜置0.5h，蘋果籽粉沉于瓶底，留待下批反應(yīng)繼續(xù)使用；底物葡萄糖的濃度為49g/L，對(duì)羥基苯乙醇的濃度為172.5g/L，紅景天苷的濃度為5.2g/L；在反應(yīng)上清液中加入30g吸附樹脂Amberlite XAD-7，在30℃、60rpm搖床上吸附3h后減壓抽濾，并用20ml 90％叔丁醇-水溶液淋洗濾餅，以洗下未吸附的底物醇，再用50ml乙酸乙酯浸泡1h，以解吸被吸附在樹脂上的底物醇，最后用50ml 75％乙醇水溶液浸泡樹脂，以解吸被吸附在樹脂上的產(chǎn)物糖苷。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙酸乙酯，得到未反應(yīng)的底物醇，將其與經(jīng)過吸附并過濾后的反應(yīng)上清液及吸附樹脂的叔丁醇-水淋洗液合并，重新投入下一輪反應(yīng)，在下一批反應(yīng)前重新補(bǔ)加葡萄糖2.45g。
經(jīng)過連續(xù)10批重復(fù)反應(yīng)后，將75％乙醇水溶液解吸的糖苷溶液蒸干，經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑為乙酸乙酯∶甲醇＝13∶1，體積比)層析，重結(jié)晶(溶劑為甲醇和乙酸乙酯，乙酸乙酯∶甲醇＝13∶1，體積比)后，得白色固體狀紅景天苷2.0g。采用文獻(xiàn)Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2004，142095-2097所述的方法進(jìn)行分析，產(chǎn)物紅景天苷的生產(chǎn)率為1.3g/L·d。
實(shí)施例5在帶有恒溫水夾套的玻璃柱反應(yīng)器中填入10g蘋果籽粉；另配反應(yīng)液約200ml，其中包括20g葡萄糖，20ml磷酸鉀緩沖液(50mmol/L，pH 7.0)，34.5g對(duì)羥基苯乙醇和180ml叔丁醇；用蠕動(dòng)泵將反應(yīng)液循環(huán)通過填充酶柱開始酶促合成反應(yīng)，控制反應(yīng)器的溫度為48±2℃，循環(huán)液流速為0.3ml/min，反應(yīng)時(shí)間72h。反應(yīng)液中，底物葡萄糖的濃度為100g/L，對(duì)羥基苯乙醇的濃度為172.5g/L，紅景天苷的濃度為10.3g/L；將反應(yīng)液通入氧化鋁(75g)填充柱吸附后，用50ml90％叔丁醇-水溶液淋洗管路和未吸附的底物醇，再用叔丁醇100ml解吸被吸附的少量底物醇，然后用100ml 50％乙醇水溶液洗脫被吸附的產(chǎn)物糖苷。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙酸乙酯，將得到的底物醇與吸附后的反應(yīng)液及淋洗液合并，重新投入下一輪反應(yīng)，在下一批反應(yīng)前重新補(bǔ)加葡萄糖20g。
經(jīng)過連續(xù)3批重復(fù)反應(yīng)后采用實(shí)施例4相同的方法收集產(chǎn)物，得到紅景天苷白色固體5.3g。紅景天苷的生產(chǎn)率為2.94g/L·d。
實(shí)施例6在帶有恒溫水夾套的玻璃柱反應(yīng)器中加入蘋果籽粉20g和反應(yīng)液500ml，其中包括葡萄糖25g，磷酸鉀緩沖液(50mM，pH7.0)75ml，對(duì)羥基苯乙醇100g和二氧六環(huán)425ml。恒溫水夾套的玻璃柱上方接有冷卻水循環(huán)裝置，下面有空氣壓縮泵鼓氣，通氣速率為0.5L/min，控制溫度在40℃，反應(yīng)時(shí)間為60h。反應(yīng)液中，底物葡萄糖的濃度為50g/L，對(duì)羥基苯乙醇的濃度為200g/L，紅景天苷的濃度為4.8g/L；反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液通入氧化鋁(150g)填充柱吸附后，用100ml 90％二氧六環(huán)-水溶液淋洗管路和未吸附的底物醇，再用正己烷200ml解吸被吸附的少量底物醇，然后用200ml 70％叔丁醇水溶液洗脫被吸附的產(chǎn)物糖苷。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙酸乙酯，將得到的底物醇與吸附后的反應(yīng)液及淋洗液合并，重新投入下一輪反應(yīng)，在下一批反應(yīng)前重新補(bǔ)加葡萄糖25g。
經(jīng)過連續(xù)3批重復(fù)反應(yīng)后，采用實(shí)施例4相同的方法收集產(chǎn)物，得到紅景天苷白色固體6.1g。紅景天苷的生產(chǎn)率為1.36g/L·d。
權(quán)利要求
1.一種反應(yīng)與分離耦合酶促合成紅景天苷的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)將吸附劑與反應(yīng)液接觸，20～40℃的溫度下吸附1～5h，減壓抽濾，獲得濾餅；所說的反應(yīng)液為蘋果籽粉、底物葡萄糖和對(duì)羥基苯乙醇在含有緩沖溶液的有機(jī)溶劑中反應(yīng)所獲得的產(chǎn)物；所說的吸附劑選自氧化鋁、Amberlite系列樹脂或Dowex系列樹脂中的一種；(2)用反應(yīng)體系中采用的含水有機(jī)溶劑淋洗濾餅；(3)然后用底物醇的解吸劑浸泡濾餅，浸泡時(shí)間為0.5～2小時(shí)，過濾，獲得濾餅；所說的底物醇解吸劑選自乙酸乙酯、乙醇、正己烷或叔丁醇；(4)將步驟(3)的濾餅浸泡在糖苷解吸劑中，浸泡時(shí)間為0.5～2小時(shí)，過濾，獲得含有產(chǎn)物糖苷的濾液；所說的糖苷解吸劑選自體積濃度為35～95％的乙醇水溶液、水、叔丁醇或40～80％的叔丁醇水溶液中的一種；(5)然后從步驟(4)的濾液中收集紅景天苷。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于，吸附劑的用量為0.01～1kg/L反應(yīng)液。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于，吸附形式為靜態(tài)吸附或動(dòng)態(tài)吸附。，
4.根據(jù)權(quán)利要求
3所述的方法，其特征在于，將加有吸附劑的反應(yīng)液在40～100rpm的搖床上吸附1～5h，或者將反應(yīng)液通入吸附劑填充柱。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于，作為淋洗劑的有機(jī)溶劑-水溶液用量為0.1～5ml/g吸附劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于，底物醇解吸劑的用量為1～10ml/g吸附劑，糖苷解吸劑的用量為1～10ml/g吸附劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于，步驟(3)收集的濾液，蒸發(fā)除去底物醇解吸劑，得到未反應(yīng)的底物醇，循環(huán)使用。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種反應(yīng)與分離耦合酶促合成紅景天苷的方法。該方法以果脯廠廢棄的蘋果籽為廉價(jià)生物催化劑，以葡萄糖和對(duì)羥基苯乙醇為底物，在有機(jī)溶劑－水體系中酶促合成了珍貴的天然保健品紅景天苷，反應(yīng)混合液經(jīng)過氧化鋁等吸附劑吸附后，通過洗脫劑的選擇性解吸作用，使底物對(duì)羥基苯乙醇與產(chǎn)物紅景天苷相分離，簡(jiǎn)化了產(chǎn)物的純化過程，并使未反應(yīng)的醇能夠循環(huán)使用，是一種極具應(yīng)用前景的批量生產(chǎn)紅景天苷的新方法。
文檔編號(hào)C12P19/44GKCN1844405SQ200610024094
公開日2006年10月11日 申請(qǐng)日期2006年2月22日
發(fā)明者許建和, 郁惠蕾, 林國(guó)強(qiáng) 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué), 中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan