專利名稱：:處理生物質(zhì)以獲得目標(biāo)化學(xué)物質(zhì)的制作方法處理生物質(zhì)以獲得目標(biāo)化學(xué)物質(zhì)本申請(qǐng)要求享受2005年4月12日的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/670437的權(quán)益。政府斥又力聲明本發(fā)明是在美國(guó)政府支持下，根據(jù)能源部授予的契約號(hào)04-34)公開(kāi)了一系列使用化學(xué)計(jì)量的氬氧化鈉和氨水預(yù)處理生物質(zhì)，其中生物質(zhì)濃度極低。溶液與生物質(zhì)的比例是14:1。Elshafei，A.等人(BioresourceTech.(1991)35:73物質(zhì)得到糖類，其隨:被用、作微生物生長(zhǎng)的碳源，所述微生物可以制備作為其代謝產(chǎn)物的目標(biāo)化學(xué)物質(zhì)。通過(guò)以較高濃度，使用相對(duì)于生物質(zhì)干重較低濃度的氨預(yù)處理生物質(zhì)來(lái)釋放糖類。然后使用糖化酶聚生體消化經(jīng)過(guò)氨處理的生物質(zhì)以生產(chǎn)可發(fā)酵糖類。糖類用作能產(chǎn)生目標(biāo)化學(xué)物質(zhì)的微生物或生物催化劑生長(zhǎng)的發(fā)酵基質(zhì)。定義本說(shuō)明書(shū)中使用一些術(shù)語(yǔ)。提供了下列定義術(shù)語(yǔ)"可發(fā)酵糖"是指發(fā)酵過(guò)程中可以被微生物用作碳源的寡糖和單糖。術(shù)語(yǔ)"木質(zhì)纖維素"是指包括木質(zhì)素和纖維素的組合物。木質(zhì)纖維素物質(zhì)還可以包括半纖維素。術(shù)語(yǔ)"纖維素"是指包括纖維素的組合物。生物質(zhì)"干重"是除去全部或基本上全部水的生物質(zhì)的重量。通常才艮氺居美國(guó)溯'K式和才才泮+學(xué)會(huì)(AmericanSocietyforTestingandMaterials)(ASTM)標(biāo)準(zhǔn)E1756放氨的化合物例如尿素及其組合物。用于本方法的最小氨濃度足以維持生物質(zhì)-氨水混合物的堿性pH值，并且最大濃度小于生物質(zhì)千重的約12wt。/。。這種低濃度的氨足以用于預(yù)處理，并且低濃度還可以小于生物質(zhì)千重的約10wt。/Q。還可以^使用極低濃度的占生物質(zhì)千重的6%或更少的氨進(jìn)行預(yù)處理。堿性的意思是指pH值大于7.0。特別合適的生物質(zhì)-氨水混合物的pH值大于8。在一個(gè)實(shí)施例中，存在的氨小于生物質(zhì)干重的約10wt。/。。特別合適的氨小于生物質(zhì)干重的約6wt。/。。用于本方法的氨與其它;威相比具有優(yōu)勢(shì)。氨分配到液相和氣相中。氣態(tài)氨比液態(tài)^威更容易地?cái)U(kuò)散穿過(guò)生物質(zhì)，在較低濃度下更有效地進(jìn)4亍預(yù)處理。本文實(shí)施例ll還顯示氨通過(guò)氨解作用，與生物質(zhì)中的乙?；ニ饩?fàn)幰孕纬梢阴０贰Ｒ阴０穼?duì)某些發(fā)酵生物體的毒性比醋酸鹽更低，例如運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(如本文實(shí)施例12所示)。因此，乙?；マD(zhuǎn)化為乙酰胺而不是乙酸，減少了除去乙酸的需求。使用氨還減少了發(fā)酵期間用氮源補(bǔ)充生長(zhǎng)培養(yǎng)基的需求。此外，氨是一種廉價(jià)的原料并且因此提供經(jīng)濟(jì)的方法。在預(yù)處理期間或預(yù)處理之后，氨還可以被循環(huán)至預(yù)處理反應(yīng)器，因此實(shí)現(xiàn)了更經(jīng)濟(jì)的方法。例如，當(dāng)溫度降低至適于糖化時(shí)，在預(yù)處理之后釋放氨氣，并且任選地在真空的情況下可以循環(huán)氨氣。在連續(xù)方法中，可以連續(xù)循環(huán)氨。才艮據(jù)本方法，含氨的水溶液任選地包括至少一種其他v喊，例如氫氧化鈉、；友酸鈉、氫氧化鉀、》友酸鉀、氫氧化鈣和^友酸鈣。所述至少一種其他堿的添加量與銨合并的總堿量小于生物質(zhì)干重的約20wt%。優(yōu)選第二堿和氨的總量小于約lSwt。/。。例如，可以使用其他堿中和生物質(zhì)中的酸，來(lái)為糖化酶提供金屬離子或?yàn)榘l(fā)酵生長(zhǎng)培養(yǎng)基提供金屬離子。在本方法中，生物質(zhì)干重的初始含量為生物質(zhì)-氨水混合物重量的至少約15%~約80%。更合適地，生物質(zhì)干重的含量為生物質(zhì)-氨水混合物重量的約15%~約60%。生物質(zhì)占生物質(zhì)-氨水混合物的百分比維持在較高水平，以使對(duì)糖類濃縮的需求最小化，所述糖類得自用于發(fā)酵的經(jīng)過(guò)預(yù)處理的生物質(zhì)的糖化。高生物質(zhì)含量還降低預(yù)處理原料的總體積，Y吏該方法更經(jīng)濟(jì)。生物質(zhì)可以以得到的形式直接使用，或可以向生物質(zhì)施加能量以減少尺寸、增加暴露的表面積和/或使生物質(zhì)中存在的纖維素、半纖維素和/或寡糖被氨和所述方法第二步所用糖化酶利用的程度。用于減少尺寸、增加暴露的表面積和/或使生物質(zhì)中存在的纖維素、半纖維素和/或寡糖被氨和糖化酶利用的程度的能量方式包括但不限于，磨細(xì)、壓碎、磨碎、撕碎、切碎、圓盤(pán)精煉、超聲和微波?？梢栽陬A(yù)處理之前或期間、糖化之前或期間或其任意組合中施加能量。在合適的容器中用氨溶液預(yù)處理生物質(zhì)。通常，容器可以經(jīng)受壓力，具有加熱機(jī)構(gòu)，并且具有混合內(nèi)容物的機(jī)構(gòu)。市場(chǎng)上可買到的容器包括例如，Zipperclave⑧反應(yīng)器(AutoclaveEngineers,Erie,PA)、Jaygo反應(yīng)器(JaygoManufacturing,Inc.，Mahwah,NJ)和蒸汽槍反應(yīng)器(GeneralMethods;AutoclaveEngineers,Erie,PA描述)?？梢?吏用許多具有相同性能的較大規(guī)模的反應(yīng)器。或者，可以在一種容器中混合生物質(zhì)和氨溶液，然后轉(zhuǎn)入另一種反應(yīng)器。還可以在一種容器中預(yù)處理生物質(zhì)，然后在另一種反應(yīng)器，例如蒸汽槍反應(yīng)器(GeneralMethods;AutoclaveEngineers,Erie,PA描述)中進(jìn)一步力口工。在生物質(zhì)與含氨的水溶液接觸之前，向裝有生物質(zhì)的容器施加真空。通過(guò)抽空生物質(zhì)孔隙中的空氣，可以使氨更好地滲透入生物質(zhì)。施加真空的時(shí)期和施加于生物質(zhì)的負(fù)壓值取決于生物質(zhì)種類，并且可以憑經(jīng)驗(yàn)確定以便最理想地預(yù)處理生物質(zhì)(如通過(guò)在糖化之后生產(chǎn)可發(fā)酵的糖而測(cè)量的)。在約4。C~約20(TC溫度下使生物質(zhì)與含氨的水溶液接觸。發(fā)現(xiàn)生物質(zhì)與氨在4。C首次接觸，允許在該溫度下滲透，增加了未經(jīng)預(yù)處理的天然生物質(zhì)的糖化效率。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述生物質(zhì)的接觸在約75°C~約15(TC下進(jìn)行。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述生物質(zhì)的接觸在大于90。C至約15(TC下進(jìn)行。4吏生物質(zhì)與含氨的水溶液4妄觸最多約25小時(shí)。預(yù)處理時(shí)間可以更長(zhǎng)，然而由于經(jīng)濟(jì)的原因?qū)嶋H上優(yōu)選較短的處理時(shí)間。通常，與氨4^觸處理的時(shí)間為約8小時(shí)或更少。較長(zhǎng)時(shí)間的優(yōu)點(diǎn)是降低對(duì)施加能量破碎生物質(zhì)的需求，因此優(yōu)選最多約25小時(shí)的時(shí)間。在一個(gè)實(shí)施例中，在較高溫度進(jìn)行預(yù)處理步驟持續(xù)較短時(shí)間，例如在約10CrC約15(TC進(jìn)行約5分鐘-約2小時(shí)。在另一個(gè)實(shí)施例中，在較低溫度進(jìn)行預(yù)處理步驟持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間，例如在約75。C~約100。C進(jìn)行約2小時(shí)約8小時(shí)。在另一個(gè)實(shí)施例中，在室溫下(約2226。C)進(jìn)行預(yù)處理步驟持續(xù)甚至更長(zhǎng)時(shí)間，約24小時(shí)。還可以使用在這些之間的溫度和時(shí)間的組合。對(duì)于預(yù)處理方法，與溫度、預(yù)處理時(shí)間、氨濃度、一種或多種其他堿的濃度、生物質(zhì)濃度、生物質(zhì)類型和生物質(zhì)粒徑相關(guān)聯(lián)；因此可以根據(jù)需要調(diào)節(jié)這些變量，以獲得最佳的產(chǎn)物與糖化酶聚生體的接觸。可以在預(yù)處理步驟(即步驟(a))中添加增塑劑、軟化劑、或其組合，例如多元醇(例如甘油、乙二醇)、多元醇的酯(例如單乙酸甘油酯)、乙二醇醚(例如二甘醇)、乙酰胺、乙醇和乙醇胺。增塑劑可以作為氨水溶液的組分、單獨(dú)的溶液或干燥組分^t添加?？梢栽谌魏魏线m的容器中進(jìn)行預(yù)處理反應(yīng)，例如在間歇式反應(yīng)器或連續(xù)式反應(yīng)器中進(jìn)行。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該認(rèn)識(shí)到在較高溫度(高于IOO。C)下需要耐壓容器。合適的容器可以裝備有用于攪拌生物質(zhì)-氨水混合物的葉輪等設(shè)備。Lm，K.氨。去除氨降低了pH值，并且因此減少了為了獲得糖化和發(fā)酵所需pH值所用的中和酸。這導(dǎo)致預(yù)處理混合物中更低的鹽負(fù)荷。通常殘留某些所需的氨而為發(fā)酵提供了氮源。然后，糖化酶聚生體存在下預(yù)處理混合物進(jìn)一步水解，釋放水解產(chǎn)物中的寡糖和/或單糖。Lynd,L.R.，etal.(Microbiol.Mol.Biol.Rev.(2002)66:506纖維二糖水解酶、p-葡糖苷酶)、半纖維素水解糖苷酶(例如木聚糖酶、木聚糖內(nèi)切酶、外切木聚糖酶、P-木糖苷酶、阿拉伯木聚糖酶、甘露聚糖酶、半乳糖酶、果膠酶、葡糖苷酸酶)和淀粉水解糖苷酶(例如淀粉酶、(X-淀粉酶、P-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、(X-葡糖苦酶、異淀粉酶)。此外，向糖化酶聚生體中添加其它活性物質(zhì)例如肽酶(EC3.4.x.y)、月旨肪酶(EC3.1.1.x禾口3.1.4.x)、木質(zhì)酶(ECl.ll.l.x)矛口P可魏酰酯酶(EC3.1.1.73)有助于從生物質(zhì)的其它組分釋放多糖。本領(lǐng)域眾所周知，產(chǎn)生多糖水解酶的微生物經(jīng)常顯示一種被具有不同底物特異性的若干酶或一組酶催化的活性，例如纖維素降解。因此，得自微生物的"纖維素酶"包括一組酶，這些酶均有助于纖維素降解活性。取決于用于獲得酶的純化方案，商品或非商品酶制劑包括許多酶，例如纖維素酶。因此，本方法的糖化酶聚生體具有酶活性，例如"纖維素酶"，然而應(yīng)i人識(shí)到該活性可以一皮一種以上的酶催^(guò)f匕?？梢再?gòu)買糖化酶，例如Spezyme⑧CP纖維素酶(GenencorInternational,Rochester,NY)和Multifect⑧木fHt酶(Genencor)。》匕外，可以以生物學(xué)方式，包括利用重組微生物生產(chǎn)糖化酶。本領(lǐng)域:技術(shù)人員應(yīng)該知曉如何確定聚生體中所用酶的有效量并調(diào)節(jié)獲得最佳酶活性的條件。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)知曉如何優(yōu)化聚生體內(nèi)所需酶活性的種類，以在選定條件下使給定的預(yù)處理產(chǎn)物獲得最佳的糖化。優(yōu)選糖化反應(yīng)在對(duì)于糖化酶最佳的溫度和pH值或其附近進(jìn)行。在本方法中糖化酶聚生體的最適溫度為約15。C~約100。C。在另一個(gè)實(shí)施例中，最適溫度為約2(TC~約80。C。最佳pH值為約2約11。在另一個(gè)實(shí)施例中，本方法中糖化酶聚生體的最佳pH值為約4~約10。糖化可以進(jìn)行約幾分鐘~約120小時(shí)，并且優(yōu)選約幾分鐘~約48小時(shí)。反應(yīng)時(shí)間取決于酶濃度和比活度以及所用底物和環(huán)境條件，例如溫度和pH值。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定特定底物和糖化酶聚生體所用的最佳溫度、pH值和時(shí)間。糖化可以分批進(jìn)4亍或連續(xù)進(jìn)行。糖化還可以一步完成或在若千步中完成。例如，糖化所需的不同酶具有不同的最適pH值或最適溫度。可以在一個(gè)溫度和pH值用酶進(jìn)行初步處理，然后在不同溫度和/或pH值用不同的酶進(jìn)行二次處理或三次(或更多)處理。此外，可以在相同的pH值和/或溫度或不同的pH值和溫度，用不同的酶在順序步驟中進(jìn)行處理，例如使用在較高的pH值和溫度下穩(wěn)定的并更具活性的半纖維素酶，繼之以在較低pH值和溫度下具有活性的纖維素酶。可以通過(guò)測(cè)量單糖和寡糖的釋放來(lái)監(jiān)控在糖化之后得自生物質(zhì)的糖類的溶解度。測(cè)量單糖和寡糖的方法為大家所熟知。例如，使用1,3甲烷、乙烯、丙酮和工業(yè)酶?？梢允褂靡环N或多種合適的生物催化劑通過(guò)單級(jí)或多級(jí)發(fā)酵將糖類發(fā)酵為目標(biāo)化學(xué)物質(zhì)。生物催化劑可以是選自細(xì)菌、絲狀真菌和酵母的微生物。生物催化劑可以是野生型微生物或重組的微生物，并且包括埃希氏菌屬、發(fā)酵單胞菌屬、釀酒酵母屬、念珠菌屬、畢赤氏酵母屬、鏈霉菌屬、芽孢桿菌屬、乳桿菌屬和梭狀芽胞桿菌屬。在另一個(gè)實(shí)施例中，生物催化劑可以選自重組的大腸桿菌、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、釀酒酵母、熱纖梭菌、解糖熱厭氧桿菌和樹(shù)干畢赤酵母。已經(jīng)描述了許多用于發(fā)酵生產(chǎn)目標(biāo)化學(xué)物質(zhì)的生物催化劑，并且通過(guò)突變方法生產(chǎn)的或通過(guò)重組方法工程化的其它生物催化劑。任何利用在本方法中生產(chǎn)的可發(fā)酵糖的生物催化劑可以被用于通過(guò)在本方法通過(guò)發(fā)酵制備目標(biāo)化學(xué)物質(zhì)。已知生溶劑的沖炎狀芽孢桿菌(JonesandWoods(1986)Microbiol.Rev.50:484(2003)Appl.Environ.Microbiol.69:399-407)，桿菌屬的天然菌抹(US20050250192)和米才艮霉(TayandYang(2002)Biotechnol.Bioeng.80:1—12)在發(fā)酵中生產(chǎn)乳酸。大腸桿菌的重組菌抹已經(jīng)被用作發(fā)酵的生物催化劑來(lái)生產(chǎn)1,3丙二醇(US6013494,US6514733)和己二酸(Niuetal.,(2002)Biotechnol.Prog.18:201-211)。使用重組的梭狀芽孢桿菌(Cheryanetal.，(1997)Adv.Appl.Microbiol.43:1菌空變型生產(chǎn)蘇氨酸。百合棒桿菌空變型生產(chǎn)甲硫氨酸(Kumaretal，(2005)Bioresour.Technol.96:287。C。在預(yù)處理結(jié)束時(shí)，通過(guò)排氣冷凝器降低反應(yīng)器壓力，并且打開(kāi)反應(yīng)器并在回收經(jīng)過(guò)預(yù)處理的生物質(zhì)之前施加真空(約85kPa)3分鐘以降溫并從經(jīng)過(guò)預(yù)處理的漿液除去多余的氨。將含有0.5g纖維素(基于最初的原料組成)的完整的、未洗滌的預(yù)處理漿液添加入最終容積為50mL~125mL的搖并瓦。由于酶對(duì)高pH值環(huán)境敏感，在添加酶之前加入乙酸(10-100^L)而將經(jīng)過(guò)氨預(yù)處理的生物質(zhì)的pH值滴定至5.0。糖化期間通過(guò)添加50mM檸檬酸緩沖液將pH值控制在5.0，并且將溫度維持在50。C。按表l對(duì)每份樣品列出的濃度添加Spezyme⑧CP纖維素酶(GenencorInternational,Rochester,NY)。if唐4ti96小時(shí)后，根據(jù)一般方法中描述的糖類測(cè)量方案測(cè)定所得糖化液的糖含量。表2顯示96小時(shí)之后釋放的糖類。本實(shí)驗(yàn)的對(duì)照是l)未經(jīng)處理的玉米秸桿，其葡萄糖的理論產(chǎn)量為23。/。(使用56mg纖維素酶/g纖維素)和2)蒸汽U40。C)預(yù)處理的玉米秸桿，其葡萄糖的理論產(chǎn)量為40%(使用56mg纖維素酶/g纖維素)；對(duì)照不測(cè)量木糖。表1:糖化96小時(shí)后經(jīng)過(guò)預(yù)處理的玉米秸桿釋放的糖類DWB:生物質(zhì)干重<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>這些結(jié)果顯示使用12%的氨在140°(3預(yù)處理15分鐘，然后糖化，比使用35。/。的氨在14(TC預(yù)處理5分鐘釋放更多的葡萄糖和木糖。因此，少量增加預(yù)處理時(shí)間可以體現(xiàn)使用較低濃度氨的優(yōu)勢(shì)。實(shí)施例2在高生物質(zhì)濃度、低溫和極低濃度氨情況下秸桿的預(yù)處理Jaygo反應(yīng)器裝有O.635-cm磨碎的秸桿(干重Ukg)。向容器施加真空(67.7kPa),并注入稀釋的氨水溶液以使氨濃度為6.2g氨/100g生物質(zhì)干重并且生物質(zhì)含量的千重為生物質(zhì)-氨水混合物總重量的30wt%。解除真空，向夾套施加蒸汽以加熱秸桿至100。C。將浸透的秸桿在該溫度保持8小時(shí)，在32rpm下恒速攪拌，然后持續(xù)混合所得漿液以冷卻過(guò)4艾。將含有0.5g纖維素(基于最初的原料組成)的完整的、未洗滌的預(yù)處理漿液添加到最終容積50mL~125mL的搖瓶中。由于酶對(duì)高pH值環(huán)境敏感，必要時(shí)在添加酶之前加入乙酸(10實(shí)施例4在高生物質(zhì)濃度、高溫和極低氨濃度條件下預(yù)處理玉米棒子，然后進(jìn)行高生物質(zhì)濃度糖化將折斷的玉米棒子(干重13kg)裝入Jaygo反應(yīng)器。對(duì)反應(yīng)器施加真空之后，向反應(yīng)器注入適當(dāng)濃度的氨水溶液以產(chǎn)生2%氨和30%生物質(zhì)濃度的干重，在室溫下以32rpm攪拌。然后使用低壓夾套蒸汽加熱反應(yīng)器內(nèi)容物至95。C。一旦反應(yīng)器達(dá)到95。C,使用直接蒸汽注入加熱反應(yīng)器內(nèi)容物至145'C。當(dāng)反應(yīng)器達(dá)到145°(3,使用夾套蒸汽和一定的直接蒸汽注入將反應(yīng)器內(nèi)容物在該溫度維持20分鐘。在20分鐘之后，從通風(fēng)孔向反應(yīng)器施加真空并開(kāi)啟切碎機(jī)馬達(dá)5分鐘。l小時(shí)之后，開(kāi)啟通向夾套的冷卻水。將Jaygo反應(yīng)器的內(nèi)容物冷卻至33'C~37°C;然后使用002將反應(yīng)器增壓至138kPa。增壓C02氣壓維持30min。反應(yīng)器內(nèi)容物的最終溫度為27'C~31°C。浸透的/經(jīng)過(guò)預(yù)處理的生物質(zhì)的pH值為約7.5。始時(shí)，生物質(zhì)濃度的最終千重為經(jīng)過(guò)預(yù)處理的生物質(zhì)-糖化酶聚生體混合物總重量的30%。然后用固體檸檬酸調(diào)節(jié)pH值至5.5,并如實(shí)施例3所述用在未經(jīng)處理的玉米棒子中的28mgSpezymeCP⑧/g纖維素和28mg1^必^"乂^&1^6@/8纖維素消化原料。根據(jù)一般方法中的糖類測(cè)量方案測(cè)定所得糖化液的糖含量。表4顯示在消化96小時(shí)之后釋放的糖類。表4:在糖化期間使用高濃度生物質(zhì)(干重)，從經(jīng)過(guò)預(yù)處理的玉米棒子釋放的糖類。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>實(shí)施例5添加增塑劑進(jìn)行預(yù)處理如實(shí)施例3所述預(yù)處理完整的玉米棒子，生物質(zhì)濃度的干重為生物質(zhì)-氨水混合物總重量的約30%,氨為生物質(zhì)干重的2wt%，在IO(TC下在Jaygo反應(yīng)器進(jìn)4于8小時(shí)，添加占生物質(zhì)干重3wt。/o的甘油作為增塑劑。在預(yù)處理之后，用固體檸檬酸將所得物質(zhì)的pH值調(diào)節(jié)至5。然后如實(shí)施例3中所述消化經(jīng)過(guò)預(yù)處理的玉米才奉子。使用28mgSpezymeCP/g纖維素在未經(jīng)處理的秸桿中加28mg/g纖維素MultifectXylanase在未經(jīng)處理的玉米棒子中的酶混合物。在消化96小時(shí)之后，葡萄糖濃度為92.3g/L并且木糖濃度為54.4g/L。實(shí)施例6對(duì)經(jīng)過(guò)預(yù)處理的生物質(zhì)進(jìn)行圓盤(pán)精煉如實(shí)施例l所述對(duì)秸桿進(jìn)行預(yù)處理，不同樣品使用低氨濃度(12%)或?qū)φ瞻睗舛?35%),并且溫度、時(shí)間和酶條件如表5中所列。如實(shí)施例3所述對(duì)完整的玉米棒子進(jìn)行預(yù)處理，不同樣品使用極低氨濃度(3%或6%),并且其它條件如表5中所列。在預(yù)處理之后，讓樣品經(jīng)過(guò)SproutWaldron圓盤(pán)磨。將固定平板和旋轉(zhuǎn)平板之間的間隙設(shè)為0.254mm(0.010英寸)并且輸送螺旋速度為7rpra。如實(shí)施例2中所述糖化經(jīng)過(guò)精煉的原料，并且根據(jù)一般方法中的糖類測(cè)量方案測(cè)定所得糖化液的糖含量。表5中顯示糖化96小時(shí)的結(jié)果。結(jié)果顯示在糖化之前進(jìn)行圓盤(pán)精煉，可以更好地消化，或使用較低濃度的酶是有效的。表5:在糖化之前進(jìn)行圓盤(pán)精煉的經(jīng)過(guò)預(yù)處理的原料的可消化性<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>實(shí)施例7經(jīng)過(guò)預(yù)處理的生物質(zhì)的蒸汽槍處理如實(shí)施例l中所述預(yù)處理秸桿，所用條件為生物質(zhì)千重占生物質(zhì)-氨水混合物總重量的30%、占DWB6wt。/o的氨、100°C、8小時(shí)、Jaygo反應(yīng)器。如實(shí)施例3中所述預(yù)處理玉米棒子，所用條件為生物質(zhì)干重是生物質(zhì)_氨水混合物總重量的40%、占DWB6wt。/。的氨、93。C、8小時(shí)、Jaygo反應(yīng)器。將每份經(jīng)過(guò)預(yù)處理的生物質(zhì)樣品單獨(dú)裝入4升的蒸汽槍反應(yīng)器。在經(jīng)過(guò)沖模釋放之前，使經(jīng)過(guò)預(yù)處理的原料經(jīng)受170。C5分鐘或140。C20分鐘。如實(shí)施例2中所述糖化所得原料。結(jié)果顯示于下面的表6中。結(jié)果顯示在糖化之前進(jìn)行蒸汽槍處理改善了葡萄糖的釋放c表6:在蒸汽槍處理之后經(jīng)過(guò)預(yù)處理的原料的可消化性<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>實(shí)施例8使用氨循環(huán)的預(yù)處理模型對(duì)于下列兩種預(yù)處理方案，4吏用Aspen才莫型(AspenTechnologies,Cambridge,MA，version12.1);險(xiǎn)查氨循環(huán)的優(yōu)點(diǎn)低溫(85°C)長(zhǎng)保留時(shí)間(4小時(shí))和高溫(lWC)短保留時(shí)間(20分鐘)。在每種模型中存在一系列三個(gè)閃蒸箱，在預(yù)處理反應(yīng)器之后，以連續(xù)較低的壓力操作以提供氨循環(huán)手段。當(dāng)原料流進(jìn)入每個(gè)閃蒸箱時(shí)，其由于壓力減少而分為蒸氣和液體部分。蒸氣部分循環(huán)至預(yù)處理，而液體部分繼續(xù)4于進(jìn)到下一步。假設(shè)預(yù)處理中氨占DWB的2wt乂并且生物質(zhì)干重為生物質(zhì)-氨水混合物總重量的約27%，表7中顯示每一步新鮮供應(yīng)的氨和循環(huán)液流供應(yīng)的氨。在兩種模型中，閃蒸箱以相似的方式運(yùn)轉(zhuǎn)以便氨循環(huán)相似。對(duì)于兩種方案，所需氨的一半以上由循環(huán)供應(yīng)，降低了對(duì)新鮮氨的需求和成本。表7:在預(yù)處理中的氨循環(huán)-Aspen模型試驗(yàn)結(jié)果。<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>實(shí)施例9從低濃度氨預(yù)處理和糖化的玉米棒子生物質(zhì)生產(chǎn)乙醇以及與高濃度氨預(yù)處理和糖化的秸桿對(duì)比如實(shí)施例3中所述，通過(guò)在Jaygo反應(yīng)器中于93。C預(yù)處理完整的玉米棒子8小時(shí)生產(chǎn)玉米棒子水解產(chǎn)物，所用氨濃度占生物質(zhì)干重的6wt。/。，生物質(zhì)濃度的干重占生物質(zhì)-氨水混合物總重量的40城％。在預(yù)處理之后，在真空下加熱反應(yīng)器至9(TC以除去氨。然后用硫酸調(diào)節(jié)經(jīng)過(guò)預(yù)處理的生物質(zhì)的pH值至5。在Jaygo反應(yīng)器中糖化經(jīng)過(guò)預(yù)處理的生物質(zhì)，生物質(zhì)干重占經(jīng)過(guò)預(yù)處理的生物質(zhì)-糖化酶聚生體混合物總重量的30%，使用28mg/g纖維素Spezyme⑧纖維素酶和28mg/g纖維素Multifect⑧木聚糖酶，于50。C和pH5下糖化168小時(shí)。所得水解產(chǎn)物用于在Sixfors發(fā)酵罐(INFORSAG，Switzerland)中運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌8b的發(fā)酵。運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌8b是一抹已經(jīng)進(jìn)行遺傳工程化的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌，其具有比野生型改善的乙醇生產(chǎn)并被描述在美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2003/0162271Al(實(shí)施例IV、Vl和XII)中。玉米棒子水解產(chǎn)物含有78g/L葡萄糖、51g/L木糖、6g/L乙酰胺和7g/L乙酸。使用40%和80%濃度的玉米棒子水解產(chǎn)物，與其平衡的培養(yǎng)基是濃縮的液體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基由酵母提取物和KH2P04，其含量使其在最終漿液中的濃度分別為約5g/L和2g/L。此外，在40%水解產(chǎn)物漿液中，添加萄萄糖和木糖使其濃度足以與80%水解產(chǎn)物漿液中的濃度相同。發(fā)酵在37。C下進(jìn)行。發(fā)酵罐中的攪拌為100rpm，并且通過(guò)添加2NKOH維持pH值5.5。在表8中顯示了結(jié)果。如一般方法中所述分析糖類和乙醇。為了進(jìn)行比較，如實(shí)施例l中所述，在Zipperclave⑧反應(yīng)器中，于170。C預(yù)處理秸桿5分鐘產(chǎn)生秸桿水解產(chǎn)物，所用氨的濃度為生物質(zhì)干重的35wt%,生物質(zhì)濃度的干重為生物質(zhì)-氨水混合物總重量的約30wty。。對(duì)經(jīng)過(guò)預(yù)處理的生物質(zhì)進(jìn)4于酶消化，生物質(zhì)干重為經(jīng)過(guò)予貞處理的生物質(zhì)-糖化酶聚生體混合物總重量的30%,使用224mg/g纖維素SpezymeCP纖維素酶于50°C和pH5下進(jìn)行，以產(chǎn)生用于發(fā)酵試驗(yàn)的高糖含量的水解產(chǎn)物。所得水解產(chǎn)物包括88g/L葡萄糖、52g/L木糖、9g/L乙酸和15g/L乳酸。為了生產(chǎn)乙醇，對(duì)40%或80%(v/v)水解產(chǎn)物漿液進(jìn)行運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌8b的發(fā)酵。剩余體積由濃縮液體培養(yǎng)基組成，該培養(yǎng)基由酵母提取物、KH2P04和MES緩沖液組成，其含量使其在最終漿液中的濃度分別為約10g/L、2g/L和0.1M。此外，在40%水解產(chǎn)物漿液中，添加定量的葡萄糖和木糖，使其濃度足以與在80%水解產(chǎn)物漿液中的濃度相同。于30。C和pH6下在具有20ml工作容積的25ml搖瓶中進(jìn)行發(fā)酵。在150rpm下維持?jǐn)嚢?。分析玉米棒子水解產(chǎn)物發(fā)酵樣品并且結(jié)果列于表8中。表8:在針對(duì)玉米棒子和秸桿水解產(chǎn)物的發(fā)酵中糖的利用和乙醇產(chǎn)量<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>這些結(jié)果顯示，用從經(jīng)過(guò)低濃度氨預(yù)處理的玉米棒子水解產(chǎn)物的發(fā)酵生產(chǎn)乙醇比用經(jīng)過(guò)高濃度氨預(yù)處理的秸桿的效率更高。實(shí)施例IO從經(jīng)過(guò)極低濃度氨預(yù)處理和糖化的玉米棒子生物質(zhì)生產(chǎn)1,3丙二醇將經(jīng)過(guò)預(yù)處理和糖化的玉米棒子產(chǎn)生的水解產(chǎn)物發(fā)酵以生產(chǎn)1，3-丙二醇。在蒸汽槍反應(yīng)器中預(yù)處理玉米棒子碎片以產(chǎn)生水解產(chǎn)物。首先將玉米棒子生物質(zhì)裝入PEHR(—般方法描述)，施加真空，并注入稀釋的氨水溶液以使氨濃度為4g氨/100g生物質(zhì)千重，生物質(zhì)濃度的千重為30g生物質(zhì)干重/100g總生物質(zhì)-氨水混合物。將裝有氨和玉米棒子的反應(yīng)器容器于4X:旋轉(zhuǎn)30分鐘。將內(nèi)容物轉(zhuǎn)入蒸汽槍反應(yīng)器(一般方法所述)，溫度升高至14VC,并且將混合物維持在該溫度20分鐘。蒸汽槍中的物質(zhì)進(jìn)入閃蒸箱，維持閃蒸箱真空以幫助除去氨。在調(diào)節(jié)pH值之后，將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的生物質(zhì)以30g生物質(zhì)干重/100g經(jīng)過(guò)預(yù)處理的生物質(zhì)-糖化酶聚生體混合物糖化，使用28.4mg/g纖維素Spezyme0@纖維素酶和IO.Img活性蛋白質(zhì)/g纖維素酶聚生體(包括p-葡糖苦酶、木聚糖酶、卩-木糖苦酶和阿拉伯呋喃糖酶)，于5(TC和pH5.5下糖化72小時(shí)。所得水解產(chǎn)物被用作可發(fā)酵糖的來(lái)源，用于通過(guò)重組的大腸桿菌菌抹RJ8npBE93的產(chǎn)物包括甘油(中間代謝物)和1,3-丙二醇。實(shí)驗(yàn)在燒瓶中平行進(jìn)刊-兩次并在24小時(shí)時(shí)分析。在該體系中，水解產(chǎn)物中的葡萄糖轉(zhuǎn)化為甘油和1,3-丙二醇。表9:通過(guò)采用大腸桿菌發(fā)酵的底物利用和產(chǎn)物形成時(shí)間為零時(shí)的液體培養(yǎng)基燒瓶1,24小時(shí)燒瓶2,24小時(shí)葡萄糖(g/L)7.392.122.10甘油(g/L)03.143.141，3—丙二醇(g/L)01.031.07葡萄糖的利用率071%72%實(shí)施例ll在預(yù)處理期間乙酰胺的形成分析經(jīng)過(guò)實(shí)施例3和實(shí)施例4所述方法預(yù)處理的玉米才奉子4f品，以確定生物質(zhì)中乙酰基的走向。如下分析預(yù)處理液(除去不溶性固形物的預(yù)處理混合物)的乙酸和乙酰胺含量。用H2S04(72%)調(diào)節(jié)每份樣品的pH值至約3。對(duì)于乙酰胺的測(cè)量，讓樣品通過(guò)0.2)im過(guò)濾器并根據(jù)下列條件通過(guò)HPLC進(jìn)行分析。對(duì)于總乙酸鹽(包括以乙酸和乙酰胺形式存在的乙酸鹽)的測(cè)量，將酸化樣品于12rC高壓滅菌l小時(shí)；在該步驟期間乙酰胺定量轉(zhuǎn)化為乙酸。在高壓滅菌之后，冷卻樣品。然后使樣品通過(guò)0.2pm過(guò)濾器進(jìn)入樣品小瓶并根據(jù)下列條件進(jìn)行分析。根據(jù)各自產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定乙酸和乙酰胺的濃度。流動(dòng)相0.01NH2SO4,0.2jxm過(guò)濾并脫氣的流速0.6mL/mm柱溫55~65°C檢測(cè)器溫度盡可能接近柱溫檢測(cè)器折射率運(yùn)4亍時(shí)間60分鐘柱具有相應(yīng)保護(hù)柱的BioradAminexHPX表l0:在預(yù)處理期間生物質(zhì)中的乙酰胺向乙?；霓D(zhuǎn)化。DWB,生物質(zhì)的干重(相對(duì)于生物質(zhì)-氨水混合物的總重量計(jì)算百分比)<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>使用6%濃度的氨，幾乎一半乙?；D(zhuǎn)化為乙酰胺，其如實(shí)施例12所示對(duì)生物催化劑生長(zhǎng)無(wú)抑制性。實(shí)施例12乙酰胺和乙酸對(duì)單胞發(fā)酵菌生長(zhǎng)的影響為了測(cè)試乙酰胺和乙酸的毒性，于pH值6.0，在有和沒(méi)有乙酰胺或乙酸條件下，在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌菌抹8b(實(shí)施例9描述)。發(fā)酵培養(yǎng)基由10g/L酵母提取物、2g/LKH2P04、70g/L葡萄糖、40g/L木糖和0.1MMES緩沖液組成。將運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌8b在25在高生物質(zhì)濃度、高溫和極低氨濃度條件下預(yù)處理甘蔗渣，并且以低和高濃度進(jìn)行糖化給不具有研磨介質(zhì)的PEHR(常規(guī)方法中描述)中裝入1.27cm磨碎的甘蔗渣(干重370g)。這些甘蔗渣是NIST參照物質(zhì)RM8491,來(lái)自甘蔗純系H65ND:未確定結(jié)果顯示，與未經(jīng)過(guò)預(yù)處理的對(duì)照相比，使用極低氨濃度預(yù)處理甘蔗渣允許相當(dāng)多的糖釋放，而在PEHR中以高千生物質(zhì)濃度糖化在釋放糖類方面非常有效。實(shí)施例M在高生物質(zhì)濃度、高溫和極低氨濃度條件下預(yù)處理美國(guó)鵝掌楸鋸屑，并且以低和高濃度進(jìn)4亍糖化在不具有研磨介質(zhì)的PEHR中裝入美國(guó)鵝掌楸鋸屑(干重596g;購(gòu)自SawmillerInc.，Haydenville,OH)。向反應(yīng)器容器施加真空，并注入稀釋的氨水溶液以使氨濃度為6g/100g生物質(zhì)干重，并且生物質(zhì)濃度的干重為44g/100g總生物質(zhì)-氨水混合物。如實(shí)施例13中所述，將裝有氨和美國(guó)鵝掌楸鋸屑的反應(yīng)器容器置于4。C,并于4。C旋轉(zhuǎn)30分鐘。這時(shí)，將內(nèi)容物轉(zhuǎn)入蒸汽槍反應(yīng)器。一旦蒸汽槍反應(yīng)器裝入了氨-美國(guó)鵝掌楸混合物，溫度升至145。C并且在該溫度維持混合物20分鐘。在預(yù)處理結(jié)束時(shí)，通過(guò)l英寸圓型沖模從蒸汽槍反應(yīng)器排出美國(guó)鵝掌楸鋸屑，進(jìn)入閃蒸箱。隨后，將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的美國(guó)鵝掌楸鋸屑樣品如實(shí)施例13中所述在搖瓶中糖化，并且將另一個(gè)樣品在PEHR中糖化。以占經(jīng)過(guò)預(yù)處理的生物質(zhì)-糖化酶聚生體混合物總重量5%的生物質(zhì)干重進(jìn)行搖瓶糖化，而以占經(jīng)過(guò)預(yù)處理的生物質(zhì)-糖化酶聚生體混合物總重量30%的生物質(zhì)干重進(jìn)行PEHR糖化(使用干重約279g的經(jīng)過(guò)預(yù)處理的鋸屑)。將未經(jīng)預(yù)處理的美國(guó)鵝掌楸鋸屑也以占經(jīng)過(guò)預(yù)處理的生物質(zhì)-糖化酶聚生體混合物總重量5%的生物質(zhì)干重在搖瓶中糖化。所有糖化均使用28.4mg/g纖維素SpezymeCP⑧纖維素酶和28.4mg/g纖維素Multifect木聚糖酶于50。C和pH值5.5進(jìn)行96小時(shí)。下表12中給出的產(chǎn)量是作為理論產(chǎn)量百分比的每種糖類的釋放量。表12:在美國(guó)鵝掌楸鋸屑的預(yù)處理和糖化之后的產(chǎn)量成分未預(yù)處理5%DWB糖化預(yù)處理5%DWB糖化預(yù)處理30%DWB糖化<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>ND:未確定結(jié)果顯示，與未經(jīng)預(yù)處理的對(duì)照相比，用極低氨濃度預(yù)處理的美國(guó)鵝掌楸鋸屑允許相當(dāng)量的糖類釋放，而在PEHR中以高生物質(zhì)干重進(jìn)行糖化對(duì)纟奪i文糖類比搖弁瓦更有效。實(shí)施例15通過(guò)對(duì)得自極低氨濃度預(yù)處理和糖化的玉米棒子生物盾的水解產(chǎn)物進(jìn)行酵母發(fā)酵來(lái)生產(chǎn)乙醇與實(shí)施例10相同的用于生產(chǎn)1,3-丙二醇的水解產(chǎn)物也用于通過(guò)酵母發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。這些水解產(chǎn)物被用作在搖瓶中通過(guò)野生型釀酒酵母發(fā)酵糖來(lái)源轉(zhuǎn)化為乙醇。以10%(v/v)濃度使用該水解產(chǎn)物，與其平衡的液體培養(yǎng)基包括IOg/L酵母提取物和20g/L蛋白胨。在裝有50mL培養(yǎng)基的250mL擋板燒^f瓦中培養(yǎng)酵母。將培養(yǎng)物于30。C以250rpm振搖培養(yǎng)24小時(shí)。如實(shí)施例9中所述通過(guò)HPLC測(cè)量產(chǎn)生的乙醇量，下表13中列出了兩份燒瓶的結(jié)果。表13:通過(guò)用酵母發(fā)酵的底物利用和產(chǎn)物形成。<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>實(shí)施例16通過(guò)從得自極低氨濃度預(yù)處理和糖化的玉米棒子生物質(zhì)的水解產(chǎn)物進(jìn)行乳酸桿菌發(fā)酵來(lái)生產(chǎn)乳酸與實(shí)施例10相同的用于生產(chǎn)1,3-丙二醇的水解產(chǎn)物也用于在搖瓶中發(fā)酵短乳桿菌來(lái)生產(chǎn)乳酸。以10%(v/v)的濃度使用水解產(chǎn)物，與其平衡的液體培養(yǎng)基包括5g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、2g/L檸檬酸銨、5g/L乙酸鈉、0.1g/LMgS04、0.05g/LMnS04和2g/LK2HP04以及1g/L吐溫。在裝有50mL肉湯的250mL擋板燒瓶中培養(yǎng)乳酸桿菌。于34。C以150rpm振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，重復(fù)培養(yǎng)。如實(shí)施例10中所述通過(guò)HPLC測(cè)量產(chǎn)生的乳酸量并列于表M中。兩個(gè)燒瓶的2份樣品是同樣培養(yǎng)的重復(fù)試驗(yàn)。表14:通過(guò)用短乳桿菌發(fā)酵的底物利用和產(chǎn)i的形成<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>實(shí)施例17以較高的干生物質(zhì)濃度，用極低氨濃度預(yù)處理玉米棒子用顎間距約0.95cm的顎式破碎機(jī)(2.2kW馬達(dá))處理完整的玉米才奉子，繼之以石皮塊才幾(1.5kW馬達(dá)，F(xiàn)ranklmMillerInc.，Livingston,NJ),然后用裝備有1.9cm美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)篩的Sweco篩篩選。將約805g折斷的玉米棒子裝入PEHR。玉米棒子的水分含量為約7%。在裝料之前用氮?dú)鉀_洗反應(yīng)器容器中的空氣5次。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將不具有研磨介質(zhì)的反應(yīng)器預(yù)熱至75r,不旋轉(zhuǎn)。當(dāng)反應(yīng)器容器內(nèi)溫度穩(wěn)定在75。C時(shí)，開(kāi)啟保溫箱內(nèi)的旋轉(zhuǎn)機(jī)構(gòu)并調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速到19rpm。然后向反應(yīng)器注入合適量的稀釋的氨水溶液以使氨濃度為6g氨/100g生物質(zhì)干重，并且固形物濃度為50g生物質(zhì)干重/100g生物質(zhì)-氨混合物總重量。還向溶液添加lg/100g生物質(zhì)干重的乙醇。將氨溶液泵過(guò)加熱至75。C的水浴中的使用2加侖的Parr反應(yīng)器制造的加熱環(huán)。通過(guò)注入噴管向反應(yīng)器容器中注入加熱的稀釋的氨水溶液，并在反應(yīng)器中噴涂旋轉(zhuǎn)并滾動(dòng)的折斷的玉米棒子。將反應(yīng)器維持在75。C持續(xù)2小時(shí)，同時(shí)以19卬m旋轉(zhuǎn)。結(jié)束時(shí)，向反應(yīng)器容器施加真空(約85kPa)30分鐘以除去氨，并將反應(yīng)器內(nèi)容物的溫度降至約50。C。然后將二氧化碳注入反應(yīng)器以解除真空，并用C02將反應(yīng)器加壓至103kPa表壓并于該壓力在50。C維持30分鐘。之后，將反應(yīng)器卸壓，打開(kāi)并添加研磨介質(zhì)。4吏用注入噴管注入pH值為4.8的1M檸檬酸緩沖液并添加檸檬酸一水化物，以增加檸檬酸緩沖液濃度至75mM,將內(nèi)容物的pH值調(diào)節(jié)至約5.5。并非所有氨均在真空步驟中被除去，也沒(méi)有被C02中和。在加熱至50。C之后，將檸檬酸緩沖液注入反應(yīng)器，然后將反應(yīng)器于50。C和19rpm保溫l小時(shí)以使內(nèi)容物平衡。在使用注入噴管注入檸檬酸緩沖液的同時(shí)，旋轉(zhuǎn)反應(yīng)器使得緩沖液更均勻地噴灑并分布在經(jīng)過(guò)預(yù)處理的玉米棒子顆粒上。從保溫箱取出反應(yīng)器，打開(kāi)，測(cè)定樣品的pH值。如果pH值大于5.5,那么額外添加固體檸檬酸一水化物，并將反應(yīng)器于攪拌下在50。C再保溫一小時(shí)。重復(fù)這些步驟直至pH值為約5.5。一旦達(dá)到所需的pH值，將12.9mg/g纖維素SpezymeCP(Genencor)和5mg活性蛋白質(zhì)/g纖維素酶聚生體(包括(3-葡糖苷酶、木聚糖酶、P-木糖苷酶和阿拉伯呋喃糖酶)裝入反應(yīng)器。將反應(yīng)器置于保溫箱，在5(TC19rpm下持續(xù)72小時(shí)。在這些預(yù)處理和糖化之后，單體葡萄糖的產(chǎn)量是62.0%并且單體木糖的產(chǎn)量是31.0%?？偲咸烟钱a(chǎn)量是75.2%并且總木糖產(chǎn)量是80.3%。實(shí)施例18以較高的固形物濃度，用極低濃度的氨和替換條件預(yù)處理玉米棒子用錘磨機(jī)(IO英寸錘磨機(jī)，GlenMillsInc.,Clifton,NH)處理完整的玉米棒子，使其通過(guò)1.27cm篩。將約805g折斷的玉米棒子裝入PEHR。玉米棒子的水分含量為約7%。向反應(yīng)器中添加22個(gè)陶資磨碎圓筒(直徑3.2cmx長(zhǎng)3.2厘米；E.R.AdvancedCeramics,EastPalestine,OH)。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將反應(yīng)器預(yù)熱至95。C,不旋轉(zhuǎn)。在開(kāi)始之前，向反應(yīng)器容器施加真空(約85kPa)并密封容器。當(dāng)反應(yīng)器容器內(nèi)溫度穩(wěn)定在95。C時(shí)，開(kāi)啟保溫箱內(nèi)的旋轉(zhuǎn)機(jī)構(gòu)并調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速到19rpm。然后向反應(yīng)器內(nèi)注入合適量的稀釋的氨水溶液以使氨濃度為6g氨/100g生物質(zhì)干重，并且固形物含量為50g生物質(zhì)干重/100g生物質(zhì)-氨混合物總重量。將氨溶液泵過(guò)在沸水浴中的使用2加侖Parr反應(yīng)器制成的加熱環(huán)。通過(guò)注入噴管向反應(yīng)器容器注入加熱的稀釋的氨水溶液，并在反應(yīng)器中噴涂旋轉(zhuǎn)并滾動(dòng)的折斷的玉米棒子。將反應(yīng)器維持在95。C持續(xù)2小時(shí)，同時(shí)以19rpm轉(zhuǎn)動(dòng)。在結(jié)束時(shí)，向反應(yīng)器容器施加真空(約85kPa)30分鐘以除去氨，并將反應(yīng)器內(nèi)容物的溫度降至約50。C。然后將二氧化碳注入反應(yīng)器以解除真空，并且將反應(yīng)器加壓至103kPa表壓并于該壓力在50。C維持30分鐘。之后，降低反應(yīng)器壓力，打開(kāi)，并注入pH值為4.8的添加并溶有檸檬酸一水化物的1M檸檬酸緩沖液，將內(nèi)容物的pH值調(diào)節(jié)至約5.5。在加熱至5(TC之后，將檸檬酸緩沖液注入反應(yīng)器，然后將反應(yīng)器于50。C和19rpm保溫1小時(shí)以使內(nèi)容物平衡。在使用注入噴管注入檸檬酸緩沖液的同時(shí)，旋轉(zhuǎn)反應(yīng)器，使得緩沖液更均勻地噴灑并分布在經(jīng)過(guò)預(yù)處理的玉米f奉子顆粒上。從保溫箱取出反應(yīng)器，打開(kāi)，測(cè)定樣品的pH值。如果pH值大于5.5,那么額外添加固體檸檬酸一水化物，并將反應(yīng)器于攪拌下在50。C再保溫一小時(shí)。重復(fù)這些步驟直至pH值為約5.5。一旦達(dá)到所需pH值，將12.9mg/g纖維素SpezymeCP(Genencor)和5mg活性蛋白質(zhì)/g纖維素酶聚生體(包括P-葡糖苷酶、木聚糖酶、p-木糖苷酶和阿拉伯呋喃糖酶)裝入反應(yīng)器。將反應(yīng)器置于保溫箱，在50。C和19rpm下持續(xù)72小時(shí)。在這些預(yù)處理和糖化之后，單體葡萄糖產(chǎn)量是50.7%并且單體木糖產(chǎn)量是35.7%?？偲咸烟钱a(chǎn)量和總木糖產(chǎn)量分別是71.7%和89.8%。實(shí)施例19用極低濃度的氨和額外的堿預(yù)處理玉米棒子用顎間距為約0.95cm的顎式破碎機(jī)(2.2kW馬達(dá))處理完整的玉米棒子，繼之以破塊機(jī)(1.5kW馬達(dá)，F(xiàn)ranklinMillerInc.)處理,然后用裝備有1.9cm美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)篩的Sweco篩篩選。將約460g折斷的玉米^奉子裝入PEHR。玉米棒子的水分含量為約7%。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將反應(yīng)器預(yù)熱至95°C，不旋轉(zhuǎn)。在開(kāi)始之前，向反應(yīng)器容器施加真空(約85kPa)并密封容器。當(dāng)反應(yīng)器容器內(nèi)溫度再次穩(wěn)定在95。C時(shí)，開(kāi)啟保溫箱內(nèi)的旋轉(zhuǎn)機(jī)構(gòu)并調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速到19rpm。然后向反應(yīng)器注入合適量的氨水溶液以使氨濃度為3.2g氨/100g生物質(zhì)干重，注入NaOH使得達(dá)到1.9gNaOH/100g生物質(zhì)干重，同時(shí)維持固形物含量為30g生物質(zhì)干重/100g生物質(zhì)-氨混合物總重量。將氨和額外的堿性溶液泵過(guò)在沸水浴中，的使用2加侖Parr反應(yīng)器制造的加熱環(huán)。通過(guò)注入噴管將加熱的稀釋的氨水溶液注入反應(yīng)器容器，并在反應(yīng)器中噴涂旋轉(zhuǎn)并滾動(dòng)的折斷的玉米棒子。在注入之后，解除容器真空至大氣壓。將反應(yīng)器維持在95。C持續(xù)30分鐘，然后將溫度降低至85。C并維持4小時(shí)。在結(jié)束時(shí)，向反應(yīng)器容器施加真空(約85kPa)30分鐘以除去氨，并將反應(yīng)器內(nèi)容物的溫度降至約50。C。然后將二氧化碳注入反應(yīng)器以解除真空，并且將反應(yīng)器加壓至103kPa表壓并在該壓力于WC下維持30分鐘。之后，降低反應(yīng)器壓力，打開(kāi)，并注入約75mlpH值為4.8的添加并溶有檸檬酸一水化物的1M檸檬酸緩沖液，將內(nèi)容物的pH值調(diào)節(jié)至約5.5。在加熱至50。C之后，將檸檬酸緩沖液注入反應(yīng)器，然后將反應(yīng)器于50。C和19rpm下保溫1小時(shí)以使內(nèi)容物平衡。在使用注入噴管注入檸檬酸緩沖液的同時(shí)旋轉(zhuǎn)反應(yīng)器，使得緩沖液更均勻地噴灑并分布在經(jīng)過(guò)預(yù)處理的玉米棒子顆粒上。從保溫箱取出反應(yīng)器，打開(kāi)，測(cè)定樣品的pH值。如果pH值大于5.5,那么額外添加固體檸檬酸一水化物，并將反應(yīng)器于攪拌下在5(TC再保溫一小時(shí)。重復(fù)這些步驟直至pH值為約5.5。一旦達(dá)到所需的pH值，將28.4mg/g纖維素SpezymeCP(Genencor)和28.4mg/g纖維素Multifect裝入反應(yīng)器。將反應(yīng)器置于保溫箱，在50X:和19rpm下持續(xù)72小時(shí)。在這些預(yù)處理和糖化之后，單體葡萄糖產(chǎn)量是56.1%并且單體木糖產(chǎn)量是39.5%?？偲咸烟钱a(chǎn)量和總木糖產(chǎn)量分別是82.8%和84.2%。這些數(shù)值是2次實(shí)驗(yàn)的平均值。實(shí)施例20室溫和極低濃度氨預(yù)處理用顎間距約3/8英寸的顎式破碎機(jī)(2.2kW馬達(dá))處理完整的玉米棒子，繼之以破塊機(jī)(1.5kW馬達(dá)，F(xiàn)ranklinMillerInc.)處理，然后用裝備有1.9cm美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)篩的Sweco篩篩選。將約460g折斷的玉米棒子裝入PEHR。玉米才奉子的水分含量為約7%。還向反應(yīng)器中添加22個(gè)陶瓷磨石爭(zhēng)圓筒(直徑3.2cmx長(zhǎng)3.2厘米；E.R.AdvancedCeramics,EastPalestine,OH)。在開(kāi)始之前，向反應(yīng)器容器施加真空(約85kPa)并密封反應(yīng)器。當(dāng)反應(yīng)器內(nèi)溫度再次穩(wěn)定在室溫時(shí)(22權(quán)利要求1.一種生產(chǎn)來(lái)源于生物質(zhì)的目標(biāo)化學(xué)物質(zhì)的方法，包括a)使生物質(zhì)與含氨的水溶液接觸，其中氨的濃度至少足以維持生物質(zhì)-氨水混合物的堿性pH值，但是其中所述氨的存在量小于生物質(zhì)干重的約12wt％，并且進(jìn)一步，其中生物質(zhì)的干重處于占生物質(zhì)-氨水混合物重量的至少約15wt％的高固形物含量下；b)在適于生產(chǎn)可發(fā)酵糖的條件下，使步驟(a)的產(chǎn)物與糖化酶聚生體接觸；以及c)在合適的發(fā)酵的條件下，使步驟b)的產(chǎn)物與至少一種能發(fā)酵糖類以生產(chǎn)目標(biāo)化學(xué)物質(zhì)的生物催化劑接觸。2.權(quán)利要求l所述的方法，其中同時(shí)進(jìn)行步驟(b)和(c)。3.權(quán)利要求1所述的目標(biāo)化學(xué)物質(zhì)，選自酸類、醇類、烷烴、烯烴、芳香族化合物、醛類、酮類、生物聚合物、蛋白質(zhì)、肽、氨基酸、維生素、抗生素和藥物。4.權(quán)利要求l所述的方法，其中目標(biāo)化學(xué)物質(zhì)選自甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇、乙二醇、丙二醇、丁二醇、甘油、赤蘚醇、木糖醇、山梨糖醇、乙酸、乳酸、丙酸、3-羥基丙酸、丁酸、葡#唐酸、衣康酸、檸檬酸、琥珀酸、乙酰丙酸、谷氨酸、天冬氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸、甘氨酸、精氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甲烷、乙烯、丙酮和工業(yè)酶。5.權(quán)利要求4所述的方法，其中目標(biāo)化學(xué)物質(zhì)是乳酸、丙二醇或乙醇。6.權(quán)利要求l所述的方法，其中所述的至少一種生物催化劑選自細(xì)菌、絲狀真菌和酵母。7.權(quán)利要求l所述的方法，其中至少一種生物催化劑選自野生型、空變型或重組的埃希氏菌屬、發(fā)酵單胞菌屬、念珠菌屬、釀酒酵母屬、畢赤氏酵母屬、鏈霉菌屬、芽孢桿菌屬、乳桿菌屬和梭狀芽胞桿菌屬。8.權(quán)利要求l所述的方法，其中所述至少一種生物催化劑選自重組的大腸桿菌、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、釀酒酵母、熱纖梭菌、解糖耐熱厭氧桿菌和樹(shù)干畢赤酵母。9.權(quán)利要求l所述的方法，其中生物質(zhì)-氨水混合物的pH值大于8。10.權(quán)利要求l所述的方法，其中在使生物質(zhì)與含氨的水溶液接觸之前，向生物質(zhì)施加真空。11.權(quán)利要求l所述的方法，其中所述生物質(zhì)干重處于至少約15%~約80%的高固形物含量下。12.權(quán)利要求ll所述的方法，其中所述生物質(zhì)干重處于至少約15%~約60%的高固形物含量下。13.權(quán)利要求l所述的方法，其中所述的氨的存在量小于生物質(zhì)干重的約10wt0/0。14.權(quán)利要求13所述的方法，其中所述的氨的存在量為生物質(zhì)干重的約6%或更小。15.權(quán)利要求l所述的方法，其中生物質(zhì)選自生物能農(nóng)作物、農(nóng)業(yè)殘留物、城市固體廢物、工業(yè)固體廢物、庭院廢物、木材和森林廢物。16.權(quán)利要求l所述的方法，其中生物質(zhì)選自柳枝稷、廢紙、造紙淤泥、玉米顆粒、玉米纟奉子、玉米皮、玉米秸桿、草、小麥、麥桿、干草、大麥、大麥稈、稻草、甘蔗渣、高粱、大豆、從加工谷物得到的組分、樹(shù)木、樹(shù)枝、根苗、葉、木材碎片、鋸屑、灌木和灌木叢、蔬菜、水果、花和牲畜糞。17.權(quán)利要求16所述的方法，其中生物質(zhì)選自玉米棒子、玉米秸桿、玉米皮、甘蔗渣、鋸屑、柳枝稷、麥桿、干草、大麥稈、稻草和草。18.權(quán)利要求17所述的方法，其中生物質(zhì)選自玉米棒子、玉米秸桿、鋸屑和甘蔗渣。19.權(quán)利要求l所述的方法，其中氨選自氨氣、氨水、尿素及其組合。20.權(quán)利要求1所述的方法，其中(a)是在約4'C200。C的溫度下進(jìn)行的。21.權(quán)利要求20所述的方法，其中(a)是在約75。C~15(TC的溫度下進(jìn)行的。22.權(quán)利要求21所述的方法，其中(a)是在大于90。C~15(TC的溫度下進(jìn)行的。23.權(quán)利要求l所述的方法，其中最多進(jìn)行(a)約25小時(shí)。24.權(quán)利要求23所述的方法，其中最多進(jìn)行(a)約8小時(shí)。25.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中在(b)之前除去至少一部分(a)中的氨。26.權(quán)利要求25所述的方法，其中將來(lái)自(a)的氨循環(huán)。27.權(quán)利要求l所述的方法，其中(b)的接觸是在至少約15%的生物質(zhì)干重濃度下進(jìn)行的。28.權(quán)利要求l所述的方法，其中將(a)、(b)或(a)和(b)重復(fù)至少一次。29.權(quán)利要求l所述的方法，進(jìn)一步包括在(a)中添加至少一種增塑劑、軟化劑或其組合。30.權(quán)利要求29所述的方法，其中所述的至少一種增塑劑、軟化劑或其組合選自多元醇、多元醇酯、乙二醇醚、乙酰胺、乙醇和乙醇胺。31.權(quán)利要求l所述的方法，進(jìn)一步包括在(a)之前或期間、在(b)之前或期間或其組合中施加能量。32.權(quán)利要求31所述的方法，其中所述能量選自碾磨、壓碎、磨碎、扭斤碎、切碎、圓盤(pán)精煉、超聲和微波。33.權(quán)利要求l所述的方法，其中在糖化之前使用來(lái)自發(fā)酵的二氧化碳來(lái)調(diào)節(jié)預(yù)處理混合物的pH值。34.權(quán)利要求l所述的方法，其中所述糖化酶聚生體包括至少一種糖苷酶。35.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述糖化酶聚生體包括至少一種選自纖維素水解糖苷酶、半纖維素水解糖苷酶、淀粉水解糖苦酶、肽酶、脂肪酶、木質(zhì)酶和阿魏酰酯酶的酶。36.權(quán)利要求l所述的方法，其中所述糖化酶聚生體包括至少一種選自纖維素酶、葡聚糖內(nèi)切酶、外切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、p-葡糖苷酶、木聚糖酶、木聚糖內(nèi)切酶、外切木聚糖酶、卩-木糖苦酶、阿拉伯木聚糖酶、甘露聚糖酶、半乳糖酶、果膠酶、葡糖苦酸酶、淀粉酶、a-淀粉酶、(3-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、a-葡糖苦酶、異淀粉酶的酶。37.權(quán)利要求1所述的方法，其中(b)是在約15°C~約100。C的溫度下和約2~約11的pH值下進(jìn)行的。專利摘要使用生物催化劑生產(chǎn)目標(biāo)化學(xué)物質(zhì)，所述生物催化劑能夠發(fā)酵來(lái)源于生物質(zhì)的糖類。通過(guò)在高固形物和低氨濃度的條件下預(yù)處理生物質(zhì)，繼之以糖化而獲得了糖類。文檔編號(hào)C12P1/00GKCN101160405SQ200680012124公開(kāi)日2008年4月9日申請(qǐng)日期2006年4月12日發(fā)明者J·B·鄧森,M·特克,R·埃蘭德,S·亨尼西申請(qǐng)人:納幕爾杜邦公司導(dǎo)出引文BiBTeX,EndNote,RefMan