專利名稱：:與急性排異反應(yīng)有關(guān)的impdh2snp的制作方法與急性排異反應(yīng)有關(guān)的IMPDH2SNP本發(fā)明涉及用于腎移植急性排異反應(yīng)的標(biāo)記。腎移植術(shù)常與移植物的急性排異反應(yīng)有關(guān)。有利的是鑒定免疫調(diào)節(jié)基因內(nèi)允許預(yù)測(cè)個(gè)體移植后不良后果風(fēng)險(xiǎn)的基因多態(tài)性，以及預(yù)測(cè)哪些患者更易于發(fā)生副作用和/或哪些患者可能發(fā)展成更嚴(yán)重的病態(tài)及腎衰竭。此外，由于靼內(nèi)和藥物的生物合成途徑及代謝途徑內(nèi)的遺傳變異可以影響個(gè)體對(duì)療法的反應(yīng)，故與霉酚酸酯(MMF)或環(huán)孢菌素A(CsA)代謝有關(guān)的基因多態(tài)性將可用作標(biāo)記以預(yù)測(cè)對(duì)療法的反應(yīng)。本發(fā)明以IMPDH2(肌苷一磷酸脫氫酶2)基因座內(nèi)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)(T3757C)與腎移植排異反應(yīng)的聯(lián)系為基礎(chǔ)。該基因座對(duì)應(yīng)于SeqIDNo.l的位置3757。SeqIDNo.1代表IMPDH2基因的外顯子1至13。在此位置內(nèi)的多態(tài)性由IMPDH2基因座的內(nèi)含子7中核苷酸T替換為C組成。IMPDH2是活化的淋巴細(xì)胞內(nèi)GMP從頭O/e柳v0)合成的限速酶。它的活性與細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)，并且IMPDH2是眾多已證實(shí)及實(shí)驗(yàn)性藥物(包括MMF)療法的靶。MPA是在口月良施用藥物MMF(MPA的2-嗎啉代乙酯)后水解產(chǎn)生的活性代謝物；MPA有效地、選擇性地和可逆地抑制IMPDH2。IMPDH2表達(dá)的改變與移植排異反應(yīng)有關(guān)(Vannozzi等，TransplantProc.2004,36(9),2787-2790)。本發(fā)明涉及在本文中證實(shí)與急性腎移植排異反應(yīng)有關(guān)的先前未知的IMPDH基因多態(tài)性。所述的多態(tài)性位于SeqIDNo.1的位置3757處的核苷酸，其中在此位置的T由C替換。因此，包含位置3757處的核苷酸T由C替換的SeqIDNo.1的分離的核酸分子及其片段預(yù)示著患者對(duì)急性腎移植排異反應(yīng)的易感性。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含位置3757處的核苷酸T由C替換的SeqIDNo.l的分離核酸分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及包含SeqIDNo.1的片段的分離的核酸分子，其中所述的片段包括SeqIDNo.l的位置3757并且在位置3757處的核苷酸T由C替換。本發(fā)明還涉及用于評(píng)估患者內(nèi)急性腎移植排異反應(yīng)的易感性的方法，包括a)從已經(jīng)自患者中取出的樣品內(nèi)分離核酸，和b)檢測(cè)SEQIDNo.1的位置3757處的核苷酸，其中在此位置存在C預(yù)示著有腎移植排異反應(yīng)，c)任選地檢測(cè)一種或多種用于預(yù)測(cè)急性腎移植排異反應(yīng)的其它標(biāo)記。所述任選的一種或多種標(biāo)記可以是存在于其它基因內(nèi)的多態(tài)性。優(yōu)選地，以上方法的步驟c)包括檢測(cè)在Seq.IDNo.5的位置176處的核普酸(C3435T)，其中在此位置存在T預(yù)示著有腎移植排異反應(yīng)，和/或包括檢測(cè)在Seq.IDNo.6的位置682處的核苷酸(-592C〉A(chǔ))，其中在此位置存在A預(yù)示著有腎移植排異反應(yīng)。SeqIDNo.5為人多藥耐藥性1基因(MDR1)的外顯子26。SeqIDNo.6為人白細(xì)胞介素IO(ILIO)基因的啟動(dòng)子區(qū)。優(yōu)選地，用于以上方法的樣品是全血。所述的樣品還可以是血清或血漿?？梢酝ㄟ^適用于基因分型的任意方法開展對(duì)本文此前所述核苷酸的檢測(cè)。在以上所述的IMPDH核酸序列內(nèi)的多態(tài)性存在可以通過差異性核酸分析技術(shù)如限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析、使用質(zhì)鐠法對(duì)PCR產(chǎn)物的直接質(zhì)量分析、直接分析侵入性切割產(chǎn)物、基于延伸的技術(shù)如ARMSTM(擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng))、ALEXTM(擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)線性延伸)和COPS(竟?fàn)幮怨押塑账嵋l(fā)系統(tǒng))、OLA(寡核苷酸連接測(cè)定)、4仏者分析法、直接的序列分析或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析加以確定。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，方法是雙脫氧測(cè)序法。一個(gè)更優(yōu)選的方法是熱循環(huán)測(cè)序法。為了檢測(cè)上述的IMPDH多態(tài)性，在最優(yōu)選的實(shí)施方案，所述的測(cè)序使用SeqIDNo.10和SeqIDNo.11的引物開展。檢測(cè)任一多態(tài)性的核苷酸的優(yōu)選方法是定量PCR。在更優(yōu)選的實(shí)施方案，所述的方法是使用僅與一個(gè)等位基因退火而不與另一個(gè)等位基因退火的等位基因特異性引物的等位基因特異性定量PCR。一種這樣的定量PCR是動(dòng)態(tài)熱循環(huán)法(KTC)。一個(gè)更優(yōu)選的檢測(cè)方法是與KTC結(jié)合的擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)(ARMS)，這允許在單管內(nèi)區(qū)分單核苷酸多態(tài)性(SNP)，而不使用熒光探針(Higuchi等，Biotechnology(1993)，11,1026-1030)。為了用以上所述的方法額外任選地檢測(cè)IL10多態(tài)性，在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用SeqIDNo.2和SeqIDNo.3的等位基因特異性引物和SeqIDNo.4的共同引物開展所述的等位基因特異性PCR。為了額外任選地檢測(cè)以上所述的MDR1多態(tài)性，最優(yōu)選的實(shí)施方案包括使用SeqIDNo.7和SeqIDNo.8的等位基因特異性引物和SeqIDNo.9的共同引物開展等位基因特異性PCR。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟c)內(nèi)的額外檢測(cè)包括檢測(cè)MDR1多態(tài)性和IL10多態(tài)性。可以在相同或另外的反應(yīng)混合物內(nèi)開展本文此前所述方法的步驟c)內(nèi)額外任選的檢測(cè)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域眾所周知的多種差異性核酸分析技術(shù)中的任一技#測(cè)樣品中與正常序列不同的核酸序列的存在。差異性核酸分析技術(shù)包括但不限于熒光原位(/"s/似)雜交(FISH)、直接DNA測(cè)序、單鏈構(gòu)象分析(SSCP)、DNA印跡法(包括限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(RFLP))、聚合#^式反應(yīng)(PCR)、多態(tài)性特異性寡核苷酸雜交及PCR-SSCP分析、單核苷酸引物延伸和寡核苷酸連接法。用于評(píng)估和操作核^列和M,列的技術(shù)綜述見CurrentProtocolsInMolecularBiology,第I-III巻,FrederickM.Ausubel等編輯，1995。雜交方法包括但不限于反向點(diǎn)印跡法、基因芯片微陣列法、DASH、PNA及LNA探針、TaqMan和分子信標(biāo)法；等位基因特異性PCR包括但不限于嵌入染料法、FRET引物法和AlphaScreen;引物延伸法包括但不限于SNP流/GBA(遺傳比特分析法)、多重農(nóng)l型測(cè)序法/SNaPshot、焦磷酸測(cè)序法、MassEXTEND/MassArray、GOOD分析法、微陣列miniseq/APEX(排列的引物延伸法)、微陣列引物延伸法、'Tag，陣列法、編碼的微球、TDI(模板定向摻入)/熒光極化法；寡核苷酸連接法包括但不限于比色性O(shè)LA(寡核苷酸連接測(cè)定)、序列編碼的OLA、微陣列連接法、連接酴漣式反應(yīng)、padlock探針、滾環(huán)擴(kuò)增法；內(nèi)切核酸酶切割法包括但不限于限制性位點(diǎn)分析和侵入者分析法。這些方法在Syvanen,NatureRevGenet2，2001,930-942內(nèi)描述并且在本文中引用作為參考。用于高度的標(biāo)記復(fù)雜性的Multiplex平臺(tái)包括但不限于珠基多重基因分型、用于基因分型的高密度微陣列、再測(cè)序平臺(tái)、基于微陣列的差異性基因表達(dá)分析。這些方法在Koch,NatureRevDrugDiscovery3，2004，749-761內(nèi)描述并且在本文中引用作為參考。也可以使用以上所列方法的組合(例如作為非限制的實(shí)例，分子倒置探針和在陣列上雜交的組合，Hardenbol等，Nat.Biotechnol.2003,21，673-678)。眾多的方法可以用來直接檢測(cè)DNA序列變異。直接DNA測(cè)序(手工測(cè)序或自動(dòng)熒光測(cè)序)可以檢測(cè)序列變異。除雙脫氧測(cè)序法以外，也可以使用焦磷酸測(cè)序法?？梢允褂贸Ｒ?guī)技術(shù)克隆待檢驗(yàn)個(gè)體中IMPDH2區(qū)域內(nèi)的基因的等位基因。例如，從個(gè)體中獲得血液樣品，將IMPDH2基因組DNA從該樣品內(nèi)的細(xì)胞中分離并連接至用于擴(kuò)增的適宜載體內(nèi)。測(cè)定這些克隆的序列并與正常IMPDH2序列比較。本領(lǐng)域眾所周知涉及DNA克隆和測(cè)序的技術(shù)，見例如CurrentProtocolsInMolecularBiology,第1巻，第7單元，F(xiàn)rederickM.Ausubul等編輯，1995。檢測(cè)DNA序列內(nèi)變異的另一種方法是單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)(Orita等，1989)。該方法不檢測(cè)全部的序列變化，尤其DNA片M寸大于200bp時(shí)，但是可以加以優(yōu)化以檢測(cè)最多的DNA序列變異。檢測(cè)靈敏度降低是缺點(diǎn)，但是用SSCP可能增加通量，這使其成為直接測(cè)序法的有吸引力、有效的替代用于基于研究的多態(tài)性檢測(cè)。對(duì)SSCP凝膠上具有變動(dòng)的遷移率的片段進(jìn)行測(cè)序以確定DNA序列變異的確切本質(zhì)?；跈z測(cè)兩條互補(bǔ)DNA鏈間錯(cuò)配的其它方法包括變性梯度凝膠電泳(CDGE)(Sheffield等，Am.J.Hum.Genet"49:699-706(1991))、異質(zhì)性雙鏈體分析(NA)(Mite等，Genomics12:301-306(1992))和化學(xué)錯(cuò)配切割(CMC)(Grompe等，P.N.A.S.86:5855-5892(1989))?？梢詸z測(cè)這些類型多態(tài)性的其它方法如蛋白質(zhì)截短分析法或非對(duì)稱分析法僅檢測(cè)特殊類型的多態(tài)性并且不檢測(cè)錯(cuò)義多態(tài)性。可以在Grompe等，NatureGenetics5:111-117,(1993)和Landegren等，GenomeResearch8:769-776,(1998)等最近的綜述內(nèi)找到對(duì)檢測(cè)DNA序列變異的目前可用方法的綜述?？梢允褂肦TLP開展檢測(cè)DNA序列內(nèi)多態(tài)性的快速初步分析，其中DNA用一種或多種限制酶、優(yōu)選用多種限制酶切割并用IMPDH2特異性探針在一系列DNA印跡內(nèi)進(jìn)行分析。每一印跡含有一系列正常個(gè)體和一系列具有異常骨形成的病例。顯示雜交性片段(當(dāng)用多態(tài)性基因座附近或包括多態(tài)性基因的序列探測(cè)時(shí)，該片段與對(duì)照DNA的長(zhǎng)度不同)的DNA印跡指示可能的多態(tài)性。本領(lǐng)域眾所周知涉及RFLP的技術(shù)，見例如CurrentProtocolsInMolecularBiology,第1巻,第2單元，F(xiàn)rederickM.Ausubul等編輯，1995。的分析方法。具體而言，通過單純地使用來自IMPDH2的多個(gè)區(qū)域作為探針，技術(shù)人員可以對(duì)核酸樣品評(píng)估本文中乂i^開的IMPDH2T3757C多態(tài)性，所分離的接近的序列。見例如Ueghara等，Mamm.Genome1(2):92-99(1991)。特別優(yōu)選的使用聚合酶推動(dòng)性擴(kuò)增的核酸分析方法是聚合im式反應(yīng)(PCR)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和其它聚合酶推動(dòng)性擴(kuò)增分析法可以通過使用聚合酶推動(dòng)性擴(kuò)增循環(huán)實(shí)現(xiàn)超過百萬倍地增加拷貝數(shù)。一旦被擴(kuò)增，得到的核酸可以通過限制性內(nèi)切核酸酶消化得到分析、測(cè)序或用作DNA探針的底物。當(dāng)包含特定多態(tài)性的序列已知時(shí)，可以產(chǎn)生靶向這些序列的多種PCR引物。例如，分布在多態(tài)性序列側(cè)翼的序列可以用來擴(kuò)增這些多態(tài)性序列。作為序列特異性PCR的變例，可以使用在引物3，端與IMPDH2T3757C多態(tài)性雜交的引物。如果特定的多態(tài)性不存在，則》見察不到擴(kuò)增產(chǎn)物。如在歐洲專利申請(qǐng)公開號(hào)0332435及在Newton等，1989中公開，也可以使用擴(kuò)增阻滯多態(tài)性系統(tǒng)(ARMS)。也可以用基于正常IMPDH2區(qū)域內(nèi)的任何序列的引物對(duì)開展PCR。例如，可以制備和利用針對(duì)諸內(nèi)含子之一的引物對(duì)。隨后使用常規(guī)技術(shù)，通過單鏈構(gòu)象多態(tài)性法(SSCP)分析擴(kuò)增的產(chǎn)物以鑒定任意差異，并且隨后對(duì)這些產(chǎn)物測(cè)序并與正?；蛐蛄羞M(jìn)行比較。其它合適的擴(kuò)增方法包括連接酴漣式反應(yīng)(LCR)(見Wu和Wallace,G*eow,cs4:560(1989),Landegren等，5We"ce241:1077(1988)、轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增(Kwoh等，iVoc.iV"汰爿cflrf.5W.(75^486:1173(1989)),和自我維持的序列復(fù)制法(Guatelli等，iVoc.TVfltJaw/.CAS^87:1874(1990))以;S^于核酸的序列擴(kuò)增法(NASBA)。后兩種擴(kuò)增方法涉及基于等溫轉(zhuǎn)錄的等溫反應(yīng)，在這兩種擴(kuò)增方法中分別以約30:1或100:1的比率產(chǎn)生單鏈RNA(ssRNA)和雙鏈DNA(dsDNA)作為擴(kuò)增產(chǎn)物。本發(fā)明的引物對(duì)用于利用PCR確定特定IMPDH2序列的核苷酸序列。例如，單鏈DNA引物對(duì)可以與IMPDH2序列內(nèi)或周圍的序列退火以便引發(fā)基因自身的擴(kuò)增性DNA合成。一組完整的這些引物允許合成編碼基因序列的全部核苷酸。引物組優(yōu)選地允許合成內(nèi)含子序列和外顯子序列。此夕卜，也可以使用等位基因特異性引物。這類引物與其中T3757替換為C的IMPDH2等位基因退火，并且因此僅在作為模板的突變性等位基因存在時(shí)才擴(kuò)增產(chǎn)物。還可以使用等位基因特異性探針篩選通過利用PCR擴(kuò)增的IMPDH2區(qū)域的DNA序列。這些探針是核酸寡聚物，每種探針含有攜帶T3757C多態(tài)性基因序列的區(qū)域。例如，一種寡聚物可以是約20個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，其對(duì)應(yīng)于IMPDH2多態(tài)性序列的部分?？梢岳缭谀猃埬ど祥_展等位基因特異性探針與所擴(kuò)增IMPDH2序列的雜交。在嚴(yán)格雜交條件下與特檢測(cè)多態(tài)性的另一種優(yōu)先應(yīng)用的方法包括使用質(zhì)鐠法。在含有IMPDHT3757C多態(tài)性的DNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，用在目的多態(tài)性上游一個(gè)堿基結(jié)尾的引物開展內(nèi)部引物延伸反應(yīng)。引物延伸反應(yīng)中僅使用雙脫氧三磷酸核苷(ddNTP)，引物將僅通過代表多態(tài)性的一個(gè)堿基被延伸。用MALDI-TOF(基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間)質(zhì)i普直接測(cè)定受延伸的引物的確切質(zhì)量并且雜合子產(chǎn)生可清楚區(qū)分的2個(gè)峰。還可以通過質(zhì)鐠法或通過基于焚光的方法檢測(cè)侵入性切割產(chǎn)物。單核苷酸多態(tài)性(SNP)基于特定的結(jié)構(gòu)特異性內(nèi)切核酸酶(切割酶)識(shí)別(由特異性雜交產(chǎn)生的)特定DNA結(jié)構(gòu)的能力得到檢測(cè)。設(shè)計(jì)與靶DNA雜交的侵入探針和標(biāo)記信號(hào)探針，以至于侵入探針與信號(hào)探針重疊至少一個(gè)代表SNP位點(diǎn)的4^&。信號(hào)-探針靶的這種侵入取代了含有標(biāo)記物的單鏈翼。在該翼與被部分侵入的雙鏈體間的交接處由所述酶在切割位點(diǎn)的互補(bǔ)性4^處識(shí)別并切割，釋》文信號(hào)探針的未雜交區(qū)域。對(duì)切割片段的檢測(cè)可以如上新的信號(hào)探針發(fā)生雜交并且該過程重復(fù)進(jìn)行，以至于切割的信號(hào)探針積累。因此信號(hào)在該方法中得到擴(kuò)增并且這種擴(kuò)增增加本技術(shù)的整體靈敏度。反過來，含有數(shù)種多態(tài)性的寡核苷酸可以被固定在尼龍膜上("SNP帶，，)并與多重PCR反應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行雜交,其中所述的產(chǎn)物從用于等位基因特異性雜交的個(gè)體的DNA內(nèi)獲得(Cheng等，Clin.Chem.Lab.Med.(1998)36(8):561-566,RMS,Alameda)。大部分以上所述的分析法包含核酸探針作為重要基本構(gòu)成。當(dāng)使用探針來檢測(cè)耙序列的存在時(shí)，可以處理待分析的生物樣品如血液或血清以提取核酸。如以上所討論，樣品核酸可以以多種促進(jìn)檢測(cè)耙序列的方式制備，例如變性、限制性消化、電泳或點(diǎn)印跡。分析物核酸內(nèi),皮靼向的區(qū)域通常必須是至少部分單鏈的，以便與探針的靶向性序列形成雜交體。若序列天然是單鏈時(shí)，則不需要變性。然而，若序列是雙鏈的，則可能需要一^f列變性?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域內(nèi)已知的多種技術(shù)實(shí)施變性。靼核酸、^:針和分析物可以在促進(jìn)探針內(nèi)靼序列與分析物內(nèi)被靼向的假定序列形成穩(wěn)定雜交體的條件下進(jìn)行溫育?？梢允褂脕硗治鑫锝Y(jié)合的探針的區(qū)域與人IMPDH2基因的被耙向區(qū)域完全互補(bǔ)。因此為了防止假陽(yáng)性，需要高嚴(yán)格性條件。然而，僅當(dāng)探針與基因組內(nèi)獨(dú)特的染色體區(qū)域互補(bǔ)時(shí)才使用高嚴(yán)格性條件。雜交的嚴(yán)格性由雜交期間及洗滌過程期間的眾多因素決定，包括溫度、離子強(qiáng)度、堿基組成、探針長(zhǎng)度和甲酰胺濃度。這些因素例如在Maniatis等，MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringsHarborLaboratory,1982和Sambrook等，1989中概述。在某些環(huán)境下，可能需要形成更高級(jí)的雜交體(如三聯(lián)體、四聯(lián)體等)以提供檢測(cè)耙序列的手段。如本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地認(rèn)識(shí)到，核酸雜交除了受堿基組成、互補(bǔ)鏈的長(zhǎng)度和雜交核酸之間的核苷酸4^J^錯(cuò)配數(shù)影響之外，其還受如鹽濃度、溫度或有機(jī)溶劑等條件的影響。嚴(yán)格的溫度條件通常包括超過30。C，一般超過37。C并且優(yōu)選超過45。C的溫度。嚴(yán)格的鹽條件通常少于1000mM，一般少于500mM并且優(yōu)選少于200mM。然而，參數(shù)的組合將比任意單個(gè)參數(shù)的量值重要得多。探針序列還可以與雙鏈體DNA在形成三聯(lián):體或其它更高級(jí)的DNA復(fù)合物的某些條件下特異性雜交。本領(lǐng)域眾所周知此類探針的制備和合適的雜交條件。通常通過利用標(biāo)記探針完成對(duì)得到的雜交體(若存在)的檢測(cè)?；蛘?，探針可以不做標(biāo)記，但是可以通過與標(biāo)記的配體直接或間接特異性結(jié)合而可檢測(cè)。本領(lǐng)域內(nèi)已知合適的標(biāo)記物和用于標(biāo)記探針及配體的方法，并且包括例如可以通過已知方法(例如缺刻翻譯、隨機(jī)引發(fā)或激酶法)引入的放射活性標(biāo)記物、生物素、熒光基團(tuán)、化學(xué)發(fā)光基團(tuán)(例如二氧環(huán)丁烷、特殊觸發(fā)的二氧環(huán)丁烷)、酶、抗體等。本領(lǐng)域內(nèi)已知此種基本方案的變例，包括促進(jìn)從外界材料中分離待檢測(cè)的雜交體的那些變例和/或擴(kuò)增來自標(biāo)記部分的信號(hào)的那些變例。這些眾多變例在例如Matthews和Kricka，Anal.Biochem.，169:1，1988;Landegren等，Science,242:229,1988;Mittlin，1989;美國(guó)專利4,868,105并在EPO公開號(hào)225,807內(nèi)綜述?？梢酝ㄟ^用多核苷酸探針的雜交來檢測(cè)具有與急性腎移植排異反應(yīng)有關(guān)多態(tài)性的核酸序列，其中所述的多核苷酸探針與靼序列在嚴(yán)格雜交至中等嚴(yán)格雜交和洗滌條件下形成穩(wěn)定的雜交體。本發(fā)明允許設(shè)計(jì)優(yōu)先與多態(tài)性區(qū)域雜交的探針。本領(lǐng)域眾所周知設(shè)計(jì)優(yōu)先靶向特異性序列的探針以及使用探針的雜交務(wù)H1。見例如CurrentProtocolsInMolecularBiology,第I-III巻，F(xiàn)rederickM.Ausubel等編輯，1995。例如，若預(yù)期探/lf將與乾序列完全互補(bǔ)，則使用嚴(yán)*件。若預(yù)期存在一些錯(cuò)配，例如若預(yù)期存在變體以至于探針將不與耙序列完全互補(bǔ)，則可以降低雜交嚴(yán)格性。選擇排除非特異性/偶然性結(jié)合的條件以使噪音最小化。探針可以包括與標(biāo)記物或報(bào)道分子連接的分離的多核苷酸并可以用來通過標(biāo)準(zhǔn)方法分離與目的序列具有序列相似性或接近的其它多核苷酸序列。對(duì)于用來制備并標(biāo)記探針的技術(shù)，見例如Sambrook等，1989或Ausubel等，1992?？梢酝ㄟ^使用同源的多核苷酸選擇其它相似的多核苦酸。包含本發(fā)明的合成性寡核苷酸或其它多核苷酸的探針可以衍生自天然存在的或重組的單鏈或雙鏈多核苷酸，或可以化學(xué)性合成。探針也可以通缺刻翻譯、Klenow補(bǔ)平反應(yīng)或本4頁(yè)域內(nèi)已知的其它方法而標(biāo)記。本領(lǐng)域眾所周知設(shè)計(jì)具有合適大小和用于優(yōu)先與靶特異性序列結(jié)合的序列的探針以及使用這些探針的雜交條件。見例如，CurrentProtocolsInMolecularBiology,第1巻，第2、4和6單位，F(xiàn)rederickM.Ausubel等編輯，1995。優(yōu)選多核苷酸序列中如此部分作為探針，其中所述的部分具有來自多態(tài)性序列的至少約8個(gè)核苷酸、通常至少約15個(gè)核苷酸并且小于約6kb、通常小于約1.0kb。還考慮了具有多態(tài)性序列中特定部分的探針。此外，接近于多態(tài)性區(qū)域的探針也可以在評(píng)估核酸樣品中使用。如上所述，在本發(fā)明中考慮了眾多基于非PCR的篩選分析法。一種方法將核酸探針(或類似物，如替換正常磷酸二酯的甲基磷酸酯主鏈)與低濃度存在的靶DNA雜交。這種探針可以具有與探針共價(jià)連接的酶，而共價(jià)連接不干擾雜交的特異性。1^可以從游離的探針酶綴合物中分離這種酶-探針-綴合耙核酸復(fù)合物并添加用于酶檢測(cè)的底物。酶活性觀察為引起靈敏度增加的顯色改變或發(fā)光產(chǎn)量改變。對(duì)于涉及制備寡脫氧核苷酸-堿性磷酸酶綴合物及其用作雜交探針的實(shí)例，見Jablonski等，N.A.R.,14:6115-6128,1986。本領(lǐng)域內(nèi)已知兩步驟標(biāo)記物擴(kuò)增方法。這些分析法以如此原理工作，即小配體(如地高辛、生物素等)與能夠特異性結(jié)合IMPDH2基因區(qū)域序列的核酸探針連接。還考慮了處于該實(shí)例范圍內(nèi)的等位基因特異性探針，并探針。在一個(gè)實(shí)例中，與核酸探針連接的小配體由抗體-酶綴合物特異性識(shí)別。在該實(shí)例的一個(gè)實(shí)施方案中，地高辛與核酸探針連接。雜交通過與堿性磷酸酶綴合物綴合的抗地高辛抗體檢測(cè)。堿性磷酸酶修飾隨后可加以檢測(cè)的化學(xué)發(fā)光底物。用于根據(jù)本實(shí)施方案對(duì)核酸探針標(biāo)記的方法見Martin等，BioTechniques9:762-768，19卯。在第二個(gè)實(shí)例中，小配體通過能夠與第一配體特異性復(fù)合的第二種配體-酶綴合物識(shí)別。本實(shí)例的眾所周知實(shí)施方案是生物素-抗生物素蛋白型相互作用。用于核酸探針標(biāo)記的方法及該核酸探針在基于生物素-抗生物素蛋白的分析法中用途，見Nguyen等,BioTechniques13:116-123,1992。在本發(fā)明范圍還考慮了本發(fā)明的核酸探針分析法將使用能夠檢測(cè)IMPDH2、IL10和MDR1多態(tài)性的核酸探針組合。因此，在檢測(cè)細(xì)胞樣品內(nèi)多態(tài)性的存在的一個(gè)實(shí)例中，使用多于一種同的核酸探針序列。該混合物包括能夠與在該區(qū)域中具有變異的患者群體內(nèi)的已鑒定等位基因特異性多態(tài)性相結(jié)合的探針。在這個(gè)實(shí)施方案中，可以使用任何數(shù)目的探針并且所述探針優(yōu)選地包括與具有急性腎移植排異反應(yīng)的患者內(nèi)的主要多態(tài)性相對(duì)應(yīng)的探針。檢測(cè)以上所述的多態(tài)性的任一方法也可以用于任選地檢測(cè)IL10多態(tài)性或MDR1多態(tài)性。"多核苷酸"和"核酸，，指單鏈或雙鏈分子，所述的分子可以是由核苷酸堿基A、T、C和G構(gòu)成的DNA或由威基A、U(T的取4戈物)、C和G構(gòu)成的RNA。多核苷酸可以代表編碼鏈或其互補(bǔ)鏈。多核苷酸分子可以在序列上與天然存在的序列相同或可以包括編碼如與在天然存在序列內(nèi)所存在氨基酸相同的氨基酸的替代性密碼子(見Lewin"GeneV"OxfordUniversityPress第7章，笫171-174頁(yè)(1994)。此外，多核苷酸分子可以包括代表如所述的氨基酸連續(xù)置換的密碼子。多核普酸可以代表基因組DNA或cDNA。核酸還可以是合成產(chǎn)生的DNA(例如PCR擴(kuò)增產(chǎn)物)。"特異性雜交"如本文中所用指第一核酸以如此方式與第二核酸雜交以至于第一核酸不與除第二核酸以外的任意核酸雜交的能力(例如，當(dāng)?shù)谝缓怂崤c第二核酸的相似性比與其中待開展雜交的樣品內(nèi)的任意其它核酸的相似性更高時(shí))。用于雜交的"嚴(yán)格性條件"是本領(lǐng)域的術(shù)語(yǔ)，該術(shù)語(yǔ)指溫育條件和洗滌射卜，例如，允許特定核酸與第二核酸雜交的溫度及緩沖液濃度條件；第一核酸可以與第二核酸完全(即100%)互補(bǔ)，或第一核酸和第二核酸可以共有一定程度的低于完全互補(bǔ)性的互補(bǔ)性(例如70%、75%、85%、95%)。例如，可以使用將完全互補(bǔ)性核酸與互補(bǔ)性較低的核酸區(qū)分開的某些高嚴(yán)格性^f^。在C""rmifiVo組.o/sfViAfo/eew/fir歷o/。gy(Ausubel，F(xiàn).M.等，iV她co/s/wM(0/"/"f必/o/ogv"，JohnWiley&Sons，(2001))內(nèi)的第2.10.1-2.10.16頁(yè)和第6.3.1-6.3.6頁(yè)中描述了用于核酸雜交的"高嚴(yán)格性條件"、"中等嚴(yán)格性條件"和"低嚴(yán)格性條件"，其中所述文獻(xiàn)的全部教導(dǎo)在本文引用作為參考。決定雜嚴(yán)格性的確切條件不僅取決于離子強(qiáng)度(例如0.2xSSC、O.lxSSC)、溫度(例如室溫、42°C、68。C)和去穩(wěn)定劑(如甲酰胺)或變性劑(如SDS)的濃度，還取決于如此因素，如核^列的長(zhǎng)度、堿基組成、雜交序列之間的錯(cuò)配百分?jǐn)?shù)和該序列的亞部分在其它不相同序列內(nèi)的出現(xiàn)頻率。因此，可以如此確定等效^Hf，即通過變動(dòng)這些參數(shù)中的一種或多種參數(shù)，同時(shí)維持同一性的相似程度或兩種核酸分子之間的相似性。通常，使用這樣的條件，以至于彼此至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或至少約95%或更高程度相同的序列仍然相互雜交。通過將雜交條件從不發(fā)生雜交的嚴(yán)格性水平變動(dòng)至最先觀察到雜交的水平，可以確定允許給定序列與樣品內(nèi)的最相似序列(例如選擇性地)雜交的條件。在Krause，M.H.和S.A.Aaronson，Me幼o(hù)f/s五wg;挑0/ogy200:546-556(1991)中并在Ausubel等，"CWr^細(xì)toc^/wMo/"w/ffr楊/柳",JohnWiley&Sons,(2001)中描述了示例性條件，其中所述文獻(xiàn)描述了對(duì)用于中等嚴(yán)格性或低嚴(yán)格性條件的洗滌條件的確定。洗滌是這樣的步驟，其中通常設(shè)定條件以至于確定最低水平的雜交體互補(bǔ)性。通常，從仗發(fā)生同源雜交的最低溫度開始，終末洗滌溫度每降低一度(維持ssc濃度恒定)允許雜交序列間的最大程度錯(cuò)配增加1%。通常地，SSC濃度加倍導(dǎo)致Tm降低17。C。使用這些原則，根據(jù)所要求的錯(cuò)配水平，可以經(jīng)驗(yàn)地確定用于高嚴(yán)格性、中等嚴(yán)格性或低嚴(yán)格性洗滌溫度。例如，低嚴(yán)格性洗滌可以包括在含有0.2xSSC/0.1%SDS的溶液內(nèi)于室溫洗滌10分鐘；中等嚴(yán)格性洗滌可以包括在含有0.2xSSC/0.1%SDS的預(yù)溫(42。C)溶液內(nèi)于42。C洗滌15分鐘；并且高嚴(yán)格性洗滌可以包括在含有O.lxSSC/0.1%SDS的預(yù)溫(68。C)溶液內(nèi)于68。C洗滌15分鐘。此外，如本領(lǐng)域內(nèi)已知，可以重復(fù)或依次地開展洗滌以獲得所需要的結(jié)果。如本領(lǐng)域內(nèi)已知，可以如此確定等效條件，即通過變動(dòng)作為實(shí)例給出的參數(shù)中的一個(gè)或多個(gè)|*,同時(shí)維持同一性的相似程度或M酸分子與所用引物或探針之間的相似性。本發(fā)明還提供包含如此片段或部分的分離的核酸分子，其中所述的片段或部分包含在SeqIDNo.l的位置3757處的C并且與其中在位置3757處的T由C替換的SeqIDNo.l或其互補(bǔ)鏈在高度嚴(yán)*件下雜交。本發(fā)明的核酸片段是至少約15個(gè)、優(yōu)選至少約18、20、23或25個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，并且可以是30、40、50、100、200個(gè)或更多個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。作為非限制性實(shí)例，這樣的一個(gè)片段可以是包含SeqIDNo.l位置3497至3938的序列的核酸，其中位置3757處的核苦酸T由C替換。這樣的片段還可以是本文此前所述的探針或引物。在相關(guān)的方面，使用本發(fā)明的核酸片段作為分析方法(如本文中所述那些分析方法)中的探針或引物。"探針"或"引物，，是以堿基特異性方式與核酸分子的互補(bǔ)鏈雜交的寡核苷酸。此類探針和引物包括如Nielsen等，5Wew"254:1497-1500(1991)內(nèi)所述的多肽核酸。探4十或引物包含與核酸分子的至少約15個(gè)例如約20-25個(gè)并且在某些實(shí)施方案中約40、50或75個(gè)連續(xù)核苦酸雜交的核苦酸序列區(qū)域，其中所述的核酸分子包含來自其中在位置3757處的T由C替換的SeqIDNo.l的連續(xù)核普i^列。除以上所述的探針或引物之外，任選地可以使用衍生自SeqlDNo.5或6的此類探針。本發(fā)明的核酸分子(如上述那些核酸分子)可以使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)和本文中提供的序列信息進(jìn)行鑒定并分離。例如，可以使用基于SeqIDNo.1、5或6或該序列互補(bǔ)鏈所設(shè)計(jì)的合成性寡核苷酸引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增并分離核酸分子。通常參見PC/r"Awo/ogv:/V/""》/esflwd々/7//cflftVws/orZX/V/i^4附/7/折cflri卵(編者H.A.Erlich，F(xiàn)reemanPress,NY，NY，1992);PC//Vo似co/s:^Gw,VfctoM^oA朋d々/i/z'cfl^附(編者Innis等，AcademicPress,SanDiego，CA，19卯)；Mattila等，Nucl.AcidsRes.19:4967(1991);Eckert等，PC及M^/^rfs1:17(1991);PCR(編者M(jìn)cPherson等，IRLPress,Oxford)和美國(guó)專利4,683,202。核酸分子可以使用cDNA、mRNA或基因組DNA作為才莫板得到擴(kuò)增、克隆至適宜栽體內(nèi)并通過DNA序列分析進(jìn)行表征。為開展用于評(píng)估患者內(nèi)對(duì)急性腎移植排異反應(yīng)的易感性的方法，本發(fā)明還涉及試劑盒，其包括用于檢測(cè)IMPDH基因內(nèi)T3757C多態(tài)性的至少一種試劑、描述才艮據(jù)任意方法的步驟的說明書(其中所述的方法用于評(píng)估本文此前所述對(duì)急性腎移植排異反應(yīng)的易感性)和用于試劑盒內(nèi)容物的容器。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于檢測(cè)IMPDH基因內(nèi)T3757C多態(tài)性的至少一種試劑包含核酸，其中所述核酸能夠與SeqIDNo.l的核酸或其中在位置3757處的核苷酸T由C替換的SeqIDNo.l的核酸特異性雜交。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的用于檢測(cè)IMPDH2基因內(nèi)T3757C多態(tài)性的至少一種試劑包含在嚴(yán)^件下與SeqIDNo.1雜交并且可以用于對(duì)包括位置3757的SeqIDNo.1的部分進(jìn)行雙脫氧測(cè)序的核酸引物。此類核酸可以是SeqIDNo.10和/或11的核酸。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，試劑盒額外地包含檢測(cè)MDR1基因內(nèi)C3435T多態(tài)性和/或IL10基因內(nèi)-592C>A多態(tài)性的至少一種試劑。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，試劑盒包含SeqIDNo.lO至ll和/或7至9和/或2至4的核酸。實(shí)施例實(shí)施例1群體描述在536位參與CAESAR臨床研究的患者中的同意進(jìn)行本文中所述藥物遺傳學(xué)研究的237位白種人移植患者群體內(nèi)開展分析。CAESAR是為期12個(gè)月的開放的受控的多中心前瞻性研究，該研究的設(shè)計(jì)目的是在原發(fā)性腎同種異體移植受者內(nèi)評(píng)估腎功能、移植物存活及患者存活和活組織檢查證實(shí)的急性排異反應(yīng)(BPAR)。主要目的是通過減少或取消環(huán)孢菌素的使用而使腎毒性最小化并改善長(zhǎng)期腎功能和移植物存活，同時(shí)沒有不利地影響效力?；颊咴谝浦睬半S機(jī)分至3個(gè)組的1組內(nèi)。(1)達(dá)克珠單抗(dac)、霉酚酸酯(MMF)、糖皮質(zhì)激素(CS)、低劑量環(huán)孢菌素(CsA)隨后減量(第4月)和撤藥(第6月)；(2)dac、MMF、CS、低劑量CsA;(3)MMF、CS、標(biāo)準(zhǔn)劑量CsA。選擇患者提交藥物遺傳學(xué)研究方案和知情同意表至各自國(guó)家的當(dāng)?shù)貍惱韺W(xué)委員會(huì)以獲得批準(zhǔn)。向全部患者提供他們的血液樣品將用于基因分型的書面形式知情同意書。如果患者改變主意，樣品可以在至多一個(gè)月后抽取。賦予全部樣品新的獨(dú)立編碼，并且在收集樣品一個(gè)月后，取消新編碼和原始編碼間的聯(lián)系。這是確保患者隱私的額外措施；然而，其結(jié)果是不可能基于原始臨床試驗(yàn)中所用的患者姓名或編號(hào)而提取基因型信息。接近15年時(shí)間時(shí)，毀掉全部血液樣品和DNA樣品。才羊品的制備在EDTA管中收集單份血液樣品(9ml)。在送到瑞士巴塞爾的RocheCentralSampleOffice(CSO)前，這些血液樣品于-20。C至-70。C之間冷凍并貯藏，血液樣品在cso等分至三個(gè)管內(nèi)并在條碼標(biāo)簽上賦予新的獨(dú)立編碼以確保患者匿名。兩份血液樣品(lml和4ml)送到瑞士巴塞爾羅氏醫(yī)學(xué)基因組學(xué)中心(RocheCenterforMedicalGenomics(RCMG))的RocheSampleR印ository(RSR)。其余的4ml等分試樣在瑞士巴塞爾的CSO于-80。C貯藏。使用GCP指南，根據(jù)已建立的標(biāo)準(zhǔn)^^作步驟在RSR完成在樣品上所開展的全部步驟。使用基于硅膠的提取方法(MagNAPureLCDNAIsolationKITI,RocheMolecularBiochemicals)從200pi全血中提取DNA。樣品4吏用針對(duì)MDRl和IL10內(nèi)SNP的擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)(ARMS)與對(duì)IMPDH2內(nèi)SNP的測(cè)序分析的組合對(duì)兩種不同單核苷酸多態(tài)性(SNP)進(jìn)行基因分型，其中所述的擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)根據(jù)Newton等，NucleicAcidsRes.(1989)，17(7)，2503-16依賴于PCR引物與進(jìn)行擴(kuò)增的模板之間的3，末端錯(cuò)配。通過使用擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)(ARMS，NucleicAcidsRes.(1989),17(7)，2503-16)和使用聚合il^式反應(yīng)的動(dòng)態(tài)熱循環(huán)儀(KTC)模式開展對(duì)DNA內(nèi)兩個(gè)點(diǎn)突變的分析。該方法允許在單管內(nèi)區(qū)分單核普酸多態(tài)性(SNP),而不使用熒光探針(Higuchi等，Biotechnology(1993)，11，1026-1030)。在KTC模式下，使用DNA嵌入染料和連接有熒光檢測(cè)CCD照相機(jī)在i火和變性的每個(gè)循環(huán)中測(cè)量PCR擴(kuò)增^板每孔內(nèi)的熒光。將其中相對(duì)熒光達(dá)到使用來自PE-Biosystems的SDS軟件所計(jì)算的0.5閾值的循環(huán)定義為Ct。將擴(kuò)增反應(yīng)i殳計(jì)成等位基因特異性的，以至于如果多態(tài)性存在，則擴(kuò)增反應(yīng)是陽(yáng)性的，并且若多態(tài)性不存在，則擴(kuò)增反應(yīng)是陰性的。對(duì)于雙重等位基因多態(tài)性，將擴(kuò)增平板的一個(gè)孔設(shè)定成對(duì)等位基因l是特異性的并且將第二孔設(shè)定成對(duì)等位基因2是特異性的。對(duì)于待檢測(cè)的每種多態(tài)性，設(shè)計(jì)三個(gè)引物一兩個(gè)等位基因特異性引物和一個(gè)共同引物(表3)。用于等位基因l的反應(yīng)含有等位基因l特異性引物和共同引物，而用于等位基因2的反應(yīng)含有等位基因2特異性引物和共同引物。表l:用于多態(tài)性檢測(cè)的寡核苷酸引物列表<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>對(duì)于IL10和MDR1擴(kuò)增條件如下50mMTrispH8.0,50mMKCl，3mMMgC12,50拜每種dATP、dCTP和dGTP,25nm的TTP和75nm的dUTP，4%DMSO,2nMROX(^羅丹明)0.1xSyBrGreen(MolecularProbs，Eugene,OR),2%甘油，尿嘧啶N-糖基化酶(UNG,2單位)，DeltaZ05GoldDNA聚合酶(3單位)，和在每孔20nl體積內(nèi)的引物。用于每種分析法的引物濃度列于表1。IC^每孔添加5pl體積內(nèi)的5ngDNA。為降低預(yù)先存在的擴(kuò)增產(chǎn)物污染的可能性，分析步驟包括將dUTP引入擴(kuò)增產(chǎn)物和用于UNG降解預(yù)先存在的含U產(chǎn)物的溫育步驟(Longo等，Gene(19卯)，93,125-128)。使用等分機(jī)器裝置(Tecan)在通過由實(shí)驗(yàn)室管理數(shù)據(jù)庫(kù)所產(chǎn)生的條碼標(biāo)記標(biāo)定的384-孔擴(kuò)增平板內(nèi)準(zhǔn)備擴(kuò)增反應(yīng)物。設(shè)定用于機(jī)械裝置所開展的步驟參數(shù)以使交叉污染的可能性最小化。對(duì)于具有81個(gè)樣品的每個(gè)平板，重復(fù)運(yùn)行5個(gè)樣品并且分析重復(fù)的結(jié)果以確定它們相符。熱循環(huán)條件如下50°C2分鐘用于UNG降解先前任意的污染性PCR產(chǎn)物，95。C12分鐘用于DeltaZ05GoldDNA聚合酶活化，45個(gè)循環(huán)在95。C變性和在表l內(nèi)所示的退火溫度上退火，隨后為從60。C至95。C以1度遞增1分鐘的解離步驟。擴(kuò)增反應(yīng)在ABIGeneAmp7卯0序列檢測(cè)系統(tǒng)儀器上運(yùn)行。解離曲線的一階導(dǎo)數(shù)由SDS軟件產(chǎn)生并根據(jù)需要進(jìn)行檢驗(yàn)，以確證給定反應(yīng)內(nèi)的熒光是因?yàn)閿U(kuò)增了具有充分定義的解離峰的特異性產(chǎn)物，而非擴(kuò)增非特異性引物二聚體。按照K.M.Ririe等，Anal.Biochem.(1997),245，154-160的方法，通過分析PCR期間的DNA解鏈曲線實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物區(qū)分。確定每個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)閾值Ct并且使用等位基因1的Ct和等位基因2的Ct之間的差異(ACt)作為分析結(jié)果。具有-3.0與3.0間的ACt的樣品視為是雜合的(A1/A2)。具有低于-3.0的ACt的樣品視為Al純合的(A1/A1);具有高于3.0的ACt的樣品視為A2純合的(A2/A2)。在大多數(shù)情況下，充分地定義三組基因型之間的ACt差異并且再檢驗(yàn)作為偏差的具有接近于3.0的Ct值的樣品。每種分析在一組47種細(xì)胞系DNA上實(shí)施，以鑒定在每種分析平板(A1/A1、Al/A2和A2/A2)內(nèi)用作對(duì)照的具有合適基因型的細(xì)胞系。細(xì)胞系DNA從CorrielInstitute獲得并使用Qiagen提取試劑盒(QiaAmpDNA血液試劑盒，Valencia,CA)提取。通過DNA測(cè)序證實(shí)細(xì)胞系DNA的基因型。三種細(xì)胞系DNA(A1/A1、Al/A2和A2/A2)作為臨床試驗(yàn)樣品的每個(gè)平板內(nèi)的對(duì)照運(yùn)行并且用來確定平板間變異性。分析由對(duì)照細(xì)胞系所獲得的Ct值以確定用于對(duì)臨床試驗(yàn)樣品所獲得的Ct值的截?cái)嘀?。含有每孔Ct值的數(shù)據(jù)文件由SDS軟件產(chǎn)生并輸入實(shí)驗(yàn)管理數(shù)據(jù)庫(kù)。從該數(shù)據(jù)庫(kù)中提取具有由獨(dú)立編碼所確定的最終基因型的數(shù)據(jù)文件并與也由獨(dú)立編碼所確定的臨床數(shù)據(jù)匹配用于統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)于IMPDH2，使用ABI毛細(xì)管測(cè)序儀和BigDye化學(xué)(ABI)，通過雙鏈DNA測(cè)序完成單核苷酸多態(tài)性(SNP)基因分型。用來擴(kuò)增外顯子7/內(nèi)含子7邊界的引物示于表l內(nèi)并也用作測(cè)序引物。使用公眾可獲得的基因組序列作為引物i殳計(jì)的參考。用這套引物對(duì)耙向全部多態(tài)性。引物IL10-5920AAS1對(duì)應(yīng)于IL10啟動(dòng)子序列內(nèi)的如SEQIDNO:l內(nèi)位置所定義的位置668至682。引物IL10-5920AAS2對(duì)應(yīng)于IL10啟動(dòng)子序列內(nèi)的如SEQIDNO:l內(nèi)位置所定義的位置668至682。引物IL10-5920A共同引物對(duì)應(yīng)于IL10啟動(dòng)子序列內(nèi)的如SEQIDNO:l內(nèi)位置所定義的位置708至685的互補(bǔ)鏈并與其雜交。引物MDR1C3435TAS1對(duì)應(yīng)于MDR1的外顯子26內(nèi)的如SEQIDNO:5內(nèi)位置所定義的位置193至176的互補(bǔ)鏈并與其雜交。引物MDR1C3435TAS2對(duì)應(yīng)于MDR1的外顯子26內(nèi)的如SEQIDNO:5內(nèi)位置所定義的位置194至176的互補(bǔ)鏈并與其雜交。引物MDR1C3435T共同引物對(duì)應(yīng)于MDR1的外顯子26內(nèi)的如SEQIDNO:5內(nèi)位置所定義的位置154至。引物IMPDH2T3757CF對(duì)應(yīng)于IMPDH2的內(nèi)含子6內(nèi)的如SEQIDNO:6內(nèi)位置所定義的位置3938至3919的互補(bǔ)鏈并與其雜交。引物IMPDH2T3757CR對(duì)應(yīng)于IMPDH2的內(nèi)含子8內(nèi)的如SEQIDNO:6內(nèi)位置所定義的位置3497至3516。對(duì)于IMPDH2PCR，在20/d反應(yīng)中使用MJresearchTetradPCR儀PCR擴(kuò)增20ng基因組DNA。如下是用于擴(kuò)增IMPDH2片段的條件50mMTrispH8.3，10mMKCl，1.5mMMgC12，0.2mM每種dNTP，0.4pM每種引物和0.6UAmpliTaqGold聚合酶。熱循環(huán)方案組成如下95。C初始溫育15分鐘，隨后是94°C1分鐘、61。C30秒、72。C1分鐘的35個(gè)循環(huán)和72。C持續(xù)5分鐘的一個(gè)終末延伸步驟。擴(kuò)增后，PCR擴(kuò)增片段使用MilliporePCRCleanup平板在Temaybiorobot上純化。使用ABIBigDye終止劑化學(xué)，根據(jù)制造商說明在MJTetradPCR儀上開展循環(huán)測(cè)序。測(cè)序后，使用Polyphred軟件(經(jīng)華盛頓大學(xué)許可)完成多態(tài)性分析。實(shí)施例2單變量snp分析首先對(duì)每種多態(tài)性開展分析。在對(duì)處理組性別和年齡(作為兩類變量編碼，<=50y，〉50y)調(diào)整后，使用對(duì)數(shù)回歸模型評(píng)估BPAR(活組織檢查證實(shí)的急性排異>^應(yīng))發(fā)生率與每種多態(tài)性之間的聯(lián)系。使用基因型檢驗(yàn)法(Sasieni1997)檢驗(yàn)在對(duì)每種多態(tài)性的基因型與BPAR發(fā)生率之間不存在聯(lián)系的假設(shè)。該檢驗(yàn)法U因型與BPAR發(fā)生率之間的獨(dú)立檢驗(yàn)，該獨(dú)立檢驗(yàn)在MDR1C3435T和IL10-5920A的情況下遵循具有2個(gè)自由度的卡方。對(duì)于IMPDH2T3757C，C/C純合組與C/T基因型合并，因?yàn)樵摻M僅含有2位個(gè)體。因此，這種基因型檢驗(yàn)僅具有自由度df1。將該基因型檢驗(yàn)的I型4I^設(shè)定為0.05并且不對(duì)多重比較做調(diào)整。對(duì)于MDR1C3435T多態(tài)性，還開展等位基因趨勢(shì)檢驗(yàn)法(Sasieni，1997)以檢驗(yàn)等位基因的這種多態(tài)性與BPAR發(fā)生率之間不存在聯(lián)系。等位基因趨勢(shì)檢驗(yàn)法檢驗(yàn)等位基因1的存在與BPAR發(fā)生率之間的獨(dú)立性。計(jì)算相應(yīng)的優(yōu)勢(shì)比及其95%置信區(qū)間(見下表)。對(duì)于IMPDH2T3757C，計(jì)算相應(yīng)的優(yōu)勢(shì)比((C/CUC/T)對(duì)T/T)及其相對(duì)的95%置信區(qū)間。對(duì)于IL10-592OA，通過將C/C和A/C基因型合并，還計(jì)算隱性編碼檢驗(yàn)，因?yàn)橥ㄟ^基因型檢!Hi實(shí)在具有這些基因型的患者中發(fā)生BPAR的比率極其相似。計(jì)算具有l(wèi)df的相應(yīng)卡方，以及與A/C或C/C基因型比較，計(jì)算與A/A基因有關(guān)的BPAR的優(yōu)勢(shì)比。如表2中所示，使用基因分型檢驗(yàn)法，全部3種多態(tài)性均是顯著性的。^kffZXH2C等位基因的存在增加BPAR發(fā)生的優(yōu)勢(shì)達(dá)幾乎3倍(優(yōu)勢(shì)比(OR)2.99,95%CI:1.27-6.99;p=0.012);T等位基因的存在幾乎使優(yōu)勢(shì)加倍(OR1.98，95%CI:1.24-3.14;p=0.004);幾20A等位基因的存在與接近5倍的較高優(yōu)勢(shì)有關(guān)(OR4.76，95。/。CI:1.59-14.26;p=0.005)。對(duì)這三種多態(tài)性，沒有檢測(cè)到處理組與基因型之間的顯著相互作用。_表2:單變量藥物遺傳學(xué)的分析結(jié)果_MDR1C3435Tsupn基因型(％)T/T_^_^_6420(37.7)35(29.9)9(16.1)16233(62.3)82(70.1)47(83.9)基因型檢驗(yàn)法x^6.60,df=2,p=0.037等位基因趨勢(shì)檢驗(yàn)法x^8.32，df-l,p=0.004等位基因ORT對(duì)C=1.98[1.24;3.14IMPDH2T3757Csnpn基因型(％)__T/CUC/C__BPAR事件6113(46.4)48(24.9)非BPAR事件16015(53.6)145(75.1)基因型檢驗(yàn)法^=5.69，df=l,p=0.017OR{T/CUC/C〉對(duì)TT=2.99[1.27;6.99BPAR事件非BPAR事件IL10-592OAsnpn基因型(％)息A/CC/CBPAR事件6010(55.6)18(25.0)32(25.2)非BPAR事件1578(44.4)54(75.0)95(74.8)基因型檢驗(yàn)法X^7.64，df=2，p=0.022隱性編碼檢驗(yàn)法(A/A對(duì)(A/CUC/C})，X^7.87，df=l，p=0.005ORA/A對(duì)(A/CUC/C}=4.76[159;14.26說明n:每組樣品大小OR優(yōu)勢(shì)比(事件的優(yōu)勢(shì)；非事件的優(yōu)勢(shì))[OR的95%置信區(qū)間];基因型檢驗(yàn)法、等位基因趨勢(shì)檢驗(yàn)法、隱性編碼檢驗(yàn)法見正文；df:自由度；p:p-值；BPAR:活組織檢查證實(shí)的急性排異反應(yīng)；df:自由度。實(shí)施例3多變量snp分析三種顯著性多態(tài)性(見表2)在對(duì)數(shù)回歸模型內(nèi)組合，以便評(píng)估經(jīng)對(duì)其它兩種顯著性的影響所校正的顯著性。使用以上所述的編碼添加這三種多態(tài)。如前所述，考慮處理組、性別和年齡，開展分析。結(jié)果示于表3。當(dāng)包含于同一個(gè)多變量模型內(nèi)時(shí)，全部三種多態(tài)性均在5%I型錯(cuò)誤水平上是顯著的。表3:多變量藥物遺傳學(xué)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>權(quán)利要求1.用于評(píng)估患者對(duì)急性腎移植排異反應(yīng)易感性的方法，包括a)從取自患者的樣品內(nèi)分離核酸，和b)檢測(cè)在SEQIDNo.1的位置682處的核苷酸，其中在此位置存在A預(yù)示著有急性腎移植排異反應(yīng)，c)任選地檢測(cè)一種或多種用于預(yù)測(cè)急性腎移植排異反應(yīng)的其它標(biāo)記。2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的一種或多種其它標(biāo)記是在SEQIDNo.5的位置176處的核苷酸和/或在SEQIDNo.6的位置3757處的核苷酸。3.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述的樣品是全血。4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述的檢測(cè)通過雙脫氧測(cè)序和/或等位基因特異性定量PCR實(shí)現(xiàn)。5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中使用SeqIDNo.2和SeqIDNo.3的等位基因特異性引物和SeqIDNo.4的共同引物和/或SeqIDNo.7和SeqIDNo.8的等位基因特異性引物和SeqIDNo.9的共同引物開展所述的等位基因特異性PCR和/或用SeqIDNo.10和SeqIDNo.11的等位基因特異性引物開展所述的雙脫氧測(cè)序。6.用于評(píng)估患者對(duì)急性腎移植排異反應(yīng)易感性的試劑盒，包含用于檢測(cè)IMPDH2基因內(nèi)T3757C多態(tài)性的至少一種試劑、描述根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述方法的說明書和用于試劑盒內(nèi)容物的容器。7.根據(jù)權(quán)利要求6的試劑盒，其中用于檢測(cè)IMPDH2基因內(nèi)T3757C多態(tài)性的試劑包含這樣的核酸，該核酸能夠與SeqIDNo.1的核酸或其中在位置3757處的核苷酸T由C替換的SeqIDNo.1的核酸特異性雜交。8.才艮據(jù)4又利要求6或7中任一項(xiàng)所述的試劑盒，還包含檢測(cè)MDR1基因內(nèi)C3435T多態(tài)性和/或IL10基因內(nèi)-5920A多態(tài)性的至少一種試劑。9.本文此前所述、尤其是關(guān)于前述實(shí)施例的核酸分子、方法和試劑盒。專利摘要本發(fā)明涉及用于通過檢測(cè)IMPDH2基因的內(nèi)含子7中的多態(tài)性、任選地與同急性腎移植排異反應(yīng)有關(guān)的MDR1和IL10基因的多態(tài)性的組合而預(yù)測(cè)急性腎移植排異反應(yīng)的方法。文檔編號(hào)C12Q1/68GKCN101194025SQ200680020898公開日2008年6月4日申請(qǐng)日期2006年6月7日發(fā)明者A·沃爾伽利,D·費(fèi)恩茲勒,K·林德派因特納,L·哈希莫托,L·埃塞奧克斯,M·拉希福德,M·特魯曼,O·斯普雷斯申請(qǐng)人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX,EndNote,RefMan