專利名稱:通過核酸模板化學(xué)生物檢測(cè)的相關(guān)應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一般而言，本發(fā)明涉及探針及其在生物檢測(cè)和診斷學(xué)中的用途。更具體地，本發(fā)明涉及生物檢測(cè)和診斷學(xué)(例如對(duì)核酸和蛋白質(zhì)的檢測(cè))中核酸模板化學(xué)的組合物和方法(例如熒光的、化學(xué)發(fā)光的和發(fā)色化合物的合成)。
背景技術(shù)：
熒光和有色化合物已被用于生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，以檢測(cè)生物分子的存在、不存在、狀態(tài)、數(shù)量和組成。使用熒光和有色化合物的測(cè)定法可以體外、原位或體內(nèi)進(jìn)行。用于檢測(cè)DNA和RNA的體外檢測(cè)法中常用的例子是實(shí)時(shí)和終點(diǎn)PCR、DNA測(cè)序和DNA微陣列技術(shù)。
核酸檢測(cè)
DNA和RNA檢測(cè)測(cè)定法常常需要帶有熒光標(biāo)記的DNA探針和/或引物。典型地，這些通過酶合成和/或化學(xué)合成產(chǎn)生。體外熒光測(cè)定法的其它例子包括ELISA測(cè)定法，該測(cè)定法中用熒光團(tuán)標(biāo)記抗體。原位熒光`測(cè)定法的一個(gè)例子是用熒光修飾的抗體來標(biāo)記整個(gè)細(xì)胞(活的或死的)，使得它們能夠(例如使用流式分選器)被檢測(cè)、成像和分離。最近，有人努力在完整動(dòng)物中使用熒光作為侵害最小的檢測(cè)技術(shù)?；旧?，用近IR或IR熒光化合物來標(biāo)記抗體或其它生物活性分子，隨后注射進(jìn)動(dòng)物中；使用合適的光照和成像設(shè)備檢測(cè)熒光定位。以這種方式可以發(fā)現(xiàn)和監(jiān)測(cè)癌癥和其它疾病，而不需要探查手術(shù)。前文只是闡述熒光作為生物探測(cè)技術(shù)的滲透性的若干例子。
典型地，對(duì)于多數(shù)這些類型的測(cè)定法而言，需要通過洗滌步驟去除未結(jié)合的探針或抗體以獲得足夠的信號(hào)噪音比和靈敏度。這向測(cè)定過程添加了步驟，導(dǎo)致額外的時(shí)間和成本(試劑和可能的設(shè)備)。DNA/RNA擴(kuò)增測(cè)定法(如RT-PCR)不需要洗滌步驟，因?yàn)榘袠?biāo)被擴(kuò)增有效地降低了樣品的復(fù)雜性，同時(shí)提供了大量待分析物用于測(cè)定。但是即便是PCR也受到一些限制。例如，在單一測(cè)定中可以被檢測(cè)的待分析物數(shù)量被限制為四個(gè)或更少，并且測(cè)定需要昂貴和耗能(power-hungry)的設(shè)備，這限制了其在實(shí)驗(yàn)性用途(特別是在田間用途)中的可應(yīng)用性。具有與PCR同樣的靈敏性和特異性，但是更加強(qiáng)大(robust)和輕便的測(cè)定技術(shù)會(huì)是有利的。在體內(nèi)成像的情況下，因?yàn)樽⑸浜椭蠛统上裰靶枰恍r(shí)間，因此進(jìn)行“生物學(xué)”洗滌步驟，允許生物活性化合物找到其靶標(biāo)，并允許多余的試劑清除身體。
蛋白質(zhì)檢測(cè)[0008]蛋白質(zhì)在許多生物學(xué)反應(yīng)中起中心作用，所述生物學(xué)反應(yīng)基本上由分子間作用和涉及多種蛋白質(zhì)的分子識(shí)別組成。蛋白質(zhì)鑒定和定量測(cè)定中用的常用方法使用雙向電泳和質(zhì)譜法。另一方法使用液相色譜和質(zhì)譜法。對(duì)相互作用檢測(cè)和蛋白質(zhì)鑒定而言，也可使用抗體芯片，所述抗體芯片提供點(diǎn)在平表面上的大量抗體。使用電泳的常規(guī)方法在分辨率和檢測(cè)靈敏度方面有問題。
Landegren et al.的 U.S.專利公開號(hào) N0.20020064779 描述了接近連接(proximity ligation)測(cè)定法,其中與待檢測(cè)祀標(biāo)結(jié)合的兩個(gè)探針與附著在所述兩個(gè)結(jié)合探針上的兩個(gè)寡核苷酸的末端酶連接。結(jié)合的寡聚體被擴(kuò)增，以測(cè)定靶標(biāo)分子的存在。Nadeau et al.的U.S.專利申請(qǐng)公開號(hào)N0.2005/0009050描述了形成擴(kuò)增子的類似原理。
Kolman et al的U.S.專利申請(qǐng)公開號(hào)N0.20050095627描述了基于接近性的測(cè)定法，其中與兩個(gè)寡核苷酸連接的兩個(gè)結(jié)合配偶體與靶標(biāo)結(jié)合時(shí)形成雜合體一這是部分為雙鏈的DNA結(jié)構(gòu)。然后可以用DNA聚合酶延伸所述部分為雙鏈的結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生可以通過PCR被進(jìn)一步擴(kuò)增的產(chǎn)物。
人們需要針對(duì)上述生物檢測(cè)方法中許多固有缺陷的、新的熒光和比色法。還需要發(fā)現(xiàn)新的熒光化合物。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明部分基于下述發(fā)現(xiàn):核酸模板化學(xué)可用于檢測(cè)生物學(xué)靶標(biāo)，例如核酸、蛋白質(zhì)、自身抗體、細(xì)胞等。本發(fā)明部分基于下述發(fā)現(xiàn):熒光、化學(xué)發(fā)光和發(fā)色化合物和產(chǎn)生熒光、化學(xué)發(fā)光和發(fā)色信號(hào)的反應(yīng)可以通過核酸模板化學(xué)被合成。這類方法、化合物、化學(xué)反應(yīng)和其它組分適用于檢測(cè)生物分子，如核酸和蛋白質(zhì)。使用熒光、化學(xué)發(fā)光和有色化合物的本發(fā)明測(cè)定法可以體外、原位或體內(nèi)進(jìn)行。
在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于檢測(cè)靶標(biāo)核苷酸序列的方法。該方法包括(a)提供
(I)第一探針，其包含(i)第一寡核苷酸序列和(ii)與所述第一寡核苷酸序列連接的第一反應(yīng)基團(tuán)，和(2)第二探針，其包含(i)第二寡核苷酸序列和(ii)與所述第二寡核苷酸序列連接的第二反應(yīng)基團(tuán)，其中所述第一寡核苷酸序列和所述第二寡核苷酸序列與靶標(biāo)核苷酸的兩個(gè)分離區(qū)域互補(bǔ)；(b)將所述第一探針和所述第二探針與將用來測(cè)試靶標(biāo)核苷酸序列的存在的樣品在下述條件下結(jié)合，所述條件是這樣的:如果靶標(biāo)核苷酸序列存在于樣品中，那么在所述條件下，所述第一探針和所述第二探針與靶標(biāo)核苷酸序列上它們各自的互補(bǔ)區(qū)雜交，從而使得所述第一反應(yīng)基團(tuán)和所述第二反應(yīng)基團(tuán)開始反應(yīng)性接近；和(c)檢測(cè)所述第一反應(yīng)基團(tuán)和所述第二反應(yīng)基團(tuán)之間的反應(yīng)，從而測(cè)定靶標(biāo)核苷酸序列的存在。
在另一方面，本發(fā)明涉及用于檢測(cè)靶標(biāo)核苷酸序列的方法。所述方法包括(a)提供一組探針對(duì)，每個(gè)探針對(duì)包含(I)第一探針，其包含(i)第一核苷酸序列和(ii)與所述第一寡核苷酸序列連接的第一反應(yīng)基團(tuán)，和(2)第二探針，其包含(i)第二寡核苷酸序列和
(ii)與所述第二寡核苷酸序列連接的相應(yīng)第二反應(yīng)基團(tuán)，其中所述第一寡核苷酸序列和所述第二寡核苷酸序列與靶標(biāo)核苷酸的兩個(gè)分離區(qū)域互補(bǔ)；(b)將所述探針對(duì)組與將用來測(cè)試靶標(biāo)核苷酸序列的存在的樣品在下述條件下結(jié)合，所述條件是這樣的:如果靶標(biāo)核苷酸序列存在于樣品中，那么所述條件下所述探針對(duì)的每個(gè)所述第一探針和所述第二探針與靶標(biāo)核苷酸序列上它們各自的互補(bǔ)區(qū)雜交，從而使得相應(yīng)的所述第一反應(yīng)基團(tuán)和所述第二反應(yīng)基團(tuán)對(duì)開始反應(yīng)性接近；和(C)檢測(cè)所述第一反應(yīng)基團(tuán)和相應(yīng)的所述第二反應(yīng)基團(tuán)對(duì)之間的一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)，從而測(cè)定靶標(biāo)核苷酸序列的存在。
在又一方面，本發(fā)明涉及用于進(jìn)行核酸模板化學(xué)的方法。本方法包括例如在基本相似的條件下和/或基本同時(shí)地進(jìn)行多重核酸模板化學(xué)反應(yīng)，所述反應(yīng)以單個(gè)模板核苷酸序列作為模板。
在又一方面，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)生物學(xué)靶標(biāo)的方法。所述方法包括下述這些。提供第一探針。所述第一探針包括(I)對(duì)所述生物學(xué)靶標(biāo)具有親合力的第一結(jié)合部分，和
(2)第一寡核苷酸序列，和(3)與所述第一寡核苷酸序列結(jié)合的第一反應(yīng)基團(tuán)。提供第二探針，所述第二探針包括(I)對(duì)所述生物學(xué)靶標(biāo)具有親合力的第二結(jié)合部分，(2)第二寡核苷酸序列，和(3)與所述第二寡核苷酸序列結(jié)合的第二反應(yīng)基團(tuán)。所述第二寡核苷酸能夠與所述第一寡核苷酸序列雜交。當(dāng)彼此開始反應(yīng)性接近時(shí)，所述第二反應(yīng)基團(tuán)對(duì)所述第一反應(yīng)基團(tuán)來說是有反應(yīng)性的。將所述第一探針與所述第二探針與將用來測(cè)試生物學(xué)靶標(biāo)存在的樣品在下述條件下結(jié)合，所述條件下所述第一和第二結(jié)合部分與生物學(xué)靶標(biāo)結(jié)合。所述第二寡核苷酸被允許與所述第一寡核苷酸雜交，使所述第一和第二反應(yīng)基團(tuán)開始反應(yīng)性接近。檢測(cè)所述第一和第二反應(yīng)基團(tuán)之間的反應(yīng)，從而測(cè)定生物學(xué)靶標(biāo)的存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一和第二反應(yīng)基團(tuán)之間的反應(yīng)產(chǎn)生熒光部分。在另一實(shí)施方案中，第一和第二反應(yīng)基團(tuán)之間的反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光和/或發(fā)色部分。
在又一方面，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)生物學(xué)靶標(biāo)的方法。所述方法包括下述這些。提供生物學(xué)靶標(biāo)與第一探針的結(jié)合復(fù)合物。所述第一探針包括(I)對(duì)所述生物學(xué)靶標(biāo)具有親合力的第一結(jié)合部分，和(2)第一寡核苷酸序列，和(3)與所述第一寡核苷酸序列結(jié)合的第一反應(yīng)基團(tuán)。將結(jié)合復(fù)合物與第二探針接觸。所述第二探針包括(I)對(duì)所述生物學(xué)靶標(biāo)具有親合力的第二結(jié)合部分，(2)第二寡核苷酸序列，和(3)與所述第二寡核苷酸序列結(jié)合的第二反應(yīng)基團(tuán)。所述第二寡核苷酸能夠與所述第一寡核苷酸序列雜交，當(dāng)彼此開始反應(yīng)性接近時(shí)，所述第二反應(yīng)基團(tuán)對(duì)所述第一反應(yīng)基團(tuán)來說是反應(yīng)性的。所述第二寡核苷酸被允許與所述第一寡核苷酸雜交，使所述第一和第二反應(yīng)基團(tuán)開始反應(yīng)性接近。檢測(cè)所述第一和第二反應(yīng)基團(tuán)之間的反應(yīng)，從而測(cè)定生物學(xué)靶標(biāo)是否存在。
在又一方面，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)生物學(xué)靶標(biāo)存在的方法。所述方法包括下述這些。允許第一探針和第二探針與靶標(biāo)結(jié)合。所述第一探針包括(I)對(duì)所述生物學(xué)靶標(biāo)具有親合力的第一結(jié)合部分，和(2)第一寡核苷酸序列，和(3)與所述第一寡核苷酸序列結(jié)合的第一反應(yīng)基團(tuán)。所述第二探針包括(I)對(duì)所述生物學(xué)靶標(biāo)具有親合力的第二結(jié)合部分，
(2)第二寡核苷酸序列，和(3)與所述第二寡核苷酸序列結(jié)合的第二反應(yīng)基團(tuán)。第二寡核苷酸能夠與第一寡核苷酸序列雜交。當(dāng)彼此開始反應(yīng)性接近時(shí)，所述第二反應(yīng)基團(tuán)對(duì)所述第一反應(yīng)基團(tuán)來說是反應(yīng)性的。所述第二寡核苷酸被允許與所述第一寡核苷酸雜交，從而使所述第一和第二反應(yīng)基團(tuán)開始反應(yīng)性接近。檢測(cè)所述第一和第二反應(yīng)基團(tuán)之間的反應(yīng)，從而測(cè)定樣品中是否存在生物學(xué)靶標(biāo)。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一和第二反應(yīng)基團(tuán)之間的反應(yīng)產(chǎn)生熒光部分。在另一實(shí)施方案中，第一和第二反應(yīng)基團(tuán)之間的反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光和/或發(fā)色部分。
在又一方面，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)生物學(xué)靶標(biāo)存在的方法。所述方法包括下述這些。提供第一探針，其包括(I)對(duì)所述生物學(xué)靶標(biāo)具有親合力的第一結(jié)合部分，和(2)第一寡核苷酸壓縮碼序列。提供第二探針，其包括(I)對(duì)所述生物學(xué)靶標(biāo)具有親合力的第二結(jié)合部分，(2)第二寡核苷酸壓縮碼。所述第一探針與第一報(bào)告子探針雜交，所述第一報(bào)告子探針包含(I)與所述第一寡核苷酸壓縮碼序列互補(bǔ)的寡核苷酸反壓縮碼序列，(2)第一報(bào)告子寡核苷酸，和(3)第一反應(yīng)基團(tuán)。所述第二探針與第二報(bào)告子探針雜交，所述第二報(bào)告子探針包含(I)與所述第二寡核苷酸壓縮碼序列互補(bǔ)的寡核苷酸反壓縮碼序列，(2)第二報(bào)告子寡核苷酸，和(3)第二反應(yīng)基團(tuán)。第二報(bào)告子寡核苷酸能夠與第一報(bào)告子寡核苷酸序列雜交，且當(dāng)彼此開始反應(yīng)性接近時(shí)，所述第二反應(yīng)基團(tuán)對(duì)所述第一反應(yīng)基團(tuán)來說是反應(yīng)性的。將所述第一和第二探針與用于測(cè)試所述生物學(xué)靶標(biāo)存在的樣品接觸。當(dāng)樣品中存在所述生物學(xué)靶標(biāo)時(shí)，允許所述第一和第二探針與所述生物學(xué)靶標(biāo)結(jié)合，從而所述第二報(bào)告子寡核苷酸與所述第一報(bào)告子寡核苷酸雜交，使得所述第一和第二反應(yīng)基團(tuán)開始反應(yīng)性接近。檢測(cè)所述第一和第二反應(yīng)基團(tuán)之間的反應(yīng)，從而測(cè)定樣品中是否存在所述生物學(xué)靶標(biāo)。
值得指出的是，本發(fā)明的方法不要求對(duì)第一和/或第二寡核苷酸序列進(jìn)行酶連接或化學(xué)連接。
在又一方面，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)生物學(xué)待分析物的試劑盒。所述試劑盒包括第一探針，其包含(I)對(duì)所述生物學(xué)待分析物具有親合力的第一結(jié)合部分，(2)第一寡核苷酸序列，和(3)與所述第一寡核苷酸序列結(jié)合的第一反應(yīng)基團(tuán)；和第二探針，其包含(I)對(duì)所述生物學(xué)待分析物具有親合力的第二結(jié)合部分，(2)第二寡核苷酸序列，和(3)與所述第二寡核苷酸序列結(jié)合的第二反應(yīng)基團(tuán)。所述第二寡核苷酸能夠與所述第一寡核苷酸序列雜交。當(dāng)彼此開始反應(yīng)性接近時(shí)，所述第二反應(yīng)基團(tuán)對(duì)所述第一反應(yīng)基團(tuán)來說是反應(yīng)性的。
在又一方面，本發(fā)明提供了可用于檢測(cè)生物學(xué)待分析物的試劑盒。所述試劑盒包含第一探針，所述第一探針包含(I)對(duì)所述生物學(xué)靶標(biāo)具有親合力的第一結(jié)合部分，和(2)第一寡核苷酸壓縮碼序列；和第二探針，所述第二探針包含(I)對(duì)所述生物學(xué)靶標(biāo)具有親合力的第二結(jié)合部分，和(2)第二寡核苷酸壓縮碼序列。所述第一探針能夠與第一報(bào)告子探針雜交，所述第一報(bào)告子探針包含(I`)與所述第一寡核苷酸壓縮碼序列互補(bǔ)的寡核苷酸的反壓縮碼序列，(2)第一報(bào)告子寡核苷酸，和(3)第一反應(yīng)基團(tuán)。所述第二探針能夠第二報(bào)告子探針雜交，所述第二報(bào)告子探針包含(I)與所述第二寡核苷酸壓縮碼序列互補(bǔ)的寡核苷酸的反壓縮碼序列，(2)第二報(bào)告子寡核苷酸，和(3)第二反應(yīng)基團(tuán)。所述第二報(bào)告子寡核苷酸能夠與所述第一報(bào)告子寡核苷酸序列雜交，且當(dāng)彼此開始反應(yīng)性接近時(shí)，所述第二反應(yīng)基團(tuán)對(duì)所述第一反應(yīng)基團(tuán)來說是反應(yīng)性的。
本發(fā)明包括提供一種、兩種或多種本文所述探針的試劑盒。更具體地，本發(fā)明包括提供一種、兩種或多種下述探針的試劑盒，所述探針利用核酸模板化學(xué)產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)，用作檢測(cè)生物學(xué)靶標(biāo)或靶標(biāo)(例如一種或多種核酸、一種或多種蛋白質(zhì)、一種或多種自身抗體和/或一種或多種細(xì)胞)存在的手段。
參考下文附圖、詳述和權(quán)利要求
書可透徹地理解本發(fā)明之前的方面和實(shí)施方案。
定義
本文使用的術(shù)語“DNA程序化化學(xué)”或” DPC”指核酸模板化學(xué)，例如對(duì)化學(xué)反應(yīng)物進(jìn)行序列特異性控制，產(chǎn)生特定產(chǎn)物，這通過下文所述來完成:(I)提供一種或多種模板，其具有結(jié)合的反應(yīng)基團(tuán)；(2)將具有反密碼子(例如一種或多種模板的互補(bǔ)序列)的一種或多種轉(zhuǎn)移基團(tuán)(試劑)與反應(yīng)基團(tuán)在允許與模板雜交的條件下接觸，和(3)反應(yīng)基團(tuán)反應(yīng)產(chǎn)生產(chǎn)物。例如在一步核酸模板反應(yīng)中，“模板”和“互補(bǔ)”寡核苷酸的雜交將反應(yīng)基團(tuán)裝配在一起，隨后進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生目的產(chǎn)物。反應(yīng)物和產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)無需與核酸的結(jié)構(gòu)相關(guān)，所述核酸包含模板和轉(zhuǎn)移基團(tuán)寡核苷酸。參閱例如Liu et al.的U.S.專利申請(qǐng)公開號(hào) Nos.2004/0180412 Al (USSN 10/643, 752 ；Aug.19,2003)和 Liu et al 的 2003/0113738 Al(USSN 10/101, 030 ；Mar.19,2002) ；Gartner, et al，2004，Science, vol.305,pp.1601-1605 ；Doyon, et al，2003，JACS, vol.125，pp.12372-12373，所有參考文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容通過引用明確并入本文。還參閱"Turn Over Probes and Use Thereof by Coull etal.，2006年五月3日提交的PCT國(guó)際申請(qǐng)PCT/US06/16999。
本文使用術(shù)語“核酸”、“寡核苷酸”(有時(shí)簡(jiǎn)稱為“寡(oligo) ”)或“多核苷酸”是指核苷酸的多聚體。多聚體可包括，但不限于天然核苷(即腺苷、胸苷、鳥苷、胞苷、尿苷、脫氧腺苷、脫氧胸苷、脫氧鳥苷和脫氧胞苷)、核苷類似物(例如2-氨基腺苷、2-硫胸苷、肌苷、吡咯并-嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙塊基_尿苷、C5-丙塊基-胞苷、C5-甲基胞苷、7_脫氮腺苷、7_脫氮鳥苷、8_氧腺苷、8_氧鳥苷、0(6)-甲基鳥嘌呤和2-硫胞苷)、經(jīng)化學(xué)修飾的堿基、經(jīng)生物學(xué)修飾的堿基(例如甲基化的堿基)、插入的堿基、經(jīng)修飾的糖(例如2’ -氟核糖、核糖、2’ -脫氧核糖、阿拉伯糖和己糖)或經(jīng)修飾的磷酸基(例如硫代磷酸酯和5' -N-亞磷酰胺鍵)。核酸和寡核苷酸可還包括具有經(jīng)修飾主鏈的其·它堿基多聚體，如鎖定核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、蘇糖核酸(TNA)。
在整個(gè)說明書，組合物被描述為具有、包括或包含特異組分，或其中方法被描述為具有、包括或包含特異的操作步驟時(shí)，也包括下面的情況:本發(fā)明的組合物還主要由所述成分組成或由所述成分組成，本發(fā)明的方法也主要由所述操作步驟組成或由所述操作步驟組成。此外，應(yīng)當(dāng)理解:步驟順序或進(jìn)行某些活動(dòng)的順序是非關(guān)鍵性的，只要本發(fā)明仍可操作即可。另外，可同時(shí)進(jìn)行兩個(gè)或更多的步驟或行動(dòng)。
附圖概述
可從以下附圖進(jìn)一步理解本發(fā)明，其中:

圖1是對(duì)根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案用于檢測(cè)核酸靶標(biāo)的方法的圖示。
圖2是對(duì)通過基因涂抹(gene painting)檢測(cè)低拷貝數(shù)基因的例子的圖示。
圖3是對(duì)通過輔因子釋放測(cè)定法檢測(cè)核酸靶標(biāo)的例子的圖示。
圖4是對(duì)根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案用于檢測(cè)生物學(xué)靶標(biāo)的方法的圖示。
圖5是對(duì)根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案用于檢測(cè)生物學(xué)靶標(biāo)的方法的圖示。
圖6顯示了受濃度、溫度和單個(gè)堿基對(duì)錯(cuò)配的存在或不存在影響的雜交的例子。
圖7顯示了某些解鏈曲線實(shí)驗(yàn)中的示例性寡核苷酸。
圖8是對(duì)根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案用于檢測(cè)生物學(xué)靶標(biāo)的方法的圖示。
圖9是對(duì)根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案用于檢測(cè)血小板衍生的生長(zhǎng)因子(TOGF)的方法的圖示。
圖10顯示了夾板的(splinted)、壓縮碼的檢測(cè)體系的示例性實(shí)施方案，其中使用適體作為靶標(biāo)結(jié)合部分。
圖11顯示夾板的(、壓縮碼的檢測(cè)體系的示例性實(shí)施方案，使用抗體作為靶標(biāo)結(jié)合部分。
圖12是對(duì)根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案用于檢測(cè)蛋白質(zhì)靶標(biāo)的方法的圖示。
圖13顯示了聚甲炔染料、花青(cyanine)和半花青(hemicyanine)的一般結(jié)構(gòu)。
圖14顯示了熒光信號(hào)的產(chǎn)生和通過三苯膦(TPP)和疊氮香豆素(AzC)報(bào)告化學(xué)對(duì)生物學(xué)靶標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)的例子。
圖15顯示了熒光信號(hào)的產(chǎn)生和通過TPP和AzC報(bào)告化學(xué)對(duì)生物學(xué)靶標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)的例子。
圖16顯示了解鏈曲線的某些例子，展示了寡核苷酸濃度對(duì)Tm的影響。
圖17顯示了有和沒有抗生物素蛋白時(shí)，生物素化的寡核苷酸的DNA雜交解鏈曲線的某些例子。
圖18顯示了與抗生物素蛋白結(jié)合后互補(bǔ)的生物素化寡核苷酸的T111改變的某些例子。
圖19顯示了鹽和鎂濃度對(duì)寡核苷酸+/_生物素的Tm的影響的某些例子。
圖20顯示了在不同比例的寡核苷酸與抗生物素蛋白之比的情況下，生物素化的寡核苷酸解鏈溫度行為的某些例子。
圖21顯示了存在和不存在抗生物素蛋白時(shí)，與生物素_5’ 5' (+)鏈寡核苷酸成為雙鏈體的3’ (-)生物素-鏈寡核苷酸的解鏈曲線的某些例子。
圖22顯示了有和沒有抗生物素蛋白時(shí)，富含AT的生物素化寡核苷酸二聚體解鏈曲線的某些例子。
圖23是對(duì)根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案檢測(cè)生物學(xué)靶標(biāo)的方法的圖示。
圖24顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案檢測(cè)生物學(xué)靶標(biāo)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的例子。
圖25A和圖25B顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案檢測(cè)生物學(xué)靶標(biāo)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(反應(yīng)混合物中甲酰胺的效應(yīng))的例子。
圖26A和圖26B顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案檢測(cè)生物學(xué)靶標(biāo)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(反應(yīng)混合物中甲酰胺的效應(yīng))的例子。
圖27顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案檢測(cè)生物學(xué)靶標(biāo)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(反應(yīng)混合物中甲酰胺的效應(yīng))的例子。
圖28顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案檢測(cè)生物學(xué)靶標(biāo)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(反應(yīng)混合物的時(shí)程)的例子。
圖29顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案檢測(cè)生物學(xué)靶標(biāo)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(反應(yīng)混合物的時(shí)程)的例子。
圖30顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案檢測(cè)生物學(xué)靶標(biāo)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(探針比例)的例子。
圖31顯示了通過壓縮碼檢測(cè)體系檢測(cè)TOGF的例子。
圖32顯示了針對(duì)適體和報(bào)告子的比例進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)。
圖33闡述了用于檢測(cè)TOGF的“單片”檢測(cè)體系的實(shí)施方案。
圖34顯示了夾板的、壓縮碼的檢測(cè)體系的示例性實(shí)施方案，其中使用抗體作為靶標(biāo)結(jié)合部分。
圖35顯示了反應(yīng)混合物的MALD1-MS譜。[0066]圖36顯示了反應(yīng)混合物的吸收和熒光發(fā)射光譜。
圖37顯示了純化的半花青的吸收和熒光發(fā)射光譜。
圖38顯示了化合物的電噴射質(zhì)量數(shù)據(jù)。
發(fā)明詳述
就最簡(jiǎn)單的目的而言，本發(fā)明旨在通過核酸模板反應(yīng)產(chǎn)生可檢測(cè)的、指示靶標(biāo)待分析物(例如核酸或蛋白質(zhì))的存在的信號(hào)。更具體地，本發(fā)明提供了令人興奮的方法來產(chǎn)生熒光、化學(xué)發(fā)光或發(fā)色化合物和信號(hào)，并將這類技術(shù)用于生物檢測(cè)和/或診斷應(yīng)用中。直接作為核酸模板化學(xué)反應(yīng)結(jié)果的(由于化學(xué)鍵的形成或切割，或功能基團(tuán)的化學(xué)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的)有色、熒光或化學(xué)發(fā)光化合物或前體的產(chǎn)生及檢測(cè)提供了獨(dú)特的技術(shù)，所述技術(shù)可應(yīng)用于許多領(lǐng)域，包括生物恐怖劑(bioterror agent)檢測(cè)和疾病診斷。
因此，探針之間的雜交事件之后是由DNA模板(寡核苷酸)介導(dǎo)的化學(xué)反應(yīng)，所述DNA模板由于接近效應(yīng)從而顯著提高了化學(xué)反應(yīng)的速率，并能夠介導(dǎo)大量化學(xué)反應(yīng)。因此，靶標(biāo)生物分子(例如核酸或蛋白質(zhì))的存在導(dǎo)致可檢測(cè)化學(xué)反應(yīng)的發(fā)生。從而，本發(fā)明提供了易于使用和高信噪比的生物學(xué)靶標(biāo)檢測(cè)。
核酸檢測(cè)
圖1闡述了對(duì)核酸的檢測(cè)的一個(gè)實(shí)施方案。兩個(gè)寡核苷酸與DNA或RNA靶標(biāo)(待分析物，例如在相信含有生物恐怖劑或其它傳染劑的樣品中)結(jié)合。用化學(xué)反應(yīng)種類X和Y標(biāo)記兩種探針。雜交后，X與Y反應(yīng)產(chǎn)生產(chǎn)信號(hào)的化合物Z(例如熒光、化學(xué)發(fā)光或有色化合物)。Z與兩個(gè)探針可以共價(jià)連接或不連接，不連接時(shí)Z可以與任一探針連接。Z形成后可從寡核苷酸釋放。
如果熒光圖或發(fā)色團(tuán)被釋放，其可以從雜交復(fù)合物分離并單獨(dú)分析，或其被檢測(cè)后可被去除，從而能夠進(jìn)行樣品的另一輪查詢(例如探針翻轉(zhuǎn))。如果熒光團(tuán)或發(fā)色團(tuán)未被釋放，也可將其從反應(yīng)混合物剩余部分分離，例如作為雙鏈結(jié)構(gòu)移動(dòng)，所述雙鏈結(jié)構(gòu)可通過例如凝膠電泳分析。DNA或RNA靶標(biāo)上附著于DNA探針的熒光團(tuán)可以附著在固相(例如珠、載玻片(微陣列)表面等)或溶液中(在該情況下反應(yīng)構(gòu)成均相測(cè)定)。
因此在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于檢測(cè)靶標(biāo)核苷酸序列的方法。所述方法包括(a)提供(I)第一探針，其包含(i)第一寡核苷酸序列和(ii)與所述第一寡核苷酸序列連接的第一反應(yīng)基團(tuán)，和(2)第二探針，其包含(i)第二寡核苷酸序列和(ii)與所述第二寡核苷酸序列連接的第二反應(yīng)基團(tuán)，其中所述第一寡核苷酸序列和所述第二寡核苷酸序列與靶標(biāo)核苷酸的兩個(gè)分離區(qū)域互補(bǔ)；(b)將所述第一探針和所述第二探針與用于測(cè)試靶標(biāo)核苷酸序列存在的樣品在下述條件下結(jié)合，所述條件是這樣的:如果靶標(biāo)核苷酸序列存在于樣品中，那么所述條件下所述第一探針和所述第二探針與靶標(biāo)核苷酸序列上它們各自的互補(bǔ)區(qū)雜交，從而所述第一反應(yīng)基團(tuán)和所述第二反應(yīng)基團(tuán)開始反應(yīng)性接近；和(c)檢測(cè)所述第一反應(yīng)基團(tuán)和所述第二反應(yīng)基團(tuán)之間的反應(yīng)，從而測(cè)定靶標(biāo)核苷酸序列的存在。
圖2闡述了通過能夠檢測(cè)低拷貝數(shù)基因的核酸模板化學(xué)檢測(cè)核酸序列的例子。用一組探針對(duì)(例如 400/基因)“涂抹”目的基因。探針對(duì)的數(shù)量可以在例如2、5、10和1，000、5，000或10，000之間。探針對(duì)(第一反應(yīng)基團(tuán)和響應(yīng)的第二反應(yīng)基團(tuán))之間的化學(xué)反應(yīng)在所有探針對(duì)中可以相同， 也可以不同。產(chǎn)生不同熒光團(tuán)的不同組探針對(duì)可以靶向靶標(biāo)中不同的序列。[0077]圖2中闡述的實(shí)施方案也可應(yīng)用于除生物檢測(cè)外的應(yīng)用。單個(gè)DNA模板上發(fā)生多重核酸模板反應(yīng)的原理不局限于產(chǎn)生突光信號(hào)。
因此，在另一方面，本發(fā)明涉及用于檢測(cè)靶標(biāo)核苷酸序列的方法。所述方法包括a)提供一組探針對(duì)，每個(gè)探針對(duì)包含(I)第一探針，其包含(i)第一核苷酸序列和(ii)與所述第一寡核苷酸序列連接的第一反應(yīng)基團(tuán)，和(2)第二探針，其包含(i)第二寡核苷酸序列和(ii)與所述第二寡核苷酸序列連接的相應(yīng)第二反應(yīng)基團(tuán)，其中所述第一寡核苷酸序列和所述第二寡核苷酸序列與靶標(biāo)核苷酸的兩個(gè)分離區(qū)域互補(bǔ)；(b)將所述探針對(duì)組與用于測(cè)試靶標(biāo)核苷酸序列存在的樣品在下述條件下結(jié)合，所述條件是這樣的:如果靶標(biāo)核苷酸序列存在于樣品中，那么所述條件下所述探針對(duì)的每個(gè)所述第一探針和所述第二探針與靶標(biāo)核苷酸序列上它們各自的互補(bǔ)區(qū)雜交，從而相應(yīng)的所述第一反應(yīng)基團(tuán)和所述第二反應(yīng)基團(tuán)對(duì)開始反應(yīng)性接近；和(C)檢測(cè)所述第一反應(yīng)基團(tuán)和相應(yīng)的所述第二反應(yīng)基團(tuán)對(duì)之間的一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)，從而測(cè)定靶標(biāo)核苷酸序列的存在。
圖3闡述了另一實(shí)施方案的例子，其中間接檢測(cè)流程涉及核酸模板反應(yīng)，隨后是輔因子釋放和后繼的可檢測(cè)反應(yīng)。
蛋白質(zhì)檢測(cè)
圖4和圖5闡述了用于檢測(cè)蛋白質(zhì)革巴標(biāo)的本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案。
圖4顯示了通過本發(fā)明檢測(cè)蛋白質(zhì)靶標(biāo)的一個(gè)實(shí)施方案。兩個(gè)探針含有靶標(biāo)結(jié)合部分、互補(bǔ)寡核苷酸，并且分別含有化學(xué)反應(yīng)種類X和Y。雜交后X和Y反應(yīng)產(chǎn)生產(chǎn)信號(hào)(例如熒光)化合物，其與兩種探針可共價(jià)連接或不共價(jià)連接。X和Y的反應(yīng)產(chǎn)物也可作為未結(jié)合的、可溶的化合物被釋放進(jìn)溶液中。蛋白質(zhì)靶標(biāo)可以附著在固相(例如珠、載玻片(微陣列)表面等)或溶液中。靶標(biāo)結(jié)合部分可以是例如適體、抗體、抗體片段(即Fab)、受體蛋白或小分子。
在圖5中更具體闡述的是使用兩種探針的二元探針途徑的例子，所述兩種探針各帶有一個(gè)“前熒光團(tuán)”前體(Fl和F2)并含有靶標(biāo)結(jié)合部分和被設(shè)計(jì)為彼此退火的寡核苷酸序列。在該實(shí)施方案中，檢測(cè)在下述條件下進(jìn)行:不存在靶標(biāo)時(shí)前熒光團(tuán)寡核苷酸不會(huì)彼此退火。這些條件通常被選為:使得不存在靶標(biāo)時(shí)環(huán)境溫度高于寡核苷酸對(duì)的Tm(從而不存在目的靶標(biāo)待分析物時(shí)寡核苷酸對(duì)不會(huì)退火)。然而，存在目的靶標(biāo)時(shí)，局部高濃度的寡核苷酸隨后提高它們雙鏈復(fù)合物的Tm使得雜交發(fā)生，之后發(fā)生產(chǎn)信號(hào)的核酸模板反應(yīng)(Fl和F2之間的反應(yīng))。產(chǎn)信號(hào)核酸模板反應(yīng)由于局部更高的前突光團(tuán)濃度而被加速，但是也可被前熒光團(tuán)基團(tuán)朝向彼此的接近和定向促進(jìn)。該信號(hào)產(chǎn)生的構(gòu)型具有能夠制造試劑盒的潛力，所述試劑盒用于檢測(cè)多種生物分子、細(xì)胞、表面和用于原位測(cè)定法的設(shè)計(jì)。信號(hào)產(chǎn)生不需要酶，均相形式不需要樣品加工。
在圖5中顯示了兩種寡核苷酸，每種都通過可選的間隔臂與獨(dú)立的結(jié)合物(如圖所示的情況下是抗體，但是可以是其它結(jié)合物如適體或小分子)連接。每個(gè)抗體識(shí)別共用靶標(biāo)待分析物(如蛋白質(zhì))上的獨(dú)立表位。間隔臂可以添加至寡核苷酸和結(jié)合物之間的一個(gè)或兩個(gè)寡核苷酸上。在某些情況下，該間隔臂可被要求符合接近的要求以達(dá)到所期望的反應(yīng)性。原則上間隔臂可以是任何合適的基團(tuán)，例如線性或分支的脂肪族碳鏈C3到C5、C10、C15、C20、C25、C30、C35、C40 或 ClOO 基團(tuán)，I 到 10、15、20、30、50 或 100 個(gè)堿基長(zhǎng)的 DNA序列或適當(dāng)長(zhǎng)度的聚乙二醇寡聚物。[0085]前熒光團(tuán)可位于“螺旋末端”構(gòu)型中(圖5頂部)，一個(gè)附著于01igo5’端，另一附著于3’端。(可應(yīng)用其它構(gòu)型，包括將兩個(gè)前熒光團(tuán)置于序列中，或例如使一個(gè)寡核苷酸與部分發(fā)夾結(jié)構(gòu)(例如100埃長(zhǎng))雜交)。在第一個(gè)例子中，一個(gè)01igo5’端附著于間隔臂和靶標(biāo)結(jié)合物，另一個(gè)3’端附著于間隔臂和分離的靶標(biāo)結(jié)合物。可以添加間隔臂(其可由不互補(bǔ)的DNA序列組成)或合成間隔臂(如乙二醇寡聚物)以滿足接近要求。這類間隔臂可以非常有彈性，其具有下述優(yōu)點(diǎn):克服與堅(jiān)硬間隔可能發(fā)生的任何結(jié)合位阻。合適的長(zhǎng)間隔臂設(shè)計(jì)可以允許01igo5’與它們的結(jié)合物(圖5底部)連接，或3’也連接，只要寡核苷酸能夠以反向平行的構(gòu)型退火并允許反應(yīng)基團(tuán)彼此反應(yīng)即可。可對(duì)每個(gè)靶標(biāo)設(shè)計(jì)最佳的間隔臂長(zhǎng)度。過長(zhǎng)的間隔臂應(yīng)當(dāng)避免，因?yàn)樗鼈兛赡軙?huì)降低體系中的特異性或降低的提高的Tm效應(yīng)。
與兩種寡核苷酸游離于溶液中相比，限定(tethering)寡核苷酸對(duì)所提供的接近效應(yīng)可影響兩個(gè)互補(bǔ)寡核苷酸序列退火的動(dòng)力學(xué)。更重要的是，與游離復(fù)合物相比，局部高濃度使解鏈曲線向上移動(dòng)，即提高復(fù)合物的Tm。如下文方程所闡述的，在大量(bulk)溶液中，已知 Tm 取決于總寡核苷酸濃度。ffetmur, Crit1.Rev.1n Biochem.And Mo1.Biol, 26,227-259(1991)。
Tm = (1000*AH)/(A+AS+R In(C τ /4)-273.15+16.6 log Na+)
其中Λ H和AS是螺旋形成的焓和熵，R是摩爾氣體常數(shù)，Q是寡聚物的總濃度，Na+是溶液中鈉離子的摩爾濃度。
圖6顯示了在0.1M鹽中短寡核苷酸范圍內(nèi)Tm對(duì)濃度的斜線具有下述依賴性:根據(jù)上述方程，寡核苷酸(圖7中的序列)濃度每提高10倍約+7°C。因此例如1000倍的局部濃度會(huì)被預(yù)期提高Tm約+21°C。
Fl和F2的反應(yīng)產(chǎn)物可作為化學(xué)轉(zhuǎn)化的結(jié)果從雜交復(fù)合物中釋放。因此，熒光團(tuán)或發(fā)色團(tuán)可從雜交復(fù)合物分離并獨(dú)立地分析，或檢測(cè)后可將熒光團(tuán)或發(fā)色團(tuán)和退火的寡核苷酸去除，使得能夠進(jìn)行樣品的另一輪查詢。一旦形成產(chǎn)物，F(xiàn)l和F2之間的反應(yīng)可與兩個(gè)探針共價(jià)連接或不共價(jià)連接。
因此在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)生物學(xué)靶標(biāo)的方法。所述方法包括下述這些。提供第一探針。所述第一探針包括(I)對(duì)生物學(xué)靶標(biāo)具有親合力的第一結(jié)合部分，(2)第一寡核苷酸序列，和(3)與所述第一寡核苷酸序列結(jié)合的第一反應(yīng)基團(tuán)。提供第二探針，其包含(I)對(duì)生物學(xué)靶標(biāo)具有親合力的第二結(jié)合部分，(2)第二寡核苷酸序列，和(3)與所述第二寡核苷酸序列結(jié)合的第二反應(yīng)基團(tuán)。所述第二寡核苷酸能夠與所述第一寡核苷酸序列雜交。當(dāng)彼此開始反應(yīng)性接近時(shí)，所述第二反應(yīng)基團(tuán)對(duì)所述第一反應(yīng)基團(tuán)來說是反應(yīng)性的。將所述第一探針與所述第二探針與用于測(cè)試生物學(xué)靶標(biāo)存在的樣品在下述條件下結(jié)合，所述條件下所述第一和第二結(jié)合部分與生物學(xué)靶標(biāo)結(jié)合。允許所述第二寡核苷酸與所述第一寡核苷酸雜交，使所述第一和第二反應(yīng)基團(tuán)開始反應(yīng)性接近。檢測(cè)所述第一和第二反應(yīng)基團(tuán)之間的反應(yīng)，從而測(cè)定生物學(xué)靶標(biāo)的存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一和第二反應(yīng)基團(tuán)之間的反應(yīng)產(chǎn)生熒光部分。在另一實(shí)施方案中，所述第一和第二反應(yīng)基團(tuán)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光和/或發(fā)色部分。
在另一方面，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)生物學(xué)靶標(biāo)的方法。所述方法包括下述這些。提供生物學(xué)靶標(biāo)和第一探針的結(jié)合復(fù)合物。所述第一探針包括(I)所述第一探針包含(I)對(duì)生物學(xué)靶標(biāo)具有親合力的第一結(jié)合部分，(2)第一寡核苷酸序列，和(3)與所述第一寡核苷酸序列結(jié)合的第一反應(yīng)基團(tuán)。將結(jié)合復(fù)合物與第二探針接觸。所述第二探針包括(I)對(duì)生物學(xué)靶標(biāo)具有親合力的第二結(jié)合部分，(2)第二寡核苷酸序列，和(3)與所述第二寡核苷酸序列結(jié)合的第二反應(yīng)基團(tuán)。所述第二寡核苷酸能夠與所述第一寡核苷酸序列雜交，且當(dāng)彼此開始反應(yīng)性接近時(shí)，所述第二反應(yīng)基團(tuán)對(duì)所述第一反應(yīng)基團(tuán)是反應(yīng)性的。允許所述第二寡核苷酸與所述第一寡核苷酸雜交，使所述第一和第二反應(yīng)基團(tuán)開始反應(yīng)性接近。檢測(cè)所述第一和第二反應(yīng)基團(tuán)之間的反應(yīng)，從而測(cè)定樣品中是否存在生物學(xué)靶標(biāo)。
在又一方面，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)生物學(xué)靶標(biāo)存在的方法。所述方法包括下述這些。允許第一探針和第二探針與靶標(biāo)結(jié)合。所述第一探針包括(I)對(duì)所述生物學(xué)靶標(biāo)具有親合力的第一結(jié)合部分，(2)第一寡核苷酸序列，和(3)與所述第一寡核苷酸序列結(jié)合的第一反應(yīng)基團(tuán)。所述第二探針包括(I)對(duì)所述生物學(xué)靶標(biāo)具有親合力的第二結(jié)合部分，(2)第二寡核苷酸序列，和(3)與所述第二寡核苷酸序列結(jié)合的第二反應(yīng)基團(tuán)。所述第二寡核苷酸能夠與所述第一寡核苷酸序列雜交。當(dāng)彼此開始反應(yīng)性接近時(shí)，所述第二反應(yīng)基團(tuán)對(duì)所述第一反應(yīng)基團(tuán)是反應(yīng)性的。允許所述第二寡核苷酸與所述第一寡核苷酸序列雜交，使所述第一和第二反應(yīng)基團(tuán)開始反應(yīng)性接近。檢測(cè)所述第一和第二反應(yīng)基團(tuán)之間的反應(yīng)，從而測(cè)定樣品中是否存在所述生物學(xué)靶標(biāo)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一和第二反應(yīng)基團(tuán)之間的反應(yīng)產(chǎn)生熒光部分。在另一實(shí)施方案中，所述第一和第二反應(yīng)基團(tuán)之間的反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光和/或發(fā)色部分。
圖8闡述了本發(fā)明的另一實(shí)施方案，其使用“壓縮碼”夾板結(jié)構(gòu)用于基于核酸模板的生物檢測(cè)。在該實(shí)施方案中，與靶標(biāo)結(jié)合部分直接與互補(bǔ)寡核苷酸(其雜交并開始核酸模板反應(yīng))連接(可選地通過間隔基團(tuán))不同，靶標(biāo)結(jié)合部分與“壓縮碼”寡核苷酸序列連接。每個(gè)相應(yīng)的報(bào)告寡核苷酸具有互補(bǔ)的、“壓縮碼”序列(除開始核酸模板反應(yīng)的“報(bào)告”序列外)O核酸模板化學(xué)反應(yīng)通過報(bào)告寡核苷酸的雜交開始，所述報(bào)告寡核苷酸與反應(yīng)并產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的反應(yīng)基團(tuán)連接。重要的是探針的每個(gè)寡核苷酸序列僅與其目的雜交配偶體互補(bǔ)，不與檢測(cè)體系中的其它寡核苷酸互補(bǔ)。
所述壓縮碼結(jié)構(gòu)支持產(chǎn)生信號(hào)報(bào)告子-寡核苷酸綴合物，所述綴合物會(huì)與不同的下游報(bào)告寡核苷酸通過 反壓縮碼序列裝配?？扇缦挛乃龊?jiǎn)單地測(cè)試與獨(dú)特的反壓縮碼連接的不同報(bào)告子文庫(kù):將化學(xué)計(jì)量的結(jié)合物-壓縮碼寡核苷酸與其互補(bǔ)壓縮碼的綴合物與每個(gè)獨(dú)特的壓縮碼混合。
圖9是對(duì)壓縮碼夾板結(jié)構(gòu)途徑的闡述，其中靶標(biāo)結(jié)合部分是兩個(gè)適體。在用說明性寡核苷酸序列和報(bào)告子化學(xué)(例如三苯膦、TPP和7-疊氮香豆素、AzC)檢測(cè)血小板衍生
的生長(zhǎng)因子(TOGF)的該例子中，通過壓縮碼序列(NNN......)與TPP報(bào)告寡核苷酸上互補(bǔ)
的反壓縮碼序列(N' N' N'......)的雜交將TPP報(bào)告寡核苷酸自我裝配至TOGF適體寡
核苷酸上。報(bào)告寡核苷酸末端是示例性的10堿基報(bào)告序列和5’-TPP基團(tuán)。帶有不同壓縮碼和反壓縮碼(成對(duì)彼此互補(bǔ))的獨(dú)立寡核苷酸對(duì)也自我裝配，以提供AzC報(bào)告序列和3’ -AzC基團(tuán)。AzC寡核苷酸與TPP寡核苷酸互補(bǔ)并反向平行，使得當(dāng)TPP和AzC寡核苷酸彼此退火時(shí)，TPP和AzC基團(tuán)端對(duì)端地終止。
圖10更詳細(xì)地闡述了用出性寡核苷酸序列和報(bào)告化學(xué)(TPP和AzC)檢測(cè)TOGF的壓縮碼夾板結(jié)構(gòu)途徑。首先，TPP對(duì)在5’端包括TOGF適體，C18基于聚乙二醇的間隔和18個(gè)成員的壓縮碼序列。TPP報(bào)告序列在其3’端包括互補(bǔ)的反壓縮碼序列，C18 PEG間隔，和終止于5’TPP基團(tuán)中的十堿基對(duì)報(bào)告序列。寡核苷酸的AzC對(duì)包括通過C18 PEG間隔與獨(dú)立壓縮碼連接的3’ -適體，和與5’反壓縮碼連接的檢測(cè)寡核苷酸，一個(gè)C18 PEG間隔和一個(gè)終止于3' AzC基團(tuán)中的報(bào)告寡核苷酸。
圖11闡述了相應(yīng)設(shè)計(jì)的例子，其中使用抗體代替適體作為靶標(biāo)結(jié)合部分。
“壓縮碼”途徑的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于下述能力:獨(dú)立地產(chǎn)生報(bào)告寡核苷酸，在維持結(jié)合物和核酸模板激活化學(xué)二者的活性的條件下將它們裝配在一起。
壓縮碼體系基于兩對(duì)寡核苷酸，通過獨(dú)特壓縮碼和壓縮碼對(duì)的堿基配對(duì)將每對(duì)結(jié)合。“壓縮碼”是與它們的互補(bǔ)序列特異結(jié)合的寡核苷酸序列，它們優(yōu)選被設(shè)計(jì)為使得:它們不與已知的基因組序列互補(bǔ)(如果樣品可能含有基因組DNA的話，則相關(guān))，具有相似的Tm值，缺乏顯著的二級(jí)結(jié)構(gòu)，不與檢測(cè)體系中其它的壓縮碼或反壓縮碼序列退火。
因此，本發(fā)明的另一方面提供了用于檢測(cè)生物學(xué)靶標(biāo)存在的方法。所述方法包括下述這些。提供第一探針，其包含(I)對(duì)所述生物學(xué)靶標(biāo)具有親合力的第一結(jié)合部分，和(2)第一寡核苷酸壓縮碼序列。提供第二探針，所述第二探針包含(I)對(duì)所述生物學(xué)靶標(biāo)具有親合力的第二結(jié)合部分，和(2)第二寡核苷酸壓縮碼序列。所述第一探針與第一報(bào)告探針雜交，所述第一報(bào)告探針包含(I)與所述第一寡核苷酸壓縮碼序列互補(bǔ)的寡核苷酸反壓縮碼序列，(2)第一報(bào)告子寡核苷酸，和(3)第一反應(yīng)基團(tuán)。所述第二探針與第二報(bào)告子探針雜交，所述第二報(bào)告子探針包含(I)與所述第二寡核苷酸壓縮碼序列互補(bǔ)的寡核苷酸反壓縮碼序列，(2)第二報(bào)告子寡核苷酸，和(3)第二反應(yīng)基團(tuán)。所述第二報(bào)告子寡核苷酸能夠與所述第一報(bào)告子寡核苷酸序列雜交，且當(dāng)彼此開始反應(yīng)性接近時(shí)，所述第二反應(yīng)基團(tuán)對(duì)所述第一反應(yīng)基團(tuán)來說是反應(yīng)性的。將所述第一和第二探針與用于測(cè)試所述生物學(xué)靶標(biāo)存在的樣品接觸。當(dāng)樣品中存在`所述生物學(xué)靶標(biāo)時(shí)，允許所述第一和第二探針與所述生物學(xué)靶標(biāo)結(jié)合，從而所述第二報(bào)告子寡核苷酸與所述第一報(bào)告子寡核苷酸雜交，使得所述第一和第二反應(yīng)基團(tuán)開始反應(yīng)性接近。檢測(cè)所述第一和第二反應(yīng)基團(tuán)之間的反應(yīng)，從而測(cè)定樣品中是否存在所述生物學(xué)靶標(biāo)。
值得指出的是，本發(fā)明的方法不要求對(duì)第一和/或第二寡核苷酸序列進(jìn)行酶連接或化學(xué)連接。
最優(yōu)化壓縮碼結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)中可考慮的因素包括例如(I)適體/抗體和壓縮碼(間隔I)之間的間隔基團(tuán)(例如寡核苷酸和/或非堿基基團(tuán))，用于例如允許雜交配偶體彼此到達(dá)，防止任何位阻；(2)壓縮碼序列的長(zhǎng)度，為了與反壓縮碼序列形成足夠穩(wěn)定的退火而形成復(fù)合物；和⑶反壓縮碼和報(bào)告序列之間的間隔基團(tuán)(間隔2)，用于例如防止任何位阻。
附著在寡核苷酸上的結(jié)合物(靶標(biāo)結(jié)合部分)可以是與靶標(biāo)分子特異結(jié)合并允許本發(fā)明的設(shè)計(jì)運(yùn)作的任何化學(xué)部分。例子包括大范圍的官能團(tuán)，例如(I)抗體，例如IgG、IgM、IgA、IgE、Fab' s、Fab'、F (ab) 2、Dab、Fv 或 ScFv 片段；(2)小分子結(jié)合物，例如抑制齊U、藥物、輔因子；⑶蛋白質(zhì)檢測(cè)報(bào)告子，反之亦然；(4)0嫩、1 應(yīng)、？嫩適體；(5)用于DNA結(jié)合的DNA序列和調(diào)節(jié)蛋白；(6)代表蛋白質(zhì)結(jié)合基序的肽；(7)通過噬菌體展示、隨機(jī)合成、誘變發(fā)現(xiàn)的肽；(8)天然結(jié)合蛋白質(zhì)對(duì)和復(fù)合物；(9)抗原(用于抗體檢測(cè))；和(10)獨(dú)立附著在兩個(gè)寡核苷酸上的單個(gè)多克隆抗體，其可用作不同特異性的兩個(gè)獨(dú)立結(jié)合物。
與寡核苷酸結(jié)合的靶標(biāo)結(jié)合部分可以是針對(duì)相同靶標(biāo)中不同位點(diǎn)的異種類型。例如，兩個(gè)結(jié)合物可以是兩個(gè)不同的抗體、一個(gè)抗體和一個(gè)受體、一個(gè)抗體和一個(gè)小分子結(jié)合物、一個(gè)受體和一個(gè)肽、一個(gè)適體和一個(gè)輔因子或任何其它組合。
靶標(biāo)待分析物可以是任何類型的，只要靶標(biāo)支持兩個(gè)(或更多)結(jié)合位點(diǎn)即可。兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)可相同或不同。位點(diǎn)相同的情況下，將不會(huì)獲得用兩個(gè)不同結(jié)合物所獲得的特異性提高的好處?？赏ㄟ^一對(duì)探針來檢測(cè)存在于單體形式和同型二聚體或更高聚合作用相的平衡之中的分子，所述探針含有相同的結(jié)合物但是不同的互補(bǔ)DNA序列。合適的靶標(biāo)包括蛋白質(zhì)、細(xì)胞表面、抗體、抗原、病毒、細(xì)菌、器官表面、膜、細(xì)胞器、固定細(xì)胞的原位分析、蛋白質(zhì)復(fù)合物。本發(fā)明可具體地適用于檢測(cè)融合蛋白(例如存在BCR和ABL時(shí)為BCR-ABL)。
圖12顯示了一個(gè)·實(shí)施方案——如何通過核酸模板化學(xué)使用熒光團(tuán)或發(fā)色團(tuán)的合成報(bào)告蛋白質(zhì)或小分子結(jié)合測(cè)定。在該例子中，五邊形所代表的蛋白質(zhì)結(jié)合物(如適體、抗體或小分子結(jié)合物)與末端具有反應(yīng)基團(tuán)X的寡核苷酸(“模板”)綴合。樣品與結(jié)合物-模板混合，如果存在目的待分析物(用圈代表)，則形成復(fù)合物。去除多余的結(jié)合物-模板，并添加帶有反應(yīng)基團(tuán)Y的探針和與上述模板互補(bǔ)的寡核苷酸。寡核苷酸的雜交使得X和Y之間的反應(yīng)起始，從而產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)分子(例如熒光團(tuán)或發(fā)色團(tuán))。
信號(hào)分子(用星號(hào)代表)可保持與探針-模板雜交體結(jié)合，或可從復(fù)合物被釋放。待分析物可與固相結(jié)合，或可游離于溶液中，只要在添加帶有Y的探針之前去除多余的結(jié)合物-模板即可。
因?yàn)槟０搴吞结槳?dú)特地編碼對(duì)報(bào)告子的合成，并且可以預(yù)見到許多不同的報(bào)告子，因此可設(shè)計(jì)多路體系(multiplex system)。例如?？蓜?chuàng)造具有間隔(例如均勻間隔)發(fā)射的一列熒光團(tuán)，允許同時(shí)檢測(cè)兩種、三種、四種、物種或更多的待分析物。另外，可設(shè)計(jì)一種體系，其中同時(shí)產(chǎn)生有色和熒光化合物。
在探針設(shè)計(jì)中，一個(gè)考慮是帶有反應(yīng)基團(tuán)的兩個(gè)報(bào)告序列的Tm。由于不存在靶標(biāo)時(shí)雙鏈體的TmS當(dāng)?shù)陀谑覝?，因此該序列通常?yīng)當(dāng)較短，例如6-15個(gè)堿基和/或富含A-T。10堿基對(duì)的典型報(bào)告子長(zhǎng)度在低鹽濃度下可具有30°C左右的Tm。因此，通常甚至對(duì)短序列也需要添加10%到40%體積/體積的甲酰胺，將溫度進(jìn)一步降低至低于測(cè)定溫度，或提高測(cè)定溫度。非常短的報(bào)告寡核苷酸可遭受特異性缺乏并對(duì)不期望的壓縮碼序列(當(dāng)使用這些序列時(shí))顯示部分結(jié)合。
探針設(shè)計(jì)中的另一因素是結(jié)合部分和報(bào)告序列之間包括任何壓縮碼序列的寡核苷酸的長(zhǎng)度。它們必需足夠長(zhǎng)，使得報(bào)告子寡核苷酸能彼此到達(dá)并退火。序列可用聚乙二醇(PEG)接頭分散，所述接頭是彈性的，并可提供針對(duì)任何位阻的額外保護(hù)。例如，寡核苷酸總長(zhǎng)度可在35堿基長(zhǎng)左右。也可使用含0、1廣義2個(gè)C18 PEG間隔的寡核苷酸或同聚物束(即Cltl)。
第三個(gè)考慮是使用壓縮和反壓縮序列時(shí)它們的長(zhǎng)度(即圖9和圖34)。除了需要每個(gè)壓縮碼僅與其反壓縮碼退火而不與任何其它壓縮碼、反壓縮碼或報(bào)告序列退火外，一個(gè)重要的參數(shù)是壓縮碼和反壓縮碼之間雙鏈體的τπ。該TmS當(dāng)顯著高于測(cè)定中會(huì)使用的最高溫度，使得報(bào)告寡核苷酸保持與結(jié)合部分牢固地結(jié)合。在實(shí)踐中，約為報(bào)告序列長(zhǎng)度兩倍的壓縮碼(即總長(zhǎng)度為15-30堿基)是想要的，其通常滿足這些標(biāo)準(zhǔn)。
關(guān)于信號(hào)產(chǎn)生的方面，可使用核酸模板化學(xué)產(chǎn)生或消除影響光學(xué)信號(hào)的標(biāo)簽，例如產(chǎn)生或消除熒光、化學(xué)發(fā)光或發(fā)色分子。另外，可對(duì)檢測(cè)反應(yīng)加以設(shè)計(jì)，來產(chǎn)生或消除直接或間接產(chǎn)生可檢測(cè)標(biāo)簽的產(chǎn)物，例如下述這些產(chǎn)物，所述產(chǎn)物催化產(chǎn)生光學(xué)標(biāo)簽的反應(yīng)；抑制產(chǎn)生光學(xué)標(biāo)簽的反應(yīng)；是突光淬滅劑；是突光能量轉(zhuǎn)移分子；產(chǎn)生Ramen標(biāo)簽；產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光標(biāo)簽(即ruthernium bipyridyl);生產(chǎn)電子自旋標(biāo)簽分子。
另外，可對(duì)檢測(cè)反應(yīng)加以設(shè)計(jì)，以包括“無標(biāo)簽”檢測(cè)。可使用核酸模板化學(xué)來產(chǎn)生或消除可通過分子的固有天然性質(zhì)辨別的分子，例如下述產(chǎn)物，所述產(chǎn)物產(chǎn)生光散射標(biāo)簽或聚集；可通過微量量熱法檢測(cè)；可通過表面等離振子共振(即與固定的抗體結(jié)合)檢測(cè)(例如表位)；產(chǎn)生或破壞被抗體識(shí)別的表位(即ELISA);通過質(zhì)譜法測(cè)量具有可辨別的質(zhì)量；具有改變的尺寸，可通過光散射、凝膠電泳或尺寸排除色譜辨別；具有改變的疏水性或離子含量，可通過色譜辨別；具有改變的對(duì)親和色譜分離的親和力。
本發(fā)明的另一方面提供了可用于檢測(cè)生物學(xué)待分析物的試劑盒。所述試劑盒包括第一探針，其包括(I)對(duì)所述生物學(xué)待分析物具有親合力的第一結(jié)合部分，(2)第一寡核苷酸序列，和(3)與所述第一寡核苷酸序列結(jié)合的第一反應(yīng)基團(tuán)；和第二探針，其包含(I)對(duì)所述生物學(xué)待分析物具有親合力的第二結(jié)合部分，(2)第二寡核苷酸序列，和(3)與所述第二寡核苷酸序列結(jié)合的第二反應(yīng)基團(tuán)。所述第二寡核苷酸能夠與所述第一寡核苷酸序列雜 交。當(dāng)彼此開始反應(yīng)性接近時(shí)，所述第二反應(yīng)基團(tuán)對(duì)所述第一反應(yīng)基團(tuán)來說是反應(yīng)性的。
在又一方面，本發(fā)明提供了可用于檢測(cè)生物學(xué)待分析物的試劑盒。所述試劑盒包括第一探針，其包括(I)對(duì)所述生物學(xué)靶標(biāo)具有親合力的第一結(jié)合部分，和(2)第一寡核苷酸壓縮碼序列；和第二探針，所述第二探針包含(I)對(duì)所述生物學(xué)靶標(biāo)具有親合力的第二結(jié)合部分，和(2)第二寡核苷酸壓縮碼序列。所述第一探針能夠與第一報(bào)告探針雜交，所述第一報(bào)告探針包含(I)與所述第一寡核苷酸壓縮碼序列互補(bǔ)的寡核苷酸的反壓縮碼序列，(2)第一報(bào)告子寡核苷酸，和(3)第一反應(yīng)基團(tuán)。所述第二探針能夠第二報(bào)告探針雜交，所述第二報(bào)告探針包含(I)與所述第二寡核苷酸壓縮碼序列互補(bǔ)的寡核苷酸反壓縮碼序列，
(2)第二報(bào)告子寡核苷酸，和(3)第二反應(yīng)基團(tuán)。所述第二報(bào)告子寡核苷酸能夠與所述第一報(bào)告子寡核苷酸序列雜交，且當(dāng)彼此開始反應(yīng)性接近時(shí)，所述第二反應(yīng)基團(tuán)對(duì)所述第一反應(yīng)基團(tuán)來說是反應(yīng)性的。
本發(fā)明包括下述試劑盒，所述試劑盒提供本文所述的一種、兩種或更多探針。更具體地，本發(fā)明包括提供一種、兩種或更多探針的試劑盒，所述探針利用核酸模板化學(xué)用于產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)，作為檢測(cè)生物學(xué)靶標(biāo)(例如核酸和蛋白質(zhì))存在的一種手段。
報(bào)告子化學(xué)
香豆素
香豆素可用于報(bào)告化學(xué)中，特別是7-位上帶有供電子取代基的香豆素。下文的流程圖闡述了如何使用核酸模板化學(xué)完成從7-疊氮香豆素(已知是非熒光的)到7-氨基衍生物(熒光的)的還原。
制備第I寡核苷酸
權(quán)利要求
1.用于檢測(cè)生物學(xué)靶標(biāo)的方法，所述方法包括； (a)提供第一探針，所述第一探針包含(I)對(duì)生物學(xué)靶標(biāo)具有親合力的第一結(jié)合部分，(2)第一寡核苷酸序列，和(3)與所述第一寡核苷酸序列結(jié)合的第一反應(yīng)基團(tuán)； (b)提供第二探針，所述第二探針包含(I)對(duì)生物學(xué)靶標(biāo)具有親合力的第二結(jié)合部分，(2)第二寡核苷酸序列，和(3)與所述第二寡核苷酸序列結(jié)合的第二反應(yīng)基團(tuán)，其中所述第二寡核苷酸能夠與所述第一寡核苷酸雜交，且當(dāng)彼此開始反應(yīng)性接近時(shí)，所述第二反應(yīng)基團(tuán)對(duì)所述第一反應(yīng)基團(tuán)來說是反應(yīng)性的； (c)將所述第一探針與所述第二探針與用于測(cè)試生物學(xué)靶標(biāo)存在的樣品在下述條件下結(jié)合，所述條件下所述第一和第二結(jié)合部分與生物學(xué)靶標(biāo)結(jié)合； (d)允許所述第二寡核苷酸與所述第一寡核苷酸雜交，使所述第一和第二反應(yīng)基團(tuán)開始反應(yīng)性接近，其中所述第一和第二反應(yīng)基團(tuán)彼此進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)從而產(chǎn)生反應(yīng)產(chǎn)物；和 (e)檢測(cè)所述反應(yīng)產(chǎn)物是否存在,如果存在所述反應(yīng)產(chǎn)物則表示存在所述生物學(xué)靶標(biāo)。
2.權(quán)利要求
1所述的方法，其中所述第一探針還包含所述第一結(jié)合部分和所述第一寡核苷酸序列之間的第一接頭。
3.權(quán)利要求
1所述的方法，其中所述第二探針還包含所述第二結(jié)合部分和所述第二寡核苷酸序列之間的第二接頭。
4.權(quán)利要求
1所述的方法，其中所述生物學(xué)靶標(biāo)是蛋白質(zhì)。
5.權(quán)利要求
1所述的方法，其中所述生物學(xué)靶標(biāo)是自身抗體。
6.權(quán)利要求
1所述的方法，其中所述生物學(xué)靶標(biāo)是細(xì)胞。
7.權(quán)利要求
1所述的方法，其中所述第一和第二結(jié)合部分中至少一個(gè)是針對(duì)所述生物學(xué)靶標(biāo)的抗體。
8.權(quán)利要求
1所述的方法，其中所述第一和第二結(jié)合部分均為針對(duì)所述生物學(xué)靶標(biāo)的抗體。
9.權(quán)利要求
1所述的方法，其中所述第一和第二結(jié)合部分中至少一個(gè)不是針對(duì)所述生物學(xué)靶標(biāo)的抗體。
10.權(quán)利要求
1所述的方法，其中所述第一和第二結(jié)合部分中至少一個(gè)是與所述生物學(xué)靶標(biāo)結(jié)合的適體。
11.權(quán)利要求
1所述的方法，其中所述第一和第二結(jié)合部分均為與所述生物學(xué)靶標(biāo)結(jié)合的適體。
12.權(quán)利要求
1所述的方法，其中所述第一和第二結(jié)合部分中至少一個(gè)是小分子結(jié)合物。
13.權(quán)利要求
1所述的方法，其中所述第一和第二結(jié)合部分均為小分子結(jié)合物。
14.權(quán)利要求
1所述的方法，其中所述第一寡核苷酸序列和所述第二寡核苷酸序列包含6到30個(gè)堿基的互補(bǔ)區(qū)。
15.權(quán)利要求
1所述的方法，其中所述第一和第二反應(yīng)基團(tuán)之間的反應(yīng)產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物是熒光部分。
16.權(quán)利要求
1所述的方法，其中所述第一和第二反應(yīng)基團(tuán)之間的反應(yīng)產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物是化學(xué)發(fā)光部分或發(fā)色部分。
17.權(quán)利要求
1所述的方法，其中當(dāng)所述樣品中不含所述生物學(xué)靶標(biāo)時(shí)，基本不產(chǎn)生可檢測(cè)的反 應(yīng)產(chǎn)物。
專利摘要
本發(fā)明提供了用于檢測(cè)生物靶標(biāo)(例如核酸和蛋白質(zhì))的組合物和方法，所述方法通過核酸模板化學(xué)，例如通過產(chǎn)生熒光、化學(xué)發(fā)光和/或發(fā)色信號(hào)來實(shí)現(xiàn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GKCN101248189 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請(qǐng)?zhí)朇N 200680027521
公開日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2006年5月26日
發(fā)明者詹姆斯·M·庫(kù)爾, 安德魯·M·斯登, 勞倫斯·A·哈夫, 芭芭拉·S·福克斯, 黃玉梅 申請(qǐng)人:通信改革公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (1), 非專利引用 (2),