專利名稱:非還原性糖類生成酶及其制備和應(yīng)用的制作方法
非還原性糖類生成酶及其制備和應(yīng)用
本發(fā)明涉及一種新的非還原性糖類生成酶，以及它的制備和應(yīng)用。更具體地說，涉及這樣一種新的還原性糖類生成酶:當(dāng)其作用于一種或多種具有3個(gè)或3個(gè)以上的葡萄糖聚合度的還原性淀粉部分水解產(chǎn)物時(shí)，生成一種具有海藻糖結(jié)構(gòu)的非還原性糖類，還涉及這種酶的制備，以及能夠產(chǎn)生這種酶的微生物。本發(fā)明還涉及含有可由這種酶制備的以海藻糖結(jié)構(gòu)為末端單元的非還原性糖類的組合物，含有上述非還原性糖類的還原性比較低的糖類，和/或由這種糖類所制備的海藻糖。
海藻糖或α，α-海藻糖長期以來一直被認(rèn)為是由葡萄糖單元組成的非還原性糖類。正如在 Advance in Carbohydrate Chemistry, 18 卷，第 201-225 (1963)中(由美國的 Academic Press 出版)和在 Appliedand Environmental Microbiology,第 56 卷，3213-3215頁(1990)中所公開的,海藻糖廣泛存在于微生物、蘑燕和昆蟲中，但含量較低。由于非還原性糖類包括不會(huì)與具有氨基的物質(zhì)，如氨基酸和蛋白質(zhì)反應(yīng)的海藻糖，所以它們即不會(huì)引起氨基-羰基反應(yīng)，也不會(huì)改變含有氨基酸的物質(zhì)。因此，非還原性糖類被認(rèn)為可以使用而不用擔(dān)心會(huì)引起不理想的褐變和變質(zhì)。因?yàn)樯鲜鲈?，就迫切需要建立一種制備這種還原糖的方法。
在海藻糖的傳統(tǒng)制備方法中，和在日本專利公開號(hào)N0.154, 485, 75中所公開的，采用的微生物，或者如日本專利公開號(hào)N0.216，695/83中提出的，同時(shí)采用麥芽糖酶-和麥芽糖磷酸化酶將麥芽糖轉(zhuǎn)化成海藻糖。然而，前一種方法不適于工業(yè)規(guī)模的制備，因?yàn)楹Ｔ逄窃谧鳛樵牧系奈⑸镏械暮恳愿晒腆w物計(jì)(d.s.b.)低于15w/w% (“w/w%”的表達(dá)形式在說明書中可簡化為％，除非另有說明)，且分離和提純步驟復(fù)雜。而后一種方案具有如下缺點(diǎn):
(i)因?yàn)楹Ｔ逄鞘峭ㄟ^葡萄糖-1-磷酸生成的，作為底物的麥芽糖不能以較高的濃度使用；(ii)因?yàn)榱姿峄复俜磻?yīng)體系是可逆反應(yīng)，所以目的產(chǎn)物海藻糖的產(chǎn)量較低；
(iii)要保持該反應(yīng)體系的穩(wěn)定和順利延續(xù)其酶促反應(yīng)實(shí)際上是困難的。
關(guān)于海藻糖的制備，在“Food Chemicals”，N0.88，67-72頁(1992年8月)上題為“Current Status of Starch Application Developmentand Related Problems，，的章節(jié)中的標(biāo)題為“Oligosaccharides”的專欄中有報(bào)道:“盡管海藻糖具有廣泛的用途，但是通過直接糖轉(zhuǎn)移反應(yīng)或水解反應(yīng)的酶促制備海藻糖的方法在本領(lǐng)域被認(rèn)為從科學(xué)上來講是不可能的。”因此，以淀粉為材料酶促制備海藻糖的方法被認(rèn)為從科學(xué)上講是極為困難的。
業(yè)已知道，由淀粉材料，如液化淀粉、環(huán)狀糊精和麥芽寡糖制備的淀粉的部分水解產(chǎn)物通常以還原性末端基團(tuán)為末端單元。在說明書中，這種淀粉的部分水解產(chǎn)物被稱為“非還原性的淀粉部分水解產(chǎn)物”。這種還原性淀粉部分水解產(chǎn)物的還原能力通常表達(dá)為以其干固體物重計(jì)的“葡萄糖當(dāng)量(DE)值”。 業(yè)已知道，還原性淀粉部分水解產(chǎn)物中那些具有較高的DE值的產(chǎn)物通常具有較低的分子量和粘度，以及較高的適宜甜度和反應(yīng)性，且易與含有氣基的物質(zhì)如氣基酸和蛋白質(zhì)反應(yīng)，使其品質(zhì)發(fā)生不理想的揭變、發(fā)臭和變質(zhì)。
還原性淀粉部分水解產(chǎn)物的這些不利特性根據(jù)其DE值有所變化，且還原性淀粉部分水解產(chǎn)物與其DE值之間的關(guān)系是極為重要的。甚至在本領(lǐng)域中一直認(rèn)為要打破這種關(guān)系是不可能的。
打破這種關(guān)系的唯一途徑是一種在較高的氫壓下通過氫化還原性淀粉部分水解產(chǎn)物將其還原性末端基團(tuán)轉(zhuǎn)化成羥基而將這種水解產(chǎn)物制成非還原性糖類。不過，這種方法需要高壓滅菌鍋并耗費(fèi)大量的氫和能源，而且還需要較高的水平的控制或安全設(shè)施以免發(fā)生災(zāi)難。還原性部分淀粉水解產(chǎn)物與所得產(chǎn)物不同，因?yàn)榍罢哂善咸烟菃卧M成，而后者，即所得淀粉部分產(chǎn)物的糖醇則是由葡萄糖和山梨醇組成，當(dāng)將其用在人體上時(shí)可能導(dǎo)致出現(xiàn)消化紊亂或腹瀉癥狀。因此，迫切需要建立一種降低甚至消除還原性淀粉部分水解產(chǎn)物的還原能力而又不改變以葡萄糖單元作為其組分糖的狀況的方法。
本發(fā)明的目的是要提供一種新的非還原性糖類及其應(yīng)用，并由還原性淀粉部分水解產(chǎn)物來制備，以使打破傳統(tǒng)上認(rèn)為的還原性部分淀粉部分水解產(chǎn)物和其DE值之間的關(guān)系，并揭示這種非還原性糖類的新用途。
為達(dá)上述目的，本發(fā)明人廣泛篩選了能產(chǎn)生一種新的非還原性糖類生成酶的微生物，當(dāng)這種酶作用于還原性淀粉部分水解產(chǎn)物時(shí)，可生成具有海藻糖結(jié)構(gòu)的非還原性糖類。
結(jié)果，從日本岡山市和Soja市的土壤中分別分離出了根瘤菌屬(Rhizobium)的新微生物，命名為“Rhizobium Sp.M-1I”,和節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)的新微生物,命名為iiArthrobacter Sp.Q36” ；并發(fā)現(xiàn)上述微生物能產(chǎn)生非還原性糖生成酶，當(dāng)這種酶作用于還原性淀粉部分水解產(chǎn)物時(shí)，能生成具有海藻糖結(jié)構(gòu)的非還原性糖類，而且當(dāng)這種酶作用于還原性淀粉部分水解產(chǎn)物時(shí)容易制備出所需要的非還原性糖類。
我們還發(fā)現(xiàn)，通過先將這種酶作用于還原性淀粉部分水解產(chǎn)物再將所得非還原性糖類用葡萄糖淀粉酶或α-葡萄糖苷酶處理可很容易地制備出海藻糖。這樣，本發(fā)明人完成了這一發(fā)明。此外，我們還從常規(guī)微生物中廣泛篩選了能產(chǎn)生這種酶的微生物。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，短桿菌屬(Brevibacterium)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、微珠菌屬(Micrococcus)、彎曲桿菌(Curtobac`terium)和土桿菌屬(Terrabacter)的微生物與根瘤菌屬和節(jié)桿菌屬的微生物一樣能產(chǎn)生這種非還原性糖類生成酶，并且我們完成了這一發(fā)明。另外，我們建立了制備含有這種非還原性糖類及含非還原性糖類的還原性較低的糖類和/或由這種糖類制成的海藻糖的組合物如食品、化妝品和藥品的制品方法，而且我們完成了這一發(fā)明。
本發(fā)明所涉及的微生物Rhizobium sp.Μ-11以及Arthrobacter sp.Q36分別于1994年6月13日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，武漢，武漢大學(xué)內(nèi))，其保藏號(hào)分別為 CCTCC M94031 和 CCTCC M94030。

圖1表示溫度對(duì)由根瘤菌屬的Rhizobium SP.M-1l菌獲得的非還原性糖類生成酶的活性的影響。
圖2表示pH值對(duì)由根瘤菌屬的Rhizobium SP.M-1l菌獲得的非還原性糖類生成酶的活性的影響。
圖3表示由Rhizibium SP.M-1l菌獲得的非還原性糖類生成酶的熱穩(wěn)定性。
圖4表示由Rhizibium SP.M-1l菌獲得的非還原性糖類生成酶的pH穩(wěn)定性。
圖5表示溫度對(duì)由節(jié)桿菌屬的Arthrobacter SP.Q36菌獲得的非還原性糖類生成酶的活性的影響。
圖6表示pH值對(duì)由Arthrobacter SP.Q36菌獲得的非還原性糖類生成酶的活性的影響。
圖7表示由Arthrobacter SP.Q36菌獲得的非還原性糖類生成酶的熱穩(wěn)定性。
圖8表示由Arthrobacter SP.Q36獲得的非還原性糖類生成酶的pH穩(wěn)定性。
本發(fā)明涉及一種新的非還原性糖類生成酶，以及它的制備和應(yīng)用。本發(fā)明還涉及能夠產(chǎn)生這種酶的微生物，用這種酶所制備的非還原性糖類含有所說非原性糖類的相對(duì)低還原性糖類，由這些糖類制備的海藻糖、以及含有這些糖類和海藻糖的之一和兩者的組合物。
本發(fā)明人廣泛篩選了能夠產(chǎn)生一種新的非還原性糖類生成酶的微生物，當(dāng)這種酶作用于還原性淀粉部分水解產(chǎn)物時(shí)能生成具有海藻糖結(jié)構(gòu)的非還原性糖類，最終發(fā)現(xiàn)了目標(biāo)微生物。
現(xiàn)在，本發(fā)明人首先闡述 該根瘤菌屬微生物，即本發(fā)明的“Rhizobium Sp.M_ll”菌的鑒定試驗(yàn)。該試驗(yàn)是按照在“Bisebutsu-no-Bunvu1-to-Dotei” (微生物分類和鑒定)中所述方法進(jìn)行的。該書由Takej Hasegawa編輯，由日本科協(xié)出版社出版，日本，東京1985)。結(jié)果如下:
A.形態(tài)學(xué)
當(dāng)在27°C在營養(yǎng)瓊脂中培育時(shí)細(xì)胞的特征:
一般呈 0.6 0.8 X 1.0 1.5 μ m 的桿狀；
一般單獨(dú)存在，但偶爾也以偶聯(lián)或接合形式存在；
不表現(xiàn)出多形性；
具有游動(dòng)性、不產(chǎn)孢子性和鞭毛；
不耐酸；
革蘭氏染色:陰性；
胞襄:無；
異染粒:有；
能積累多羥丁酸。
B.培養(yǎng)特性
(I)當(dāng)在27°C在營養(yǎng)瓊脂板中培養(yǎng)時(shí)所形成的菌落的特征形狀:在培養(yǎng)24小時(shí)之后圓形菌落的直徑為1.5mm左右；
邊緣:完整；
突出物:平均或半球形；
光澤:有；
表面:光滑；
顏色:乳白色半透明；
(2)在27°C溫度下，在含有葡萄糖和胰蛋白胨的瓊脂板上培養(yǎng)時(shí)所形成菌落的特征
乳白色半透明菌落具有類粘蛋白；
(3)在27°C溫度下，在含有酵母抽提物和甘露醇的瓊脂板上培養(yǎng)時(shí)所形成菌落的特點(diǎn)
形狀:培養(yǎng)5天后，圓形菌落的直徑為3mm左右；[0048]顏色:乳白色半透明菌落具有類粘蛋白；
(4)在27°C溫度下，在含有酵母抽提物、甘露醇和剛果紅的瓊脂板上培養(yǎng)時(shí)所形成菌落的特征
呈淺桃紅色且基本上不吸收剛果紅；
(5)在27°C的溫度下，在含有酵母抽提物、甘露醇和2W/v% NaCl的瓊脂板上生長;
(6)在27°C溫度下，在營養(yǎng)瓊 脂斜面上培養(yǎng)時(shí)所形成菌落的特征
生長:令人滿意；
形狀:絲狀；并且
(7)在27°C溫度下在營養(yǎng)明膠上穿刺培養(yǎng)時(shí)不會(huì)液化明膠。
C.生理特性
(I)硝酸還原作用:陽性
(2)反硝化作用:陰性
(3)甲基紅測驗(yàn):陰性
⑷VP-測驗(yàn):陰性
(5)吲哚生成:陰性
(6)硫化氫生成:陽性
(7)淀粉水解:陰性
(8)檸檬酸的利用:陽性
(9)無機(jī)氮源的利用:
利用了銨鹽和硝酸鹽；
(10)色素的生成:未生成可溶的色素；
(11)脲酶:陽性
(12)氧化酶:陰性
(13)過氧化氫酶:陽性
(14)生長條件:在ρΗ5.5-9.0和溫度4_35°C范圍內(nèi)生長；
(15)需氧情況:需氧；
(16)碳源的利用和酸的生成
權(quán)利要求
1.制備如下式所示非還原性糖類或者含有該非還原性糖類的糖組合物的方法，
Gn-T 其中，符號(hào)“G”表示葡萄糖殘基；“η”為一個(gè)或多個(gè)整數(shù)；“T”表示α，α-海藻糖， 該方法包括步驟: (a)將淀粉物質(zhì)部分水解，獲得含有直鏈淀粉和/或麥芽寡糖的還原性淀粉部分水解產(chǎn)物； (b)將能夠形成如上式所示非還原性糖類的酶作用于步驟(a)中所述還原性淀粉部分水解產(chǎn)物，以形成所述非還原性糖類或者含有該非還原性糖類的糖組合物；和 (C)收集所得到的非還原性糖類或者含有該非還原性糖類的糖組合物； 其中步驟(b)中所述能夠形成如上式所示非還原性糖類的酶來自從根瘤菌屬(Rhizobium)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、短桿菌屬(Brevibacterium)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、微珠菌屬(Micrococcus)、彎曲桿菌(Curtobacterium)和土桿菌屬(Terrabacter)的微生物中選擇的微生物,而且具有以下物理化學(xué)特性: (1)作用 當(dāng)作用于具有3個(gè)或3個(gè)以上葡萄糖聚合度的一種或多種還原性淀粉部分水解產(chǎn)物時(shí)，生成以海藻糖結(jié)構(gòu)為末端單元的非還原性糖類； (2)最適溫度 當(dāng)在pH 7.0條件下培養(yǎng)60分鐘時(shí)為35-40°C ； (3)最適pH 當(dāng)在40°C溫度下培養(yǎng)60分鐘時(shí)為pH 6.4-7.2 ； (4)熱穩(wěn)定性 當(dāng)在pH 7.0培養(yǎng)60分鐘時(shí)在高達(dá)35-40°C的溫度下是穩(wěn)定的； (5)pH穩(wěn)定性 當(dāng)在25°C培養(yǎng)16小時(shí)時(shí)，在5.5 11.0的pH范圍是穩(wěn)定的； (6)分子量 通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測得為76，000-87, 000道爾頓； (7)等電點(diǎn)(PI) 在利用兩性電解質(zhì)進(jìn)行等電電泳時(shí)為3.6-4.6 ； 所述酶具有一個(gè)或多個(gè)從下組中選擇的部分氨基酸序列: (1)X1-精氨酸-蘇氨酸-脯氨酸-X2-絲氨酸-蘇氨酸-酪氨酸-精氨酸-亮氨酸，其中“X/’指纈氨酸或甲硫氨酸，“X2”指丙氨酸或纈氨酸；
(2)Gly-Val-Glu-Asp-Thr-Ala-Phe-Phe-Arg-Tyr-；
(3)Leu-Val-Gln-Leu-Thr-Met-Pro-Gly-Val-Pro-;和
(4)Glu-Gly-Arg-X3-Ser-X4-Tyr-Ala-X5-Ala,其中 “X3” 指 Gly 或 Gln:“X4” 指 Pro 或Arg ;“X5” 指 Val 或 Glu。
2.如權(quán)利要求
1所述的方法，其中用選自由α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶和α-葡糖苷酶組成的組的一種或者多種酶將步驟(C)中所述非還原性糖類進(jìn)一步水解。
3.如權(quán)利要求
1所述的方法，其中步驟(c)還包括將所得到的混合物中的殘余還原性糖類氫化成糖醇類。
4.如權(quán)利要求
1所述的方法，其中步驟(c)還包括將所得到的混合物用離子交換劑進(jìn)行柱層析，以除去雜質(zhì)。
專利摘要
公開了一種新的非還原性糖類生成酶及其制備和應(yīng)用。這種酶可從Rhizobium Sp.M-11(FERMBP4130)和Arthrobacter Sp.Q36(FERM BP-4316)等微生物的培養(yǎng)物中獲取，當(dāng)其作用于還原性淀粉部分水解產(chǎn)物時(shí)可生成具有海藻糖結(jié)構(gòu)的非還原性糖類。當(dāng)葡萄糖淀粉酶和α-葡糖苷酶作用于這種非還原性糖類時(shí)，易于產(chǎn)生海藻糖。這種非還原性糖類和海藻糖可廣泛應(yīng)用于食品、化妝品和藥品中。
文檔編號(hào)C12N9/24GKCN101186939 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請(qǐng)?zhí)朇N 200710180720
公開日2013年5月29日 申請(qǐng)日期1994年6月27日
發(fā)明者丸田和彥, 久保田倫夫, 杉本利行, 三宅俊雄 申請(qǐng)人:株式會(huì)社林原生物化學(xué)研究所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (2), 非專利引用 (1),