專利名稱:用于數(shù)字多重pcr測定的裝置和方法
用于數(shù)字多重PCR測定的裝置和方法
本申請要求2006年11月29日提交的臨時專利申請系列號 60/867， 459的優(yōu)先權，其通過引用合并入本文。
發(fā)明背景
發(fā)明領域
本發(fā)明涉及使用連續(xù)流式多重測定的方法，更具體地，使用其中 將結果轉換成數(shù)字格式的連續(xù)流式多重測定的方法?？蓪Χ鄠€患者樣 品中的每一個樣品進行多重測定，從而允許高水平的復用性 (multiplexing)和靈活性 。
相關技術的論述
目前，多重聚合酶鏈式反應("PCR，，)以靜態(tài)形式進行，其中各 反應在分開的試管、毛細管或多孔板的孔中完成。在所有情況下，可 進行的PCR反應的數(shù)目受到固定形式中的位置的數(shù)目限制。最常見地， 使用可允許例如一個待測試患者DNA樣品進行達到96個不同PCR測定 的96孔格式。在該格式中，可增加被檢測的患者DNA樣品的數(shù)目，但 以減少可進行的不同PCR測定的數(shù)目為代價。例如，在96孔格式中， 可檢測24個不同的患者DNA樣品，但只能進行4個PCR測定。更近以 來，已引入384孔板格式，其增加了可進行的患者-測定組合的數(shù)目， 但是如果需要進行100個不同的PCR測定，即使該格式也不能容納超 過3個患者的DNA樣品。
允許詢問(interrogation)數(shù)千個基因座的DNA微陣列是對基 于板的測定的限制的另 一選擇，但至關重要的不利方面是對輸出數(shù)據(jù) 的可靠性的限制、進行此類測定所需的高昂的費用和長時間以及微陣列是不允許最終用戶按需要改變測定的固定格式。
許多診斷患者的疾病狀態(tài)、診斷發(fā)生疾病的風險或預測患者對不
同治療性藥物的反應的新型診斷PCR測定關注于鑒定單核苷酸多態(tài)性 (SNP)。在大多數(shù)情況下，多個SNP的確定是精確診斷或預測治療反應 所必需的。繪制人基因組中的所有SNP圖語的努力不斷地增加與特定 疾病狀態(tài)或治療結果關聯(lián)的SNP的數(shù)目。同時進行數(shù)十個測定的多重 分析是許多診斷和治療預測應用所必需的。目前存在對允許高復用性 和靈活性格式以容納新靶(當需要時)的PCR測定格式的未滿足的需 要。
熱解鏈分析(thermal melting analysis )目前在本領域中用于 在基于PCR的測定中區(qū)分SNP。Wittwer已公開了利用熒光分子測定核 酸的熱解鏈特征和基于熱解鏈特征區(qū)分SNP的方法和裝置。(參見美國 專利6，174，670、 6, 140, 054、 6, 472,156、 6, 753, 141、 6， 569， 627和 美國專利申請公開號2003-0224434A1和2005-0233335Al)。然而，這
些方法和裝置遭受上述相同的限制。
發(fā)明概述
本文中描述的發(fā)明使得熱解鏈分析能夠用于在連續(xù)流式PCR微流 控芯片(microfluidic chip)中進行的SNP檢測，從而產(chǎn)生多重檢測 的數(shù)字輸出。
連續(xù)流動格式允許單獨地和分別地監(jiān)控多重PCR+熱解鏈測定 (Thermal Melt assay)的單個PCR反應和熱解鏈，而不影響多重測 定中的其他PCR反應和熱解鏈。連續(xù)流動格式允許比96和384孔格式 程度更高的復用性，其是復雜的遺傳藥理學測定(pharmocogenetic assay)所必需的。連續(xù)流動格式比靜態(tài)的、固定的格式更靈活。此外， 用戶可規(guī)定使用的測定數(shù)目和進行它們的順序。數(shù)字輸出(例如，指 定陽性結果為"1"和陰性結果為"0"或反之亦然)簡化了結果的解 釋并且允許容易地將數(shù)據(jù)傳遞至數(shù)字媒介。
本發(fā)明的方面體現(xiàn)在使用包含多個反應通道的微流控芯片對多個樣品進行多重測定的方法。該方法包括步驟在多個反應通道的每 一個中提供連續(xù)的樣品流并且交替地向每一個通道導入一定量的試劑 材料和緩沖材料，從而沿著各通道的一部分長度形成包含與栽體液 (carrier fluid)順序交替的受試溶液團的連續(xù)流。受試溶液包含樣 品與試劑材料的混合物，而載體液包含樣品和緩沖材料的混合物。對 各通道內(nèi)的連續(xù)流進行擴增方法，然后在進行擴增方法后檢測由各受 試材料團發(fā)出的信號。分析被檢測的信號以確定目的核普酸在樣品材 料團內(nèi)的存在或不存在。通過將結果指定為1或0將分析步驟的結果 轉換成數(shù)字格式，其中表明目的核苷酸存在的結果被指定為1，表明 目的核苷酸不存在的結果被指定為0或反之亦然。
本發(fā)明的方面體現(xiàn)在用于進行上述方法的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括微 流控芯片，所述微流控芯片包含多個反應通道、各反應通道的相對末 端上的樣品池(sample well )和廢液池(waste well )、吸漿管(sipper )
且經(jīng)設計將由吸漿管汲取的物質(zhì)分配至每一個反應通道的通道網(wǎng)絡。 系統(tǒng)還包括溫度控制系統(tǒng)和光學成像系統(tǒng)，所述溫度控制系統(tǒng)經(jīng)設計 使受試溶液沿著每一個通道的界定的區(qū)段進行熱循環(huán)以在受試溶液中 進行實時PCR,所述光學成像系統(tǒng)與微流控芯片整合在一起或與之相 鄰并且經(jīng)設計用來照明各通道和在沿著各通道的許多位置上檢測熒光 信號。系統(tǒng)還包括經(jīng)編程使系統(tǒng)進行數(shù)字多重PCR測定的控制器。
本發(fā)明的其他方面，包括操作方法以及結構元件和功能元件的功 能和相互關系，將在考慮下列描述和所附的權利要求
，參考附圖后變 得更明了，其全都形成本公開內(nèi)容的部分，其中相同的參考數(shù)字指示 不同圖中的相應部分。
附圖概述

圖1是可用于執(zhí)行本發(fā)明的實時PCR結構的方框圖(block diagram);
圖2(A)是可用于實施本發(fā)明的微流控芯片的側視圖；
9圖2(B)是圖2(A)的微流控芯片的頂視圖；
圖2(C)是圖2(B)的微流控芯片的微流控通道的放大圖；
溫度圖；
圖4是顯示對30個患者DNA樣品和2個對照進行的8個多重測 定(每一個進行2次)的測定結果的陣列的表；和
圖5是舉例說明體現(xiàn)本發(fā)明的使用連續(xù)多重數(shù)字測定進行診斷或 預測的方面的方法的流程圖。
發(fā)明詳述
除非另外定義，本文中使用的所有技術和科學術語具有與本發(fā)明 所屬的領域內(nèi)的技術人員通常理解的含義相同的含義。雖然與本文中
施，但優(yōu)選的材料和方法描述于本文中。
圖1舉例說明可用于實施本發(fā)明的實時PCR結構的方框圖。系統(tǒng) 包括受試溶液貯器(reservoir) 101，其可以是包含多種受試溶液例 如受試樣品的貯器。系統(tǒng)還包括載體液貯器102。受試溶液貯器和/或 載體液貯器可在與微流控裝置連接的藥液筒(cartridge )例如在共同 轉讓的美國專利申請系列號11/850， 229 (其公開內(nèi)容通過引用合并入 本文)中描述的藥液筒內(nèi)包含小室。受試溶液可以基本上與載體液相 同，除了受試溶液包含所有必需的實時PCR試劑。實時PCR試劑混合 物可包含PCR引物、dNTP、聚合酶、鹽、緩沖液、表面鈍化劑 (surface—passivating agent)等。jt匕夕卜，實時PCR》'昆合凈勿可包含 非特異性熒光DNA檢測分子、序列特異性熒光DM探針或標志物。載 體液可以是不相混溶的液體(例如油、氟化液體或任何其他非水性或疏 水性溶劑)。載體液的目的是阻止材料從一個受試團至另 一個受試團的 轉移。載體液的另一個目的是在液團之間提供可用于在通道中追蹤液 流的可辨別的過渡物。栽體液可包含標志物。
受式溶液和載體液通過例如開關104被導入微通道103。微通道的尺寸小至足以允許進行最初存在于受試溶液中的單個DM分子的擴 增和檢測。在本發(fā)明中，微通道103是作為微流控裝置(例如圖2中 所示的)的一部分的幾個微通道中的一個。開關104在主控制和處理 計算機105的控制之下，以使載體液和受試溶液被順序交替地導入微 通道103。選擇導入微通道103的受試溶液和載體液的體積以使它們 在移動通過微通道103的過程中發(fā)生混合的程度最低。
備選地，可以在微通道103中以連續(xù)流的形式提供樣品材料，可 通過吸漿管將測定特異性試劑和緩沖材料交替地導入樣品材料的連續(xù) 流，如下面更詳細地描述的。
因此，作為不同受試溶液(所述每一種不同受試溶液被載體液分 隔開)通過微通道103的連續(xù)移動的結果，可在相同的微通道103中 進行許多串聯(lián)的反應(或順序的反應)。其中，如在本發(fā)明中，微通道 103是微流控裝置中的幾個微通道中的一個，因而也可在微流控裝置 的微通道中平行進行許多反應。載體液和受試溶液通過微通道103的 流速受泵機械裝置106的控制。泵機械裝置106在主控制和處理計算 機105的控制之下以調(diào)節(jié)受試溶液和載體液在孩i通道103中的流速。 調(diào)節(jié)流速以便當受試溶液通過微通道10 3時進行期望數(shù)目的PCR循環(huán)。
泵才幾械裝置106可通過孩i通道103的上游側或入口處的正壓或通 過微通道103的下游側或出口處的負壓調(diào)節(jié)受試溶液和載體液的流 速。在一個實施方案中，壓力差是大約1 psi，盡管可使用其他壓力 差。微通道103的長度適合于當受試溶液移動通過微通道103的反應 區(qū)時，完成期望數(shù)目的PCR循環(huán)，例如10至50個PCR循環(huán)，或其間 的任何數(shù)目的循環(huán)。微通道103的反應區(qū)是其中使溫度發(fā)生循環(huán)以進 行PCR循環(huán)的微通道的區(qū)域。通常，對于標準擴增反應進行25-30、 25-35、 25-40、 30-35、 30-40或35-40個PCR循環(huán)。完成期望數(shù)目的 PCR循環(huán)的微通道103的長度也取決于順序交替移動通過微通道103 的受試溶液和載體液的體積。例如，如果反應區(qū)是40 mm，那么受試 溶液的最小體積將在微通道103的反應區(qū)中占據(jù)1 mm,并且受試溶液 的最大體積在微通道103的反應區(qū)中占據(jù)20 mm。因此，在該非限定性實例中，當受試溶液移動通過微通道103的反應區(qū)時可擴增最少1 個樣品和最多20個樣品。當然，可選擇微通道長度和樣品體積來擴增 任何數(shù)目的樣品。
在系統(tǒng)中包含溫度控制系統(tǒng)107來控制和循環(huán)溫度以在受試溶液 移動通過微通道103時產(chǎn)生適合進行PCR循環(huán)的溫度。適合進行PCR 循環(huán)的溫度對于本領域技術人員來說是熟知的并且可包括大約8 5 。C 至大約IOO'C的范圍內(nèi)的第一溫度、大約2(TC至大約7(TC的范圍內(nèi)的 第二溫度和大約55。C至大約80。C的范圍內(nèi)的第三溫度。溫度控制系統(tǒng) 107與微通道103或微流控裝置的微通道整合在一起或與之相鄰。溫 度控制系統(tǒng)107包括加熱器108、冷卻器109、溫度傳感器110和溫度 控制器111。溫度控制器111從溫度傳感器110收集溫度信息并且基 于溫度信息產(chǎn)生控制信號?？刂菩盘柋粋魉椭良訜崞?08或冷卻器109 以在微通道103中使溫度發(fā)生循環(huán)來進行期望的PCR循環(huán)。溫度控制 器111在主控制和處理計算機105的控制之下，以使溫度發(fā)生循環(huán)以 便當受試溶液移動通過微通道103時進行期望數(shù)目的PCR循環(huán)。不同 受試溶液中的不同PCR反應，由于在微通道103中的連續(xù)流動，以串 聯(lián)的方式在孩t通道103中連續(xù)地進行。
可通過吹入適當溫度的空氣來進行微通道103的加熱和冷卻。備 選地，可通過循環(huán)水浴或流體浴(fluid bath)或通過對于本領域技 術人員來i兌是^;^口的巾白爾帖效應元寸牛(Pel tier—ef feet element)來 進行加熱和冷卻。電流通過的不同金屬的接頭使得可能冷卻或加熱小 表面。帕爾帖元件上的溫度探針使得可能調(diào)節(jié)與電強度(electrical intensity)成正比的功率，從而使得可能調(diào)節(jié)溫度。金屬塊可用作熱 轉移元件并且包括與金屬塊接觸的熱電冷卻器。該金屬塊可由任何具 有適當?shù)臒徂D移性質(zhì)的金屬(或合金)例如鋁制造。為了減少光從金 屬塊的背散射，優(yōu)選將金屬塊涂成黑色或作陽極化處理。對于該熱轉 移單位，PCR循環(huán)的溫度可以以適當?shù)臅r間間隔平衡。例如，PCR循環(huán) 的溫度可在大約1-2秒內(nèi)或甚至更快平衡。
溫度控制系統(tǒng)107優(yōu)選使溫度在微通道103的整個界定的區(qū)段內(nèi)
12(即其中進行PCR循環(huán)的微通道103的區(qū)段)循環(huán)。微通道103的該 界定的區(qū)段也稱為反應區(qū)。因此，恒溫區(qū)用于提供熱循環(huán)。適當編程 的計算機控制熱轉移元件的溫度循環(huán)。此外，對通道的長度(反應區(qū)) 進行加熱和冷卻，以使其溫度及時遵循PCR特征。將受試液團以這樣 的流速(速度)泵入通過該反應區(qū)，所述流速使得在液團從反應區(qū)的 上游端流至下游端的時間內(nèi)完成所需的PCR循環(huán)次數(shù)。
備選地，溫度控制系統(tǒng)107沿著微通道103應用空間溫度區(qū)
(spatial temperature zone )來實現(xiàn)聚合酶鏈式反應。在一個方面， 使用熱轉移元件沿著微通道103或微流控裝置的微通道的部分來使溫 度循環(huán)。在另一個方面，熱轉移元件在微通道103的部分中使溫度循 環(huán)。適當?shù)鼐幊痰挠嬎銠C控制熱轉移元件的溫度循環(huán)。根據(jù)本發(fā)明， 對通道的部分進行加熱和冷卻以使?jié)M足PCR溫度特征。將受試液團以 一定的流速(速度)泵入通過該反應區(qū)以使在液團從反應區(qū)的上游端 流至下游端的時間內(nèi)完成所需的PCR循環(huán)的次數(shù)。
光學成像系統(tǒng)112檢測表明SNP或其他目的核酸(即，擴增產(chǎn)物) 的存在和可能地其數(shù)量的發(fā)射物(例如，熒光或化學發(fā)光)以及監(jiān)控 微通道103中的受試溶液的流速。在一個實施方案中，光學成像系統(tǒng) 112是優(yōu)選包括一個或多個激發(fā)源113、 一個或多個光學器件/濾光片 114和一個或多個檢測器115的焚光成像系統(tǒng)。激發(fā)源113產(chǎn)生具有 期望的波長的光來激發(fā)標記，所述標記用于在實時PCR中檢測擴增產(chǎn) 物，和/或來檢測可存在以監(jiān)控微通道103中的受試溶液的流速的標志 物。光學器件/濾光片114用于形成光束和/或?qū)碜约ぐl(fā)源113的光 導向微通道103上的適當位置。光學器件/濾光片114也用于過濾光以 消除具有不期望的波長的光或減少到達檢測器115的光的背散射。激 發(fā)用于實時PCR的標記的期望的波長將取決于所使用的精確標記和/ 或標志物例如嵌入染料、分子信標、量子點(quantum dot)或TaqMan 探針，所述波長對于本領域技術人員來說是熟知的。類似地，精確標 記和/或標志物的發(fā)射波長對于本領域技術人員來說是熟知的。檢測器 115檢測被激發(fā)的標記和/或標志物的發(fā)射波長和測量發(fā)射的光的強度。光學成像系統(tǒng)112優(yōu)選能夠區(qū)分微流控裝置中的多個微通道。
光學成像系統(tǒng)112在主控制和處理計算機105的控制之下，所述 計算機指導光學/熒光成像系統(tǒng)112以期望的時間間隔(例如在每一個 PCR循環(huán)過程中至少一次)在微通道103中的或微流控裝置的微通道 中的多個位置上測量發(fā)射光的強度。檢測器115產(chǎn)生發(fā)射光的強度的 信號或圖像以及將其導向主控制和處理計算機105以進行擴增產(chǎn)物的 分析和監(jiān)控受試溶液的流速。檢測器115可包括多像素陣列檢測器(例 如CCD檢測器)和/或不連續(xù)的單一像素或非成像檢測器。檢測器115 可以與微通道103或與微流控裝置的微通道整合在一起或與之相鄰。 檢測器115可以是固止的或可以進行掃描。檢測器115應當具有適當 的分辨率以獲得有意義的結果和用于監(jiān)控微通道103中液體流動，特 別地因為流體在微通道103中連續(xù)地移動。
如上所述，實時PCR混合物可包含非特異性熒光DNA檢測分子(例 如嵌入染料)、序列特異性熒光DNA探針(例如分子信標、TaqMan 探針或量子點探針)或流動標志物(例如量子點)，并且載體液可包 含流動標志物。在一個實施方案中，光學成像系統(tǒng)112用于檢測來自 DNA檢測分子或探針的熒光強度(即熒光信號的強度)和/或檢測標志 物的熒光。標志物的熒光可用于區(qū)分載體液與受試溶液，也可用于測 定和監(jiān)控受試溶液或載體液的流速。熒光信號的強度可用于檢測擴增 的產(chǎn)物，用于測定擴增產(chǎn)物的量，用于測定存在于受試溶液中的初始 分子的數(shù)目等，這對于進行實時PCR的技術人員來說是熟知的。熒光 信號的強度還可用于測定和監(jiān)控受試溶液的流速。
可在PCR溫度循環(huán)中的棒定的時間和/或溫度下測量熒光信號的 強度(例如，拍攝熒光信號的圖像)。備選地，可在每一個PCR循環(huán) 中測量熒光信號的強度一次。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，可在PCR步驟 后在熱解鏈過程中測量發(fā)射。
捕捉圖像的最佳時間取決于所使用的化學藥品。例如，如果使用 嵌入染料檢測擴增產(chǎn)物，那么應當在PCR循環(huán)的延伸期結束時捕捉圖 像。如果使用TaqMan⑧探針檢測擴增產(chǎn)物，那么可在PCR循環(huán)的任何時間的捕捉圖像。主控制和處理計算機105可經(jīng)編程以在期望的時間 和溫度下拍攝圖像。光學成像系統(tǒng)112可經(jīng)設計用于在多個位置測量 焚光信號的強度。在其上測量熒光信號強度的多個位置可以是微通道 的不同區(qū)段。在其上測量熒光信號強度的多個位置可以是微通道的整 個界定的區(qū)段(即，反應區(qū))。備選地，可產(chǎn)生至少一個沿著通道的長 度的熒光信號的圖像。在另外的實施方案中，重復地在連續(xù)的溫度循 環(huán)期進行圖像捕捉?？墒褂枚嘞袼仃嚵袡z測器(例如CCD或CMOS成像 傳感器)或單像素檢測器產(chǎn)生圖像或測量熒光信號的強度?？墒褂么笠?場成像光學器件和/或小視場光學器件例如光纖/透鏡組合來收集熒 光。固定機制或掃描機制或兩者可用于捕捉圖像。用適當編程的計算 機處理關于熒光信號強度的數(shù)據(jù)。
在受試溶液已移動通過微通道103和完成期望的PCR循環(huán)次數(shù) 后，其可任選地被送至PCR后分析儀116。 PCR后分析儀116可包括可 對PCR擴增產(chǎn)物使用的任何分析技術。此類技術包括但不限于測序、 電;永、才笨領寸、解鏈曲線分才斤(melt curve analysis)等。
連續(xù)流式PCR芯片裝置的 一個實例描述于共同轉讓的美國專利申 i青系列號11/850， 229, "Chip and Cartridge Design Configuration for Performing Micro-Fluidic Assays"(其公開內(nèi)容通過引用合 并入本文)中。在'229申請中描述的芯片中，通過與芯片頂部連接 的具有樣品貯藏小室(sample-holding chamber)的藥液筒將DNA樣 品導入芯片的頂部。各藥液筒與樣品池(sample well )相通，從而使 各通道成為單個患者DNA樣品的連續(xù)流。通過將試劑從外部的容器吸 取至微流控芯片的吸漿管將試劑導入該連續(xù)流。本發(fā)明的方面包括微 流控芯片結構例如11/850, 229申請中描述的微流控芯片結構的應用， 所述微流控芯片結構允許以連續(xù)流動的格式進行多重PCR測定，例如 需要多達100個PCR反應的遺傳藥理學測定，對于每一個PCR反應都 有分別的數(shù)字輸出。連續(xù)流式PCR芯片裝置的另一個實例描述于共同 轉讓的美國專利申^青系列號11/606,006， "Systems and Methods for Monitoring the Amplification and Dissociation Behavior of DMMolecules"(其公開內(nèi)容以其全文通過引用合并入本文)中。
圖2(A)-(C)顯示了多通道微流控芯片120，其在通常具有圖1中
方面。圖2(A)顯示微流控芯片120的側視圖，圖2 (B)顯示微流控芯 片120的頂視圖。圖2(C)以放大的方式顯示流過微流控芯片120的單 個通道103的連續(xù)流式多重測定。
如圖2(B)中所示，微流控芯片120包括患者樣品池122 (在該處 處，患者的樣品材料被導入從各池122延伸的通道103內(nèi))。在圖2 顯示的舉例說明性實施方案中，存在用于患者樣品的32個池122和 32個相連接的通道103。圖2(B)中顯示的實施方案是非限定性實例； 芯片可具有多于或少于32個的樣品池和連接的通道。
在舉例說明的實施方案中，如圖2(A)中所示，微流控芯片120 包括用于汲取用于各測定的試劑混合物(溶液)(對于特定SNP是特異 性的PCR引物、雙鏈結合染料、任選的探針、緩沖劑等)的單個吸漿管 126。
孩丈流控芯片120還包括在完成測定后在該處貯存材沖+的廢液池 124。備選地，可在完成測定后將材料從廢液池124導向外部廢液室(未 顯示)。
參考圖2(C)，各通道103內(nèi)的流動是從左至右，并且流動終止于 廢液池124。將每一個患者DNA樣品預先裝載入32個池122中的一個， 然后通過例如對通道103的相對末端施用真空來從池122吸取樣品材 料的連續(xù)流使之通過通道103。通過在盛裝期望的試劑混合物的容器 和盛裝緩沖液的容器之間移動吸漿管126來交替地汲取測定特異性試 劑材料(即，"試劑混合物")和緩沖汲取液通過吸漿管126。將各 試劑混合物和緩沖液汲取液在通道128的網(wǎng)絡中分開數(shù)次以將相同試 劑混合物和緩沖液分配入每一個含有患者DNA的通道103中。因此， 各通道包含患者DNA的連續(xù)流，和沿著通道103散布的特異性成套試 劑或"小滴"或"團"132以及緩沖液130。各成套試劑132可包含用 于進行不同PCR測定和鑒定不同SNP的不同測定特異性試劑，或兩個或更多個成套試劑132可包含相同的測定特異性試劑。
作為對吸漿管的備選，可通過其他工具例如熱加熱式(thermal heating)(氣泡噴射式(bubble jet))或壓電式打印機械裝置將試劑
和染料導入通道。
通過在主控制和處理計算機105的控制下的溫度控制系統(tǒng)107沿 著通道103的長度進行熱循環(huán)，當液流沿著通道l(H移動時，PCR反 應在成套試劑132中進行。在通道103的末端，在進入廢液池124之 前，并且當仍然在移動時，坡升(rampup)各試劑小滴132的溫度以 在小滴132內(nèi)進行DNA的熱解鏈，同時使用在主控制和處理計算機105 控制下的光學成像系統(tǒng)112監(jiān)控適當?shù)臒晒馓卣?。各小滴的?shù)據(jù)輸出 是作為溫度的函數(shù)的熒光特征，如下所述將其轉換成數(shù)字信號。
沿著每一個通道103連續(xù)進行PCR測定，并且以平行的方式在不 同的通道103間進行患者DNA樣品的測定。
表1
患者樣品的數(shù)目在每一個復用'生水平上進行的檢測的總數(shù)
10個SNP25個SNP50個SNP100個SNP
101002505001, 000
202005001， 0002， 000
303007501， 5003， 000
表1舉例說明了基于患者和需要分析的SNP的不同數(shù)目的不同的 可能的測定復用方案(multiplexing scenario)。對于IO個患者樣 品，每一個樣品需要鑒定10個SNP，必須進行總共100個檢測(PCR 測定)，對于10個患者樣品，每個樣品需要鑒定25個SNP，必須進 行250個檢測等。
圖2(B)中顯示的示例性芯片120可容納表1中所列的任何檢測 要求。即，芯片120可容納達到32個不同患者樣品，并且可在沿著通 道103的長度順序排列的成套試劑132中進行的檢測的次數(shù)只受到可 獲得的樣品材料的量的限制，其可以是10至100或更多個順序排列的
17檢測。
圖3顯示8個不同樣品的單個熱解鏈SNP測定結果的示例性熒光 對溫度曲線。實際的焚光對溫度曲線與預先確定的預期的曲線的比專交 可表明結果是"野生型"(即，正常的)還是雜合的(即，異常的)。 存在許多可用于比較的熒光對溫度曲線的特征。在舉例說明的實例中， 使用熒光下降至預先確定的水平時所處的溫度。例如，在舉例說明性 實施方案中，可比較熒光下降至70%時所處的溫度。4個上方的曲線展 示預先確定為正常的特征，即熒光在大約84. 7'C下降至70%，從而表 明為野生型，4個下方的曲線展示與預先確定的正常特征不同的特征， 即熒光在大約83. 6。C下降至70%，從而表明為雜合子。曲線的其他特 征性質(zhì)可用于比較，例如曲線的斜率、形狀或平滑度(smoothness )、 曲線下的面積等。然后通過例如指定雜合子基因型為"1"以及野生型 為"0"來將SNP檢測結果轉換成數(shù)字信號。備選地，可將雜合子指定 為"0",野生型指定為"1"。
在其他應用中，本發(fā)明的方法可用于檢測除了 SNP外的目的DM 序列變異。DM序列變異的實例包括但不限于插入、缺失、點突變和 重排。此外，可選擇適當?shù)慕怄溓€來區(qū)分野生型和DNA序列變異的 純合性以及區(qū)分野生型、DNA序列變異的雜合性和DNA序列變異的純 合性。
圖4顯示來自對30個患者DNA樣品和2個對照DNA樣品進行的8 個SNP多重測定(A-H)的示例性數(shù)字輸出。8個PCR反應和熱解鏈中 的每一個進行兩次。各列表示對30個患者樣品和2個對照的每一個進 行的單個SNP測定的結果，各行表示對單個患者或?qū)φ者M行的所有SNP 測定(A-H)的結果，每個測定進行2次。
為了增加特定患者樣品的任何給定的S N P測定的觀察到的結果的
可靠性，相同的SNP測定可進行兩次或更多次，測定的每一次額外的 執(zhí)行增加觀察到的結果的可靠性。為了增加診斷或治療反應預測的可
靠性，其中多個SNP可與特定的診斷或預測相關，可對患者樣品進行 2個或更多個相關SNP的檢測。然而，如果可用少于所有SNP的SNP獲得充分可靠的診斷或預測，則可以不必分析所有可能的與特定診斷
或預測相關的SNP。
在一個實施方案中，本發(fā)明任選地包括進行測定結果(從一個或 多個檢測獲得的)的一個或多個統(tǒng)計或概率分析以推算診斷或預測的 可靠性水平的統(tǒng)計或相克率系統(tǒng)軟件。例如，統(tǒng)計或概率分析可包括 Poisson分析、Monte Carlo分析、遺傳算法的應用、神經(jīng)網(wǎng)絡訓練 (neural network training)、 馬爾可夫建模(Markov model ing )、 隱馬爾可夫建模、多維尺度分析(multidimensional scaling)、偏 最小二乘(PLS)分析和/或主成分分析(PCA)。統(tǒng)計或概率分析任選包括 定量地測定診斷或預測的可靠性水平。
用于理解產(chǎn)生和分析數(shù)據(jù)的方法以及其他相關概念的一般參考 資料包括Weiss ( Introductory Statistics, 第 7 版， Addison-Wesley, Reading, Mass., 2004); Weiss ( Elementary Statistics ， 第 5版，Addison-Wesley, Reading, Mass., 2001); Berinstein (Finding Statistics Online: How to Locate the Elusive Numbers You Need, Information Today, Medford, N. J.， 1998); Everitt， ( The Cambridge Dictionary of Statistics, Cambridge University Press, New York, 1998); Kotz ( Encyclopedia of Statistical Sciences, 第l-9巻和補充材料，Wiley, New York, 1988) ; Di 1 Ion和Goldstein (Multivariate Analysis: Methods and Applications, Wiley, New York, 1984) ; Tabachnick和Fidell (Using Multivariate Statistics, HarperCollins College Publishers, New York, 1996); Box 等人(Statistics for Experimenters, Wiley， New York, 1978); Cornell (Experiments with Mixtures, Wiley, New York, 1990); John (Statistical Design and Analysis of Experiments, SIAM， Philadelphia, 1998); Gibas 和 Jambeck (Bioinformatics Computer Skills, O'Reilly, Sebastipol, Calif., 2001); Pevzner (Computational Molecular Biology and Algorithmic Approach, The MIT Press, Cambridge,Mass.， 2000); Durbin 等人(Biologica1 Sequence Analysis : Probabilistic Models of Proteins and Nucleic Acids, Cambridge University Press, Cambridge, UK, 1998); 以及 Rashidi 和 Buehler (Bioinformatic Basics: Applications in Biological Science and Medicine, CRC Press LLC, Boca Raton, Fla.， 2000)。 這些參考資料中每一個的公開內(nèi)容通過引用合并入本文。
上面提及的統(tǒng)計功能也可整合入系統(tǒng)軟件，所述軟件例如包含于 主控制和處理計算機105中或包含于PCR后分析儀116中，包含于計 算機內(nèi)存中或計算機可讀介質(zhì)上。
例如，對于特定的疾病，假定存在10個已知的與進行特定遺傳 易感性或攜帶者狀態(tài)(carrier state)(例如，疾病或發(fā)生疾病的風 險)的診斷相關的SNP?；颊邩悠返脑\斷可通過對患者樣品進行10個 相關SNP檢測中的5個來開始。各SNP檢測的結果是1 (雜合子)或0 (野 生型)。各SNP檢測可進行多次以確保觀察到的結果(l或O)是正確 的可靠性水平。如果，當完成5個SNP檢測時，所有5個檢測表明患 者確實攜帶或不攜帶疾病或發(fā)生疾病的風險，則可具有合理的診斷可 靠性水平，可以不必進行進一步的檢測。在另一方面，如果2個SNP 檢測表明患者確實攜帶或沒有攜帶疾病而其他3個表明相反的結果， 那么最終診斷的可靠性水平不可能是高的，因而必須進行進一步的 SNP檢測(仍然可獲得另外多至5個SNP檢測)。
根據(jù)本發(fā)明，在通過微流控通道的患者樣品材料的連續(xù)流中容易 地進行多個不同的SNP檢測和進行單個SNP檢測多次，其中，對于待 進行的每一個SNP檢測，將一定量的適當?shù)臏y定特異性試劑汲入通道。 當期望額外的SNP檢測以增加診斷或預測的可靠性水平(無論期望額 外的不同的SNP檢測還是需要重復已進行的SNP檢測)時，這可按照 本發(fā)明來實時測定和進行。SNP檢測結果是簡單的和數(shù)字的，即l或0， 并且在診斷或預測方面檢測結果的含意是已知的。因此，如果，在觀 察許多檢測結果后，確定需要額外的檢測，那么可在通過微流控通道 的患者樣品的連續(xù)流中導入額外的測定特異性試劑(所述試劑相應于待重復的檢測或待進行的額外的不同的檢測)。
圖5中顯示舉例說明根據(jù)本發(fā)明的方面用于進行關于疾病、發(fā)生 疾病的風險的診斷或進行關于治療性藥物的治療的預測的方法的流程 圖。在步驟140中，將樣品材料-優(yōu)選基因組DNA材料提供至反應通道。 例如，可向微流控芯片120的樣品池122提供樣品材料，這樣當對通 道103施用真空時，樣品材料將流入通道103。在步驟142中，如上 面所描述的，通過例如經(jīng)由吸漿管126交替地吸取待分配入通道103 的試劑和緩沖液來向通道103內(nèi)的樣品材料中加入測定特異性試劑。
在步驟144中，如上面所描述的，當成套試劑沿著通道103進行 時，對試劑/樣品混合物即對成套試劑132進行PCR方法。在步驟146 中，當樣品沿著通道103進行時，對樣品進行熱解鏈方法。在步驟150 中獲得關于樣品材料的熒光對溫度特征，和在步驟152中，分析熒光 特征數(shù)據(jù)以獲得關于目的SNP的存在的數(shù)字結果(l或0)。如果檢測結 果是不明確的(步驟154),通過重復相同的測定(步驟158)—次或多次 來獲得更多的檢測結果可增加檢測結果的可靠性。通過例如本領域技 術人員已知的任何適當?shù)慕y(tǒng)計分析技術在步驟156中將重復檢測數(shù)據(jù) 整合，以獲得明確的結果。
當檢測結果明確時(步驟160)，可對樣品進行額外的不同的測 定(步驟162)以獲得更多的與診斷或預測相關的"數(shù)據(jù)點，，。可多 次進行每一個不同的測定(步驟154、 156、 158)以獲得關于對樣品 進行的各測定的明確結果。通過例如對于本領域技術人員來說是已知 的任何適當?shù)慕y(tǒng)計分析技術(步驟166)在步驟164中將額外的檢測 數(shù)據(jù)整合，然后在步驟168中報告具有可靠性水平的所得的診斷或預 測(例如，"檢測以95%的可靠性水平表明患者Jones是疾病X的攜帶 者)。
用于進行圖5的方法的系統(tǒng)優(yōu)選是自動化的和計算機控制的，并 且通過該系統(tǒng)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)是鑒定各PCR反應的結果的連續(xù)的字節(jié)流。
本文中描述的某些方面和示例性實施方案公開了使用熒光監(jiān)控 熱解鏈的方法。本發(fā)明不限于這些方面和示例性實施方案。在其他方面，熱解鏈可通過其他方法來監(jiān)控，所述其他方法通過例如紫外吸收
或使用非熒光報告染料或分子來檢測雙鏈DNA的分離。
除非在本文中另外指出或通過上下文明確地與之相反，術語"一 個"和"一種"和"該"和相似的所指對象在描述本發(fā)明的上下文中
(特別地在下列權利要求
的上下文中)被解釋為包括單數(shù)和復數(shù)。除 非另外指出，術語"包含"、"具有"、"包括"和"含有，，被解釋 為開放式術語(即，表示"包括，但不限于")。除非在本文中另外 指出，本文中值的范圍的引用只意欲用作個別地提及落在范圍內(nèi)的每 一個分離值的速記法，并且將各分離值整合入說明書中，就如其在本 文中被單獨地引用 一樣。除非在本文中另外指出或通過上下文明確地 與之相反，本文中所述的所有方法可以以任何合適的順序進行。除非 另外聲明，本文中提供的任何和所有實施例或示例性措辭(例如，"例 如")的使用僅為了更好地說明本發(fā)明而不對發(fā)明的范圍施加限制。 本說明書中的措辭不應當解釋為表示任何未要求的成分為本發(fā)明的實 施所必需的。
將認識到，本發(fā)明的方法和組合物可以以多種實施方案的形式整 合，本文只公開其中的少數(shù)。在閱讀上述說明書后，這些實施方案的 變化形式對于本領域技術人員將變得顯而易見。本發(fā)明者預期本領域 技術人員可使用此類變化形式(適當時)，并且本發(fā)明者預期可不按 本文中所明確描述的實施本發(fā)明。因此，本發(fā)明包括其所附的權利要 求中引用的主題的所有改變和等同物，如適用的法律所允許的。此外， 除非在本文中另外指出或通過上下文清楚地與之相反，在其所有可能 的變化形式中上述要素的任何組合包括在本發(fā)明中。
權利要求
1.一種方法，該方法用于在微流控芯片的多個通道內(nèi)進行數(shù)字多重PCR測定以鑒定多個患者樣品的每一個中的DNA序列變異，從而診斷疾病狀態(tài)、疾病風險或預測各患者的治療性藥物的反應，所述方法包括
A.對于各患者樣品，在通道之一中提供基因組DNA樣品流；
B.將測定特異性試劑溶液導入基因組DNA樣品流以形成受試混合物；
C.在通道內(nèi)對受試混合物進行PCR方法；
D.在進行PCR方法后對受試樣品進行熱解鏈方法；
E.收集關于熱解鏈方法的數(shù)據(jù)；
F.分析收集的熱解鏈數(shù)據(jù)以確定目的DNA序列變異在受試混合物中的存在或不存在；和
G.通過指定表明目的DNA序列變異存在的結果為1和指定表明目的DNA序列變異不存在的結果為0或反之亦然，來將分析步驟的結果轉換成數(shù)字信號。
2. 權利要求
1的方法，其還包括H. 使用相同的測定特異性試劑溶液重復步驟B至G至少一次以 提高目的DM序列變異的存在或不存在的測定的可靠性。
3. 權利要求
2的方法，其還包括I. 使用適合于鑒定與診斷或預測相關的不同的DNA序列變異的 不同的測定特異性試劑溶液重復步驟B至H至少一次；和J.對步驟B至I的結果進行統(tǒng)計分析以推斷出診斷或預測以及 診斷或預測的可靠性水平。
4. 權利要求
1的方法，其中收集關于熱解鏈方法的數(shù)據(jù)的步驟 包括當進行熱解鏈方法時收集來自受試混合物的熒光特征數(shù)據(jù)。
5. 權利要求
4的方法，其中步驟D包括坡升受試混合物團的溫 度以及步驟E包括產(chǎn)生信號強度對溫度的相關性。
6. 權利要求
5的方法，其中步驟F包括將所述相關性與預先確 評估結果。
7. 權利要求
4的方法，其中熒光特征包括由受試混合物團發(fā)射 的熒光。
8. 權利要求
6的方法，其中產(chǎn)生信號強度對溫度的相關性包括 繪制各受試混合物團的熒光對溫度曲線，并且比較步驟包括將各熒光 對溫度曲線的形狀與預期的熒光對溫度曲線的形狀進行比較。
9. 權利要求
6的方法，其中產(chǎn)生信號強度對溫度的相關性包括 繪制各受試混合物團的熒光對溫度曲線，并且比較步驟包括將熒光下 降至預先確定的水平時所處的溫度與預期的焚光下降至所述預先確定 的水平時所處的溫度相比較。
10. 權利要求
l的方法，其中流體芯片是微流控芯片，其包含 各反應通道的相對末端上的樣品池和廢液池；吸漿管；和從吸漿管散發(fā)并且將吸漿管與所述多個反應通道的每一個連接 并且經(jīng)設計將通過吸漿管汲取的物質(zhì)分配至反應通道的每一個中的通 道網(wǎng)絡。
11. 權利要求
1的方法，其中步驟B包括將一定量的試劑材料和 緩沖材料交替地導入每一個通道，從而沿著各通道的長度形成包含與 載體液順序交替的受試溶液團的連續(xù)流，其中受試溶液包含樣品和試 劑材料的混合物，而栽體液包含樣品和緩沖材料的混合物。
12. 權利要求
1的方法，其中可靠性水平是所進行的不同測定的 數(shù)目的函數(shù)。
13. 權利要求
1的方法，其中可靠性水平是重復各測定的次數(shù)的函數(shù)。
14. 權利要求
1的方法，其中確定DNA序列變異的存在或不存在 包括確定單核苷酸多態(tài)性的存在或不存在。
15. 使用包含多個反應通道的流體芯片對多個樣品進行多重測定的方法，所述方法包括在多個反應通道的每一個中提供連續(xù)的樣品流； 交替地將一定量的試劑材料和緩沖材料導入每一個通道，從而沿著各通道的長度形成包含與載體液順序交替的受試溶液團的連續(xù)流，其中受試溶液包含樣品和試劑材料的混合物，而載體液包含樣品和緩沖材料的混合物；在各通道中的連續(xù)流內(nèi)對受試溶液進行擴增方法； 對各通道內(nèi)的擴增的受試溶液進行熱解鏈方法； 檢測在熱解鏈方法期間由各受試溶液團發(fā)射的信號； 分析檢測的信號以確定目的核苷酸在受試溶液團中的存在或不存在；和通過指定結果為1或0來將分析步驟的結果轉換成數(shù)字格式，其 中表明目的核苷酸的存在的結果被指定為1，以及表明目的核苷酸的 不存在的結果被指定為0，或反之亦然。
16. 權利要求
15的方法，其中檢測步驟包括產(chǎn)生信號強度對溫 度的相關性。
17. 權利要求
16的方法，其中檢測步驟還包括將產(chǎn)生的相關性關性的偏差評估結果。
18. 權利要求
17的方法，其中檢測的信號是由受試溶液團發(fā)射 的熒光。
19. 權利要求
18的方法，其中產(chǎn)生信號強度對溫度的相關性包 括繪制各受試溶液團的熒光對溫度曲線，以及比較步驟包括將各熒光 對溫度曲線的形狀與預期的熒光對溫度曲線的形狀進行比較。
20. 權利要求
18的方法，其中產(chǎn)生信號強度對溫度的相關性包 括繪制各受試溶液團的熒光對溫度曲線，并且比較步驟包括將熒光下的水平時所處的溫度相比較。
21. 權利要求
15的方法，其中目的核苷酸是單核苷酸多態(tài)性。
22. 權利要求
15的方法，其中流體芯片是微流控芯片，其包含 各反應通道的相對末端上的樣品池和廢液池；吸漿管；和從吸漿管散發(fā)并且將吸漿管與所述多個反應通道的每一個連接 并且經(jīng)設計將通過吸漿管汲取的物質(zhì)分配至每一個反應通道的通道網(wǎng) 絡。
23. 權利要求
15的方法，其中通過吸漿管將試劑材料和緩沖材 料導入每一個通道。
24. 用于進行數(shù)字多重PCR測定的系統(tǒng)，其包括 微流控芯片，其包括多個反應通道；各反應通道的相對末端上的樣品池和廢液池； 吸漿管；和從吸漿管散發(fā)并且將吸漿管與所述多個反應通道的每一個 連接并且經(jīng)設計將通過吸漿管汲取的物質(zhì)分配到每一個反應通道的通 道網(wǎng)絡；與微流控芯片整合在一起或與之相鄰的并且經(jīng)設計使內(nèi)容物沿統(tǒng)；與微流控芯片整合在一起或與之相鄰的并且經(jīng)設計照明各通道 和在沿著各通道的多個位置檢測由各通道的內(nèi)容物發(fā)射的熒光信號的 光學成像系統(tǒng)；和控制器，該控制器經(jīng)編程使系統(tǒng)在各反應通道內(nèi)產(chǎn)生樣品材料的連續(xù)流；通過吸漿管將一定量的試劑材料和緩沖材料交替地導入每 一個通道，從而沿著各通道的長度形成包含與載體液順序交替的受試 溶液團的連續(xù)流，其中受試溶液包含樣品和試劑材料的混合物，而載 體液包含樣品和緩沖材料的混合物；用溫度控制系統(tǒng)使各反應通道的內(nèi)容物發(fā)生熱循環(huán)以在各通道中的連續(xù)流內(nèi)對受試溶液進行擴增方法；用溫度控制系統(tǒng)對受試溶液進行熱解鏈；在進行熱解鏈方法后，使用光學成像系統(tǒng)檢測由各受試溶液 團發(fā)射的信號；分析檢測的信號以確定目的核苷酸在受試溶液團內(nèi)的存在 或不存在；和通過將結果指定為l或O來將分析步驟的結果轉換成數(shù)字格 式，其中表明目的核苷酸存在的結果被指定為1，以及表明目的核苷 酸不存在的結果被指定為0，或反之亦然。
25. 權利要求
24的系統(tǒng)，其中控制器經(jīng)設計使溫度控制系統(tǒng)坡 升受試溶液團的溫度。
26. 權利要求
25的系統(tǒng)，其中控制器經(jīng)編程將相關性與預先確評估結果,
專利摘要
用于數(shù)字多重PCR測定的方法和裝置使用微流控芯片在芯片的微通道中進行實時、連續(xù)流式PCR。將樣品材料流導入各微通道并且將測定特異性試劑團(boluses)和緩沖液交替地導入流內(nèi)以形成順序配置的受試團。對所述受試團進行PCR方法，然后進行熱解鏈方法(thermal melt procedure)。在熱解鏈方法期間，檢測熒光輸出和收集熒光對溫度的數(shù)據(jù)并且將其與預期的正常相關性(normalcorrelation)相比較。將陽性或陰性的結果轉換成數(shù)字格式，其中陽性結果指定為“1”，陰性結果指定為“0”，或反之亦然。
文檔編號C12P19/34GKCN101583724SQ200780049029
公開日2009年11月18日 申請日期2007年11月29日
發(fā)明者I·T·奈特, 井上裕司 申請人:佳能美國生命科學公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan