專利名稱:液態(tài)β-淀粉酶制劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶制劑的制備方法，具體涉及利用植物制備液態(tài)β -淀粉酶制劑的制
備方法。
背景技術(shù)：
β-淀粉酶(又稱0-1，4_0葡聚糖麥芽糖水解酶工.(.3.2. 1.2)是一種外切型淀 粉水解酶，它能從淀粉的非還原性末端開始，依次催化水解α _1，4-D葡萄糖苷鍵，生成麥 芽糖。與此同時，發(fā)生瓦爾登轉(zhuǎn)位反應(yīng)(Waldeninversion)，使產(chǎn)物由α-型變?yōu)棣?型，故 稱β-淀粉酶。
由于β _淀粉酶不能水解支鏈淀粉的α -1，6鍵，也不能跨過分支點α _1，6鍵而 切開內(nèi)部的α-1，4鍵和α-1，6鍵附近的2 3個α-1，4鍵，所以在水解產(chǎn)物中殘留下側(cè) 支外常掛有2 3個葡萄糖殘基的β-極限糊精。β-淀粉酶即使作用于直鏈淀粉時，也只 能使淀粉的70% 90%水解成麥芽糖，其它為麥芽三糖和寡糖。β-淀粉酶在工業(yè)上是一 種重要的酶，它可把淀粉質(zhì)原料轉(zhuǎn)化成麥芽糖，含量不同的麥芽糖產(chǎn)品可以用于如糖果、啤 酒發(fā)酵等食品工業(yè)，高純度的麥芽糖液還可替代葡萄糖輸液用于糖尿病人。
在目前已有報道的生產(chǎn)技術(shù)中，有用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的商品淀粉酶，此酶 耐熱穩(wěn)定性能差，除產(chǎn)生麥芽糖外，還產(chǎn)生相當(dāng)量的麥芽三糖，而植物β “淀粉酶耐熱穩(wěn)定 性好，作用PH范圍廣，能產(chǎn)生較多的麥芽糖。但現(xiàn)有從植物中提取的淀粉酶都是固體 產(chǎn)品，為粗制品雜質(zhì)含量高，不能作為食品添加劑(見專利公開號CN1225943A大豆β-淀 粉酶的制備工藝)，并在制備過程中采用鹽析工藝，硫酸鈉回收困難，存在廢液處理問題。反 復(fù)凍融使操作復(fù)雜，成本高。而專利《提取β-淀粉酶的方法》(見專利公開號CN1491279A) 僅提供了采用纖維素酶從大麥或小麥中提取淀粉酶，但纖維素酶價格高，生產(chǎn)成本高。 到目前為止，由于缺乏有效的制備工藝，高酶活力的液體植物β -淀粉酶制劑仍未實現(xiàn)工 業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有β-淀粉酶制備方法存在生產(chǎn)成本高、產(chǎn)品雜質(zhì)含量高以及廢液 處理等問題，本申請人提供一種液態(tài)β “淀粉酶制劑的制備方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下
液態(tài)β -淀粉酶制劑的制備方法，其工藝步驟包括
以麩皮為原料，其工藝步驟包括麩皮的浸提、固液分離、浸提液的精濾、超濾濃縮、 配方、二次精濾、酶活力調(diào)整，分述如下
浸提
(1)配制浸提水在水中按(重量/體積)加入防腐劑對羥基苯甲酸乙酯0. 01 0. 03%、山梨酸鉀0. 1 0. 25%、苯甲酸鈉0.2 0.5%，還原劑焦亞硫酸鈉0.5 1.5%、 低亞硫酸鈉0.5 1.5% ；[0011](2)浸提將麩皮按(重量/體積)1 4 7加入步驟⑴配制的浸提水；常壓 下，浸提溫度控制在40 55°C，pH控制在4. 5 6. 5，浸提6 8小時；
固液分離浸提后進(jìn)行固液分離。
精濾分離出的浸提液迅速冷到20°C以下，分離出的浸提液加入1 2% (重量/ 體積)的硅藻土，過精濾板框進(jìn)行精濾；
超濾濃縮所得精濾液進(jìn)行超濾濃縮，超濾濃縮的溫度控制在20°C以下；
配方超濾濃縮到所需規(guī)格的酶活力要求后，將所得超濾濃縮液放入配方罐，按 (重量/體積)加入穩(wěn)定劑18 22%的氯化鈉、8 10%的醋酸鈉、5 8%麥芽糊精、
0.1 0. 25%的山梨酸鉀、0.2 0.5%苯甲酸鈉，攪拌溶解，混合均勻；
二次精濾所得配方液中加入1 2% (重量/體積)的硅藻土，過精濾板框進(jìn)行 精濾。
酶活力調(diào)整收集二次精濾的濾液，取樣作成品檢驗，用稀釋液將二次精濾濾液的 酶活力調(diào)整到300000U/g或600000U/g。
所述酶活力調(diào)整所用的稀釋液是按(重量/體積)加入穩(wěn)定劑18 22%的氯化 鈉、8 10%的醋酸鈉、5 8%麥芽糊精、0. 1 0. 25%的山梨酸鉀、0. 2 0. 5%苯甲酸鈉 的水溶液。
根據(jù)上述制備工藝生產(chǎn)出的300000U/g、600000U/g液態(tài)植物β -淀粉酶制劑，產(chǎn) 品為棕褐色液體、無異味、可以與水互溶，產(chǎn)品熱穩(wěn)定性好、催化活性強，最適合作用溫度在 55°C 60°C之間。當(dāng)溫度超過65°C時，反應(yīng)速度加快，但失活也加快。本品最適合作用pH 值范圍為5.0 6. 8之間。本產(chǎn)品中不含α-淀粉酶。
本發(fā)明所得成品能達(dá)到以下指標(biāo)酶活力300000U/g、600000U/g，容重1. 15
1.25g/ml, ρΗ5· 0 6· 0，菌落總數(shù)彡10000cfu/mlo活力保存穩(wěn)定性極高，在25°C以下，保 存6個月之后酶活力仍大于90%。
以上工藝的總酶活回收率>74%，上述工藝與指標(biāo)均優(yōu)于用其它技術(shù)得到的酶制 劑制品。本發(fā)明是全新的液態(tài)淀粉酶制劑制備工藝，工藝簡單、生產(chǎn)效率高、生產(chǎn)成本 低，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明以麩皮為原料，生產(chǎn)成本低；在液態(tài)淀粉酶制劑的生產(chǎn)過程中，由于工 序時間長，容易腐敗，引起酶的失活，本發(fā)明采用合適配比的防腐劑以及合適的溫度和ρΗ， 能夠有效的抑制細(xì)菌生長，防止腐敗以及酶的失活；本發(fā)明是一種液態(tài)的淀粉酶制劑， 相對于固體酶制劑而言所含的工業(yè)鹽濃度低，易達(dá)到食品級標(biāo)準(zhǔn)要求；在生產(chǎn)過程中，溫度 只需控制在20°C以下，降低了生產(chǎn)能耗；本發(fā)明采用精濾-超濾濃縮-二次精濾的步驟，所 得的產(chǎn)品雜質(zhì)含量低，達(dá)到食品添加劑標(biāo)準(zhǔn)的要求；分離后的麩皮經(jīng)干燥后可作飼料，無廢 固物處理問題。


圖1為本發(fā)明的工藝流程圖；
圖2為用于酶活力測定的DNS半量法標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實施方式
以下通過實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明
實施例1
1、浸提
(1)配制浸提水250L水中加入防腐劑對羥基苯甲酸乙酯0.02^(g、山梨酸鉀 0. 62^(g、苯甲酸鈉0. 87^(g、還原劑焦亞硫酸鈉1. 25Kg、低亞硫酸鈉3. 75Kg，攪拌溶解；
(2)浸提稱取50Kg麩皮加入步驟⑴配制的浸提水中；常壓下，水浴升溫至45°C 保溫，調(diào)pH為4. 5，每小時攪動一次，浸提6小時；
2、固液分離浸提后用板框或螺桿壓榨機進(jìn)行固液分離；
3、精濾分離出的浸提液迅速冷到20°C以下，浸提液加入3. 75Kg的硅藻土，過精 濾板框進(jìn)行精濾；
4、超濾濃縮步驟3所得精濾液進(jìn)入超濾濃縮器進(jìn)行超濾濃縮，超濾濃縮的溫度 控制在20°C以下，超濾濃縮所采用的為4英寸卷式膜，截流分子量為IOK道爾頓；
5、配方超濾濃縮到酶活力在390000U/g時放出，得到約6. 14L超濾濃縮液，置 于配方罐，加入1105g的氯化鈉、491g的醋酸鈉、307g麥芽糊精、防腐劑6. 14g山梨酸鉀、 12. 28g苯甲酸鈉溶解，攪拌均勻。
6、二次精濾在配方液中加入79. 8g硅藻土，攪拌均勻過濾。得成品7. 2^(g，酶活 力 320000U/g，收率 77%。
7、酶活力調(diào)整收集二次精濾的濾液，取樣作成品檢驗，測得容重1. 18g/ml, PH5.5，菌落總數(shù)彡10000cfu/mL·用稀釋液進(jìn)行酶活力調(diào)整，所用稀釋液是按(重量/體 積)加入穩(wěn)定劑18 22%的氯化鈉、8 10%的醋酸鈉、5 8%麥芽糊精、0. 1 0. 25% 的山梨酸鉀、0. 2 0. 5%苯甲酸鈉的水溶液，將酶活力調(diào)整到300000U/g。
實施例2
1、浸提
(1)配制浸提水7000L水中加入防腐劑對羥基苯甲酸乙酯1.4Kg、山梨酸鉀14Kg、 苯甲酸鈉14Kg、還原劑焦亞硫酸鈉70Kg、低亞硫酸鈉70Kg，攪拌溶解；
(2)浸提稱取IOOOKg麩皮加入步驟(1)配制的浸提水中；常壓下，水浴升溫至 55°C保溫，調(diào)pH為5. 0，每小時攪動一次，浸提7小時；
2、固液分離浸提后用板框或螺桿壓榨機進(jìn)行固液分離；
3、精濾分離出的浸提液迅速冷到20°C以下，浸提液加入84Kg的硅藻土，過精濾 板框進(jìn)行精濾；
4、超濾濃縮步驟3所得精濾液進(jìn)行超濾濃縮，超濾濃縮的溫度控制在20°C以下， 超濾濃縮所采用的為8英寸卷式膜，截流分子量為20K道爾頓；
5、配方超濾濃縮到酶活力在780000U/g時放出，得到59. 6L超濾濃縮液，置于配 方罐加入12. 49kg的氯化鈉、5. 62kg的醋酸鈉、4. Ikg麥芽糊精、防腐劑:125g山梨酸鉀、 219g苯甲酸鈉溶解，攪拌均勻。
6、二次精濾在配方液中加入0.9kg硅藻土，攪拌均勻過濾。得成品70.2^g，酶 活力 632000U/g，收率 74%。
7、酶活力調(diào)整收集二次精濾的濾液，取樣作成品檢驗，測得容重1. 17g/ml,PH5. 6，菌落總數(shù)≤10000cfu/mlo將酶活力調(diào)整到600000U/g，所用稀釋液與實施例1相同。
實施例3
1、浸提
(1)配制浸提水30000L水中加入防腐劑對羥基苯甲酸乙酯9Kg、山梨酸鉀30Kg、 苯甲酸鈉150Kg、還原劑焦亞硫酸鈉450Kg、低亞硫酸鈉150Kg，攪拌溶解；
(2)浸提稱取5000Kg麩皮加入步驟⑴配制的浸提水中；常壓下，水浴升溫至 50°C保溫，調(diào)pH為6. 5，每小時攪動一次，浸提8小時；
2、固液分離浸提后用板框或螺桿壓榨機進(jìn)行固液分離；
3、精濾分離出的浸提液迅速冷到20°C以下，浸提液加入84Kg的硅藻土，過精濾 板框進(jìn)行精濾；
4、超濾濃縮步驟3所得精濾液進(jìn)行超濾濃縮，超濾濃縮的溫度控制在20°C以下， 超濾濃縮所采用的為8英寸卷式膜，截流分子量為60K道爾頓；
5、配方超濾濃縮到酶活力在780000U/g時放出，得到309. 03L超濾濃縮液，置于 配方罐，加入67. 98kg的氯化鈉、30. 9kg的醋酸鈉、24. 72kg麥芽糊精，防腐劑618g山梨酸 鉀、1. 54kg苯甲酸鈉溶解，攪拌均勻。
6、二次精濾在配方液中加入3. 71kg硅藻土，攪拌均勻過濾。得成品370. ^g，酶 活力 615000U/g，收率 75. 7%0
7、酶活力調(diào)整收集二次精濾的濾液，取樣作成品檢驗，測得容重1.20g/ml， pH5. 4，菌落總數(shù)彡lOOOOcfu/ml。將酶活力調(diào)整到600000U/g，所用稀釋液與實施例1相同。
實施例1-3所得的產(chǎn)品，其酶活力測定方法如下
β -淀粉酶酶活力的測定，依據(jù)行業(yè)慣用測定方法，采取DNS半量法測定。
麩皮中β -淀粉酶總酶活力的測定，稱取50g麩皮置于燒杯中。取200ml水加入 對羥基苯甲酸乙酯0. 02g、山梨酸鉀0. 2g、苯甲酸鈉0. 4g，還原劑焦亞硫酸鈉lg、低亞硫酸 鈉Ig攪拌溶解，調(diào)PH4. 5。倒入置麩皮的燒杯中攪拌混合。水浴升溫至40°C保溫每小時攪 動一次浸提8小時。濾紙過濾，濾液用下面描述的方法測定酶活力。本說明書中酶活力均 由該方法測定得到。
酶活力定義在pH5. 50，溫度60°C的條件下，每小時水解1. 10%淀粉液所產(chǎn)生Img 麥芽糖所需的酶量為一個酶活力單位(u/g或u/ml)。
酶活力測定(DNS半量法)
1 試劑
1. 10. 2M, ρΗ5· 50 磷酸緩沖液
甲液稱取磷酸氫二鈉(Na2HPO4 · 12H20)53. 65g，用蒸餾水溶解定容至1000ml。
乙液稱取磷酸二氫鈉(NaH2PO4 · 12H20)27. 8g，用蒸餾水溶解定容至1000ml。
取甲液6. 5ml,乙液93. 5ml，混合后以酸度計校正pH5. 50即成。
1. 210% ρΗ5· 50 磷酸緩沖液
取上述0. 2Μ，ρΗ5. 50磷酸緩沖液10ml，加入90ml蒸餾水，混合即成。
1. 3DNS 溶液
精確稱取3. 5- 二硝基水楊酸1. OOOOg,苯酚0. 2g，亞硫酸鈉0. 05g,氫氧化鈉lg，酒石酸鉀鈉20g，用蒸餾水加熱溶解，冷卻定容至100ml，于棕色瓶中貯存，放置一周后方能 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(每次配制需繪制)。
1.41. 淀粉緩沖液
煮沸約50ml蒸餾水，加入到1. Ig淀粉的少量蒸餾水溶解液中，再煮沸至透明，冷 卻，
力口IOmUO. 2M，ρΗ5· 50 磷酸緩沖液，定容至 100ml。
2儀器和設(shè)備
2. 1 恒溫水浴 0 100°C (精度士0. 2°C )
2. 2 秒表
2. 325ml具塞比色管
2. 4移液管
2. 5容量瓶
3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪線(DNS半量法)
準(zhǔn)確稱取于(105 110°C )干燥后的葡萄糖50mg，用蒸餾水溶解定容至50ml，配 成lmg/ml葡萄糖液，按表一比例操作及開水煮沸15min，冷卻，加入10. 5ml蒸餾水，722型 分光光度計550nm比色。
表一
編號含葡萄糖 (mg)lmg/ml葡萄糖液 (ml)蒸餾水 (ml)DNS液 (ml)10. 10.10.41.5 .20.20.20.31.530. 30.30.21.540.40.40. 11.550.50.501.5對照用0. 5ml蒸餾水代替葡萄糖溶液
見圖2，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，葡萄糖mg數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(用回歸方程算 出常數(shù)K(K=葡萄糖mg/OD)。樣品根據(jù)所測定的OD值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其相當(dāng)于葡萄糖 mg數(shù)，再乘以1.9倍，即為麥芽糖mg數(shù)。
4測定步驟
4. 1樣品制備
準(zhǔn)確稱取一定量酶樣，用10%磷酸緩沖液溶解定容、搖勻。(每mg酶液約20單位 為宜，OD值控制在0. 2 0. 4之間)。
4. 2 測定
a.準(zhǔn)確吸取1. 4溶液9. 0ml，于60°C恒溫水浴預(yù)熱5min，加入Iml酶樣，立即計時 準(zhǔn)確反應(yīng)30min。
b.迅速吸取0. 5ml反應(yīng)液于已吸入DNS試劑1. 50ml的25ml具塞比色管中，煮沸15min，冷卻。再加入10. 50ml蒸餾水，搖勻。用550nm比色。對照以蒸餾水替代酶樣，其 它操作同。
4. 3 計算
酶活力單位u/mg = 0DX2X20X1. 9XKXn = 0DXKX76Xn
式中K—標(biāo)準(zhǔn)曲線常數(shù)
η—樣品稀釋倍數(shù)
2-反應(yīng) 30min 換算成 60min
20——將吸取0. 5ml反應(yīng)液換算成IOml
1.9——麥芽糖葡萄糖分子量之比
測得提取液酶活力15064U/g，折算到麩皮中含量60256U/g麩皮。
利用以上方法，實施例1-3的數(shù)據(jù)列表如下
權(quán)利要求
1.一種液態(tài)β-淀粉酶制劑的制備方法，其特征在于以麩皮為原料，其工藝步驟包括 麩皮的浸提、固液分離、浸提液的精濾、超濾濃縮、配方、二次精濾、酶活力調(diào)整，分述如下浸提(1)配制浸提水在水中按重量/體積比加入防腐劑對羥基苯甲酸乙酯0.01 0. 03%、山梨酸鉀0. 1 0. 25%、苯甲酸鈉0. 2 0. 5%，還原劑焦亞硫酸鈉0. 5 1. 5%、 低亞硫酸鈉0. 5 1. 5% ；(2)浸提將麩皮按重量/體積比1 4 7加入步驟(1)配制的浸提水；常壓下，浸 提溫度控制在40 55°C，pH控制在4. 5 6. 5，浸提6 8小時；固液分離浸提后進(jìn)行固液分離；精濾分離出的浸提液迅速冷到20°C以下，分離出的浸提液加入1 2%重量/體積比 的硅藻土，過精濾板框進(jìn)行精濾；超濾濃縮所得精濾液進(jìn)行超濾濃縮，超濾濃縮的溫度控制在20°C以下；配方超濾濃縮到所需規(guī)格的酶活力要求后，將所得超濾濃縮液放入配方罐，按重量/ 體積比加入穩(wěn)定劑18 22 %的氯化鈉、8 10 %的醋酸鈉、5 8 %麥芽糊精、0. 1 0. 25 % 的山梨酸鉀、0. 2 0. 5%苯甲酸鈉，攪拌溶解，混合均勻；二次精濾所得配方液中加入1 2%重量/體積比的硅藻土，在20°C以下過精濾板框 進(jìn)行精濾；酶活力調(diào)整收集二次精濾的濾液，取樣作成品檢驗，用稀釋液將二次精濾濾液的酶活 力調(diào)整到 300000U/g 或 600000U/g。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征是所述超濾濃縮采用卷式膜，截流分子量為 10 60K道爾頓。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征是所述酶活力調(diào)整所用的稀釋液是按重量/體 積比加入穩(wěn)定劑18 22%的氯化鈉、8 10%的醋酸鈉、5 8%麥芽糊精、0. 1 0. 25% 的山梨酸鉀、0. 2 0. 5%苯甲酸鈉的水溶液。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種液態(tài)β-淀粉酶制劑的制備方法，其特征在于以麩皮為原料，其工藝步驟包括麩皮的浸提、固液分離、浸提液的精濾、超濾濃縮、配方、二次精濾、酶活力調(diào)整。本發(fā)明采用合適配比的防腐劑以及合適的溫度和pH，能夠有效的抑制細(xì)菌生長，防止腐敗以及酶的失活；所得的產(chǎn)品雜質(zhì)含量低，相對于固體酶制劑而言所含的工業(yè)鹽濃度低，易達(dá)到食品添加劑標(biāo)準(zhǔn)的要求。本發(fā)明是全新的液態(tài)β-淀粉酶制劑制備工藝，工藝簡單、生產(chǎn)效率高、生產(chǎn)成本低，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12N9/26GKCN101323849 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 200810023194
公開日2011年6月29日 申請日期2008年7月31日
發(fā)明者華家榮, 胡洪清 申請人:無錫賽德生物工程有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan