專利名稱:家蠶絲腺生物工廠的建立方法及其制藥用途的制作方法
家蠶絲腺生物工廠的建立方法及其制藥用途 技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程技術領域：
，具體涉及一種家蠶絲腺工廠的建立方法及 其在多肽類藥物制備領域的用途。
背景技術：
生物學和分子生物學研究領域的成就促進了轉基因動物生物反應器的蓬勃 發(fā)展。轉基因動物生產的蛋白經(jīng)過后加工而類似人體天然蛋白的結構，有完全 相似的生物活性，用轉基因動物生物反應器生產藥用蛋白是生物技術領域：
里的 又一次革命，它以一個全新生產珍貴藥用蛋白的模式區(qū)別于傳統(tǒng)藥物的生產。轉基因動物生物反應器生產藥用蛋白的一種技術路線是，將目的基因構建 成載體，通過不同方法獲得轉基因動物，通過轉基因動物的特定器官收集并提 純藥用蛋白，目前以乳腺生物反應器較為多見，已成功地在轉基因動物的乳腺 生物反應器中表達了多種蛋白基因。家蠶是一個理想的生物反應器，具有表達水平髙、翻譯后加工與修飾、安 全性髙、成本低廉等優(yōu)勢，已經(jīng)成為某些真核生物所不可替代的表達系統(tǒng)。家 蠶絲腺是典型的外分泌腺體。它是由功能高度特化為合成、分泌絲蛋白的巨核 細胞所構成的單層細胞管壁的管狀器官。絲腺合成并分泌到絲腺腔里的蛋白共 兩類，即絲素蛋白與絲膠蛋白。絲素蛋白在后部絲腺合成，有重鏈、輕鏈和P25 三種蛋白分子以6:6:1的比例構成，難溶于水(Cong-Zhao Zhou, et al. Nucleic Acids Reasearch， 2000， 28(12):2413-2419;Inoue S, et al. J Biol Chem, 2000， 275(51):40517-28)。由于絲腺具有強大的生產蛋白質和分泌蛋白質的能力，而 且絲腺腔中只含有絲素蛋白和絲膠蛋白，其性質比較特殊，很容易與其他目的 蛋白質分開，將對后分離純化帶來極大方便，這一優(yōu)點將是已有的表達系統(tǒng)所 不及的。因此，利用家蠶絲腺生物工廠(生物反應器)生產外源髙價值蛋白具 有實用經(jīng)濟效益和廣闊的發(fā)展前景。公開號為CN1786176的中國專利《家蠶絲腺生物反應器及其構建方法》公開了一種家蠶絲膠-1基因啟動子及信號肽編碼區(qū)帶動的家蠶絲腺生物反應 器，通過構建由含有絲膠-l基因啟動子及信號肽編碼區(qū)的DNA片段、外源目 的基因、含有絲膠-1基因polyA信號位點序列的表達框構成的絲腺特異分泌 表達質粒，再將表達框架亞克隆進病毒表達系統(tǒng)的供體質粒，然后轉化 DH10BacAEGT感受態(tài)細胞，抽提重組病毒DNA,導入載體細胞包裝成重組 病毒質粒，大量擴增病毒，最后注射家蠶，當病毒在蠶體大量繁殖，復制的時 候，外源基因在啟動子的控制下得到表達和后加工。上述現(xiàn)有技術的特點是利用昆蟲病毒表達系統(tǒng)表達外源基因，該系統(tǒng)的缺 點是存在病毒的潛在危害。公開號為CN1912116的中國專利，利用家蠶絲心蛋白重鏈啟動子大量表 達外源蛋白的方法公開了一種利用家蠶絲心蛋白重鏈啟動子大量表達外源蛋 白的方法，以piggyBac的衍生載體pBac[3xp3-DsRedaf
為轉座子，構建攜帶 IGF-I基因且可進行表達的重組注射載體pBac[3XP3-DsRedaf
-R3，經(jīng) QIAGEN Plasmid Midikit ( Qiagen )試劑盒純化，與pHA3PIG ( Tamura et al.， 2000)輔助質粒一起，采用Kanda & Tamura (1991)描述的方法進行家蠶胚 胎顯微注射。注射后的蠶卵用無毒膠封口，催青孵化，將當代的蠶蛾進行自交 或回交，獲得G1代蠶卵，掃描Gl代蠶卵獲得轉基因個體。該專利所公開的方法中沒有使用病毒表達系統(tǒng)，所以不存在桿狀病毒可能 帶來的問題。piggyBAC因子又稱IFP2，是目前應用比較廣泛的昆蟲轉座子，已被證實 在多種昆蟲中可以發(fā)揮轉座作用，可以通過轉座而將外源基因重組整合到昆蟲 基因組中。通常情況下，通過抗生素壓力篩選可以獲得穩(wěn)定表達外源基因的轉基因個 體。運用G418篩選哺乳動物轉化細胞已有較多的報道，而通過穩(wěn)定轉化的昆 蟲細胞表達外源基因的報道還不多見，而通過G418篩選轉基因家蠶個體研究 更少。最近，Invitrogen公司開發(fā)了一種能在昆蟲sf細胞穩(wěn)定表達外源基因 的載體pIZT/V5-His，該載體通過Zeocin的抗性標記篩選可獲得穩(wěn)定表達外源 基因的細胞系，而通過Zeocin抗生素對轉基因家蠶的篩選方法也未見報道。鑒于家蠶絲腺生物工廠(生物反應器)生產外源髙價值蛋白具有實用經(jīng)濟效益和廣闊的發(fā)展前景，研發(fā)一種家蠶絲腺生物工廠的建立方法具有重要的意 義。
發(fā)明內容
本發(fā)明目的是提供一種構建家蠶絲腺生物工廠的方法，在絲腺組織特異性 表達外源蛋白，以避免采用桿狀病毒載體可能帶來的問題。本發(fā)明進一步的目的是提供含有表達的外源蛋白的藥物的制備方法，以簡 化工藝，降低制備成本。為達到上述目的，本發(fā)明釆用的技術方案是一種家蠶絲腺生物工廠的建 立方法，包括以下步驟(l)構建帶有家蠶絲腺特異性表達基因的啟動子X控制外源蛋白基因表達(2) 構建帶有增強子元件en的基于piggyBAC轉座子的帶有熒光蛋白報告 基因的載體pigA3-en;(3) 雙酶切步驟(1)所得載體，回收啟動子X控制外源基因的片段，克隆進同 樣雙酶切的pigA3-en,得帶有增強子en和啟動子控制外源基因的載體；(4) 構建昆蟲細胞內具有活性的啟動子Y控制抗生素抗性基因的重組載體；(5) 酶切步驟(4)所得載體，回收啟動子Y控制抗生素抗性基因的片段，克隆 進同樣酶切的步驟(3)所得載體，得到帶有啟動子X控制外源基因表達盒、增 強子元件、抗生素抗性基因和熒光蛋白報告基因的重組轉基因載體；(6) 步驟(5)所得重組轉基因載體，在輔助質粒的作用下，利用精子介導法導 入初產卵，孵化，篩選獲得帶有抗生素抗性基因、熒光蛋白報告基因的家蠶， 檢測到目的基因，育種制成轉基因家蠶。上述技術方案中，所述家蠶絲腺特異性表達基因啟動子X選自絲素蛋白 重鏈基因啟動子、絲素蛋白輕鏈基因啟動子、絲膠蛋白-1基因啟動子或戶25 基因啟動子中的一種。所述外源蛋白基因可以是藥用蛋白基因，如人胰島素樣 生長因子-I (/C7F-I)基因、人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(h(7M-C^F) 基因；也可以是抗原蛋白基因。所述的增強子w選自家蠶絲素蛋白輕鏈基因 第一內含子序列、桿狀病毒的同源區(qū)(homologous region)增強子序列中的一種。所述昆蟲細胞內具有活性的啟動子Y為家蠶核型多角體病毒基因 啟動子。所述的熒光蛋白報告基因選自綠色熒光蛋白基因、紅色熒光蛋白基因中的一種。所述的抗性基因可以為新霉素抗性基因A/"。上述技術方案中的步驟(6)中所述的精子介導法是一種常用的向蠶卵導入 外源基因的方法，本發(fā)明中的家蠶品種為菁松品種，正常飼養(yǎng)至化蛾，將步驟 (5)所得的轉基因載體與輔助質粒混合，用毛細管注入處女蛾交尾襄，正常交配， 產卵。步驟(6)中所述的篩選方法是抗生素篩選與熒光檢測結合，具體步驟為 孵化步驟(6)所得的初產卵，孵化后的蟻蠶(G0)連續(xù)添食特定抗生素，G418 或者Zeodn至4齡眠，結合熒光倒置顯微鏡檢測，篩選出具有抗性基因、熒 光蛋白報告基因的家蠶?？股谿418的作用不僅僅是篩選，還可以防止所導 入家蠶基因組的外源基因在繼代過程中丟失。上述技術方案中，增強子(enhancer)指增加同它連鎖的基因轉錄頻率的 DNA序列。增強子是通過啟動子來增加轉錄的。有效的增強子可以位于基因 的5'端，也可位于基因的3'端，有的還可位于基因的內含子中。增強子的 效應很明顯， 一般能使基因轉錄頻率增加10 200倍，有的甚至可以髙達上千 倍。增強子的作用同增強子的取向無關，甚至遠離靶基因達幾千kb也仍有增 強作用，本發(fā)明的技術方案中構建的轉基因載體帶有增強子，提髙了外源基因 表達的水平。為實現(xiàn)本發(fā)明進一步的目的，采用的技術方案是， 一種含有外源蛋白的藥 物制備方法，采用上述技術方案獲得的轉基因家蠶的絲腺經(jīng)冷凍干燥后制成藥 物?；蛘?，一種含有人類藥用蛋白的藥物制備方法，采用上述技術方案獲獲得 的轉基因家蠶進行蠶種繁殖，將獲得的家蠶的絲腺經(jīng)冷凍干燥后制成藥物。 由于上述技術方案運用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有下列優(yōu)點1. 本發(fā)明通過采用piggyBAC轉座子可以獲得絲蛋白基因啟動子控制外 源基因，并在絲腺組織特異性表達的轉基因家蠶，用轉基因家蠶絲腺生產的外 源蛋白制備成口服制劑有明確的藥效。2. 本發(fā)明由于采用轉基因家蠶制備藥物，獲得的藥物中不會有桿狀病毒 殘留，生物安全性髙。3. 本發(fā)明獲得的轉基因家蠶可以進行育種繁殖，與普通家蠶一樣飼養(yǎng)， 用于制藥時，制備工藝簡單，成本低。4. 本發(fā)明所獲的轉基因家蠶帶抗生素抗性基因，可以防止所導入家蠶基 因組的外源基因在繼代過程中丟失問題。5. 本發(fā)明在所構建的重組轉基因載體中導入了增強子元件，可提髙外源 基因的表達水平。
具體實施方式
下面結合實施例對本發(fā)明作進一步描述實施例一絲膠蛋白基因啟動子-1控制人胰島素樣生長因子-I基因的轉 基因家蠶的制備技術操作過程如下1. 人胰島素樣生長因子-I基因的制備根據(jù)業(yè)已公開的人胰島素樣生長因子-I基因的cDNA序列(GenBank登 錄號1^11568)，按常規(guī)人工合成人胰島素樣生長因子-I活性肽對應的DNA序 列TGGATATCATGggaccggagacgctctgcggggctgagctggtggatgctcttetigttcgtgtg tggagacaggggcttttatttcaacaagcccacagggtatggctccagcagtcggagggcgcctcagacaggccaagtcagctTAAGCTTCTCGAGAT為了便于克隆表達，在5'端引入起始密碼子ATG和EcoRV的酶切位點， 3'端引入終止密碼子TAA和Xho I的酶切位點。2. 構建帶有人胰島素樣生長因子-I基因的pBluescriptllSK(+)重組質粒 將人工合成的DNA序列用EcoRV和Xho I雙酶切，常規(guī)法回收酶切片段，與用EcoRV和Xho I雙酶切的pBluescriptllSK(+)質粒(Stratagene公司產品) 連接。T4 DNA連接酶為GIBCO BRL公司產品，連接條件為16'C, 12小時。 連接產物轉化大腸桿菌TG1菌株，通過藍白斑篩選獲得重組轉化子，小批量 提取質粒DNA (參見《分子克隆》，1989,科學出版社)，用EcoRV和Xho I 酶切鑒定，有一條約230 bp的片段被克隆，經(jīng)測序證明已成功克隆了 /GF-I基因，所獲得的重組質粒稱之為pSK-IGF。3. 絲膠蛋白啟動子控制IGF-I基因的構建以家蠶菁松品種的基因組DNA為模板，以TPser-l(ccg aat tcg cac aca cac tac ata cc)和TPser隱2 ( ccg ata tcg ttg gcg gtc "t gga tcg c)為弓1物，通過常 規(guī)PCR擴增獲得約570bp左右的片段，經(jīng)序列測定證實為絲膠蛋白啟動子一l; 該PCR產物經(jīng)EcoR I和EcoRV雙酶切后，克隆進同樣雙酶的pSK-IGF載體， 獲重組pSK-Ser-IGF載體。以家蠶菁松品種的基因組DNA為模板，以 TPFib-L-3 ( ggc tcg age aaa ttg tgt ttg cgt tag g), TPFib-L-4 (gcg gta ccc act gtc caa tec acc gtc)為引物，擴增出約290 bp的片段，測序證明為絲素輕鏈 基因的polyA信號序列，該片段經(jīng)Xhol和Kpnl雙酶切后，與同樣酶切的 pSK-Ser-IGF載體連接，獲得重組載體pSK-Ser-IGF-polyA。4. 帶有增強子元件的基于piggyBAC轉座子的轉基因載體構建 以家蠶菁松品種的基因組DNA為模板，以TPFib-L-5(cgg ata tct atg ggctec agt aac c) TPFib國L隱6 (gcg tcg acg gtc agg tta gat taa egg g) 力弓l^f, 常規(guī)PCR擴增，獲得絲素輕鏈基因第1內含子中具有增強子功能的約400 bp 左右的序列，Sall和EcoRV雙酶切后，克隆進經(jīng)Sall和Smal雙酶切的 PigA3GFP 質粒(參見 Cary， L,C. et al. Transposon mutagenesis of baculoviruses: analysis of Trichoplusia ni transposon IFP2 insertions within the FP-locus of nuclear polyhedrosis viruses. Virology, 1989， 172:156-69) 獲 帶有增強子元件的基于piggyBAC轉座子的轉基因載體，命名為pigA3-en。5. 帶有增強子元件和絲膠蛋白啟動子1控制IGF- I外源基因的轉基因載 體的構建pSK-Ser-IGF-polyA用EcoR I和Kpn I雙酶切，回收絲膠蛋白啟動子1 控制IGF-I基因的片段(約1.1 kb)，克隆進EcoR I和Kpnl雙酶切的 pigA3-en載體，獲得的新載體命名為pigA3-Ser-IGF-en6. 構建帶有家蠶核型多角體病毒IE-1基因啟動子控制新霉素抗性基因 neo的重組載體以家蠶核型多角體病毒的DNA為模板，用IE-1基因啟動子的特異性引物 對(5'ttc gaa ttc gat ttg cag ttc ggg ac3', 5'gcg gat ate agt cgt ttg gtt gtt ca3')進行PCR擴增，PCR產物用EcoR I 、 EcoRV雙酶切后，克隆在 pBlnescriptlISK(+)載體，獲得帶有家蠶核型多角體病毒IE-1基因啟動子的載 體pSK-IE以pcDNA3.1載體(Invitron公司產品)為模板，以Neol(5'ctg ata tea tga ttg aac aag atg g30 和Neo3 (5'agc tcg aga att cta get aga ggt cga c30 為引 物，PCR擴增出neo基因的編碼序列及其下游的polyA信號序列(約1.1 kb), 經(jīng)XhoI、 EcoRV酶切消化后，克隆進經(jīng)過同樣處理的pSK-IE載體中，獲得 pSK-IE-Neo載體。7. 構建帶有家蠶絲膠蛋白啟動子控制IGF-I表達盒、增強子元件、新霉 素抗性基因(iieo)和熒光蛋白報告基因的重組轉基因載體pSK-IE-Neo載體用EcoRl酶切，回收帶有IE啟動子控制新霉素抗性基 因的片段IE-Neo,克隆進同樣酶切的pigA3-Ser-IGF-en質粒，獲的重質粒命 名為pigA3-Ser-IGF-en-neo.8. 精子介導法獲得帶有熒光報告基因GFP和新霉素抗性的轉基因家蠶 家蠶品種為菁松品種，正常伺養(yǎng)至化蛾。將pigA3-Ser-IGF-en-neo及輔助質粒(參見Tamura Toshiki. et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L using a piggyBac transposon-derived vector. Nature Biotechnology, 2000,18:81-84) 按l:l混合 (混合濃度2jig/fiL)，用毛細管玻璃針以1.5 2.0 ^L/只注入處女蛾交尾囊，正 常交配，產卵，孵化后的蟻蠶(Go)連續(xù)添食10000pg/mL的G418至4齡眠， 結合熒光倒置顯微鏡檢測，篩選出抗G418、帶有熒光蛋白報告基因的家蠶， 保留具有明顯熒光顯示的家蠶(轉基因家蠶)，進行IGF-I基因檢測和常規(guī)家 蠶育種。9. 轉基因家蠶的/GF-I基因PCR檢測針刺取少量熒光家蠶的血淋巴(約20 fiL血淋巴/每頭)，加500 TE緩 沖液(pH8.0),力fl 500 nL過飽和苯酚(pH8.0)作用10 min， 12 000 r/min 離心10 min,取上清，再用過飽和酚提取一次，加氯仿:異戊醇(24:1)作用 10 min, 12 000 r/min離心10 min,取上清加2倍體積無水冷乙醇，混合均勻， 置陽20'C， 2小時后再用12 000 r/min離心10 min,棄上清，用70%乙醇洗沉淀，12 000 Wmin離心1 min，棄上清，自然干燥，沉淀用10 fiL TE緩沖液溶 解，獲家蠶基因組總DNA。以提取蠶血淋巴總DNA作為模板，用IGF- I基因的特異性引物T-IGF1 (tgg ata tea tgg gac egg aga cgc tct gc)和T-IGF2(atc tcg aga age "a age tga ctt ggc agg ctt g )進行PCR檢測，同時設正常家蠶為陰性對照， pigA3-Ser-IGF-en-neo質粒DNA為陽性對照。PCR檢測顯示，在Go、 G。 G2、 G3等代均可擴增出230 bp左右的IGF-I特異片段，陰性對照無該片段產 生，表明IGF-I基因已進入家蠶基因組，并穩(wěn)定遺傳。 10.轉基因家蠶絲腺IGF-I表達產物檢測解剖取轉基因家蠶，取中部絲腺組織，用磷酸鹽緩沖液(O.Olmol/L)充 分研磨破碎細胞，12 000 r/min, 4r離心10min，取上清，用ELISA法，按 檢測試劑盒(博士德，武漢博士德生物工程有限公司)說明書測定IGF-I的 表達水平，同設正常家蠶中部絲腺對照，結果表明，轉基因家蠶中部絲腺組織 IGF- I的表達水平達25 000 — 40 000 pg/g。實施例二絲蛋白基因P25啟動子控制人胰島素樣生長因子-I基因的轉 基因家蠶的制備具體實施方案與實施例一基本相同，不同之處是將實施例一中的步驟3 改為"p25基因啟動子控制IGF-I基因的構建"，具體步驟是1. 同實施例一中的步驟12. 同實施例一中的步驟23. p25基因啟動子控制IGF-I基因的構建以家蠶菁松品種的基因組DNA為模板，以TPP25-1 (gcg aat tea aca gaa ate ccg ag)和TPP25-2 (ccg ata tec gcg cca gga tgt tgc gcg)為弓l物，通過常 規(guī)PCR擴增獲得470bp左右的片段，經(jīng)序列測定證實為p25基因啟動子；該 PCR產物經(jīng)EcoR I和EcoRV雙酶切后，克隆進同樣雙酶的pSK-IGF載體， 獲重組pSK-P25-IGF載體。以家蠶菁松品種的基因組DNA為模板，以 TPFib-L-3 (ggc tcg age aaa ttg tgt "g cgt tag g), TPFib-L-4 (gcg gta ccc act gtc caa tec acc gtc)為引物，擴增出290bp的片段，測序證明為絲素輕鏈基因 的polyA信號序列，該片段經(jīng)Xhol和Kpnl雙酶切后，與同樣酶切的pSK-Ser-IGF載體連接，獲得重組載體pSK-p25-IGF-polyA。4. 同實施例一中的步驟45. 帶有增強子元件和p25啟動子控制IGF- I外源基因的轉基因載體的構建pSK-p25-IGF-polyA用EcoR I和Kpnl雙酶切，回收p25啟動子控制 IGF- I基因的片段(990 bp)，克隆進EcoR I和Kpn I雙酶切的pigA3-en載 體，獲得的新載體命名為pigA3-p25-IGF-en6. 同實施例一中的步驟67. 構建帶有p25啟動子控制IGF-I表達盒、增強子元件、新霉素抗性基 因(neo)和熒光蛋白報告基因的重組轉基因載體pSK-IE-Neo載體用EcoRl酶切，回收帶有IE啟動子控制新霉素抗性基 因的片段IE-Neo,克隆進同樣酶切的pigA3-p25-IGF-en質粒，獲的重質粒命 名為pigA3-p25-IGF-en-neo.8. 同實施例一中的步驟8，但所用的質粒為pigA3-p25-IGF-en-neo。9. 同實施例一中的步驟910. 同實施例一中的步驟10,但測定的組織為后部絲腺。結果表明，轉 基因家蠶后部絲腺組織IGF- I的表達水平超過25 000pg/g。實施例三帶有BmNPV hr3增強子、絲素蛋白輕鏈基因(Fib-L)啟動 子控制人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子基因(hGM-CSF)的轉基因家蠶的制 備具體實施方案與實施例一和實施例二基本相同，不同之處是將實施例一和 實施例二中的人胰島素樣生長因子-I基因改為人粒細胞-巨噬細胞集落刺激 因子基因，啟動子改為絲素蛋白輕鏈基因(Fib-L)啟動子，增強子改為家蠶 核多角體病毒(BmNPV)同源區(qū)序列(homologous region)的hr3增強子。 具體步驟是1.人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子基因的制備根據(jù)業(yè)已公開的人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子基因(hGM-CSF)的 cDNA序列(GenBank登錄號M11220),按常規(guī)人工合成人粒細胞-巨噬細胞 集落刺激因子基因的DNA序列cccgctcgcccagccccagcacgcagccctgggagcatgtgaatgccatccaggaggcccggcgtctcctgagccgacctgcctacagacccgcctggagctgtacaagcagggcctgcggggcagcctcaccaagctcaaggg ccccttgaccatgatggccagccactacaagcagcactgccctccaaccccggaaacttcctgtgcaacccag attatcacctttgaaagtttcaaagagaacctgaaggactttctgcttgtcatcccctttgactgctgggagcca gtccaggagtgaCTCGAGAT為了便于克隆表達，在5'端引入EcoRV的酶切位點，3'端引入XhoI的 酶切位點。2. 構建帶有人粒細胞-巨噬細胞集落剌激因子基因的pBluescriptlISK(+) 重組質粒同實施例一中的步驟2,不同的是，用EcoRV和Xhol酶切鑒定，有一 條約450 bp的片段被克隆，經(jīng)測序證明已成功克隆了 hGM-CSF基因，所獲 得的重組質粒稱之為pSK-GMCSF。3. 絲素蛋白輕鏈基因啟動子控制hGM-CSF基因的構建 同實施例一中的步驟3，不同的是，所用引物為TPFib-L-l(cgg aat tcc gactcg cca agt tac gtc) 和TPFib-L-2 (gcg ata tcg tgg tct gtt atg tga cc), PCR 擴增獲得約600 bp左右的片段，經(jīng)序列測定證實為絲素蛋白輕鏈基因啟動子， 獲重組pSK-FibL-GMCSF載體和重組載體pSK-FibL-GMCSF-polyA。4. 帶有絲素蛋白輕鏈基因啟動子控制hGM-CSF外源基因的基于 piggyBAC轉座子轉基因載體的構建pSK-FibL-GMCSF-polyA用EcoR I和Kpn I雙酶切，回收絲素蛋白輕鏈 基因啟動子控制hGM-CSF基因的片段(約1.3 kb)，克隆進EcoR I和Kpn I 雙酶切的PigA3GFP載體，獲得的新載體命名為pigA3-FibL-GMCSF5. 構建帶有家蠶核型多角體病毒IE-1基因啟動子控制新霉素抗性基因 neo的重組載體同實施例一中的步驟6。6. 構建帶有家蠶絲素蛋白輕鏈基因啟動子控制hGM-CSF表達盒、新霉 素抗性基因(neo)和熒光蛋白報告基因的重組轉基因載體pSK-IE-Neo載體用EcoRl酶切，回收帶有IE啟動子控制新霉素抗性基 因的片段IE-Neo,克隆進同樣酶切的pigA3-FibL-GMCSF質粒，獲的重質粒 命名為pigA3-FibL-GMCSF-neo7. 構建帶有家蠶絲素蛋白輕鏈基因啟動子控制hGM-CSF表達盒、增強 子元件、新霉素抗性基因(neo)和熒光蛋白報告基因的重組轉基因載體以BmNPV的基因組DNA為模板，以TPhr3-l(ctg gta ccg ccg tgc cca gtc acg tgt acg cc)和TPhr3-2 (etc ccg ggg tga aca gcc cat teg agg c) 為弓l物， 常規(guī)PCR擴增，獲得家蠶核多角體病毒(BmNPV)同源區(qū)序列(homologous region)的hr3中具有增強子功能的約740 bp左右的序列，Kpn I和Sma I雙 酶切后，克隆進經(jīng)Kpn I和Sma I雙酶切的pigA3-FibL-GMCSF-neo質粒， 獲帶有增強子元件的基于piggyBAC轉座子的轉基因載體，命名為 pigA3-FibL-GMCSF-en-neo。8. 精子介導法獲得帶有熒光報告基因GFP和新霉素抗性的轉基因家蠶 同實施例一中的步驟8,不同的是，所用轉基因載體為pigA3-FibL-GMCSF-en-neo，進行hGM-CSF基因的檢測。9. 轉基因家蠶的hGM-CSF基因PCR檢測 同實施例一中的步驟9提取蠶血淋巴總DNA。以提取蠶血淋巴總DNA作為模板，用hGM-CSF基因的特異性引物 T-GMCSFl"gg ata tea tgt ggc tgc aga gcc tgc)和T隱GMCSF2(atc teg agt cac tec tgg act ggc tec c)進行PCR檢測，同時設正常家蠶為陰性對照， pigA3-FibL-GMCSF-en-neo質粒DNA為陽性對照。PCR檢測顯示，在G0、G2、 G3等代均可擴增出450 bp左右的hGM-CSF特異片段，陰性對照無 該片段產生，表明hGM-CSF基因已進入家蠶基因組，并穩(wěn)定遺傳。10. 轉基因家蠶絲腺hGM-CSF表達產物檢測解剖取轉基因家蠶，取后部絲腺組織，用磷酸鹽緩沖液(0.01mol/L)充 分研磨破碎細胞，12 000 r/min， 4tl離心10min,取上清，用ELISA法，按 檢測試劑盒(Beckman coulter EIA GM-CSF)說明書測定hGM-CSF的表達 水平，同設正常家蠶后部絲腺對照，結果表明，轉基因家蠶后部絲腺組織 hGM-CSF的表達水平超過25 000pg/g。實施例四帶有人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子基因(hGM-CSF)的轉 基因家蠶的育種Go代熒光蠶與正常蠶(菁松)交配后代為d代，G,代同一蛾圏孵化后單 獨飼養(yǎng)(下同)，用便攜式熒光燈結合熒光倒置顯微鏡檢測G,代家蠶幼蟲，結 合PCR檢測(采用實施例一第9步，下同)，將既有明顯熒光顯示，又能PCR 檢測到hGM-CSF基因的同一蛾圈孵化后飼養(yǎng)的G,代轉基因家蠶進行雜交育 種，獲得G2代，用以上從G,代獲得G2代的方法，將G2代育種制備為Gj代， 對G2、 G3代同樣進行熒光檢測和PCR檢測，保留從G2代到G3代不發(fā)生性 狀分離的G3代。對保留的G3代的同一蛾圈蠶種分為兩組， 一組備用， 一組正 常飼養(yǎng)，并與正常蠶(菁松)進行單對雜交，同一蛾圈蠶種的雜交后代如果均 不發(fā)生性狀分離時，認定該蛾圈蠶種為轉基因家蠶。常規(guī)飼養(yǎng)該蛾圈蠶種的備 用組，從而獲得不發(fā)生性狀分離的轉hGM-CSF基因的家蠶品種。實施例五口服型囊膠制備及生物活性試驗收集實施例一中轉IGF- I基因的家蠶的中部絲腺或實施例二中轉IGF- I 基因家蠶的后部絲腺，經(jīng)勻漿后，用紗布過濾去除粗雜質，冷凍干燥成粉劑原 料，將原料粉按每kg加水1 L的比例溶解，經(jīng)18 000 r/min離心1小時，取 上清，再經(jīng)冷凍干燥后成精原料粉，原料粉裝入膠襄，制成口服型膠囊?？诜?型膠囊經(jīng)小鼠動物實驗證明，有明顯降血糖作用。
權利要求
1. 一種構建家蠶絲腺生物工廠的方法，其特征在于包括以下步驟
(1)構建帶有家蠶絲腺特異性表達基因的啟動子X控制外源蛋白基因表達盒；
(2)構建帶有增強子元件en的基于piggyBAC轉座子的帶有熒光蛋白報告基因的載體pigA3-en；
(3)雙酶切步驟(1)所得載體，回收啟動子X控制外源基因的片段，克隆進同樣雙酶切的pigA3-en，得帶有增強子en和啟動子X控制外源基因的載體；
(4)構建昆蟲細胞內具有活性的啟動子Y控制抗生素抗性基因的重組載體；
(5)酶切步驟(4)所得載體，回收啟動子Y控制抗性基因的片段，克隆進同樣酶切的步驟(3)所得載體，得到帶有熒光蛋白報告基因和啟動子X控制外源基因表達盒、增強子元件、啟動子Y控制抗生素抗性基因的重組轉基因載體；
(6)步驟(5)所得重組轉基因載體，在輔助質粒的作用下，利用精子介導法導入初產卵，孵化，篩選獲得帶有抗生素抗性基因、熒光蛋白報告基因的家蠶，檢測到目的基因，育種制成轉基因家蠶。
2. 根據(jù)權利要求
1所述的構建家蠶絲腺生物工廠的方法，其特征在于 所述家蠶絲腺特異性表達基因啟動子X選自絲素蛋白重鏈基因啟動子、絲素 蛋白輕鏈基因啟動子、絲膠蛋白-1基因啟動子或尸25基因啟動子中的一種； 昆蟲細胞內具有活性的啟動子Y為家蠶核型多角體病毒/E-l基因啟動子。
3. 根據(jù)權利要求
1所述的構建家蠶絲腺生物工廠的方法，其特征在于 所述外源蛋白基因是藥用蛋白基因，選自人胰島素樣生長因子-I基因、人粒 細胞-巨噬細胞集落刺激因子基因中的一種。
4. 根據(jù)權利要求
1所述的構建家蠶絲腺生物工廠的方法，其特征在于 所述的增強子e"選自家蠶絲素蛋白輕鏈基因第一內含子序列、桿狀病毒的同 源區(qū)增強子序列中的一種。
5. 根據(jù)權利要求
1所述的構建家蠶絲腺生物工廠的方法，其特征在于 所述的抗性基因選自新霉素抗性基因《^抗性基因。
6. —種含有外源蛋白的藥物制備方法，其特征在于采用權利要求
l獲 得的轉基因家蠶的絲腺經(jīng)冷凍干燥后制成藥物。
7. —種含有外源蛋白的藥物制備方法，其特征在于采用權利要求
l獲 得的轉基因家蠶進行蠶種繁殖，將獲得的家蠶的絲腺經(jīng)冷凍干燥后制成藥物。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種構建家蠶絲腺生物工廠的方法，以轉座子piggyBAC因子為基礎載體，通過基因工程操作構建帶有家蠶絲蛋白特異性啟動子控制外源基因表達盒、增強子活性的元件、抗生素抗性基因和熒光蛋白報告基因的重組轉基因載體，與輔助質粒作混合，導入初產卵，孵化后的蟻蠶連續(xù)添食特定抗生素至4齡眠，獲得抗特定抗生素、帶有熒光蛋白報告基因的家蠶，檢測到目的基因，育種制成轉基因家蠶。利用該轉基因家蠶的絲腺組織可獲得藥用蛋白藥物。本發(fā)明方法實現(xiàn)轉基因家蠶絲腺工廠制備藥用蛋白藥物，生產成本低，不涉及具有潛在危害的桿狀病毒，安全性高，具有重要的實施價值。
文檔編號A01K67/00GKCN101270367SQ200810025300
公開日2008年9月24日 申請日期2008年4月30日
發(fā)明者曹廣力, 沈衛(wèi)德, 薛仁宇, 貢成良 申請人:蘇州大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan