專利名稱:Asia1型口蹄疫病毒感染性cDNA及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及單股正鏈RNA病毒的感染性克隆，尤其涉及Asial型ロ蹄疫病毒感染性cDNA及其構(gòu)建方法，本發(fā)明還涉及由該Asial型ロ蹄疫病毒感染性cDNA和表達(dá)T7RNA聚合酶的真核表達(dá)載體所組成的江蘇譜系A(chǔ)sial型ロ蹄疫病毒的反向遺傳操作系統(tǒng)；本發(fā) 明還進(jìn)一歩涉及該感染性cDNA通過體外轉(zhuǎn)錄以及該反向遺傳操作系統(tǒng)通過體內(nèi)轉(zhuǎn)錄的方式在拯救ロ蹄疫病毒中的應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
ロ蹄疫病韋(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)屬于小 RNA病韋科ロ蹄疫病毒屬的成員，為單股正鏈RNA，其基因組RNA全長約8. 5kb。ロ蹄疫是嚴(yán)重危害偶蹄動(dòng)物的重要傳染病之一，該病引起幼畜死亡、產(chǎn)奶量下降、肉食減少、肉品下降、動(dòng)物的生產(chǎn)性能降低，導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失。此外，由于貿(mào)易的限制和禁止而引起的損失更大，全世界毎年由此造成的直接經(jīng)濟(jì)損失可達(dá)數(shù)百億美元。2005年以來在我國江蘇、山東、甘肅、北京、河北等地爆發(fā)了 Asial型FMD(Asial/JS/CHA/05，GenBank登錄號EF149009)，由于在我國江蘇省首先分離，被稱作Asial型江蘇譜系。該譜系ロ蹄疫病毒在我國牛群中ー經(jīng)流行，傳播趨勢迅猛，造成的損失極為嚴(yán)重。因此，積極開展Asial型FMD江蘇譜系毒株的研究，對我國FMD的防控具有重要的意義。
反向遺傳操作系統(tǒng)是在分子水平研究病毒的重要工具之一。通過對病毒基因組進(jìn)行定點(diǎn)突變、缺失、替換基因組的任意部分以產(chǎn)生突變體，借此在分子水平上研究病毒基因的結(jié)構(gòu)與功能、了解決定病毒毒力的分子基礎(chǔ)、宿主嗜性與跨種傳播的機(jī)制。感染性克隆還可用于抗原表位的研究，特別是構(gòu)象表位的研究。為研究病毒減毒奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為研制新型疫苗提供了有力的工具。
目前已經(jīng)有報(bào)道成功構(gòu)建了牛源毒株OlK株(Zibert A, Maass G, Strebel K, etal.Infectious loot-and—mouth disease viruses derived from acloned full-lengthcDNA[J], J Virol，1990,64 :2467-2473)、牛源毒株 A12 株(Rieder E, Bunch T, Brown F,et al. Genetically engineeredfoot-and-mouth disease viruses with poly (C) tractsof two nucleotide arevirulent in mice[J]. J Virol, 1993,67 :5139-5145)、豬源毒株0H/99 株(Guanqing liu, et al. Generation of an infectious cDNA clone of anFMDVstrain isolated from swine. Virus Research, 2004,104 :157-164)以及兔化弱毒疫苗株ZB/CHA/58 (att)(中國專利公開號CN101225395A，發(fā)明名稱亞洲ー型ロ蹄疫病毒感染性cDNA及其構(gòu)建方法。)ロ蹄疫病毒的感染性cDNA，并在此基礎(chǔ)上對FMDV進(jìn)行了探索性的研究。但上述感染性克隆與我國近年來流行的江蘇譜系A(chǔ)sial型ロ蹄疫病毒有著很大的遺傳偏離，因此構(gòu)建符合我國流行情況的江蘇譜系A(chǔ)sial型ロ蹄疫病毒的反向遺傳操作平臺，對開展Asial型ロ蹄疫病毒結(jié)構(gòu)與功能研究以及新型疫苗的研制具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
[0005]本發(fā)明的首要目的是提供ー種Asial型江蘇譜系ロ蹄疫病毒的全長感染性cDNA，該全長感染性cDNA包含了保證所合成的轉(zhuǎn)錄本具有感染性所要求的poIy(A)序列和poly (C)序列；
所述Asial型ロ蹄疫病毒的全長感染性cDNA克隆5’末端具有T7RNA聚合酶啟動(dòng)子序列，3’末端具有単一的限制性酶切位點(diǎn)；其中，所述的3’末端限制性酶切位點(diǎn)是EcoRV酶切位點(diǎn)或NotI酶切位點(diǎn)；5’末端上游具有SphI酶切位點(diǎn)。
所述Asial型ロ蹄疫病毒的全長感染性cDNA克隆除了啟動(dòng)子，poly (A)序列和PoIy(C)序列之外，其余的核苷酸序列與ロ蹄疫 病毒基因組天然序列相差不超過6個(gè)核苷酸序列；
所述Asial型ロ蹄疫病毒的全長感染性cDNA克隆的poly (C)結(jié)構(gòu)具有14-20個(gè)聚合C，poIy(A)尾具有19-22個(gè)A(更優(yōu)選為具有19個(gè)A) ；poIy(C)結(jié)構(gòu)及其側(cè)翼序列是通過RT-PCR直接擴(kuò)增得到，利用FMDV基因組中自然存在的兩個(gè)限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)，將獲得的包含PoIy(C)結(jié)構(gòu)的片段導(dǎo)入全長cDNA中。
所述Asial型ロ蹄疫病毒的全長感染性cDNA以pBluescriptSK (+)為載體；
進(jìn)ー步優(yōu)選的，所述Asial型ロ蹄疫病毒的全長感染性cDNA，包含SEQ ID NO 1所示的序列。
一種構(gòu)建上述Asial型江蘇譜系ロ蹄疫病毒的全長感染性cDNA的方法，包括
(I)以Asial型江蘇譜系ロ蹄疫病毒RNA為模板，應(yīng)用5’RACE方法擴(kuò)增基因組的5’末端序列片段；
(2)采用RT-PCR獲得ロ蹄疫病毒基因組各部分的6個(gè)片段，包括poly (C)結(jié)構(gòu)及其側(cè)翼序列；
(3)將所擴(kuò)增的PCR片段采用限制性內(nèi)切酶酶切克隆的方法組裝克隆到質(zhì)粒載體中，全長cDNA克隆5’末端具有T7RNA聚合酶啟動(dòng)子序列，3’末端具有単一的限制性酶切位點(diǎn)；
(4)將所述cDNA各片段連接，構(gòu)成帶有基因組全長cDNA的質(zhì)粒載體；純化回收包含病毒基因組全長cDNA的質(zhì)粒，即得。
其中，步驟(I)所用到引物序列為SEQ ID NO :15、SEQ ID NO :16所示；步驟(2)中所用到引物序列為 SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQID NO :12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO :14 所示；
步驟(3)中所述的質(zhì)粒載體是pBluescript II SK (+)載體；
本發(fā)明的另ー目的是提供ー種Asial型ロ蹄疫病毒反向遺傳操作系統(tǒng),該Asial型ロ蹄疫病毒反向遺傳操作系統(tǒng)由上述的Asial型江蘇譜系ロ蹄疫病毒的全長感染性cDNA和表達(dá)T7RNA聚合酶的真核表達(dá)載體所組成。
所述的表達(dá)T7RNA聚合酶的真核表達(dá)載體pT7RNAP，其構(gòu)建方法包括將T7RNA聚合酶基因克隆到真核表達(dá)載體PCDNA3. I中，并在該基因的5'端引入Kozak序列，以確保T7RNA聚合酶的高效表達(dá)；
同吋，為檢測表達(dá)載體pT7RNAP是否表達(dá)pT7RNAP以及該酶是否具有轉(zhuǎn)錄活性，構(gòu)建了以綠色熒光蛋白為檢測信號的檢測載體PT7-IRES-EGFP，該載體是利用FMDV的IRES能夠介導(dǎo)非帽依賴性表達(dá)外源基因的特性，將FMDV的IRES和EGFP順次克隆到原核表達(dá)載體PET-28a中，并使之受控于ロ蹄疫病毒的IRES元件下；
把上述兩個(gè)重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，培養(yǎng)20 48h，在紫外顯微鏡下觀察，能夠看到典型的綠色熒光，表明PT7RNAP載體能夠表達(dá)I7RNA聚合酶并具有轉(zhuǎn)錄活性。[0022]本發(fā)明的另ー個(gè)目的是將所構(gòu)建的Asial型江蘇譜系ロ蹄疫病毒的全長感染性cDNA用于拯救ロ蹄疫病毒，包括將所述Asial型江蘇譜系ロ蹄疫病毒的全長感染性cDNA采用體外轉(zhuǎn)錄的方式轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞；或者是將所述Asial型江蘇譜系ロ蹄疫病毒的全長感染性cDNA與表達(dá)I7RNA聚合酶的真核表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染(體內(nèi)轉(zhuǎn)錄)BHK-21細(xì)胞以拯救ロ蹄疫病毒；
試驗(yàn)證明，利用本發(fā)明所構(gòu)建的Asial型江蘇譜系ロ蹄疫病毒的全長感染性cDNA不倫是采用體外轉(zhuǎn)錄還是采用體內(nèi)轉(zhuǎn)錄(與表達(dá)I7RNA聚合酶的真核表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染)的方式均可以成功的拯救出ロ蹄疫病毒。
本發(fā)明ロ蹄疫病毒感染性cDNA不同于國內(nèi)外ロ蹄疫病毒感染性cDNA的地方主要有以下幾點(diǎn)
(I)美國的感染性cDNA是以A型ロ蹄疫病毒為材料研制出來的，德國的感染性cDNA是以歐洲流行毒株的代表株OlK為原材料的，分離自牛體。本發(fā)明所選用的毒株為我國流行的Asial型江蘇譜系ロ蹄疫病毒Asial/YS/CHA/05株，分離自牛體，反映了我國ロ蹄疫的流行特點(diǎn)，因此本發(fā)明ロ蹄疫病毒感染性cDNA對我國ロ蹄疫的研究更具有針對性，對我國ロ蹄疫的防控具有積極的意義。
(2)研制感染性cDNA的策略不同
美國的A株感染性cDNA是用人工方法合成一系列長度的poly (C) (Cn = 2、6、16、25，35)，并人為的在poly(C)兩端加上限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)，并在基因組全長cDNA片段下游中加入相應(yīng)的內(nèi)切酶識別位點(diǎn)，從而將Poly(C)導(dǎo)入全長cDNA序列中，這種策略會在全長cDNA中造成堿基的改變并引入非基因組的核苷酸。
德國的0IK株感染性cDNA是利用末端轉(zhuǎn)移酶的酶促活性，給全長cDNA加上poly (C)結(jié)構(gòu)，這種方法不能人為控制，可操作性差，而且也需要改變?nèi)LcDNA的真實(shí)序列。
本發(fā)明通過RT-PCR直接擴(kuò)增獲得poly(C)及其側(cè)翼序列，利用FMDV基因組中自然存在的限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)，將Poly(C)結(jié)構(gòu)導(dǎo)入全長cDNA中，不需要改變基因組的真實(shí)序列，可操作性強(qiáng)。
(3)所包含的poly(A)尾巴序列長度不一樣美國的A型感染性cDNA含有15個(gè)A,德國的OlK株感染性cDNA含有90個(gè)A。本發(fā)明感染性cDNA含有19個(gè)A這ー長度的poly(A)結(jié)構(gòu)，能夠保證病毒感染性的需要。
(4)國內(nèi)外建立ロ蹄疫病毒的反向遺傳操作平臺均是使用體外轉(zhuǎn)錄的方法拯救病毒，而本發(fā)明建立了拯救ロ蹄疫病毒的體內(nèi)轉(zhuǎn)錄和體外轉(zhuǎn)錄的雙系統(tǒng)。
目前，判斷所構(gòu)建的ロ蹄疫病毒感染性cDNA是否符合要求關(guān)鍵要滿足以下幾點(diǎn)要求
(I)病毒基因組在分子克隆過程中要確保其真實(shí)性因開放閱讀框中的一個(gè)堿基的變化就有可能會影響整個(gè)基因組的結(jié)構(gòu)從而導(dǎo)致整個(gè)全長質(zhì)粒不具備感染性；此外，因?yàn)镽NA病毒自身的特點(diǎn)，其基因組并不穩(wěn)定；
(2)要保證所構(gòu)建的感染性cDNA含有足夠長的poly (C)序列和poly (A)尾巴結(jié)構(gòu)；
(3) 3’末端具有合適的限制性酶切位點(diǎn)；
本發(fā)明所述的全長感染性cDNA除了啟動(dòng)子、poly (A)序列和poly (C)序列之外，其余的核苷酸序列與ロ蹄疫病毒基因組天然序列相差不超過6個(gè)核苷酸序列，poIy(C)結(jié)構(gòu)及其側(cè)翼序列是通過RT-PCR直接擴(kuò)增得到，所以本發(fā)明感染性cDNA在克隆過程中其真實(shí)性高；另外，本發(fā)明全長感染性cDNA的poIy(A)尾具有19-22個(gè)A ;所述poly (C)結(jié)構(gòu)具有14-20個(gè)聚合C，含有足夠長的poIy(C)序列和poIy(A)尾巴結(jié)構(gòu)；所述感染性cDNA的3’末端具有EcoRV酶切位點(diǎn)或NotI酶切位點(diǎn)。
本發(fā)明的感染性cDNA的成功構(gòu)建將為研究ロ蹄疫提供ー個(gè)有力的基因技術(shù)操作平臺，可以方便人們對ロ蹄疫病毒基因組的操作。具體應(yīng)用主要有以下幾個(gè)方面
(I) 了解基因的結(jié)構(gòu)與功能；
(2) 了解病毒的致病機(jī)理和基因組的復(fù)制、表達(dá)調(diào)控機(jī)制；
(3)研究病毒與宿主細(xì)胞的相互作用；
(4)研究病毒的B細(xì)胞表位特別是構(gòu)象型B細(xì)胞表位；
(5)通過反向遺傳操作系統(tǒng)制備不會發(fā)生毒力返祖的減毒疫苗株；
(6)研究開發(fā)新型ロ蹄疫疫苗；
本發(fā)明的Asial型ロ蹄疫病毒感染性cDNA，能夠在分子水平上通過突變、插入、缺失和替換來研究ロ蹄疫病毒的復(fù)制、毒力的分子決定因素和減毒機(jī)制、分子致病機(jī)理、基因產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)與功能、宿主嗜性改變與跨種傳播，以及減毒活疫苗、表位疫苗、核酸疫苗、標(biāo)記疫苗等新型疫苗的研究開發(fā)，是進(jìn)一歩研究ロ蹄疫病毒和防制ロ蹄疫的極有價(jià)值的工具。


圖lAsial/YS/CHA/05株FMDV基因組拼接策略示意圖。
圖2pET_28a(+)載體的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖 3pBluescript II SK(+)。
圖4pcDNA3. I (+)。
圖5全基因組cDNA的酶切鑒定圖A lkb Ladder ；B =Sphl和Notl雙酶切鑒定；C Ikb Ladder ；D EcoRl 單酶切鑒定。
圖6體外轉(zhuǎn)錄的RNA電泳圖。
圖7 (A)拯救病毒感染的BHK-21細(xì)胞⑶正常BHK-21細(xì)胞。
圖8 ロ蹄疫病毒粒子的免疫電鏡觀察(bar = IOOnm)。
圖9搖救病毒分子標(biāo)簽的鑒定(A) lanel :IOObp DNA Ladder ;lane2 :親本毒PCR產(chǎn)物PstI酶切鑒定；lane3 :拯救病毒PCR產(chǎn)物PstI酶切鑒定(B)親本毒株基因組PstI位點(diǎn)區(qū)的序列分析(C)拯救病毒PstI位點(diǎn)消除的序列分析驗(yàn)證。
圖10拯救感染BHK-21細(xì)胞的免疫熒光檢測(A)拯救病毒感染的BHK-21細(xì)胞(B)親本病毒感染的BHK-21細(xì)胞(C)正常BHK-21細(xì)胞對照。
圖11拯救病毒和親本病毒的一步生長曲線。[0056]圖12I7RNA聚合酶的表達(dá)和活性檢測(A)pI7RNAP和pT7_IRES_EGFP載體共轉(zhuǎn)BHK-21細(xì)胞后48h EGFP表達(dá)情況；(B)pEGFP-Nl載體轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞作為陽性對照；(C)PT7-IRES-EGFP載體轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞作為陰性對照。[0057]圖13pT7RNAP 載體和 p!7-IRES_EGFP 載體示意圖。
具體實(shí)施方式
一、試驗(yàn)材料、有關(guān)術(shù)語和方法
在本發(fā)明中，所述的術(shù)語“反向遺傳操作”指的是相對于經(jīng)典遺傳學(xué)而言的，是在獲得ロ蹄疫病毒(Asial/YS/CHA/05株)基因組全部序列的基礎(chǔ)上，按組成順序構(gòu)建全長病毒基因組，讓其裝配出具有生物活性的病毒粒子，為進(jìn)ー步對ロ蹄疫病毒病毒基因進(jìn)行必要的加工和修飾，如定點(diǎn)突變、基因插入/缺失、基因置換等，從而研究基因組的結(jié)構(gòu)與功能，以及這些修飾可能對病毒的表型、性狀有何種影響等方面的內(nèi)容奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
本發(fā)明所述Asial型ロ蹄疫病毒毒株指的是Asial/YS/CHA/05株。
本發(fā)明中所用到的參考文獻(xiàn)(I)王海偉，涂亞斌，周國輝，楊德成，張亞科，于力，Asial型ロ蹄疫病毒感染性克隆的建立。中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008年第12期；(2)楊德成，涂亞斌，王海偉，周國輝，于力，0型ロ蹄疫病毒泛亞譜系感染性克隆的建立，中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009 年第 I 期；(3) Zibert A, Maass G, Strebel K, etal. Infectiousloot-and—mouth disease viruses derived irom a clonea lull—length cDNA. J Virol,1990,64 :2467-2473 ； (4)Rieder E, Bunch T, Brown F, et al. Genetically engineeredfoot-and-mouth disease viruseswith poly (C) tracts of two nucleotide are virulentin mice. J Virol, 1993,67 :5139-5145.
下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》(New York Cold Spring HarborLaboratory Press, 2001)中所述的條件進(jìn)行。
在本發(fā)明的實(shí)施例中，使用的含ロ蹄疫病毒Asial/YS/CHA/05株完整基因組的質(zhì)粒PASi(保藏單位中國普通微生物菌種保藏管理中心保存；保藏地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所；保藏日期2008年10月08日；其微生物保藏號為=CGMCC2689 ;其分類命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)) ；T7 RNA聚合酶的真核表達(dá)載體質(zhì)粒PT7RNAP (保藏單位中國普通微生物菌種保藏管理中心保存；保藏地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所；保藏日期2008年10月08日；其微生物保藏號是CGMCC 2688，其分類命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli));檢測17 RNA聚合酶活性的載體質(zhì)粒PI7-IRES-EGFP (保藏單位中國普通微生物菌種保藏管理中心保存；保藏地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所；保藏日期2008年10月08日；其微生物保存號是=CGMCC 2690 ;其分類命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli))。
在本發(fā)明的實(shí)施例中，使用的質(zhì)粒與菌株pBluescript II SK(+)載體購自Stratagene公司，DH5a感受態(tài)細(xì)胞、BHK-21細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。
在本發(fā)明的實(shí)施例中，使用的其他試劑PrimeSTAR DNA聚合酶、各種限制性內(nèi)切酶、dNTPs、DNA Ladder Marker、5’FULL-RACEKit 購自 TaKaRa 公司；堿性磷酸酶、T4 DNA 連接酶New EnglandBiolabs公司；TRIzol購自GibcoBRL公司，體外轉(zhuǎn)錄米用Promega公司的 RiboMAX Large Scale RNA Production Systems_T7 試劑盒。轉(zhuǎn)染試劑米用 QIAGEN公司的Effectene Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑盒，羊抗鼠突光二抗購自Sigma公司。SDS、瓊脂糖、胰蛋白胨、酵母抽提物、Tris、EDTA、焦碳酸ニこ酯(DEPC)等試劑均為國外產(chǎn)品國內(nèi)公司分裝；氯化鈉、氯仿、異丙醇、こ醇、異戊醇、NaCl、MgCl2、磷酸ニ氫鈉、飽和酚等均為國產(chǎn)分析純試劑。
實(shí)施例I Asial型ロ蹄疫病毒江蘇譜系反向遺傳操作系統(tǒng)的建立
在本發(fā)明的實(shí)施例中，BHK-21單層細(xì)胞培養(yǎng)條件培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的DMEM，在含5% C02的培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)。Asial型ロ蹄疫病毒Asial/YS/CHA/05株與Asial/JS/CHA/05毒株(GenBank登錄號EF149009)的核苷酸序列同源性在98 %以上，屬于相同來源，其基因組全長8193bp,包含14nt poly(C)和19nt poly(A)。病毒在含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中繁殖，當(dāng)80%的細(xì)胞出現(xiàn)CPE時(shí)收獲病毒，反復(fù)凍融三次后，2000 Xg (40C )離心 lOmin，上清于-70°C保存。I. I引物設(shè)計(jì)
根據(jù)ロ蹄疫病毒Asial/YS/CHA/05株的全基因組測序結(jié)果，設(shè)計(jì)引物，分別作為PCR擴(kuò)增的引物；
I. 2 5' RACE
用5’FULL-RACE試劑盒，采用“去帽法原理”，測定病毒基因組5’末端的真實(shí)序列。簡言之，用Tobacco Acid Pyrophosphatase (TAP)去掉mRNA的5’端帽子結(jié)構(gòu)，之后用T4RNA Ligase將5’ RACEAdaptor連接到mRNA的5’端，最后用5’ RACE Adaptor上的引物與已知序列部分的引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增5’末端序列，采用的引物見表I。
表I FMDV Asial/YS/CHA/05株基因組PCR擴(kuò)增的引物
權(quán)利要求
1.一種Asial型江蘇譜系口蹄疫病毒的全長感染性cDNA，其特征在于所述的全長感染性cDNA序列為SEQ ID NO 1所示的序列。
2.—種Asial型口蹄疫病毒反向遺傳操作系統(tǒng)，由權(quán)利要求
I所述的Asial型江蘇譜系口蹄疫病毒的全長感染性cDNA和表達(dá)I7RNA聚合酶的真核表達(dá)載體所組成。
3.按照權(quán)利要求
2所述的Asial型口蹄疫病毒反向遺傳操作系統(tǒng)，其特征在于所述的表達(dá)17 RNA聚合酶的真核表達(dá)載體是pT7RNAP，其構(gòu)建方法包括將17 RNA聚合酶基因克隆到真核表達(dá)載體p⑶NA3. I中，并在該基因的5'端引入Kozak序列。
4.按照權(quán)利要求
2或3所述的Asial型口蹄疫病毒反向遺傳操作系統(tǒng)，其特征在于還包括一種檢測表達(dá)I7RNA聚合酶的真核表達(dá)載體是否表達(dá)以及所表達(dá)的酶是否具有轉(zhuǎn)錄活性的檢測表達(dá)載體。
5.按照權(quán)利要求
4所述的Asial型口蹄疫病毒反向遺傳操作系統(tǒng)，其特征在于所述的檢測表達(dá)載體是PI7-IRES-EGFP，其構(gòu)建方法包括將FMDV的IRES和EGFP順次克隆到原核表達(dá)載體PET-28a中，并使EGFP受控于口蹄疫病毒的IRES元件下，即得。
6.權(quán)利要求
I所述全長感染性cDNA在拯救口蹄疫病毒中的應(yīng)用，包括將所述的全長感染性cDNA和17 RNA聚合酶的真核表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，拯救得到口蹄疫病毒。
專利摘要
本發(fā)明公開了Asial型江蘇譜系口蹄疫病毒感染性cDNA及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。所述感染性cDNA包含了保證合成轉(zhuǎn)錄本具有感染性所要求的poIy(A)序列和poIy(C)序列，所述poIy(A)尾具有19-22個(gè)A；所述poIy(C)結(jié)構(gòu)具有14-20個(gè)聚合C；其5’末端具有T7RNA聚合酶啟動(dòng)子序列，3’末端具有單一的限制性酶切位點(diǎn)。所述感染性cDNA可以和表達(dá)T7RNA聚合酶的真核表達(dá)載體組成反向遺傳操作系統(tǒng)。該感染性cDNA及其反向遺傳操作系統(tǒng)可用于拯救口蹄疫病毒，為研究口蹄疫病毒基因的結(jié)構(gòu)與功能、病毒的分子致病機(jī)理、開發(fā)口蹄疫病毒減毒疫苗株和新型口蹄疫疫苗等奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
文檔編號C12N7/00GKCN101724636 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 200810171258
公開日2012年9月5日 申請日期2008年10月30日
發(fā)明者于力, 周國輝, 楊德成, 涂亞斌, 王海偉 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (1), 非專利引用 (3),