專利名稱：:用于誘導(dǎo)針對表皮葡萄球菌的保護(hù)性免疫反應(yīng)的多肽的制作方法用于誘導(dǎo)針對表皮葡萄球菌的保護(hù)性免疫反應(yīng)的多肽相關(guān)申請的交叉引用本申請要求2007年3月19日提交的美國臨時申請NO.60/918,846的權(quán)益，通過引用合并在此。發(fā)明背景在本申請-的現(xiàn)有技術(shù)。表皮葡萄球菌(》S/a;7/^/ococciwe^We/7m'^s)作為病原體出現(xiàn)，特別是在醫(yī)院和免疫妥協(xié)的患者中。(Ziebuhr等，/打&r"a"ow"http://cw7m/Q/^""mz'cra6/a/jge""28S:S14-S20，2006.)凝固酶陰性葡萄球菌屬(CoNS),主要是表皮葡萄球菌，是與診斷或治療操作中使用的外源物體相關(guān)的最常分離的微生物感染。(Heilmann和Peters，BiologyandPathogenicityof5Y"/7/^/ococcw51一de/7m'^y,In:GramPositivePathogens,Eds.Fischetti等，AmericanSocietyforMicrobiology,WashingtonD.C.2000和5Va//i;;/ococ"'z'wi/誰cmZXseaye,CrossleyandArcher(eds.),ChurchillLivingstoneInc.1997.)表皮葡萄球菌的核酸已經(jīng)被測序以獲得核酸序列信息并進(jìn)行關(guān)于開》文閱讀框和潛在多肽的預(yù)測。(Doucette-Stamm等，U.S專利No.6,380,370和Doucette-Stamm等，U.S專利No.7，060，458.)一些技術(shù)例如涉及展示技術(shù)和來自受感染患者的血清的那些可以用于鑒定編碼潛在抗原的基因的工作。(Meinke等，國際公開號WO02/059148，Meinke等，國際公開號WO04/087746.)發(fā)明概述本發(fā)明特征在于包含與SEQIDNO:1結(jié)構(gòu)上相關(guān)的氨基酸序列的多肽，以及這種多肽的用途。SEQIDNO:l是全長表皮葡萄球菌多肽的截短的衍生物。全長的天然存在的多肽在此被稱為全長ORF2695e。SEQIDNO:1的His標(biāo)簽化的衍生物被發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生針對表皮葡萄球菌的保護(hù)性免疫反應(yīng)。引述"保護(hù)性"免疫或免疫反應(yīng)表明針對表皮葡萄球菌感染的可檢測水平的保護(hù)。引述"免疫原"是指提供保護(hù)性免疫的能力。因而，本發(fā)明的第一方面描述了包含至少90%相同于SEQIDNO:1的氨基酸序列的多肽免疫原，其中所述多肽不具有SEQIDNO:3的氨基酸序列。引述包含與SEQIDNO:1至少90%相同的氨基酸序列表明存在SEQIDNO:1的相關(guān)區(qū)域并且可以存在其他的區(qū)域。在一個實(shí)施方式中，如果存在其他區(qū)域，所述多肽不具有SEQIDNO:3的氨基酸1-28所提供的氨基末端。與參考序列的同一性百分比(也稱為百分比相同于)是通過使多肽序列與參考序列比對并確定相應(yīng)區(qū)域中相同氨基酸的數(shù)目來測定的。這個數(shù)目除以參考序列(例如，SEQIDNO:1)中的氨基酸總數(shù)，然后乘以100并四舍五入到最接近的整數(shù)。本發(fā)明的另一個方面描述了免疫原，其包含提供針對表皮葡萄球菌的保護(hù)性免疫的氨基酸序列以及在羧基末端或氨基末端與所述氨基酸序列共價連接的一個或更多個其他區(qū)域或部分，其中每個區(qū)域或部分獨(dú)立地選自具有至少一種以下性質(zhì)的區(qū)域或部分增強(qiáng)免疫反應(yīng)，有利于純化或有利于多肽穩(wěn)定性。引述"其他區(qū)域或部分"表明不同于ORF2695e區(qū)域的區(qū)域或部分。其他區(qū)域或部分可以是，例如，其他的多肽區(qū)域或非肽區(qū)域。本發(fā)明的另一個方面描述了能在患者中誘導(dǎo)針對表皮葡萄球菌的保護(hù)性免疫的組合物。所述組合物包含藥學(xué)上可接受的載體和免疫有效量的、提供針對表皮葡萄球菌的保護(hù)性免疫的免疫原。免疫有效量是足以提供針對表皮葡萄球菌感染的保護(hù)性免疫的數(shù)量。該數(shù)量應(yīng)當(dāng)足以顯著地防止表皮葡萄球菌感染的可能性或嚴(yán)重度。本發(fā)明的另一個方面描述了包含重組基因的核酸，所述重組基因編碼提供針對表皮葡萄球菌的保護(hù)性免疫的多肽。重組基因含有編碼多肽的重組核酸以及用于適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄和加工的調(diào)節(jié)元件(其可以包括翻譯和翻譯后元件)。重組基因可以獨(dú)立于宿主基因組存在，或可以是宿主基因組的部分。重組核酸是其序列和/或形式在自然中不存在的核酸。重組核酸的實(shí)例包括純化的核酸、組合在一起提供了不同于自然中存在的核酸的兩個或更多個核酸區(qū)域，以及天然地相互相關(guān)的一個或更多個核酸區(qū)域(例如，上游或下游區(qū)域)的缺乏。本發(fā)明的另一個方面描述了重組細(xì)胞。所述細(xì)胞包含重組基因，所述重組基因編碼提供針對表皮葡萄球菌的保護(hù)性免疫的多肽。優(yōu)選的，所述細(xì)胞在體外生長。本發(fā)明的另一個方面描述了產(chǎn)生提供針對表皮葡萄球菌的保護(hù)性免疫的多肽的方法。所述方法包括使重組細(xì)胞生長，所述重組細(xì)胞含有編碼所述多肽的重組核酸，并純化所述多肽。本發(fā)明的另一個方面描述了提供針對表皮葡萄球菌的保護(hù)性免疫的多肽，所述多肽由一過程生產(chǎn)，所述過程包括在宿主中使含有編碼所述多肽的重組核酸的重組細(xì)胞生長并純化所述多肽的步驟?？梢圆捎貌煌乃拗骷?xì)胞。本發(fā)明的另一個方面描述了在患者中誘導(dǎo)針對表皮葡萄球菌的保護(hù)性免疫的方法。所述方法包括向所述患者施用免疫有效量的免疫原的步驟，所述免疫原提供針對表皮葡萄球菌的保護(hù)性免疫。除非特定的術(shù)語互相排斥，引述"或"表明之一或兩者的可能性。偶爾地術(shù)語例如"和/或"被用于突出之一或兩者的可能性。引述開放性的術(shù)語例如"包,含"允許其它的元素或步驟。有時用語例如"一個或更多個"與或不與開放式術(shù)語一同使用來突出其它的元素或步驟的可能性。除非明確地聲明，引述術(shù)語例如"一(a),(an)，，不局限于一。例如，"一個細(xì)胞(acell)"不排除"復(fù)數(shù)個細(xì)胞(cells)，，。有時用語例如一個或更多個被用于突出復(fù)數(shù)個存在的可能性。根據(jù)在此提供的包括不同實(shí)施例的其他描述，本發(fā)明的其他特征和益處是明顯的。提供的實(shí)施例例舉了在實(shí)踐本發(fā)明中有用的不同成分和方法。實(shí)施例不限制所要求保護(hù)的發(fā)明。根據(jù)當(dāng)前的公開內(nèi)容，熟練的技術(shù)人員可以鑒定和采用對于實(shí)踐本發(fā)明有用的其他成分和方法。附圖的簡要描述附圖1說明了SEQIDNO:2的氨基酸序列。SEQIDNO:2是SEQIDNO:l的His標(biāo)簽書f生物。SEQIDNO:1區(qū)域以粗體顯示。附圖2A和2B說明了SEQIDNO:3的全長ORF2695e(附圖2A)以及編碼核酸(附圖2B)。附圖2A中SEQIDNO:1區(qū)域以粗體顯示。在附圖2B中SEQIDNO:l編碼區(qū)域以粗體顯示。發(fā)明的詳細(xì)說明SEQIDNO:1相關(guān)多肽提供保護(hù)性免疫的能力在以下提供的使用SEQIDNO:2的實(shí)施例中說明了。SEQIDNO:2是SEQIDNO:1的His標(biāo)簽衍生物。這個His-標(biāo)簽有利于多肽純化和鑒定。附圖l說明了SEQIDNO:2,其中SEQIDNO:1區(qū)域以粗體顯示。SEQIDNO:1是全長ORF2695e表皮葡萄球菌多肽的衍生物。SEQIDNO:1含有ORF2695e序列(SEQIDNO:3)的氨基酸29-261。SEQIDNO:3的氨基酸1-28被鑒定為前導(dǎo)序列。附圖2A和2B說明了SEQIDNO:3和編碼核酸序列，其中SEQIDNO:1區(qū)域以粗體顯示。ORF2695e序列ORF2695e具有與Gen-Bank登記號Q5HKC6相應(yīng)的氨基酸序列。Gen-Bank登記號Q5HKC6參考Gill等，《/5a"eno/.187(7):2426-2438，2005。其他天然存在的ORF2695e序列可以根據(jù)與已知ORF2695e序列相比高度的序列相似性或連續(xù)氨基酸的存在來鑒定。連續(xù)的氨基酸提供了特征性標(biāo)簽。在不同的實(shí)施方式中，天然存在的ORF2695e序列是在葡萄球菌屬中、優(yōu)選的表皮葡萄球菌中存在的序列，具有如SEQIDNO:l中至少20個、至少30個或至少50個連續(xù)氨基酸；和/或具有與SEQIDNO:1的至少90%序列相似性或同一性。序列相似性可以通過本領(lǐng)域公知的不同的算法和技術(shù)來確定。一般地，序列相似性可以通過比對兩個序列來獲得最大氨基酸同一性，容許序列之一中的缺口、添加和替換的技術(shù)來確定。例如，使用利用程序lalign(由Huang和Miller開發(fā)，^c/v.^f;/.Mfl仇12:337-357,1991,對于《sim》程序)的局部比對工具，可以確定序列相似性。選項(xiàng)和環(huán)境變量是-f#第一個殘基缺口的罰分(默認(rèn)-14);-g#缺口中每個其他殘基的罰分(默認(rèn)-4)，-sstr(SMATRIX)可選擇的計(jì)分矩陣文件的文件名。對于蛋白質(zhì)序列，使用PAM250,默認(rèn)-w#(LINLEN)序列比對輸出線長度(60)。SEOIDNO:l相關(guān)多肽與SEQIDNO:1結(jié)構(gòu)上相關(guān)的多肽包括含有不同表皮葡萄球菌菌抹中存在的相應(yīng)區(qū)域和天然存在區(qū)域的衍生物的多肽。SEQIDNO:1相關(guān)多肽含有與SEQIDNO:1至少90%相同的氨基酸序列。引述"多肽"不提供最小或最大大小限制。至少90%相同于SEQIDNO:1的多肽含有SEQIDNO:1的最多至約26個氨基酸改變。每個氨基酸改變獨(dú)立地是氨基酸替換、缺失或添加。所述改變可以在SEQIDNO:1區(qū)域之內(nèi)或添加到SEQIDNO:1區(qū)域。在不同的實(shí)施方式中，SEQIDNO:1相關(guān)多肽至少94%或至少99%相同于SEQIDNO:1;與SEQIDNO:l不同之處在于O、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個氨基酸改變；或基本上由SEQIDNO:1組成。引述"基本上由"指明的氨基酸"組成"表明存在所指的氨基酸并且可能存在其他氨基酸。其他氨基酸可以是在羧基或氨基末端。在不同的實(shí)施方式中，存在l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個其他氨基酸。優(yōu)選的其他氨基酸是氨基末端曱硫氨酸。可以對SEQIDNO:1進(jìn)行改變來獲得可誘導(dǎo)針對表皮葡萄球菌的保護(hù)性免疫的衍生物。可以進(jìn)行改變，例如，來獲得保持了誘導(dǎo)針對表皮葡萄球菌的保護(hù)性免疫能力的衍生物，或來獲得除了提供保護(hù)性免疫之外還具有可以實(shí)現(xiàn)特定目的的區(qū)域的衍生物?？梢钥紤]不同的ORF2695e序列和氨基酸的已知性質(zhì)進(jìn)行改變。一般地，在取代不同氨基酸以保持活性中，優(yōu)選的是交換具有相似性質(zhì)的氨基酸。對于氨基酸替換可以考慮的因素包括氨基酸大小、電荷、極性和疏水性。不同的氨基酸R基團(tuán)對氨基酸性質(zhì)的影響是本領(lǐng)域公知的。(參見,例如,Ausubel，CWrew,尸r由co/s/"Mo/ecw/arS/o/og^,JohnWiley,1987-2002,Appendix1C.)實(shí)現(xiàn)特定目的的改變包括被設(shè)計(jì)以有利于多肽的生產(chǎn)或效力；或編碼核酸的克隆的那些。通過使用適合于重組表達(dá)的起始密碼子(例如，編碼曱硫氨酸)可以便于多肽產(chǎn)生。曱硫氨酸稍后可以在細(xì)胞加工期間被除去。例如，通過引入可伴隨有氨基酸添加或改變的限制性位點(diǎn)，可以便于克隆。多肽誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的效力可以通過表位強(qiáng)化來增強(qiáng)。表位強(qiáng)化可以使用不同的技術(shù)進(jìn)行，例如，涉及改變錨定殘基來改善肽對MHC分子的親和性的那些以及提高肽-MHC復(fù)合物對T細(xì)胞受體的親和性的那些。(Berzofsky等，A^w"i^v&w1:209-219,2001.)優(yōu)選的，所述多肽是純化的多肽。"純化的多肽"存在于缺少一種或更多種其他多肽的環(huán)境中，所述其他多肽天然地與之相關(guān)和/或以存在的總蛋白的至少約10%存在。在不同的實(shí)施方式中，純化的多肽在樣品或制品中代表總蛋白的至少約50%、至少約75%或至少約95%。在一個實(shí)施方式中，多肽是"基本上純化的"。基本上純化的多肽存在于缺少與之天然相關(guān)的所有或大多數(shù)其他多肽的環(huán)境中。例如，基本上純化的表皮葡萄球菌多肽存在于缺少所有或大多數(shù)其他表皮葡萄球菌多肽的環(huán)境中。環(huán)境可以是，例如，樣品或制品。引述"純化的"或"基本上純化的"不需要多肽經(jīng)歷任何純化，可以包括，例如，沒有被純化的化學(xué)上合成的多肽。多肽穩(wěn)定性可以通過修飾多肽羧基或氨基末端來增強(qiáng)。可能的修飾的實(shí)例包括氨基末端保護(hù)基團(tuán)，例如，乙?；?、丙基、丁二?；⒈綍趸?、芐氧基羰基或叔-丁氧羰基；和羧基末端保護(hù)基團(tuán)，例如酰胺、曱酰胺和乙酰胺。在一個實(shí)施方式中，多肽免疫原是免疫原的部分，所述免疫原含有在羧基末端或氨基末端與所述多肽共價連接的一個或更多個其他區(qū)域或部分，其中每個區(qū)域或部分獨(dú)立地選自具有至少一種以下性質(zhì)的區(qū)域或部分增強(qiáng)免疫反應(yīng)，有利于純化或有利于多肽穩(wěn)定性。例如，使用可以存在于氨基或羧基末端的基團(tuán)如聚乙二醇，可以增強(qiáng)多肽穩(wěn)定性。多肽純化可以通過向羧基或氨基末端添加基團(tuán)以有利于純化來親合性;示簽的實(shí)例包括六組l酸標(biāo)i、trpE、谷^甘肽和麥芽糖結(jié)合蛋白。多肽產(chǎn)生免疫反應(yīng)的能力可以使用一般地增強(qiáng)免疫反應(yīng)的基團(tuán)來增強(qiáng)?？梢耘c多肽連接來增強(qiáng)針對所述多肽的免疫反應(yīng)的基團(tuán)的實(shí)例包括細(xì)胞因子，例如IL-2。(Buchan等，2000.Mo/ecw/『/m/wwwo/og少37:545-552.)多肽生產(chǎn)多肽可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來生產(chǎn)，包括涉及化學(xué)合成的那些和涉及從產(chǎn)生所述多肽的細(xì)胞提純的那些。多肽的化學(xué)合成的技術(shù)是本領(lǐng)域公^口的。(參見，例^口,Vincent，尸e/^/eiVc^ez'wZ)n/gDe"very,NewYork,N.Y.，Decker,1990.)重組多肽生產(chǎn)和純化的技術(shù)也是本4頁；或7/^《口的。(參見，例^口，Ausubel，Cw廳ewf尸ro/oco/sAfo/ecw/ar5油g》JohnWiley，1987-2002.)使用重組核酸技術(shù)來產(chǎn)生多肽便于從細(xì)胞獲得多肽。用于產(chǎn)生多肽的重組核酸技術(shù)包括在細(xì)胞中導(dǎo)入或產(chǎn)生編碼所述多肽的重組基因并表達(dá)所述多肽。重組基因含有編碼多肽的核酸以及用于多肽表達(dá)的調(diào)節(jié)元件。重組基因可以存在于細(xì)胞基因組中，或是表達(dá)載體的部分。可以作為重組基因的部分存在的調(diào)節(jié)元件包括與所述多肽編碼序列天然地相關(guān)的那些和不與所述多肽編碼序列天然地相關(guān)的外源的調(diào)節(jié)元件。外源調(diào)節(jié)元件例如外源啟動子對于在特定宿主中表達(dá)重組基因或提高表達(dá)的水平是有用的。一般地，重組基因中存在的調(diào)節(jié)元件包括轉(zhuǎn)錄啟動子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、終止子和任選地存在的操縱子。用于真核細(xì)胞中加工的優(yōu)選的元件是多腺苷酸化信號。通過使用表達(dá)載體便于重組基因在細(xì)胞中的表達(dá)。優(yōu)選的，表達(dá)載體除重組基因之外還含有用于在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)、可選擇標(biāo)記、有限數(shù)量的有用的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和高拷貝數(shù)的潛能。表達(dá)載體的實(shí)例是克隆載體、修飾的克隆載體、專門設(shè)計(jì)的質(zhì)粒和病毒。由于遺傳密碼的簡并性，大量的不同編碼核酸序列可以用于編碼特定的多肽。由于幾乎所有的氨基酸由不同的核苷酸三聯(lián)體組合或"密碼子，，編碼，產(chǎn)生了遺傳密碼簡并性。由密碼子編碼的氨基酸如下H-His-組氨酸I-Ile:異亮氨酸:K-Lys^賴氨酸:L-Leu:亮氨酸八=八13=丙氨酸密碼子GCA,GCC,GCG,GCUC二Cys:半胱氨酸密碼子UGC，UGUD:Asp:天冬氨酸密碼子GAC，GAUE-Glu-谷氨酸密碼子GAA,GAGF-Phe-苯丙氨酸密碼子UUC，UUUG:Gly:甘氨酸密碼子GGA,GGC,GGG,GGU密碼子CAC，CAU密碼子AUA,AUC,AUU密碼子AAA,AAG密碼子UUA，UUG,CUA,CUC，CUG，CUUM二Met-甲硫氨酸密碼子AUGN-Asn:天冬酰胺密碼子AAC，AAUP-Prc^月甫氨酸密碼子CCA,CCC,CCG，CCUQ-Gln-谷氨酰胺密碼子CAA，CAGR-Arg二精氨酸密碼子AGA,AGG,CGA,CGC,CGG，CGUS二Se產(chǎn)絲氨酸密碼子AGC,AGU，UCA,UCC,UCG,UCUT^ThF蘇氨酸密碼子ACA,ACC，ACG，ACUV-VaH纈氨酸密碼子GUA,GUC，GUG,GUUW-Trp:色氨酸密碼子UGGY-Tyr-酪氨酸密碼子UAC,UAU用于SEQIDNO:1相關(guān)多肽的重組核酸表達(dá)的適合的細(xì)胞是原核生物和真核生物。原核細(xì)胞的實(shí)例包括大腸桿菌(￡.co//);葡萄球菌屬(^a//^/ococc^)的成員，例如表皮葡萄球菌；乳桿菌屬(丄a"o6ac〃/ws)的成員，例^口才直物乳4干菌(丄.p/aw^^wm);豸丄5求菌屬(丄a"ococc^)的成員，例如乳酸乳球菌(丄./acto);芽胞桿菌屬(5a"勘)的成員，例如枯草芽孢桿菌(5.sw磁s);棒狀桿菌屬(Cor少weZac/en'wm)的成員,例如,谷氨酸沖奉桿菌(C.g/Wam/cwm);以及假單胞菌屬(；^j^omoww)的成員例如熒光假單胞菌(尸&/7womycew)。真核細(xì)胞的實(shí)例包括哺乳動物細(xì)胞；昆蟲細(xì)胞；酵母細(xì)胞，例如酵母屬(Sacc/mromycw)的成員(例如，酉良酒酵母(51.ce"WW"e))、畢赤氏酵母屬(尸ZcA&)的成員(例如，巴斯德畢赤酵母(尸.)、漢遜酵母屬(//aw"ww/a)的成員(例如，多形漢遜酵母(//,;o(ymo^/m))、克魯維酵母屬(《/w_yv^wn_yc^)的成員(例如，乳酸克魯維酵母(《./"c&)或脆壁克魯維酵母(尺./rag〖fc))和裂殖酵母屬(Sc/^zc^acc/mramyces)的成員(例如，粟酒裂殖酵母(&;om&))。重組基因產(chǎn)生、導(dǎo)入細(xì)胞和重組基因表達(dá)的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。在參考文件中提供了這些技術(shù)的實(shí)例，例如Ausubel,O^reW/Vo/oco/"wMo/ecw/arJZo/ogj，JohnWiley，1987-2002,和Sambrook等,Mo/ecw/arC7o打/ng，」丄a6orafo^yM"wwa/，2ndEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989。如果希望，特定宿主中的表達(dá)可以通過密碼子優(yōu)化來增強(qiáng)。密碼子優(yōu)化包括使用更優(yōu)選的密碼子。在不同宿主中的密碼子優(yōu)化技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。SEQIDNO:1相關(guān)多肽可以含有翻譯后》務(wù)飾，例如，N-連接的糖基化，O-連接的糖基化，或乙?；?。引述多肽的"多肽"或"氨基酸"序列包括多肽，其含有來自宿主細(xì)胞例如酵母宿主的、具有翻譯后修飾的結(jié)構(gòu)的一個或更多個氨基酸。在釀酒酵母中，;數(shù)第二個氨基i的性質(zhì)看起來決定了N-末端曱硫氨酸是否被除去。此外，倒數(shù)第二個氨基酸的性質(zhì)還決定了N-末端氨基酸是否是N。-乙?；?Huang等，26:8242-8246，1987)。其他實(shí)例包括由于分泌前導(dǎo)區(qū)(例如信號肽)的存在耙向分泌的多肽，其中蛋白質(zhì)被N-連接的或O-連接的糖基化修飾。(Kuk廳zinska等，^肌Aev.腸c/z亂56:915-944,1987.)佐劑-佐劑是可以在產(chǎn)生免疫反應(yīng)中輔助免疫原的物質(zhì)。佐劑可以通過不同的機(jī)制起作用，例如一種或更多種以下的提高抗原的生物學(xué)或免疫學(xué)半衰期；改善抗原對抗原呈遞細(xì)胞的遞送；改善抗原呈遞細(xì)胞的抗原加工和呈遞；以及誘導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生。(Vogel，C"mW/"/ec".麵D/廳総30(suppl.3):S266畫270,2000.)在一個實(shí)施方式中，使用了佐劑。，實(shí)例包括氫氧化鋁、磷酸鋁、或其他鋁鹽，磷酸釣、DNACpG基序、單磷?；|(zhì)A、霍亂毒素、大腸桿菌熱不穩(wěn)定毒素、百日咳毒素、月包壁酰二肽、Freund's不完全佐劑、MF59、SAF、免疫刺激復(fù)合物、脂質(zhì)體、生物可降解的微球體、皂苷、非離子嵌段共聚物、胞壁酰肽類似物、聚磷腈、合成的多核普酸、IFN-Y、IL-2、IL-12和ISCOMS。(VogelC7/m'ca//"/ec"鍾Z)/卿雄30(suppl3):S266-270，2000，Klein等,/owrwa/o/尸/mrmacew"ca/5Wewc^89:311-321，2000，Rimmelzwaan等，Kac。'we19:1180-1187,2001,KerstenJ^c"we21:915-920,2003,O，HagenC"/r.Z>wgTag"/Xsoni.,1:273-286,2001.)誘導(dǎo)保護(hù)性免疫的患者"患者"是指能被表皮葡萄球菌感染的哺乳動物?；颊呖梢员活A(yù)防性地或治療性地治療。預(yù)防性治療提供了足夠的保護(hù)性免疫來降低表皮葡萄球菌感染的可能性或嚴(yán)重度。治療性治療可以被進(jìn)行來降低表皮葡萄球菌感染的嚴(yán)重度。預(yù)防性治療可以使用含有在此描述的免疫原的疫苗來進(jìn)行。這樣的治療優(yōu)選的對人類進(jìn)行。疫苗可以被施用給普通群體，或處在提高的表皮葡萄球菌感染風(fēng)險下的那些人。具有提高的表皮葡萄球菌感染風(fēng)險的人包括護(hù)理工作者；醫(yī)院患者；具有減弱的免疫系統(tǒng)的患者；經(jīng)歷手術(shù)的患者；接受異體植入物的患者，例如導(dǎo)管或血管設(shè)備；面對導(dǎo)致減弱的免疫性的治療的患者；涉及外源物體的診斷操作之下的患者；和在具灼傷或創(chuàng)傷的提高風(fēng)險的職業(yè)中的人。診斷或治療操作中使用的外源物體包括留置導(dǎo)管或植入的聚合物設(shè)備。外源物體相關(guān)的表皮葡萄球菌感染的實(shí)例包括敗血病(stepticemia)/心內(nèi)膜炎(例如，血管內(nèi)的導(dǎo)管、血管的假體、起搏器導(dǎo)線(pacemakerlead)、電震發(fā)生器系統(tǒng)、假體的心瓣膜、和左心室的輔助裝置)；腹膜炎(例如，腦室-腹膜腦脊液(CSF)旁路和連續(xù)非臥床腹膜透析導(dǎo)管系統(tǒng))；腦室炎(例如，內(nèi)部和外部CSF旁路)；以及慢性聚合物相關(guān)的綜合征(例如，假體的關(guān)節(jié)(髖)松動、硅酮假體的隆乳(mammaryargumentation)之后的纖維狀莢膜的攣縮綜合征、以及在白內(nèi)障手術(shù)之后人工眼內(nèi)透鏡的植入后晚期發(fā)作的眼內(nèi)炎(endophtalmisis))。(Heilmann和Peters，BiologyandPathogenicityofiS鄉(xiāng)/^/ococc"51e/油rmW51，In:GramPositivePathogens，Eds.Fischetti等,AmericanSocietyforMicrobiology,WashingtonD.C.2000.)可能被表皮葡萄球菌感染的非人類患者包括牛、豬、綿羊、山羊、兔、馬、狗、貓和小鼠。非人類患者的治療在保護(hù)寵物和家畜，以及在評估特定治療的效力方面是有用的。在一個實(shí)施方式中，與涉及外源物體的治療性或醫(yī)學(xué)操作一起，患者接受預(yù)防性的治療。在其他的實(shí)施方式中，患者在所述操作約1個月、約2個月、或約2-6個月之前免疫。組合疫苗SEQIDNO:l相關(guān)多肽可以單獨(dú)使用，或與其他免疫原組合使用，來誘導(dǎo)免疫反應(yīng)?？梢源嬖诘钠渌庖咴ㄒ环N或更多種其他的表皮葡萄球菌免疫原；靶向一種或更多種其他葡萄球菌屬生物例如金黃葡萄球菌(S.awrei^)、溶血葡萄球菌(<S.Aaemo(y"c^)、沃氏葡萄球菌(》S.麗廠"en')或《S./wgw"ew^的一種或更多種免疫原；和/或耙向其他感染生物體的一種或更多種免疫原。一種或更多種其他免疫原的實(shí)例包括ORF0657n相關(guān)多肽(Anderson等，國際公開No.WO05/009379);ORF0657/ORF0190雜合多肽(Anderson等，國際公開No.WO05/009378);sai-1相關(guān)多肽(Anderson等，國際公開No.WO05/79315);ORF0594相關(guān)多肽(Anderson等，國際公開No.WO05/086663);ORF0826相關(guān)多肽(Anderson等，國際公開No.WO05/115113);PBP4相關(guān)多肽(Anderson等，國際公開No.WO06/033918);AhpC相關(guān)多肽和AhpC-AhpF組合物(Kelly等國際公開No.WO06/078680);金黃葡萄球菌5型和8型莢膜多糖(Shinefield等，iV.Met/.346:491-496,2002);膠原蛋白粘附素、纖維蛋白原結(jié)合蛋白和凝集因子(Mamo等,FE"M5"/mmimo/ogyMet//ca/Mz'cTc^o/og>>10:47-54，1994,Nilsson等，丄C/z>z./騰"101:2640-2649,1998,Josefsson等，T7zeJowr"a/q/7"/ec"ow51ZXyeases184:1572-1580,2001)以及多糖細(xì)胞間粘附素和其片段(Joyce等，CaAo/i>^ra&ie"arcA338:903-922,2003)。施用使用在此提供的指導(dǎo)以及本領(lǐng)域公知的技術(shù)，可以配制免疫原并施用給患者。一^:的藥物施用原則在例如Kacc!>iwEds.Plotkin和Orenstein,W.B.SandersCompany,1999;Aem/wg她k尸/mrmacew"ca/6WewceyEd.Gennaro,MackPublishing,2000;andMo<a^"PAar畫cew"'cs2"rf￡^"o，Eds.BankerandRhodes,MarcelDekker，Inc.,1990中提供了。藥學(xué)上可接受的載體有利于免疫原的保存和向患者的施用。藥學(xué)上可接受的載體可以含有不同的成分，例如緩沖液、無菌注射水、生理鹽水或磷酸鹽緩沖鹽水、蔗糖、組氨酸、鹽和聚山梨酯。免疫原可以通過不同的途徑，例如皮下的、肌肉內(nèi)的或粘膜的途徑來施用。皮下的和肌肉內(nèi)的施用可以使用例如針頭或噴射注射器來進(jìn)行?？紤]本領(lǐng)域公知的因素，包括患者的年齡、體重、性別和醫(yī)學(xué)狀況；給藥途徑；期望的效果；和采用的特定化合物，優(yōu)選地確定合適的給藥方案。免疫原可以以多劑量疫苗形式使用。預(yù)計(jì)的是，劑量將由l.Opg到l.Omg總多肽的范圍構(gòu)成。在本發(fā)明的不同實(shí)施方式中，所述范圍是5.0mg到500|ug,O.Olmg到l.Omg,或0.1mg到l.Omg。給藥的時間取決于本領(lǐng)域公知的因素。在初次施用之后，可以隨后施用一次或更多次強(qiáng)化劑量來維持或強(qiáng)化抗體滴度。給藥方案的實(shí)例將是第1天、第1個月、在第4、6或12個月的第三次給藥，以及在所需的時間間隔的其他的強(qiáng)化劑量。抗體的產(chǎn)生SEQIDNO:1相關(guān)多肽可以用于產(chǎn)生結(jié)合所述多肽或表皮葡萄球菌的抗體和抗體片段。這種抗體和抗體片段具有不同的用途，包括在多肽純化、表皮葡萄球菌鑒定或在針對表皮葡萄球菌感染的預(yù)防性或治療性治療中使用。抗體可以是多克隆的或是單克隆的。生產(chǎn)和使用抗體包括人類抗體的#支術(shù)是本4頁；或7>知的。(Ausubel，Cw/reW尸ro/oco/sZ"A/o/ecw/ar腸/柳，JohnWiley,1987-2002，Harlow等，」w"7;o(^,""6ora^yMa肌a/,ColdSpringHarborLaboratory,1988,Kohler等，256:495-497，1975,Azzazy等，C7z.m'c"/Aoc/^m^o;35:425-445，2002,Berger等，」m.Me《324(1):14-40，2002.)適當(dāng)?shù)奶腔瘜τ诳贵w功能可能是重要的。(Yoo等，Jowr加/c/Z^z聽wo/og7'ca/M"AoA261:1-20，2002,Li等，7V幽re歷o&cAwo/og少24(2):210-215,2006.)天然存在的抗體含有附著于重鏈的至少一個N-連4妻的碳水^Tb物。(Yoo等，Tow/tzq/q/"/mmwwo/og/ca/AfeAo^y261:1-20,2002.)其他N-連接的碳水化物和O-連接的碳水化物可能存在，并且對于抗體功能可能是重要的。(A/.)不同類型的宿主細(xì)胞可以用于4是供有效的翻譯后修飾，包括哺乳動物宿主細(xì)胞和非哺乳動物細(xì)胞。哺乳動物宿主細(xì)胞的實(shí)例包括中國倉鼠卵巢(CHO)、HeLa、C6、PC12和骨髓瘤細(xì)胞。(Yoo等，Jowr"fl/。/7mmwwo/ogi'ca/Me/Zicxis1261:1-20，2002，Persic等，187:9-18,1997.)非哺乳動物細(xì)胞可以被修飾來復(fù)制人類糖基化。(Li等，A^"m"腸&c/mo/，24(2):210-215,2006.)糖基工程化的巴斯德畢赤氏酵母(尸z'c/n'flpaWon'"是這樣修飾的非哺乳動物細(xì)胞的實(shí)例。(Li等，胸,腸/ec/mo/ogy24(2):210-215,2006.)核酸疫苗編碼SEQIDNO:1相關(guān)多肽的核酸可以利用適合于治療性施用的載體導(dǎo)入患者中。適合的載體可以將核酸遞送到目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)而不引起不可接受的副作用?？梢圆捎玫妮d體的實(shí)例包括質(zhì)粒載體和基于病毒的載體。(BarouchJ.尸a/Ao/.208:283-289,2006，Emini等，國際公開No.WO03/031588.)利用編碼希望的多肽的基因表達(dá)盒實(shí)現(xiàn)細(xì)胞表達(dá)?；虮磉_(dá)盒含有調(diào)節(jié)元件，用于在目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生和加工足夠數(shù)量的核酸來實(shí)現(xiàn)有益效果。病毒載體的實(shí)例包括第一和第二代腺載體、輔助細(xì)胞依賴性腺載體、腺相關(guān)病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、a病毒載體、委內(nèi)端拉馬腦炎病毒載體以及質(zhì)粒載體。(Hitt等，^4ofv""ces1,"尸/mrm"co/ogy40:137-206，1997,Johnston等，U.S.專利No.6,156,588，Johnston等，國際公開No.WO95/32733，Barouch尸"Ao/.208:283-289,2006，Emini等，國際公開No.WO03/031588.)腺載體可以基于不同的腺病毒血清型，例如在人類或動物中發(fā)現(xiàn)的那些。動物腺病毒的實(shí)例包括牛的、豬的、黑猩猩的、鼠的、犬的和禽類的(CELO)。(Emini等，國際公開No.WO03/031588,Colloca等，國際公開No.WO05/071093.)人類腺病毒包括B、C、D或E血清型組，例如2型("Ad2")、4型("Ad4")、5型("Ad5")、6型("Ad6")、24型("Ad24")、26型("Ad26")、34型("Ad34")和35型("Ad35")。核酸疫苗可以利用不同的技術(shù)和給藥方案來施用。(Emini等，國際7>開No.WO03/031588.)例如，疫苗可以通過用或者不用一個或更多個電脈沖地通過注射來月幾肉內(nèi)施用。通過刺激體液和細(xì)胞的免疫反應(yīng)，電介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移可以輔助遺傳學(xué)的免疫。給藥方案的實(shí)例包括初免-強(qiáng)化以及異源的初免-強(qiáng)化方法。(Emini等，國際公開No.WO03/031588.)實(shí)施例以下提供實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的不同特征。這些實(shí)施例還i兌明了實(shí)踐本發(fā)明的有用的方法。這些實(shí)施例不限制所要求保護(hù)的發(fā)明。實(shí)施例l:保護(hù)性免疫原產(chǎn)生、純化和制劑這個實(shí)施例描述了SEQIDNO:2產(chǎn)生、純化和制劑。SEQIDNO:2^皮用于以下描述的實(shí)施例中來說明SEQIDNO:l相關(guān)多肽4是供保護(hù)性免疫的能力。SEQIDNO:2是SEQIDNO:l的His標(biāo)簽化的衍生物。ORF2695e克隆和表達(dá)和修飾ORF2695e的完整開放閱讀框施用SignalP來分析，SignalP是被設(shè)計(jì)以鑒定推定的信號序列的程序。潛在的切割位點(diǎn)在aa28之后檢測到。因而PCR《1物被設(shè)計(jì)以擴(kuò)增編碼蛋白質(zhì)的aa29到末端的核普酸。還將限制性位點(diǎn)添加到PCR引物中來便于向pET-16b載體中克隆。限制性位點(diǎn)是羧基末端的Xhol位點(diǎn)以及氨基末端的Bpul位點(diǎn)(表1)。最終表達(dá)的構(gòu)建體被設(shè)計(jì)以具有氨基末端的His標(biāo)簽來便于純化。表1引物序列(非ORF2695e序列為下劃線的)引物1SEQIDNO:5GGAATTCGCTCAGCTCATGATTCATCATCCTCGCTAGG氨基引物(3')引物2SEQIDNO:6GGATATCCTCGAGGAAGATAGCAAAGAAACGGAAA羧基引物(5')利用上述引物和來自表皮葡萄球菌菌抹RP62A的基因組DNA作為模板，通過PCR產(chǎn)生所述基因。進(jìn)行PCR反應(yīng)94°C5分鐘，然后94°C45秒、56。C45秒、72。C3分鐘的30個循環(huán)，隨后在72°C10分鐘并4。C保持。PCR產(chǎn)物在0.8%瓊脂糖凝膠上純化，用Qiagen凝膠提取試劑盒凈化，用Xhol和Blpl在37。C切割5.5小時。切下的片段進(jìn)行苯酚/氯仿提取和EtOH沉淀來除去酶活性并濃縮樣品。片段重懸浮在EB緩沖液(10mMTris-HClpH8.5)中，用于連接到Xhol、Blpl切割的pET-16b。連接施用Roche快速連接試劑盒以6:1摩爾比例(插入到載體中)來進(jìn)行。連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化到NovaBlue感受態(tài)細(xì)胞中，羧千青霉素(50|ag/ml)抗性克隆被用于產(chǎn)生小量制備(minipreps)。小量制備質(zhì)粒通過限制性消化來篩選。兩個克隆被選擇來證實(shí)序列，轉(zhuǎn)化到BLR(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中用于表達(dá)驗(yàn)證。在IPTG誘導(dǎo)之后的表達(dá)從來自BLR(DE3)轉(zhuǎn)化平板的克隆分離物的6ml培養(yǎng)物中檢查。樣品檢查為為未誘導(dǎo)的、誘導(dǎo)的、誘導(dǎo)的可溶部分和誘導(dǎo)的不溶的部份。發(fā)現(xiàn)表達(dá)非常高，但是所有的產(chǎn)物處于不溶的部份中。SEQIDNO:2純化將冷凍的重組大腸桿菌細(xì)胞糊(14克)解凍并重懸浮在兩倍體積的裂解緩沖液(50mM磷酸鈉、pH8.0、0.15MNaCl、2mM氯化鎂、10mM咪唑、0.1%Tween隱80、Benzonase(EM#1.01697.0002)以250單位/mL添加到細(xì)胞懸液中)，并且蛋白酶抑制物混合物以每50mL—片添加到細(xì)胞懸液中(CompleteTM，無EDTA，Roche#1873580)。用微流化儀制備溶胞產(chǎn)物。溶胞產(chǎn)物通過在4。C在10,000xg離心45分鐘來澄清。上清液通過25mm0.2微米MilliporeMillex注射器濾器過濾。過濾的上清液添加到Ni-NTA瓊脂糖層析樹脂(Qiagen#30250)，漿液在4。C混合大約16小時。將層析樹脂的漿液注入層析柱，通過重力從柱出口收集未結(jié)合的級分。用十倍體積的洗滌緩沖液(50mM磷酸鈉、pH8.0、0.5MNaCl、2mM氯化鎂、0.1%Tween-80和20mM咪唑)洗滌柱。用六倍柱體積的洗脫緩沖液(50mM磷酸鈉、pH8.0、2mM氯化鎂、0.P/。Tween-80和0.3M咪唑)洗脫柱。含有根據(jù)SDS/PAGE鑒定的蛋白質(zhì)的部分，以及含有最高蛋白質(zhì)濃度的部分被集中來產(chǎn)生Ni-IMAC產(chǎn)物。Ni-IMAC產(chǎn)物通過SEC分餾。含有產(chǎn)物蛋白質(zhì)的SEC級分通過Coomassie染色的SDS/PAGE來鑒定。集中含有產(chǎn)物的SEC級分來產(chǎn)生SEC產(chǎn)物。將濾液無菌過濾，以0.2mg/mL的終濃度吸附在羥基磷酸鋁(aluminumhydroxyphosphate)佐劑上。實(shí)施例2:大鼠留置導(dǎo)管模型(多次免疫)SEQIDNO:2和大鼠留置導(dǎo)管模型被用于評估利用SEQIDNO:1相關(guān)多肽的主動免疫是否可以抑制植入的設(shè)備的葡萄球菌感染。含有SEQIDNO:2的疫苗如實(shí)施例1中描述的獲得。購買3-4周齡的大鼠，在0、14和21天用磷酸氫氧化鋁(aluminumhydroxidephosphate)("AHP")上的免疫原IP免疫(Klein等，Jow濯/0/7^"rmacew"ca/Sde"cM89:311-321,2000)，或用單獨(dú)的佐劑模擬免疫。在第35天，動物進(jìn)行手術(shù)來放置留置導(dǎo)管到頸靜脈中。在手術(shù)后動物休息大約10天，此時IV給予表皮葡萄i^菌菌4朱RP62A的亞致死攻擊(5-7x109CFU)。大鼠在攻擊后24小時處死，除去導(dǎo)管。導(dǎo)管上細(xì)菌的存在通過在甘露醇鹽瓊脂平板上培養(yǎng)全部導(dǎo)管來評定。如果在平板上觀察到生長的任何征兆，導(dǎo)管被標(biāo)記為培養(yǎng)物陽性(表2)。假免疫的動物具有>80%的導(dǎo)管定殖。對于被認(rèn)為是保護(hù)性的免疫原，<50%的導(dǎo)管被攻擊菌林定殖。表2:利用大鼠留置導(dǎo)管模型的主動免疫實(shí)驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>其他實(shí)施方式處于以下的權(quán)利要求之內(nèi)。盡管已經(jīng)顯示和描述了幾個實(shí)施方式，可以對此進(jìn)行各種修改和替換而不背離本發(fā)明的精神和范圍。權(quán)利要求1.一種多肽免疫原，其包含至少90％相同于SEQIDNO1的氨基酸序列，其中所述多肽提供了針對表皮葡萄球菌的保護(hù)性免疫，以及所述多肽不具有SEQIDNO3提供的氨基酸序列。2.權(quán)利要求l的多肽，其中所述多肽由至少94%相同于SEQIDNO:1的氨基酸序列組成。3.權(quán)利要求2的多肽，其中所述多肽基本上由SEQIDNO:l組成。4.權(quán)利要求3的多肽，其中所述多肽由SEQIDNO:1的氨基酸序列或曱硫氨酸-SEQIDNO:1組成。5.—種免疫原，包含至少90%相同于SEQIDNO:1的氨基酸序列，和在羧基末端或氨基末端與所述氨基酸序列共價連接的一個或更多個其他區(qū)域或部分，其中每個區(qū)域或部分獨(dú)立地選自具有至少一種以下性質(zhì)的區(qū)域或部分增強(qiáng)免疫反應(yīng)，有利于純化或有利于多肽穩(wěn)定性。6.—種能在患者中誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)的組合物，包含免疫有效量的權(quán)利要求1-5的任一項(xiàng)的免疫原和藥學(xué)上可接受的載體。7.權(quán)利要求6的組合物，其中所述組合物進(jìn)一步包含佐劑。8.—種包含重組基因的核酸，所述重組基因包含編碼權(quán)利要求1_4的任一項(xiàng)的多肽的核苷酸序列。9.權(quán)利要求8的核酸，其中所述核酸是表達(dá)載體。10.包含權(quán)利要求8的核酸的重組細(xì)胞。11.一種產(chǎn)生提供保護(hù)性免疫的表皮葡萄球菌多肽的方法，包括步驟(a)在其中多肽被表達(dá)的條件下生長權(quán)利要求10的重組細(xì)胞；以及(b)純化所述多肽。12.—種在患者中誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)的方法，包括向所述患者施用免疫有效量的、包含至少90%相同于SEQIDNO:1的氨基酸序列的免疫原的步驟。13.權(quán)利要求12的方法，其中所述患者是人類。14.權(quán)利要求13的方法，其中所述患者被針對表皮葡萄球菌感染進(jìn)行預(yù)防性治療。15.—種在患者中誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)的方法，包括向所述患者施用免疫有效量的、權(quán)利要求11的方法產(chǎn)生的多肽的步驟。專利摘要本發(fā)明特征在于包含與SEQIDNO1結(jié)構(gòu)上相關(guān)的氨基酸序列的多肽，以及這種多肽的用途。SEQIDNO1是全長表皮葡萄球菌多肽的截短的衍生物。全長的天然存在的多肽在此被稱為全長ORF2695e。SEQIDNO1的His標(biāo)簽化的衍生物被發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生針對表皮葡萄球菌的保護(hù)性免疫反應(yīng)。文檔編號C12N15/00GKCN101636493SQ200880008989公開日2010年1月27日申請日期2008年3月14日發(fā)明者A·S·安德森,D·L·蒙特戈梅里,J·C·庫克三世,T·麥尼利,W·L·麥克萊門茨申請人:默克公司導(dǎo)出引文BiBTeX,EndNote,RefMan