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用于非侵入性產(chǎn)前診斷的方法和裝置的制作方法

文檔序號:76175閱讀:371來源:國知局

專利名稱::用于非侵入性產(chǎn)前診斷的方法和裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
:本發(fā)明涉及用于非侵入性產(chǎn)前診斷,特別是用于識別胎兒中的基因和染色體病癥的方法?,F(xiàn)有技術(shù)對于染色體病癥的產(chǎn)前診斷是為了突出胎兒中的染色體異常的目的而引入的。迄今,胎兒受染色體病癥影響的診斷確定僅能通過侵入性診斷測試而獲得,通過羊水穿刺、絨膜絨毛的采樣或臍穿刺的方法檢查胚胎細胞以確定核型。全部這些測試是侵入性的并且涉及增加的流產(chǎn)風險。因此,它們通常被推薦用于超過35歲的女性,或在以前的懷孕中曾經(jīng)懷有受染色體病癥影響的胎兒的婦女或當超聲掃描確定具有畸形的胎兒時。在母體循環(huán)中發(fā)現(xiàn)胎兒細胞的存在,雖然很少,但是已經(jīng)引起許多小組研究并且開發(fā)用于分離和回收所述細胞的方法,這容許非侵入性產(chǎn)前診斷。具體地,存在三種能通過胎盤屏障的主要胎兒細胞類型:淋巴細胞,營養(yǎng)細胞和成紅血細胞。在這些中,研究已經(jīng)首先針對研究用于分離來自外周母體血液的胎兒成紅血細胞和營養(yǎng)細胞,源自胎盤的上皮細胞的方法。從外周血分離營養(yǎng)細胞受它們的多核形態(tài)的限制,然而已經(jīng)證明[8-13],在妊娠的第6周和15周之間,經(jīng)宮頸樣品中存在這些細胞。應(yīng)當注意,從胎盤遷移的營養(yǎng)細胞經(jīng)常粘合其它營養(yǎng)細胞或母體細胞,形成凝塊。最近通過直接應(yīng)用到非培養(yǎng)的胎兒細胞的分子生物學方法已經(jīng)使得胎兒細胞的鑒定成為可能。所述方法例如是產(chǎn)前FISH(熒光原位雜交)和定量熒光-聚合酶鏈式反應(yīng)(QF-PCR)。QF-PCR是能識別和同時量化染色體特異性的DNA序列的方法,其可適用于單獨的細胞,允許了基于非常低數(shù)量胎兒細胞的遺傳分析。在文獻中,存在許多出版物,包括一些綜述[1-6,見說明書結(jié)尾的參考文獻],將其內(nèi)容結(jié)合在這里,用于作為涉及QF-PCR在產(chǎn)前分析中應(yīng)用的所需部分的簡單參考。D.ff.Bianchi和同事基于多參數(shù)評分開發(fā)了[14_27]從母體血液分離胎兒具核紅細胞(NRBCs)的系統(tǒng);所述參數(shù)包括兩種形態(tài)學特征(核的圓度和形態(tài))和胎兒血紅蛋白標記的兩種性質(zhì)(細胞質(zhì)的熒光強度和周圍發(fā)光度)。該流程提供根據(jù)密度梯度分離單核細胞和通過消除白細胞的富集(具有關(guān)于CD15和CD45的抗體的MACS)和使用利用Y抗-血紅蛋白抗體的FACS方法在細胞熒光計上分離。在顯微鏡觀察下,使用顯微操作器回收通過多參數(shù)評分鑒定的細胞。評分系統(tǒng)是非常費力的,并且使用顯微操作器引起部分細胞的損失。通常,該方法已經(jīng)在回收胎兒細胞方面顯示74%的靈敏性,兼有5%的假陽性頻率。由其它工作還已知[7],根據(jù)密度梯度分離單核細胞和通過缺少⑶71+細胞的MACS富集樣品,其進一步由關(guān)于Y和ε胎兒血紅蛋白鏈的特異性抗體標記。然而,所述標記可以產(chǎn)生非特異性,因為在成人細胞中存在產(chǎn)生胎兒血紅蛋白的情況,或歸因于胎兒血紅蛋白和成人血紅蛋白的抗體之間的交聯(lián),這是由這些血紅蛋白鏈的類似性所引起的。[0010]MonaLiza醫(yī)療公司(美國專利2005/0181429A1)開發(fā)了使用經(jīng)宮頸細胞的產(chǎn)前遺傳分析方法。所述方法基于Pap涂片細胞刷用于回收經(jīng)宮頸樣品的用途,所述樣品通過細胞離心處理以用于制備載玻片。標記經(jīng)宮頸細胞并且在顯微鏡下進行分析并且記錄它們在載玻片上的位置和坐標。在FISH中分析載玻片并且使用先前獲得的坐標鑒定營養(yǎng)細胞。所述方法的缺點是,在用于制備載玻片的處理期間,損失部分經(jīng)宮頸細胞,其由于營養(yǎng)細胞的缺乏而無響應(yīng)(no-call)。AVIVA-Biosciences公司(見,例如EP-A-1439897)開發(fā)了基于生物芯片的富集系統(tǒng),以用于從母體血液分離胎兒細胞。該方法使用容許除去大部分紅細胞的試劑,借助于高度特異性的磁珠和胎兒抗原的特異性抗體的混合物(cocktail)的分類,和借助于具有根據(jù)待分離細胞類型的可變直徑孔的高分辨率過濾室的富集。然而,所述方法被局限于通過樣品富集選擇胎兒細胞,這不限制具有污染的母體細胞的可能性,和因此后續(xù)發(fā)生不可靠遺傳分析的風險。簡言之,迄今沒有一種以上提到的非侵入性方法證明其可以被用作診斷胎兒非整倍性和/或其它染色體缺陷的常規(guī)實踐。因此本發(fā)明的目的是提供用于非侵入性產(chǎn)前診斷的方法,其基于采樣高概率含有循環(huán)胎兒具核細胞的有機母體流體和它們的后續(xù)分離物,具體地,子宮、宮頸內(nèi)或經(jīng)宮頸流體、或外周母體血。本發(fā)明的另一個目的是提供用于產(chǎn)前診斷的方法,其可以是自動的,沒有假陰性,并且具有低數(shù)量的假陽性和無響應(yīng)。發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于非侵入性產(chǎn)前診斷,特別是用于確定胎兒中的遺傳異常的方法和>J-Uρα裝直。因此,根據(jù)本發(fā)明,該診斷基于高概率含有胎兒具核細胞的有機母體流體及其后繼分離物,具體地,來自子宮,宮頸內(nèi)或經(jīng)宮頸的流體或外周母體血而進行,識別和分析其中存在的胎兒細胞,其根據(jù)權(quán)利要求1的方法進行。根據(jù)本發(fā)明,首先通過胎兒具核細胞的一個或多個富集階段處理子宮、宮頸內(nèi)或經(jīng)宮頸的流體或外周母體血。所述方法的特征在于,使用能以容易可自動化和可重復(fù)的方式,由富集樣品單獨選擇單個細胞的微型流體系統(tǒng)。通過分離單個細胞的微型流體系統(tǒng),有可能獲得一組具有足以進行遺傳診斷的純度的胎兒細胞。通過微型流體裝置,本發(fā)明人意指適于使用層流控制液體體積的裝置。通過微型流體裝置,本發(fā)明人進一步意指具有至少一個小于1_的維度的裝置。通過能單獨選擇單個細胞的裝置,本發(fā)明人意指能基于對每個細胞單獨評價的參數(shù),每次一個或同時地進行一個或多個單個細胞選擇的裝置。然后可以通過下列技術(shù),諸如定量熒光PCR(QF-PCR)進行遺傳分析,如果必要,使用母體細胞的分析用于比較,F(xiàn)ISH,核型或比較基因組雜交(CGH)。微型流體系統(tǒng)的使用提供多種優(yōu)點,包括具有一次性(disposable)系統(tǒng)的可能性,在不同的分析之間沒有污染風險,或不需要徹底清洗設(shè)備。而且,微型流體系統(tǒng)的使用提供具有自動或半自動系統(tǒng)的可能性,其特征在于高可靠性水平。從一些非限制性實施例的下列描述,參考附圖的圖,本發(fā)明另外的特征和優(yōu)點將呈現(xiàn)清楚。[0025]附圖簡述圖1顯示根據(jù)本發(fā)明的非侵入性產(chǎn)前診斷方法的概圖。圖2顯示具有IOX放大倍數(shù)的芯片圖像,其使用DAPI的熒光濾波器。可以觀察到三個細胞核,對應(yīng)三個單個細胞。圖3顯示具有IOX放大倍數(shù)的芯片圖像,其使用FITC的熒光濾波器。拍照區(qū)域與圖2相同,并且可以觀察到兩個Hb-ε陽性細胞和一個Hb-ε陰性細胞。圖4顯示關(guān)于染色體標記物AMXY、D21S11和HPRT分析的電泳圖譜。上圖指關(guān)于從母體血液回收的胎兒細胞進行的分析,下圖指關(guān)于母體細胞進行的分析。該圖顯示胎兒中存在性染色體X和Y,并且在D21S11處,胎兒細胞具有從母親(M)繼承的第一等位基因和不同的第二等位基因(屬于父系來源(P))。圖5顯示關(guān)于染色體標記物D18S391、D13S631和D21S1411分析的電泳圖譜。上圖指關(guān)于從母體血液回收的胎兒細胞進行的分析,下圖指關(guān)于母體細胞進行的分析。該圖顯示關(guān)于標記物D13S631和D21S1411,存在兩種等位基因(正常雜合子),且母體細胞的污染可以被排除。圖6顯示關(guān)于標記物D21S1437和D21S1446分析的電泳圖譜。上圖指關(guān)于從母體血液回收的胎兒細胞進行的分析,下圖指關(guān)于母體細胞進行的分析。該圖顯示存在兩種等位基因(正常雜合子),并且母體細胞的污染可以被排除。圖7顯示關(guān)于標記物D18S535分析的電泳圖譜。上圖指關(guān)于從母體血液回收的胎兒細胞進行的分析,下圖指關(guān)于母體細胞進行的分析。該圖顯示存在兩個無響應(yīng)的等位基因(正常雜合子)。圖8顯示根據(jù)本發(fā)明方法的優(yōu)選實施方案的流程圖。圖9顯示單一欄(cage)中胎兒細胞數(shù)目(NCISCC)根據(jù)每欄細胞平均密度(ACPC)的趨勢。圖10示意性顯示用于實施根據(jù)本發(fā)明的方法(或者屬于其實質(zhì)和特征部分)的裝置的實例。發(fā)明詳述本發(fā)明的主題是用于執(zhí)行非侵入性產(chǎn)前診斷的方法。經(jīng)宮頸樣品的收集經(jīng)宮頸的樣品(TCC)可以通過以下多種技術(shù)取自子宮的不同水平(外部骨,宮頸管的下部,下部子宮極,子宮內(nèi)腔):子宮頸粘液的抽吸,細胞刷或拭子,宮頸內(nèi)灌洗和子宮內(nèi)灌洗(IUL)。從外周血開始的富集可以使用多種方法富集胎兒細胞的比例,例如根據(jù)密度梯度離心,其由溶液諸如FicolI或PercolI組成;機械富集,其基于選擇nRBC和排空RBC樣品的微制造的(microfabricated)過濾器;通過介電電泳分離的富集,其借助于特定裝置,介電電泳活化細胞分類器(DACS);選擇性溶胞,例如選擇性溶解非目的紅細胞;免疫磁性分離,其借助于具有陽性選擇(使用與關(guān)于待回收的胎兒群的特異性抗體連接的珠)或陰性選擇(消除非目的細胞群)的免疫磁珠,并且其中這兩種類型的選擇可以偶聯(lián)以增強所述方法的特異性(如,例如,在US2006/0051775-Bianchi中);FACS,其關(guān)于用胎兒抗原的特異性熒光抗體標記的細胞。這些方法的大部分還是自動的,并且所有分離方法均可以借助于根據(jù)密度梯度的離心分離全部單核細胞之后,或備選地它們可以全部應(yīng)用于血液。通常,所述過程從稀釋開始,但是它不是所有技術(shù)嚴格必需的。其它富集技術(shù)另一種本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的技術(shù)被MiltenyiBiotech(Miltenyi生物技術(shù))稱作MACS,或被Stem-celltechnologies(干細胞技術(shù))稱作Easy-sep。總之,考慮由外周母體血組成有機流體的情況,使所述血液樣品富含包括至少一種類型的胎兒細胞的細胞群可以通過采用連續(xù)階段的過程獲得,所述連續(xù)階段具有,例如,第一階段,其中通過Ficoll密度梯度離心將全部單核細胞與預(yù)先稀釋在PBS/EDTA中的母體樣品分開。顯然,作為備選方案,可以使用圖1中總結(jié)的其它方法中的任一種,例如通過基于選自由下列組成的組中的至少一個參數(shù)進行細胞選擇而富集母體樣品:a.密度;b.形態(tài);c.電性質(zhì);d.化學性質(zhì);e.機械性質(zhì);f.表面抗原的表達;g.細胞質(zhì)內(nèi)抗原的表達;h.介電性質(zhì);1.磁性質(zhì);或它們的組合。隨后,胎兒細胞的富集還通過第二階段獲得,其中由在第一步驟中回收的單核細胞進行陽性或陰性選擇,例如表達CD71。顯然,第二富集步驟可以包括基于包括至少一種類型的胎兒具核細胞的細胞群的至少一個下列特征進行的選擇:a.表達⑶71表面抗原(如已經(jīng)描述的并且其代表本發(fā)明的優(yōu)選形式);b.表達0)34表面抗原;c.表達GPA表面抗原;d.不表達⑶14表面抗原;e.不表達⑶15表面抗原;f.不表達⑶45表面抗原。而且,所述使樣品富含包括至少一種類型的細胞的細胞群的第二階段可以通過下列技術(shù)之一進行:a.MACS或磁性活化細胞分類器;b.DACS或介電電泳活化細胞分類器;c.FACS或熒光活化細胞分類器。胎兒細胞的標記營養(yǎng)細胞的免疫染色如果樣品是TCC樣品,在標記以前,將樣品用乙?;?半胱氨酸溫育并且劇烈攪拌以溶解凝塊并獲得單個細胞懸浮液。為了鑒別胎兒細胞,使用利用關(guān)于胎兒細胞的特異性抗體的標記(能從母體細胞辯別它們),其如已知技術(shù)進行。營養(yǎng)細胞可以使用多種針對特異性抗原的抗體來標記,所述特異性抗原:HLA-G,ND0G-5,BC1,因子XIII,F(xiàn)D0202N,JunD,F(xiàn)ra2,HASH2和PP5(胎盤蛋白質(zhì)),其特異于絨毛外營養(yǎng)細胞;FTl.41.1,103,ND0G-1和AB-154,其特異于合胞體營養(yǎng)細胞;CK-7(細胞角蛋白-7),CHL1(CD146),CHL2,H315,HLA-C,aHCG,IGF-1I,PA1-1和Ρ57,其在營養(yǎng)細胞上表達;PLAP(胎盤堿性磷酸酶),ΑΒ-340和D6,其在合胞體營養(yǎng)細胞和細胞滋養(yǎng)層上表達;Tapasin和CAR,其特異于侵入性或絨毛外但非絨毛營養(yǎng)細胞;PLACl,PLAC4,PLAC8和PLAC9,胎盤特異的,具體是營養(yǎng)細胞譜系細胞;PAR-1(蛋白酶活化受體),其在來自妊娠第7至第10周的胎盤細胞上表達;GLUT_12(葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白),其在來自妊娠的第10至第12周的合胞體營養(yǎng)細胞和絨毛外營養(yǎng)細胞上表達;NDPK-A(二磷酸核苷激酶A),其在懷孕最初的三個月期間內(nèi)表達在絨毛外營養(yǎng)細胞上。來自外周母體血樣品的成紅血細胞的免疫染色為了鑒別胎兒細胞,使用利用關(guān)于胎兒細胞的二級特異性抗體的標記(能從母體細胞辯別它們),不同于用于富集的抗體,其如上所述,不必須特異于胎兒細胞。在這種情況下可以使用下列:.識別表面抗原(如i_抗原)的抗體.細胞內(nèi)抗原(例如,球蛋白鏈Y或ε。在這些情況下,細胞優(yōu)選是固定的和滲透化的,如在已知技術(shù)中,以容許良好標記。應(yīng)當注意,雖然從以前研究已知抗-1_抗原抗體標記胎兒細胞的用途,但是所述抗體直接使用在基于密度梯度的裝置中。在富集CD71+細胞之后借助于i_抗原抗體標記胎兒細胞具有進行預(yù)選擇胎兒細胞(富含胎兒成紅血細胞的樣品)和促進識別目的細胞的優(yōu)點,從而進一步獲得非常靈敏和特異性的標記。已經(jīng)標記的細朐胎兒細胞可以是已經(jīng)標記的,條件是在富集中使用了特異于胎兒細胞(能從母體細胞辯別它們)并且是熒光的或與熒光珠綴合的或與熒光二級或三級抗體綴合的抗體。在這種情況下,可以將富集的樣品直接注射到能選擇單個細胞的微型流體裝置中,因為其已經(jīng)可能用于識別胎兒細胞。單個胎兒細胞的分離隨后,將含有所述細胞的樣品放置在能單獨選擇任何已知類型的單個細胞的微型流體裝置中。為了所述目的,可以使用介電電泳分離(DEPArray,使用例如PCT/IB2007/000963中或PCT/IB2007/000751,或[31]和[32]中描述的技術(shù)),或光電子阱或光原子間致導(dǎo)電性(optophoretic)分離或激光鑷[28-30]。所述文件[28-30]和[31-32]的內(nèi)容結(jié)合在這里,用于簡單參考所需的部分。目的細胞的識別可以例如通過以下傳感器進行:-外部的-光學的,諸如突光顯微鏡,或者還有-內(nèi)部的-光學的,如專利PCT/IB2006/000636和W02007010367中舉例說明地,其描述識別熒光細胞的綜合方法-1mpedentiomeric,如專利PCT/IB2006/000636和TO2007010367中舉例說明地,以識別與細胞有關(guān)的介電珠。遺傳分析可以在回收的胎兒細胞上進行多種類型的分析,容許以不同水平的分辨率和靈敏性并且根據(jù)研究的診斷目的,進行基因或染色體的表征。在假定的染色體病癥的事件中,可以進行使用典型或分子方法(FISH)的核型分析或通過QF-PCR的染色體標記物研究。還可以通過比較基因組雜交研究遺傳材料的獲得或損失。本發(fā)明優(yōu)選實施方案的實施例經(jīng)由本發(fā)明目的的非限制性實施例,給出了根據(jù)本發(fā)明方法的優(yōu)選實施方案,遵循圖8中所示的流程圖。樣品收集從懷孕女性獲取IOml外周血。mM本發(fā)明的優(yōu)選實施方案包括采用連續(xù)階段方式的過程,其具有第一階段,其中將全部單核細胞與母體樣品分開。所述階段包括用PBSpH7.2的1:1稀釋母體血液。然后使稀釋的樣品根據(jù)單一Ficoll梯度1.077g/ml分層,并且在22°C以300g的速度離心30分鐘。將已經(jīng)積累在Ficoll以上的細胞環(huán)收集并轉(zhuǎn)移到無菌試管。根據(jù)本發(fā)明的特征,一部分血液或單核細胞不進行進一步處理并用于母體DNA的分析。然后通過第二階段進一步獲得胎兒具核細胞的富集,其中從在第一步驟中回收的單核細胞中陽性選擇表達CD71的細胞。該陽性選擇通過使用與磁珠綴合的抗-CD71抗體的免疫磁性分離(MACS-Miltenyi生物技術(shù)(MiltenyiBiotec))進行。為了免疫磁性分離,將細胞再懸浮在80μI的PBS/107細胞中,然后添加20μI的抗-CD71微珠(MiltenyiBiotec)/IO7細胞。在4°C溫育15分鐘以后,使細胞通過與磁場相連接、保留陽性CD71細胞的柱。然后將保留的細胞從柱中洗脫出來并用于后繼階段。將由此獲得的⑶71+細胞(對于⑶71是陽性的)用3.7%甲醛在22°C固定15分鐘。然后用處于PBS中的0.1%ΝΡ-40溶液(SigmaAldrich(西格瑪奧德里奇))滲透化固定的細胞。將識別與熒光染料FITC綴合的胎兒血紅蛋白的Y鏈的抗體(lyg/ml)加入到滲透化的細胞。根據(jù)本發(fā)明的重要方面,將樣品進一步以組合方式用DAPI(或其它適合的標記物)反標記(countermark),以顯示所有細胞的核。在加載在芯片中從而進行介電電泳操作和胎兒細胞分離以前,樣品經(jīng)歷質(zhì)量控制以驗證標記的熒光強度和總細胞含量。將一部分標記的樣品再懸浮在有效用于介電電泳操作的最小特定緩沖液體積中,并加載到用于樣品質(zhì)量控制的裝置中并在熒光顯微鏡下檢驗:在多種通道中觀察細胞的熒光強度,并且進行在DAPI中標記的細胞(總具核細胞)的計數(shù)。如果細胞濃度高于正確操作用于分離單個細胞的裝置的最佳濃度,則將樣品稀釋以獲得所需濃度;如果細胞的總數(shù)太低以致于不容許回收最小數(shù)量的胎兒細胞,則不回收胎兒細胞(無響應(yīng)結(jié)果)。為了計算最佳細胞濃度,本發(fā)明人參考特定的商業(yè)裝置(DEPArray,SiliconBiosystemsSpA(硅生物系統(tǒng)SpA)),W00069565,基于移動的介電電泳欄,特別是包括100,000欄的型號CONV600k。使用所述裝置的優(yōu)選方法提供下列步驟:1.選擇含有胎兒細胞(對標記是陽性的)的欄。2.如果所述細胞是團塊的一部分,即,它與其它非胎兒細胞共用所述欄,則將團塊的細胞分到單獨的欄中,直到將胎兒細胞分離到不與其它非胎兒細胞共用的欄中。如果胎兒細胞不與其它非胎兒細胞分開,則將其丟棄。3.回收一個單一欄中的全部胎兒細胞。使用所述裝置的另一個備選優(yōu)選方法提供下列步驟:1.選擇含有胎兒細胞(對標記是陽性的)的欄。2.如果所述細胞是團塊的一部分,則將其從待回收的細胞列表中丟棄。3.回收單一欄中的全部胎兒細胞。在所述第二情況下,考慮存在于樣品中的總細胞數(shù)目(NCELLST0T)和預(yù)期的胎兒細胞的百分比(PCI),進行待注射到芯片中的平均細胞密度/欄(ACPC)的選擇。事實上,當ACPC增加時,存在于芯片操作室中的胎兒細胞數(shù)目增加。然而,每個細胞屬于具有單個細胞的欄的概率降低,并且單一欄中的胎兒細胞數(shù)目(NCISCC)因此達到最大值A(chǔ)CPC=I。所述數(shù)值與PCI無關(guān),并且可以根據(jù)理論最大值A(chǔ)CPC=I將其限定為NCISCC的標準化數(shù)值,其趨勢顯示在附圖9的圖中。所述濃度最大化每次將樣品沖洗到操作微室中時可以回收到的細胞數(shù)目。這是好的選擇,條件是可以回收的胎兒細胞的總數(shù)足以用于下游的遺傳分析。隨著ACPC增加,存在要丟棄的細胞百分比的增長的單調(diào)增加,則歸因于這樣的事實,即它們與其它非胎兒細胞共用欄,如圖9中所示,參考關(guān)于存在于操作微室中的胎兒細胞數(shù)目的標準數(shù)值(標準化細胞廢物)。如果可回收的細胞數(shù)目低于下游分析所需的最小值,則可以稀釋樣品,并且進行更多次數(shù)的沖洗以回收更大數(shù)量的胎兒細胞。用較少次數(shù)的沖洗回收足夠數(shù)量的胎兒細胞的最佳ACPC值可以基于以上確定的統(tǒng)計學分析,例如,使用基于預(yù)期的胎兒細胞數(shù)量和用于遺傳分析的最小細胞數(shù)量的計算法來計算,由此確定樣品中存在的胎兒細胞的最小回收效率(在單一欄中的細胞/在具有其它細胞的欄中的細胞之間的比例)。從所述效率,可以推出ACPC的最大值,由此推出在所述回收效率條件下處理全部樣品的最小沖洗次數(shù)。然后將樣品加載到芯片中,從而通過移動的介電電泳欄(DEPArrayW00069525,SiliconBiosystemsSpA(娃生物系統(tǒng)SpA),例如作為包裝(package)或總裝置的一部分,如圖10中示意性說明)分離細胞,并且進行胎兒細胞的掃描,識別和選擇,分類和回收。在具有三種不同熒光通道(或采用三種不同的波長)的顯微鏡下自動地或人工地觀察(掃描)分欄的細胞:在此處所述的非限制性實例中,藍色通道容許驗證核的存在,以及如果必要,它的形態(tài)(例如用DAPI標記),且綠色通道突出已經(jīng)用特異性胎兒抗體標記的細胞,所述特異性胎兒抗體與在綠色波長中發(fā)射的熒光團(例如FITC)綴合。根據(jù)本發(fā)明的一個方面,還使用不同于前兩種的第三種通道(例如在紅色波長中發(fā)射的通道,如關(guān)于用于檢測TRITC熒光的濾波器),并且對其沒有使用熒光標記物;這允許識別自發(fā)熒光細胞,對其在DAPI和綠色通道中檢出的任何信號應(yīng)該不是特異性的。備選地,第三種通道可用于突出與連接熒光團,如例如⑶45的抗體綴合的細胞,以識別待丟棄的細胞。因此通過選擇含有一個單個具核細胞(對于DAPI是陽性的,圖2)的欄進行細胞選擇,其具有強特異性胎兒抗體信號(對于FITC/Alexa是陽性的,圖3),并且其在其它通道上(例如紅色通道)檢測,具有低或無自發(fā)熒光。為了進一步提高該方法的選擇性,熒光標記物特別是胎兒標記物,可以由與能識別目的細胞,在該情況下是胎兒細胞的抗體綴合的熒光珠組成,而不是由簡單熒光分子組成。將細胞以數(shù)微升(<40微升)回收在0.2毫升PCR管中。遺傳分析從由此獲得的所述細胞提取DNA,將其擴增并且分析染色體非整倍性的存在,優(yōu)選地在與用于選擇,且如果必要,先前已經(jīng)用于富集過程的至少一部分相同的微型流體裝置中操作(例如在使用DACS技術(shù)情況下);在該情況下,所述裝置可以類似于圖10中所示的>j-Uρα裝直。所述設(shè)備含有現(xiàn)有技術(shù)中的電極陣列,但是其特征在于主要微室(CHM)和多個次要微室(CHJ),全部在至少一個面上由一個單一芯片或多個分開的芯片分界(delimited),含有可以被激活的電極陣列。可以通過相對的進口(頂1)和出口(OMl)向主要微室填充包括至少一個細胞的樣品。每個次要微室(CHJ)優(yōu)選具有基本上更大的尺寸,但是與細胞尺寸相當。優(yōu)選地,每個次要微室通過構(gòu)型通道(長度和/或形式)與主要微室相連,所述構(gòu)型通道足以分析所需的時間內(nèi),阻止(防止或至少限制)樣品通過擴散和污染分散到其它微室中。根據(jù)說明的實施例,存在多個用于溶胞的次要微室,其例如用十字形接頭與芯片上用于毛細管電泳的通道相連。備選地,根據(jù)現(xiàn)有技術(shù),可以為具有雙T接頭的毛細管電泳提供一系列通道。任選地,在用于毛細管電泳的通道的末端,存在屬于impedentiometric和/或光學類型的集成傳感器,其能基于從交叉點(十字形或雙T)到傳感器本身分析的化合物遷移時間產(chǎn)生電泳圖譜。根據(jù)圖10,具體地,多個微室中的每個微室通過每個次要微室的流體出口(0J)與用于電泳的毛細管(CAPJ)連接。提取回收的胎兒細胞的DNA是通過堿性熱分解進行的。[0138]染色體變化的確定是通過借助于QF-PCR分析STR(短串聯(lián)重復(fù))或微衛(wèi)星進行的。熒光毛細管電泳技術(shù)容許通過適當選擇用不同的熒光分子標記的DNA片段而同時分析若干STR。在多重-PCR中擴增屬于染色體13、18和21的每一條的至少三個不同STR和性染色體的三個標記物,所述STR在種群中具有高雜合頻率。在無響應(yīng)的情形中,例如由于純合性中STR的存在,擴增相同染色體的另一個STR。分析的STR是:用于分析染色體21的D21S11,D21S1410,D21S1411,D21S1412,D21S1435和D21S1446;關(guān)于染色體13的D13S631,D13S634,D13S258,D13S305和D13S742;關(guān)于染色體18的D18S535,D18S386,D18S391,D18S858和D18S51;為了分析性染色體的,分析了標記物AMXY和SRY,以及STRX22,DXYS218,DXS6803,DXS6809,DXS8377,HPRT和SBMA0與胎兒細胞DNA的擴增平行,分析母體DNA,從而根據(jù)本發(fā)明的一個方面,識別胎兒細胞可能的母體污染或QF-PCR的可能的外部污染的存在(圖4-7)。在從使用自動測序儀(例如用ABIprism310)進行的PCR產(chǎn)物的毛細管電泳獲得的電泳圖譜中,分析了對應(yīng)于擴增的微衛(wèi)星的多種等位基因的峰的面積和尺寸。同時分析母體DNA可以作為對照幫助解釋遺傳分析的結(jié)果,從而幫助確定實驗室污染和回收的胎兒細胞被母體細胞污染的可能情況。根據(jù)本發(fā)明的可能變化,遺傳分析階段還可以通過核型的方法進行,在所述情況中,富集至少一個包括至少一種類型的胎兒具核細胞的細胞群的階段還包括下列階段:1.在中期阻斷細胞。在中期停止細胞以后,進行固定和滲透化,從而借助于細胞質(zhì)內(nèi)抗體識別胎兒細胞。參考文獻vanZwietenMC,WillemsDL,LitjensLL,Schuring-BlomHG,LeschotN.HowunexpectedareunexpectedfindingsinprenatalcytogeneticdiagnosisAliteraturereview.(產(chǎn)前細胞遺傳診斷中的意外發(fā)現(xiàn)是多么得意外?文獻綜述)EurJObstetGynecolReprodBiol.(歐洲產(chǎn)科,婦科,和生殖生物學雜志)2005年5月I日;120(1):15-21.綜述.[0147]NicoliniU,LalattaF,NatacciF,CurcioC,BuiTH.TheintroductionοfQF-PCRinprenataldiagnosisoffoetalaneuploidies:timeforreconsideration(QF-PCR在胎兒非整倍性的產(chǎn)前診斷中的引入:重新考慮的時刻).HumReprodUpdate(人類生殖最新情報).2004年11-12月;10(6):541-8.綜述.[0148]LeungWC,LauET,LaoTT,TangMH.Rapidaneuploidyscreening(FISHorQF-PCR):thechangingsceneinprenataldiagnosis(迅速非整倍性篩選(FISH或QF-PCR):在產(chǎn)前診斷中改變情況?)ExpertRevMolDiagn(分子診斷的專家綜述).20045月;4(3):333-7.綜述.[0149]HultenMA,DhanjalS,PertlB.Rapidandsimpleprenataldiagnosisofcommonchromosomedisorders!advantagesanddisadvantagesofthemolecularmethodsFISHandQF-PCR(常見染色體病癥的迅速和簡單產(chǎn)前診斷:分子方法FISH和QF-PCR的優(yōu)點和缺點).Reproduction(生殖).2003年9月;126(3):279-97.綜述.[0150]AdinolfiM,PertlB,SherlockJ.Rapiddetectionofaneuploidiesbymicrosatelliteandthequantitativefluorescentpolymerasechainreaction(通過微衛(wèi)星和定量熒光聚合酶鏈式反應(yīng)迅速檢測非整倍性).PrenatDiagn(產(chǎn)前診斷).1997年12月;17(13):1299-311.綜述.[0151]AdinolfiM,SherlockJ.Firsttrimesterprenataldiagnosisusingtranscervicalcells:anevaluation(使用經(jīng)宮頸細胞的最初三個月產(chǎn)前診斷:評估).HumReprodUpdate(人類生殖最新情報).1997年7-8月;3(4):383-92.綜述BianchiDW,SimpsonJL,JacksonLG,EliasS,HolzgreveW,EvansMI,DukesKA,SullivanLM,KlingerKW,BischoffFZ,HahnS,JohnsonKL,LewisD,WapnerRJ,delaCruzF.FoetalgenderandaneuploidydetectionusingfoetalcellsinmaternalbloodanalysisofNIFTYIdata(使用母體血液中的胎兒細胞的胎兒性別和非整倍性檢測:NIFTYI數(shù)據(jù)分析).NationalInstituteofChildHealthandDevelopmentFoetalCellIsolationStudy(國家兒童健康和發(fā)育研究所胎兒細胞分離研究).PrenatDiagn(產(chǎn)前診斷).2002年7月;22(7):609-15.[0153]Shettles,LB(1971)UseoftheYchromosomeinprenatalsexdetermination(在產(chǎn)前性別確定中使用Y染色體).Nature(自然),230,52.[0154]Adinolfi,M,Davies,A,Sharif,S等.(1993)DetectionoftrisomyI8andY—derivedsequrncesinfoetalnucleatedcellsobtainedbytranscervicalflushing(在通過經(jīng)宮頸沖洗獲得的胎兒具核細胞中檢測三體性18和Y-來源的序列),Lancet,342,403-404.[0155]Adinolfi,M和Sherlock,J(1997)Firsttrimesterprenataldiagnosisusingtranscervicalcells:anevaluation(使用經(jīng)宮頸細胞的最初3個月產(chǎn)前診斷:評估),HumanReproductionUpdate(人類生殖最新情報),3(4),383-392.[0156]Miller,D,Briggs,J,S.Rahman,M,等.(1999)Transcervicalrecoveryoffoetalcellsfromtheloweruterinepole!reliabilityofrecoveryandhistological/immunocytochemicalanalysisofrecoveredcellpopulations(從下部子宮極經(jīng)宮頸回收胎兒細胞:回收可靠性和回收的細胞群的組織學/免疫細胞化學分析),HumanReproduction(人類生殖),14(2),521-531Bussani,C,Cioni,R,ScarselliB,等.(2002)Strategiesfortheisolationanddetectionoffoetalcellsintranscervicalsamples(用于分離和檢測經(jīng)宮頸樣品中的胎兒細胞的策略),PrenatalDiagnosis(產(chǎn)前診斷),22,1098-1101.[0158]Bussani,C,Scarselli,B,Cioni,R,等.Useofthequantitativefluorescent—PCRassayinthestudyoffoetalDNAfrommicromanipulatedtranscervicalsamples(在來自微操作的經(jīng)宮頸樣品的胎兒DNA的研究中使用定量熒光-PCR測定),MolDiagn(分子診斷),8(4),259-263WangJY,ZhenDK,FalcoVM,FarinaA,ZhengYL,Dell1-BoviLC,BianchiDW.Foetalnucleatederythrocyterecovery:fluorescenceactivatedcelIsorting-basedpositiveselectionusingant1-gammaglobinversusmagneticactivatedcellsortingusinganti_CD45depletionandant1-gammaglobinpositiveselection(胎兒具核紅細胞回收:使用抗-γ球蛋白基于突光活化細胞分類的陽性選擇對比使用抗-CD45排除和抗-Y球蛋白陽性選擇的磁性活化細胞分類).Cytometry(細胞計數(shù)).2000年3月I日;39(3):224-30.[0160]SamuraO,SekizawaA,ZhenDK,FalcoVM,BianchiDff.Comparisonoffoetalcellrecoveryfrommaternalbloodusingahig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,所述具有預(yù)先確定體積的一部分在所述富集步驟以后立即與所述有機流體的樣品分開。8.權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,其特征在于,所述富集和遺傳分析的至少一種或兩種均與所述在用于執(zhí)行分離的同一個所述微型流體裝置內(nèi)的至少一個胎兒細胞的分離組合進行。9.權(quán)利要求8所述的應(yīng)用,其特征在于,使用裝配有多個不同室的微型流體裝置,所述室是相互分開并且液壓連接的,其在至少一面上由一個單一芯片或通過多個分開的芯片分界,具有可以被激活的電極的陣列。10.權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,其特征在于,所述胎兒細胞用所述胎兒細胞的特異性抗體標記,所述胎兒細胞的特異性抗體可以適于將所述胎兒細胞與母體細胞區(qū)分開,所述標記通過使用多種針對選自由下列組成的組中的特異性抗原的抗體進行:識別胎兒營養(yǎng)細胞抗原的抗體識別胎兒表面抗原諸的抗體識別胎兒細胞內(nèi)抗原的抗體。11.權(quán)利要求10所述的應(yīng)用,其中所述胎兒營養(yǎng)細胞抗原是HLA-G,所述胎兒表面抗原是i抗原,所述胎兒細胞內(nèi)抗原是血紅蛋白鏈Y和/或ε。12.權(quán)利要求10所述的應(yīng)用,其特征在于,所述適合于將胎兒細胞與母體細胞區(qū)分開的針對胎兒細胞的所述特異性抗體是熒光抗體。13.權(quán)利要求12所述的應(yīng)用,其特征在于,所述適合于將胎兒細胞與母體細胞區(qū)分開的針對胎兒細胞的所述特異性抗體綴合熒光珠。14.權(quán)利要求10所述的應(yīng)用,其中所述有機流體的樣品是血樣,所述血樣包括至少一個細胞群,所述細胞群包括至少一種類型的胎兒具核細胞,特征在于,所述血樣的具核細胞用特異于細胞核的第一標記物標記,和至少所述包括至少一種類型的胎兒具核細胞的細胞群用不同于第一標記物的第二標記物標記,其中所述第二標記物是適合于將胎兒細胞與母體細胞區(qū)分開的針對胎兒細胞的所述特異性抗體,從而使得所述微型流體裝置在所述至少一個胎兒細胞的分離物中僅選擇突出所述第一和第二標記物存在的單個細胞。15.權(quán)利要求14所述的應(yīng)用,其特征在于,所述第一和第二標記物都是熒光標記物,其具有分別處于彼此不同的第一和第二波長中。16.權(quán)利要求15所述的應(yīng)用,其特征在于所述第一和第二波長分別處于藍色和綠色波長。17.權(quán)利要求15所述的應(yīng)用,其特征在于,所述在所述分離至少一個胎兒細胞中單個細胞的單獨選擇是通過也檢測第三波長的發(fā)射而進行的,其可以通過由所述有機流體的所述樣品中的細胞自身熒光而產(chǎn)生,從而僅選擇以第一和第二所述波長發(fā)射但是同時不以所述第三波長發(fā)射的細胞。18.權(quán)利要求17所述的應(yīng)用,其特征在于所述第三波長是紅色波長。19.權(quán)利要求10所述的應(yīng)用,其特征在于細胞被標記以后被固定和滲透化,從而通過細胞質(zhì)內(nèi)的抗體用于識別胎兒細胞。20.權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,其特征在于,所述遺傳分析階段是通過整合在所述微型流體裝置中的QF-PCR進行的,并且包括在由所述至少一個胎兒具核細胞和至少一個母體具核細胞攜帶的遺傳信息之間進行比較的階段。21.權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,其特征在于,所述富含至少一個包括至少一種類型的胎兒具核細胞的細胞群的所述有機流體的所述樣品是通過將所述富含至少一個包括至少一種類型的胎兒具核細胞的細胞群的有機流體的所述樣品置于培養(yǎng)物中,并且隨后對所述樣品重復(fù)富集階段而獲得的。22.權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,其特征在于,所述有機流體的所述樣品含有選自由下列組成的組中的細胞:子宮,經(jīng)宮頸或?qū)m頸內(nèi)細胞或外周母體血。23.權(quán)利要求22所述的應(yīng)用,其特征在于,所述用于選擇單個細胞的微型流體裝置是一次性裝置。專利摘要用于非侵入的產(chǎn)前診斷的方法,所述方法包括以下步驟a.獲得有機流體樣品,所述有機流體具有含有來自懷孕婦女的胎兒細胞的高概率;b.使所述有機流體樣品富含至少一個包括至少一種類型的胎兒具核細胞的細胞群;c.從所述至少一種類型的胎兒具核細胞中分離至少一個細胞;d.在從所述至少一種類型的胎兒具核細胞中分離的所述至少一個細胞上進行遺傳分析,以便突出所述至少一個胎兒具核細胞的至少一種遺傳特征,適于容許所述診斷;其中從所述至少一種類型的胎兒具核細胞中分離至少一個細胞的步驟是通過在設(shè)計用于所述用途的微型流體裝置中單獨選擇單個細胞而進行的。文檔編號C12N5/073GKCN101715486B發(fā)布類型授權(quán)專利申請?zhí)朇N200880021783公開日2013年5月1日申請日期2008年5月2日發(fā)明者尼科洛·馬納雷西,安東尼奧·菲蒂帕爾迪,朱塞皮·焦爾吉尼,詹內(nèi)伊·梅多羅申請人:硅生物系統(tǒng)股份公司導(dǎo)出引文BiBTeX,EndNote,RefMan專利引用(3),
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