專利名稱:細菌性陰道病聯(lián)合檢測試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種體外診斷用檢測試劑，尤其涉及一種細菌性陰道病聯(lián)合檢測試劑， 通過該檢測試劑可以評價陰道微生態(tài)環(huán)境、清潔度及細菌性陰道病的致病狀況。
背景技術(shù)：
細菌性陰道病(Bactarial Vaginosis,簡稱BV)是育齡婦女最常見的陰道感染性疾病， 國內(nèi)報道在健康婦女中，BV患病率為18.9%，在婦科門診有異常陰道分泌物的患者中 為43.3%，在性亂人群中為36.7%，在孕婦患病率為12.5%，它是由于陰道正常菌群(含 乳酸桿菌)被陰道加德納菌、厭氧菌、人型支原體構(gòu)成的混合菌群所取代，造成菌群失 調(diào)而引起的疾病。雖然它不屬于國內(nèi)監(jiān)測的性病，值得注意是它在性病高危人群更為多 見，可增加艾滋病、淋病、非淋菌性尿道炎等性病的易感性，。BV的主要表現(xiàn)為陰道分 泌物增多伴有惡臭，并引起宮頸、子宮體感染及盆腔炎癥性疾病(PID)的危險。由于 40~50%的BV患者無任何癥狀，所以BV的診斷不能僅根據(jù)臨床表現(xiàn)，而是要進行實驗 室檢測。如何及時地發(fā)現(xiàn)BV病毒人并及早地采取相應(yīng)的治療措施是診治BV的關(guān)鍵所 在。
細菌性陰道病常見的診斷手段有傳統(tǒng)的細菌學(xué)檢測、Amsel診斷方法、ELISA(酶聯(lián) 接免疫吸附劑測定)方法、聚合酶鏈式反應(yīng)法及酶化學(xué)反應(yīng)法等方法。由于細菌學(xué)檢査 操作比較麻煩，已很少使用。Amsd診斷方法是國際公認的診斷BV的金標準，即在下 列四項中有三項陽性表現(xiàn)則可診斷為BV:第一，陰道pl^4.5;第二，胺試驗陽性；第 三，涂片中找到線索細胞；第四，陰道分泌物變稀有異臭。PH測定用試紙法測定，人 為判斷誤差比較大，胺試驗的測定因人而異，可靠性與近期是否有性交行為有關(guān)，而且， 測定過程中味道比較難聞，影響工作人員的工作態(tài)度，因此，目前國內(nèi)較少推廣使用。 根據(jù)Amsel診斷方法也延伸了一些改進的診斷試劑，如專利號為ZL200420111847.9的 中國實用新型專利《細菌性陰道炎快速診斷試劑盒》(授權(quán)公告號CN2760549Y)，將各 種試劑和檢測物件統(tǒng)一設(shè)于試劑盒中，以方便快速使用；又如申請?zhí)枮?00510022508.2 的中國發(fā)明申請公開《白帶pH、胺試驗聯(lián)合檢測試劑》(公開號CN1793865A)，該申 請對采用pH試劑檢測pH值，并對胺檢測試劑作了改進。
酶活性方面的檢測方法依據(jù)BV與陰道中特有的微生物的代謝產(chǎn)物有關(guān)，通過檢測 陰道中特有的微生物的代謝產(chǎn)物而達到診斷陰道病變情況的原理，然而單項酶活性測定
3診斷BV的特異性較差，可靠性不高。
為此，檢測方便、快捷且可靠的細菌性陰道病聯(lián)合檢測試劑慢慢得到應(yīng)用，常見的 有唾液酸苷酶與白細胞酯酶組合、唾液酸苷酶與三甲胺組合、唾液酸苷酶與過氧化氫的 組合等。公開的文獻如申請?zhí)枮?00610056827.X的中國發(fā)明申請公開《細菌性陰道病 聯(lián)合測定試劑盒》(公開號CN1850985A)，該申請中采用過氧化氫試劑、白細胞酯酶試 劑和唾液酸苷酶試劑組合，克服了傳統(tǒng)單一手段診斷陰道病的不客觀、不科學(xué)及不準確 的不足。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對上述的技術(shù)現(xiàn)狀而另外提供一種檢測方便、快捷 且可靠佳的細菌性陰道病聯(lián)合檢測試劑。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為 一種細菌性陰道病聯(lián)合檢測試劑， 包括過氧化氫反應(yīng)墊泡液、唾液酸苷酶反應(yīng)墊泡液、白細胞酯酶反應(yīng)墊泡液和pH反應(yīng) 墊泡液，其特征在于
所述的氧化氫反應(yīng)墊泡液包括如下組分及配比0. l~0.5mM的氯化亞鐵、0. l~0.5mM 的淀粉、10~50mg/L的2-羥基-3,5-二氯苯磺酸鈉鹽、300~500U酶活力/L辣根過氧化物 酶、體積百分比為0.01%的2-硫基乙醇，緩沖系統(tǒng)為0.1MPB液，該PB液pH為4 5;
所述的唾液酸苷酶反應(yīng)墊泡液包括如下組分及配比O.l-l.OmM的5'-溴-2'-氯-剛 哚-3，-氧唾液酸苷或5-溴-4-氯-3-吲哚基-a-D-N-乙酰神經(jīng)氨酸或百里酚酞乙?；窠?jīng)氨 酸、0.1~lmg/ml的3-(N-對甲苯磺?；?L-丙氨酰氧基)-吲哚、0.1~lmg/ml的葡萄糖，緩 沖系統(tǒng)為0.1M的PB液，該PB液pH為5 6;
所述的白細胞酯酶反應(yīng)墊泡液包括如下組分及配比0.5~1.5mM的l-乙酰基-5-溴 -4-氯吲哚-3-乙酸酯、0.2 1.0mM的乙酸-5-溴-4-氯-3-吲哚氧基酯、0.3~1.5mg/ml的3-(N-對甲苯磺?；?L-丙氨酰氧基)-5-苯基吡咯、0.1~lmg/ml的葡萄糖，緩沖系統(tǒng)為0.1M的 PB液，該PB液pH為6^7，
所述的pH反應(yīng)墊泡液采用0.02M的氫氧化納溶液溶配成質(zhì)量百分比0.1°/^0.5%溴 甲酚綠。
進一步，還包括稀釋液，該稀釋液采用0.01lVM).lMpH6.9PIPES緩沖液。 作為優(yōu)選，所述的唾液酸苷酶反應(yīng)墊泡液所使用的指示劑為0.01M 0.05M氫氧化鈉。
所述的各反應(yīng)墊的載體可以采用Whatman3MM玻璃纖維濾紙、Whatman玻璃纖維 濾紙、GF/AWhatman的纖維濾紙Grade3、定量濾紙中的至少一種。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于可同時測定多組數(shù)據(jù)，分別反映微生態(tài)環(huán)境、 致病菌和分泌物狀況，測定更加全面可靠，同時，操作簡單快速，無需使用儀器設(shè)備，成本較低。
具體實施方式
以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。
實施例本實施例中的細菌性陰道病聯(lián)合檢測試劑放在一個試劑盒內(nèi)，具體包括過 氧化氫反應(yīng)墊泡液、唾液酸苷酶反應(yīng)墊泡液、白細胞酯酶反應(yīng)墊泡液、pH反應(yīng)墊泡液、 稀釋液和指示劑。
氧化氫反應(yīng)墊泡液包括如下組分及配比0.1~0.5mM的氯化亞鐵、0.1~0.5mM的淀 粉、10 50mg/L的2-羥基-3，5-二氯苯磺酸鈉鹽、300-500U酶活力/L辣根過氧化物酶、 體積百分比為0.01%的2-硫基乙醇，緩沖系統(tǒng)為0.1MPB液，該PB液pH為4 5;
唾液酸苷酶反應(yīng)墊泡液包括如下組分及配比O.l-l.OmM的5'-溴-2'-氯-H引哚-3'-氧 唾液酸苷或5-溴-4-氯-3-吲哚基-a-D-N-乙酰神經(jīng)氨酸或百里酚酞乙?；窠?jīng)氨酸、 0.1~lmg/ml的3-(N-對甲苯磺?；?L-丙氨酰氧基)-吲哚、0.1~lmg/ml的葡萄糖，緩沖系 統(tǒng)為0.1M的PB液，該PB液pH為5 6;
白細胞酯酶反應(yīng)墊泡液包括如下組分及配比0.5~1.5mM的l-乙?；?5-溴-4-氯吲 哚-3-乙酸酯、0.2 1.0mM的乙酸-5-溴4-氯-3-哼l哚氧基酯、0.3~1.5mg/ml的3-(N-對甲苯 磺酰基-L-丙氨酰氧基)-5-苯基吡咯、0.1~lmg/ml的葡萄糖，緩沖系統(tǒng)為0.1M的PB液， 該PB液pH為^7，
pH反應(yīng)墊泡液采用0.02M的氫氧化納溶液溶配成質(zhì)量百分比0.1%~0.5%溴甲酚綠。
稀釋液采用0.01M 0.1MpH6.9PIPES緩沖液。
唾液酸苷酶反應(yīng)墊泡液所用使用的指示劑為0.01M 0.05M氫氧化鈉。 優(yōu)選配比如下
氧化氫反應(yīng)墊泡液包括如下組分及配比0.3mM(毫摩爾每升)的氯化亞鐵、0.3mM 的淀粉,30mg/L的2-羥基-3，5-二氯苯磺酸鈉鹽、400U酶活力/L辣根過氧化物酶、體積 百分比為0.01%的2-硫基乙醇，緩沖系統(tǒng)為0.1M PB液，該PB液pH為4.5;
唾液酸苷酶反應(yīng)墊泡液包括如下組分及配比0.5mM的5'-溴-2'-氯-噴哚-3'-氧唾液 酸苷或5-溴4-氯-3-吲哚基-a-D-N-乙酰神經(jīng)氨酸或百里酚酞乙?；窠?jīng)氨酸、0.5mg/ml 的3-(N-對甲苯磺酰基-L-丙氨酰氧基)-吲哚、0.5mg/ml的葡萄糖，緩沖系統(tǒng)為0.1M的 PB液，該PB液pH為5.5;
白細胞酯酶反應(yīng)墊泡液包括如下組分及配比lmM的1-乙?；?5-溴-4-氯吲哚-3-乙酸酯、0.6mM的乙酸-5-溴-4-氯-3-吲哚氧基酯、0.9mg/ml的3-(N-對甲苯磺?；?L-丙 氨酰氧基)-5-苯基吡咯、0.5mg/ml的葡萄糖，緩沖系統(tǒng)為0.1M的PB液，該PB液pH 為6.5，pH反應(yīng)墊泡液采用0.02M的氫氧化納溶液溶配成質(zhì)量百分比0.3%溴甲酚綠。
稀釋液采用0.05M pH 6.9PIPES緩沖液。
唾液酸苷酶反應(yīng)墊泡液所用使用的指示劑為0.03M氫氧化鈉。
各反應(yīng)墊的載體可以采用Whatman3MM玻璃纖維濾紙、Whatman玻璃纖維濾紙、 GF/A Whatman的纖維濾紙Grade3和普通定量濾紙。
取陰道分泌物進行檢測，直接通過顏色變化判斷患病情況。陰道病聯(lián)合檢測 試條包含有過氧化氫H202、唾液酸苷酶NAcase、白細胞酯酶LE和pH底物的反應(yīng)墊， 當(dāng)標本中H202、唾液酸苷酶NAcase、白細胞酯酶LE達到一定濃度、pH值大于4.5時， 會與各自底物發(fā)生化學(xué)或者水解反應(yīng)，而使過氧化氫11202反應(yīng)墊由無色變?yōu)榧t色或者 紫紅色，唾液酸苷酶NAcase反應(yīng)墊由無色變?yōu)榧t色、紫紅色或藍色，白細胞酯酶LE 反應(yīng)墊由無色變?yōu)樗{綠色、藍色或深藍色，pH反應(yīng)墊由淺藍色變?yōu)樗{色或深藍色。當(dāng) 沒有11202、唾液酸苷酶NAcase、白細胞酯酶LE或者未達到一定濃度，與底物接觸不 發(fā)生以上化學(xué)或者水解反應(yīng)而保持原來的顏色，pH值小于4.5時(正常)反應(yīng)墊變?yōu)辄S色。
操作過程如下
① 將試劑盒從4 3(TC取出，平衡到室溫開始使用；
② 撕掉鋁箔包裝，取出反應(yīng)裝置并輕輕揭掉鋁箔條，將反應(yīng)裝置避光放置，并在當(dāng) 天使用完畢；
③ 用棉簽于陰道后穹窿處旋轉(zhuǎn)10 20秒，以清晰見到棉簽上有分泌物附著為準，先 在反應(yīng)裝置標識有pH的反應(yīng)盲孔中點印一下，立刻觀察結(jié)果，然后加40(Hil稀釋液反 復(fù)擠壓棉簽，使樣品釋出；
④ 在反應(yīng)裝置的其他三個孔中每孔滴加一滴處理過的樣品，約35inl，以沒過反應(yīng)孔 1/2為宜，之后在"唾液酸苷酶"反應(yīng)中滴另一滴"顯色液"；
⑤ 將反應(yīng)裝置放在室溫靜置，過氧化氫H202、唾液酸苷酶NAcase、白細胞酯酶LE 等指標在5~30min內(nèi)判讀結(jié)果，pH值在l~5sec內(nèi)判讀結(jié)果；
A) 過氧化氫反應(yīng)孔呈紅色、紫色為陰性；顯無色為陽性。
B) 唾液酸苷酶反應(yīng)孔不顯色為陰性；顯紅色、紅紫色或藍色為陽性，顯藍色表示 唾液酸酶活性濃度很高。
C) 白細胞酯酶反應(yīng)孔不顯色為陰性。藍綠色為"+"、藍色為"++"、深藍色為
"III"
D) pH反應(yīng)孔顯黃色為陰性，藍色為陽性。
6
權(quán)利要求
1、一種細菌性陰道病聯(lián)合檢測試劑，包括過氧化氫反應(yīng)墊泡液、唾液酸苷酶反應(yīng)墊泡液、白細胞酯酶反應(yīng)墊泡液和pH反應(yīng)墊泡液，其特征在于所述的氧化氫反應(yīng)墊泡液包括如下組分及配比0.1～0.5mM的氯化亞鐵、0.1～0.5mM的淀粉、10～50mg/L的2-羥基-3，5-二氯苯磺酸鈉鹽、300～500U酶活力/L辣根過氧化物酶、體積百分比為0.01％的2-硫基乙醇，緩沖系統(tǒng)為0.1M PB液，該PB液pH為4～5；所述的唾液酸苷酶反應(yīng)墊泡液包括如下組分及配比0.1～1.0mM的5’-溴-2’-氯-吲哚-3’-氧唾液酸苷或5-溴-4-氯-3-吲哚基-α-D-N-乙酰神經(jīng)氨酸或百里酚酞乙酰基神經(jīng)氨酸、0.1～1mg/ml的3-(N-對甲苯磺?；?L-丙氨酰氧基)-吲哚、0.1～1mg/ml的葡萄糖，緩沖系統(tǒng)為0.1M的PB液，該PB液pH為5～6；所述的白細胞酯酶反應(yīng)墊泡液包括如下組分及配比0.5～1.5mM的1-乙?；?5-溴-4-氯吲哚-3-乙酸酯、0.2～1.0mM的乙酸-5-溴-4-氯-3-吲哚氧基酯、0.3～1.5mg/ml的3-(N-對甲苯磺?；?L-丙氨酰氧基)-5-苯基吡咯、0.1～1mg/ml的葡萄糖，緩沖系統(tǒng)為0.1M的PB液，該PB液pH為6～7，所述的pH反應(yīng)墊泡液采用0.02M的氫氧化納溶液溶配成質(zhì)量百分比0.1％～0.5％溴甲酚綠。
2、 根據(jù)權(quán)利要求
1所述的細菌性陰道病聯(lián)合檢測試劑，其特征在于還包括稀釋液， 該稀釋液采用0.01M~0.1M pH 6.9PIPES緩沖液。
3、 根據(jù)權(quán)利要求
l所述的細菌性陰道病聯(lián)合檢測試劑，其特征在于所述的唾液酸 苷酶反應(yīng)墊泡液所用使用的指示劑為0.01M 0.05M氫氧化鈉。
4、 根據(jù)權(quán)利要求
1所述的細菌性陰道病聯(lián)合檢測試劑，其特征在于所述的各反應(yīng) 墊的載體至少采用Whatman3MM玻璃纖維濾紙、Whatman玻璃纖維濾紙、GF/A Whatman 的纖維濾紙Grade3、定量濾紙中的至少一種。
專利摘要
一種細菌性陰道病聯(lián)合檢測試劑，包括過氧化氫反應(yīng)墊泡液、唾液酸苷酶反應(yīng)墊泡液、白細胞酯酶反應(yīng)墊泡液和pH反應(yīng)墊泡液，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于可同時測定多組數(shù)據(jù)，分別反映微生態(tài)環(huán)境、致病菌和分泌物狀況，測定更加全面可靠，同時，操作簡單快速，無需使用儀器設(shè)備，成本較低。
文檔編號C12Q1/28GKCN101487041SQ200910037435
公開日2009年7月22日 申請日期2009年2月26日
發(fā)明者陳文武 申請人:廣州鴻琪光學(xué)儀器科技有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan