專利名稱:利用環(huán)介導等溫擴增技術對脫氧核糖核酸防偽標記進行檢測的方法
技術領域：
本發(fā)明公布了一種脫氧核糖核酸(DNA)防偽標示物的快速鑒定技術。公開了一種利用環(huán)介導等溫擴增技術對脫氧核糖核酸(DNA)防偽標示物進行信號放大從而檢測判定被標示物真?zhèn)蔚姆椒?。本方法可以應用于DNA防偽標示物的快速檢測鑒定。
背景技術：
在產品銷售的時候經常遇到仿造仿冒的問題。此外，如名畫，古董，證件，簽名等需要進行真?zhèn)舞b別的地方均需用到防偽技術以及防偽標示物鑒定技術。現有的防偽技術大多利用技術上的屏障來防止造假者的仿冒。然而這些屏障均可以輕易被有相同技術力量的人仿造。在專利CN 11874550中，發(fā)明者公開了一種利用微量核糖核酸標記目標物并采用PCR技術放大所標記的核酸信號的方法鑒別被標示物的真?zhèn)?。利用這個方法，可以防止具有相同技術力量的人進行仿冒偽造。是目前較為有效的新一代防偽技術。然而，原有方法中對被標示物的檢測過程利用的是聚合酶鏈式反應技術，使用這一技術進行核酸擴增放大需要用到離心機，PCR儀，電泳儀，凝膠成像系統(tǒng)等一系列專業(yè)分子生物學儀器。這些儀器都非常昂貴，并且需要受過訓練的專業(yè)人員來操作，這使得該最終判斷一個被標示物的真?zhèn)稳匀恢荒芩突貙I(yè)實驗室進行，此外，使用聚合酶鏈式反應進行核酸擴增并進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定結果需要2 3小時，不僅需要操作人員有熟練的分子生物學操作技術，還需要操作人員長時間接觸致癌物溴化乙錠等對健康有嚴重影響的有毒有害化學物質。同時由于這個技術的內在缺點，需要開管取出PCR產物進行電泳進行結果判讀，無法從根本上回避常見的PCR產物氣凝膠污染的問題。只要操作人員稍有不慎，就可能由于交叉污染造成假陽性的結果。以上種種缺點使得利用聚合酶鏈式反應檢測核酸標示物的方法在實際推廣應用上受到嚴重的限制。
隨著技術的進步，核酸擴增技術出現了一種和聚合酶鏈式反應技術截然不同的技術:環(huán)介導等溫擴增技術(loo·p-mediated isothermal amplification,LAMP)。環(huán)介導等溫擴增技術主要利用了 Bst DNA聚合酶能將新生成的核酸單鏈從新合成的DNA雙鏈上置換下來的機理，實現在一個恒定不變溫度下進行核酸擴增。關于這項技術的詳細的反應機理以及其和聚合酶鏈式反應的不同可參見專利CN 100422323C (授權號)和CN 101173317A (公開號)。

發(fā)明內容
在本發(fā)明中公開了一種利用環(huán)介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermalamplification, LAMP)對脫氧核糖核酸(DNA)防偽標示物進行信號放大從而檢測判定被標示物真?zhèn)蔚姆椒?。相比原來專利中使用的聚合酶鏈式反應技術(polymerase chainreaction, PCR)，LMAP反應有著完全不同的反應機理和反應要求。其最主要的特點是等溫鏈替換擴增。這使得一個簡單廉價的小型恒溫裝置就可以完成反應。如小型金屬浴裝置，小型水浴裝置或者小型烘箱。而聚合酶鏈式反應則復雜的多，其反應管需要在三個不同的反應溫度間(變性，退火，延伸)循環(huán)保溫。這使得其反應依賴昂貴的熱循環(huán)儀(PCR儀)而無法大規(guī)模的推廣。
環(huán)介導等溫擴增技術需要對目標基因的六個位置設置4個引物或者6個引物，利用特定的具有鏈置換活性的DNA聚合酶Bst酶在等溫的條件下使目標基因實現高效擴增。而根本不需要進行傳統(tǒng)的的熱循環(huán)。其產物為梯狀的多種不同長度的DNA片段組成。在這一點上和PCR反應等長的產物有著顯著的不同。相比PCR技術，LAMP技術更適合于應用到有大量樣品的，非實驗室的檢測場所。其不僅幾乎不需要專業(yè)儀器，而且操作上更為簡單，對操作人員技術要求更低。不僅如此，其反應時間大為加快，可在一小時左右完成真?zhèn)舞b定。
此外，LAMP技術要求4對或者6對引物，對序列的特異性更高。不僅如此，環(huán)介導等溫擴增技術還具有更高的靈敏度，其靈敏度甚至超過傳統(tǒng)認為最高靈敏的巢式聚合酶鏈式反應3個數量級，參見CN 101173317A(公開號)。這意味著，使用這項技術進行核酸擴增，可以大量減少初始標記所需的脫氧核糖核酸用量，甚至不需要將其保存在介質中而可以直接標記在產品或者 產品包裝的某個隱蔽處，從而相應增加對偽造者發(fā)現標記的困難程度與試圖強行破解時的造假成本。
在前有專利CN 11874550中，其發(fā)明人使用了瓊脂糖凝膠電泳的方法對聚合酶鏈式反應的結果進行判讀。這樣的方法不僅耗時費力，而且需要操作人員有熟練的分子生物學操作技術，還需要操作人員長時間接觸致癌物溴化乙錠等對健康有嚴重影響的有毒有害化學物質。同時由于這個技術的內在缺點，需要開管取出PCR產物進行電泳進行結果判讀，無法從根本上回避常見的PCR產物氣凝膠污染的問題。只要操作人員稍有不慎，就可能由于交叉污染造成假陽性的結果。以上種種缺點使得利用聚合酶鏈式反應檢測核酸標示物的方法在實際推廣應用上受到嚴重的限制。
本發(fā)明的目的在于提供一種改進的，無需PCR儀以及凝膠成像系統(tǒng)等貴重儀器的，基于環(huán)介導的等溫擴增技術對脫氧核糖核酸標示物進行檢測判定真?zhèn)蔚姆椒?。相比于以前使用的聚合酶鏈式反應檢測并電泳判定真?zhèn)蔚姆椒ǎ痉椒ň哂锌旖莺啽悴灰蕾噧x器的優(yōu)點。并且通過熒光染料顯示結果，可以直接肉眼判斷檢測，而無需電泳和凝膠成像系統(tǒng)拍照。使用本方法，可以在不依賴PCR儀的情況下快速對具有DNA防偽標記的產品進行真?zhèn)舞b別。由于環(huán)介導的等溫擴增技術的高靈敏度與高特異性，可以減少標記目標物所需要的脫氧核糖核酸量，從而相應提高仿造破解的困難度。同時還提高了檢測反應的準確率。
本發(fā)明是這樣實現的:一種檢測目標物上的脫氧核糖核酸標示物的檢測方法，其特征在于，利用環(huán)介導的等溫擴增技術來進行。該檢測方法包括如下步驟，
I)切下或者割下被標示物的含有脫氧核糖核酸部位的一小部分，使用研缽粉碎。如果標示物保存在介質中，則取下保存介質，使用研缽粉碎；
2)使用標準分子生物學脫氧核糖核酸提取辦法提取總脫氧核糖核酸；
3)采用環(huán)介導等溫擴增技術對所標示的脫氧核糖核酸進行擴增；
4)采用熒光染料顯示擴增結果；
5)根據熒光染料的顏色變化判斷被標示物的真?zhèn)巍?br>由于環(huán)介導的等溫擴增技術的高靈敏度與高特異性，可以提高了檢測反應的準確率，同時減少標記目標物所需要的脫氧核糖核酸量，從而相應提高仿造破解的困難度。同時由于其高靈敏度，使得不需介質保護的DNA直接標記的方法成為可能。
LAMP反應中的引物FIP，BIP, F3，B3需要根據初始所標記的不同脫氧核糖核酸片段的特異序列來設計，一般情況下，不同的被標示物選擇不同的標示脫氧核糖核酸序列，一般情況下選擇對人類日常接觸的無害的生物來源脫氧核糖核酸，如水稻，番茄，白菜等常見食物的脫氧核糖核酸片段。不同的脫氧核糖核酸序列需要設計不同的LAMP引物來進行擴增。其一般設計過程以及設計要點如下:從美國國家生物技術中心網站上的數據庫檢索下載所要標記的脫氧核糖核酸序列(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/),將該序列保存為Fasta格式。提交到網頁http:/primerexplorer.jp/lamp上的軟件輸入窗口，設置GC含量退火溫度等參數之后點擊生成按鈕，服務器會自動生成所提交序列的特異性環(huán)介導等溫擴增引物 FIP，BIP，F3，B3。
以下結合具體實施例和附圖對本發(fā)明做進一步說明。


圖1:顯示從保存于聚碳酸酯介質中回收標記脫氧核糖核酸并以環(huán)介導的等溫擴增技術進行信號放大后直接以鈣黃綠素判斷結果的實施例。
圖2:顯示從保存于聚碳酸酯介質并以環(huán)介導的等溫擴增技術進行信號放大后直接以SYBR green判斷結果的實施例。
圖3:顯示從直接標記脫氧核糖核酸并以環(huán)介導的等溫擴增技術進行信號放大后直接以鈣黃綠素判斷結果的實施例。
具體實施方式

實施例1檢測以聚碳酸酯為介質的脫氧核糖核酸標記物并以鈣黃綠素顯色。
首先選擇合適的脫氧核糖核酸標記序列。在本實驗例中，以pGEM T easy質粒(購白piOmega公司)上的一段456bp的片段作為標示序列。其全序列如下:
> Fl
Aaattgtaagcgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctcatttttta
accaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagtg
ttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaa
ccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcaccctaatcaagttttttggggtcgaggt
gccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccgg
cgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtag
cggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgt
SEQ ID NO:1
將上述序列保存為一 TXT文本文件，命名為F1.txt
將該文本文件上傳至網站服務器http:/primerexplorer.jp/lamp,選擇默認參數點擊引物設計，生成兩個可行的LAMP引物，選擇其中之一按confirm按鈕。得到如下數據。
F3 AAAGGGCGAAAAACCGTCTASEQ ID NO:2
B3 CGCTCCTTTCGCTTTCTTCCSEQ ID NO:3[0036]FIP CTTTACGGCACCTCGACCCCGATGGCCCACTACGTGAACSEQ ID NO:4
BIP ATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCTTTCTCGCCACGTTCGSEQ ID NO:5
將表格中的F3，B3，FIP BIP的脫氧核糖核酸序列發(fā)送給引物合成公司如上海生工公司委托其進行DNA合成。
將0.5 μ g pGEM T easy質粒(購買自Promega公司)直接按照專利CNll8M55O內公開的方法以聚碳酸酯為介質標記于塑料膜上。并放置于陽光下一天后回收。
將含有脫氧核糖核酸的介質取下,用500 μ I氯仿溶解。加入500 μ I Tris-EDTA溶液進行抽提。離心12000rpm 5分鐘，將上清移到新管，用無水乙醇沉淀。離心12000rpm5分鐘。將沉淀用70%乙醇洗兩次,用20 μ I雙蒸水重新溶解。標記為樣品2。作為對照，取另一沒有含有脫氧核糖核酸的介質，按照上述程序處理，標記為樣品I。
從樣品I和樣品2中各取出2μ I到一新0.5ml小離心管，再加入50 μ I反應液(成分如下)。關上離心管蓋。將管子放入65度小型恒溫金屬浴裝置保溫I小時。隨后將管子取出，如果管子內液體變?yōu)榫G色，則說明樣品內含有原始標記的脫氧核糖核酸。如果液體顏色不變，則樣品內不含有原始標記的脫氧核糖核酸。在本實驗中，如附圖所顯示，樣品I管內液體仍然為透明無色，說明其中沒有含有原始標記的脫氧核糖核酸，而樣品2中的液體變?yōu)榫G色，說明其中含有原來標記的脫氧核糖核酸。
反應液成分

Tris buffer (pH 8.8)200πιΜ
KCl30mM
MgSO430mM
~(NH4)2SO420π Μ
Tween 200.2%
甜菜堿ΓθΜ
dNTPs4πιΜ
MnCl2ImM
勞光指示劑媽黃綠素50mM
引物 FIPSOpmol
引物 BIPSOpmol
引物 F3ISpmol
引物 B3ISpmol
Bst DNA聚合酶20U
實施例2檢測以聚碳酸酯為介質的脫氧核糖核酸標記物并以SYBR green顯色[0045]首先選擇合適的脫氧核糖核酸標記序列。在本實驗例中，以pGEM T easy質粒上的一段456bp的片段作為標示序列。其全序列如下:
> Fl
Aaattgtaagcgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctcatttttta
accaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagtg
ttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaa
ccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcaccctaatcaagttttttggggtcgaggt
gccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccgg
cgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtag
cggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgt
SEQ ID NO:1
將上述序列保存為一 TXT文本文件，命名為F1.txt
將該文本文件上傳至網站服務器http:/primerexplorer.jp/lamp,選擇默認參數點擊引物設計。生成兩個可行的LAMP引物，選擇其中之一按confirm按鈕。得到如下數據。
F3 AAAGGG CGAAAAACCGTCTASEQ ID NO:2
B3 CGCTCCTTTCGCTTTCTTCCSEQ ID NO:3
FIP CTTTACGGCACCTCGACCCCGATGGCCCACTACGTGAAC SEQ ID NO:4
BIP ATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCTTTCTCGCCACGTTCG SEQ ID NO:5
將表格中的F3，B3，FIP BIP的脫氧核糖核酸序列發(fā)送給引物合成公司如上海生工公司委托其進行DNA合成。
將0.5μ g pGEM T easy質粒直接按照專利CNl 1874550內公開的方法以聚碳酸酯為介質標記于塑料膜上。并放置于陽光下一天后回收。
將含有脫氧核糖核酸的介質取下，用500 μ I氯仿溶解。加入500 μ I Tris-EDTA溶液進行抽提。離心12000rpm 5分鐘，將上清移到新管，用無水乙醇沉淀。離心12000rpm5分鐘。將沉淀用70%乙醇洗兩次,用20 μ I雙蒸水重新溶解。標記為樣品2。作為對照，取另一沒有含有脫氧核糖核酸的介質，按照上述程序處理，標記為樣品I。
從樣品I和樣品2中各取出2μ I到一新0.5ml小離心管，再加入50 μ I反應液(成分如下)。關上離心管蓋。將管子放入65度小型恒溫金屬浴裝置保溫I小時。隨后將管子取出，如果管子內液體變?yōu)榫G色，則說明樣品內含有原始標記的脫氧核糖核酸。如果液體顏色不變，則樣品內不含有原始標記的脫氧核糖核酸。在本實驗中，如附圖所顯示，樣品I管內液體仍然為橙紅色，說明其中沒有含有原始標記的脫氧核糖核酸，而樣品2中的液體變?yōu)榫G色，說明其中含有原來標記的脫氧核糖核酸。
反應液成分
權利要求
1.一種利用環(huán)介導的等溫擴增技術對含有脫氧核糖核酸標示物的被標示物進行檢測判定真?zhèn)蔚姆椒?，其特征在于，該方法包含下列步驟: 1)切下或者割下被標示物的含有脫氧核糖核酸部位的一小部分，使用研缽粉碎；如果標示物保存在介質中，則取下保存介質，使用研缽粉碎； 2)使用標準分子生物學脫氧核糖核酸提取辦法提取總脫氧核糖核酸； 3)采用環(huán)介導等溫擴增技術對所標示的脫氧核糖核酸進行擴增； 4)采用熒光染料顯示擴增結果； 5)根據熒光染料的顏色判斷被標示物的真?zhèn)危? 進行擴增的檢測引物組為SEQIDNO:2,SEQIDN0:3,SEQIDN0:4和SEQIDN0:5所示序列。
2.如權利要求
1所述的一種利用環(huán)介導的等溫擴增技術對含有脫氧核糖核酸標示物的被標示物進行檢測判定真?zhèn)蔚姆椒?，其特征在于，所述的環(huán)介導的等溫擴增技術擴增過程為使用某一恒定溫度進行30分鐘至I小時之間的保溫；所述某一恒定溫度，為60至65°C之間任一溫度。
3.如權利要求
1所述的一種利用環(huán)介導的等溫擴增技術對含有脫氧核糖核酸標示物的被標示物進行檢測判定真?zhèn)蔚姆椒?，其特征在于，所述的步驟4)所采用的熒光染料為雙鏈DNA結合熒光染料SYBR gre en或金屬螯合劑鈣黃綠素。
專利摘要
本發(fā)明屬于防偽領域。公開了一種利用環(huán)介導等溫擴增技術對脫氧核糖核酸(DNA)防偽標示物進行信號放大從而檢測被標示物真?zhèn)蔚姆椒?。該方法不需要使用PCR儀和凝膠成像系統(tǒng)等專業(yè)分子生物學儀器，并可肉眼直接判定檢測真?zhèn)谓Y果。由于環(huán)介導的等溫擴增技術的高靈敏度與高特異性，不但提高了檢測反應的準確率，還同時減少標記目標物所需要的脫氧核糖核酸量，從而相應提高仿造破解的困難度，甚至可以實現無需介質保護的脫氧核糖核酸直接標記目標物。本發(fā)明由此提供了一種改進的快捷簡便檢測DNA防偽標示物的方法以及無介質保護的DNA標示目標物的方法。
文檔編號C12Q1/68GKCN101831489 B發(fā)布類型授權 專利申請?zhí)朇N 200910037774
公開日2013年10月2日 申請日期2009年3月11日
發(fā)明者不公告發(fā)明人 申請人:孫星江導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (2),