專利名稱：:亞麻微衛(wèi)星dna標記的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種亞麻微衛(wèi)星DNA標記，適用于亞麻品種分類、遺傳關系鑒定和輔助育種。技術背景微衛(wèi)星(Microsatellite)，又稱為簡單序歹隨復(simplesequencer印eat，SSR)或短串聯(lián)重復(shorttandemr印eat，STR)，是以少數(shù)幾個核苷酸(1一6個)為重復單位的串聯(lián)重復DNA序列。由于微衛(wèi)星具有高水平的雜合性和突變率、雙親遺傳模式等優(yōu)勢，加之便于檢測，費用低廉，因此廣泛用于遺傳圖譜構建、基因定位、標記輔助育種、家系分析、品種鑒定以及進化分析等研究。如用微衛(wèi)星標記研究櫻桃品種間的親緣關系(艾呈祥等，2007，果樹學報，24(4):460465)、用微衛(wèi)星DNA標記進行豬品種分類的專利申請"適于豬品種分類的豬微衛(wèi)星DNA標記"(公開號CN1370834A)。亞麻(LinumusitatissmumL.)是亞麻禾斗(Linaceae)亞麻屬(Linum)的一年生草本纖維植物，已經(jīng)有六七千年的栽培歷史。亞麻既是世界第3大纖維作物，又是5大油料作物之一。作為一種重要的經(jīng)濟作物，亞麻在微衛(wèi)星分子標記方面的研究遠遠滯后于其他作物，大豆、棉花、水稻、葡萄、花生的SSR標記已有許多研究，并公開發(fā)表了大量可以直接利用引物序列，而現(xiàn)有亞麻的微衛(wèi)星標記數(shù)量非常有限，僅有法國科學家Roose-Amsaleg等分離的28個微衛(wèi)星標記(Roose-AmsalegC等，2006，MolecularEcologyNotes,6(3):796本發(fā)明旨在分離克隆微衛(wèi)星DNA標記，建立亞麻的微衛(wèi)星DNA的技術體系并利用這些分子標記進行品種分類，遺傳關系分析和輔助育種。實現(xiàn)上述發(fā)明目的的技術方案包括亞麻(CT)和(GT)n微衛(wèi)星富集文庫的構建、含微衛(wèi)星序列的陽性克隆的篩選及測序，得到17個含有(CT)和8個含有(GT)的微衛(wèi)星克隆，確定了25個多態(tài)性豐富的微衛(wèi)星標記LU1、LU2、LU3、LU4、LU5、LU6、LU7、LU8、LU9、LUIO、LUll、LU12、LU13、LU14、LU15、LU16、LU17、L脂、LU19、LU20、LU21、LU22、LU23、LU24、LU25;LU1為214個核苷酸、LU2為265個核苷酸、LU3為328個核苷酸、LU4為250個核苷酸、LU5為173個核苷酸、LU6為202個核苷酸、LU7為363個核苷酸、LU8為199個核苷酸、LU9為206個核苷酸、LU10為270個核苷酸、LU11為511個核苷酸、LU12為196個核苷酸、LU13為302個核苷酸、LU14為196個核苷酸、LU15為393個核苷酸、LU16為314個核苷酸、LU17為369個核苷酸、LU18為394個核苷酸、LU19為356個核苷酸、LU20為305個核苷酸、LU21為462個核苷酸、LU22為249個核苷酸、LU23為308個核苷酸、LU24為258個核苷酸、LU25為616個核苷酸。圖1是用LU1位點的特異性引物擴增8個亞麻品種DNA的PAGE電泳圖。圖2是用LU2位點的特異性引物擴增8個亞麻品種DNA的PAGE電泳圖。圖3是用LU3位點的特異性引物擴增8個亞麻品種DNA的PAGE電泳圖。圖4是用LU4位點的特異性引物擴增8個亞麻品種DNA的PAGE電泳圖。圖5是用LU5位點的特異性引物擴增8個亞麻品種DNA的PAGE電泳圖。圖6是用LU6位點的特異性引物擴增8個亞麻品種DNA的PAGE電泳圖。圖7是用LU7位點的特異性引物擴增8個亞麻品種DNA的PAGE電泳圖。圖8是用LU8位點的特異性引物擴增8個亞麻品種DNA的PAGE電泳圖。圖9是用LU9位點的特異性引物擴增8個亞麻品種DNA的PAGE電泳圖。圖10是用LU10位點的特異性引物擴增8個亞麻品種DNA的PAGE電泳圖。圖11是用LU11位點的特異性引物擴增8個亞麻品種DNA的PAGE電泳圖。圖12是用LU12位點的特異性引物擴增8個亞麻品種DNA的PAGE電泳圖。圖13是用LU13位點的特異性引物擴增8個亞麻品種DNA的PAGE電泳圖。圖14是用LU14位點的特異性引物擴增8個亞麻品種DNA的PAGE電泳圖。圖15是用LU15位點的特異性引物擴增8個亞麻品種DNA的PAGE電泳圖。圖16是用LU16位點的特異性引物擴增8個亞麻品種DNA的PAGE電泳圖。圖17是用LU17位點的特異性引物擴增8個亞麻品種DNA的PAGE電泳圖。圖18是用LU18位點的特異性引物擴增8個亞麻品種DNA的PAGE電泳圖。圖19是用LU19位點的特異性引物擴增8個亞麻品種DNA的PAGE電泳圖。圖20是用LU20位點的特異性引物擴增8個亞麻品種DNA的PAGE電泳圖。圖21是用LU21位點的特異性引物擴增8個亞麻品種DNA的PAGE電泳圖。圖22是用LU22位點的特異性引物擴增8個亞麻品種DNA的PAGE電泳圖。圖23是用LU23位點的特異性引物擴增8個亞麻品種DNA的PAGE電泳圖。圖24是用LU24位點的特異性引物擴增8個亞麻品種DNA的PAGE電泳圖。圖25是用LU25位點的特異性引物擴增8個亞麻品種DNA的PAGE電泳圖。具體實施方式1、亞麻微衛(wèi)星富集文庫的構建。(l)以亞麻品種白花幼苗為材料，采用改進的CTAB法(參見鄧欣等，2007，中國麻業(yè)科學，29(4):184188)提取亞麻基因組DNA。用限制性內切酶JfeeI酶切10"g亞麻基因組DNA，酶切產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(TIANGEN)回收300-1500bp的DNA片段。(2)將堿基互補的寡核苷酸primerA(5'-AGATGGAATTCGTACACTCGT-3')和primerB(5'-TAACGAGTGTACGAATTCCATCT-3')等摩爾混合，95。C變性5min，6(TC退火1h，形成具有粘性末端的接頭。(3)將酶切產(chǎn)物和接頭用LDNA連接酶連接。連接產(chǎn)物用酚/氯仿/異戊醇(25:24:l)抽提一次，離心收集上清液在上清液中加0.3M醋酸鈉(pH5.2)和2倍體積冰乙醇純化沉淀DNA，加入15UL去離子水溶解。(4)接頭連接片段的PCR擴增連接產(chǎn)物以primerA為引物進行PCR擴增。用普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒(TIANGEN)純化PCR產(chǎn)物，并將其濃縮至15uL。(5)用生物素標記的探針(CT)15和(GT),5分別與純化的接頭連接DNA片段雜交。具體操作為建立50uL雜交混合液反應體系含5"L探針(IOumolL0,5liLprimerA，15uL20XSSC，10%SDS0.5uL及12.5uLddH20，68'C預熱。將15uL連接產(chǎn)物DNA片段于95"C變性5min，再加預熱的雜交混合液，于68"C雜交1h。(6)將雜交混合液加入100uL鏈霉親和素包被的磁珠(DynalM-280)中，于25。C溫育20min。(7)用磁力架吸附磁珠，棄上清。依次用200UL洗液I、洗液I1(3XSSC，0.1%SDS)、洗液III(6XSSC)洗滌磁珠，去除不含微衛(wèi)星的序列。方法是用洗液I在室溫洗2次，每次靜置8min;洗液II在68'C洗2次，每次靜置15min;洗液III在室溫快速洗2次。(8)用O.1XTE200PL在室溫快速洗2次，加入O.1XTE50uL，95°C變性10min，小心吸取上清，上清液即含有微衛(wèi)星序列的單鏈DNA，以primerA為引物，以單鏈DNA為模板進行PCR擴增獲得雙鏈目的片段。(9)將擴增產(chǎn)物純化后連接到pMD18-T載體(大連寶生物)上，然后將連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌ToplO感受態(tài)細胞(TIANGEN)，轉化液涂抹在含有IPTG和X-gal的LB固體培養(yǎng)基平板上進行藍白斑篩選，得到微衛(wèi)星基因組文庫。2、含微衛(wèi)星序列的陽性克隆的篩選、測序及微衛(wèi)星引物的設計。(1)挑取白色單菌落接種到lmLLB培養(yǎng)液中，于37'C培養(yǎng)過夜。(2)以菌洲為模板，采取PIMA方法(參見Lunt等，MolecularEcology,8:891-894)篩選含有(CT)n和(GT)n微衛(wèi)星序列的陽性克隆。(3)將陽性克隆測序，分析是否含有(CT)?；?GT)重復序列。(4)根據(jù)微衛(wèi)星重復序列兩側的保守序列設計引物。(5)測序結果采用SSRHunter1.3軟件分析序列，并用BioeditSequenceAlignmentEditor軟件對所有序列進行比對分析、歸類，再用PremierPrimer5.0軟件進行引物設計。對高度相似的一類微衛(wèi)星序列設計特異引物，對進一步篩選的陽性克隆進行第二次PCR擴增，以提高篩選效率。3、利用亞麻微衛(wèi)星DNA標記分析亞麻品種間的遺傳差異。將上述微衛(wèi)星標記用于8個亞麻品種的分類，確定了25個多態(tài)性豐富、適用于亞麻品種分類的微衛(wèi)星標記LU1、LU2、LU3、LU4、LU5、LU6、LU7、LU8、LU9、LU10、LUll、LU12、LU13、LU14、LU15、LU16、LU17、LU18、LU19、L腦、LU21、LU22、LU23、LU24、LU25(表l)。具體操作過程如下(1)按鄧欣等的方法(參見鄧欣等，2007，中國麻業(yè)科學，29(4):184188)提取各個亞麻品種的DNA作為模板，進行PCR。(2)分別用LU1、LU2、LU3、LU4、LU5、LU6、LU7、LU8、LU9、LUIO、LUll、LU12、LU13、LU14、LU15、LU16、LU17、LU18、LU19、LU20、LU21、LU22、LU23、LU24、LU25。25個位點的25對引物(引物序列見表l)擴增這8個亞麻品種的醒o(3)將PCR產(chǎn)物在8%的丙烯酰胺凝膠上電泳，讓后進行銀染并拍照，得到圖1-25。(4)結果分析每個一篇的擴增條帶按有或無記錄，擴增條帶存在時賦值為1，否則賦值為1。采用SPSS10.1forwindows統(tǒng)計分析軟件中的系統(tǒng)聚類分析程序，距離測量選用相關系數(shù)距離法，用類間平均連鎖法(Between-groupslinkage)進行聚類分析并建立系統(tǒng)樹。由附圖1-25可看出，本發(fā)明的25個微衛(wèi)星位點的序列長度在供試的8個品種中都出現(xiàn)多態(tài)性，由此可見，本發(fā)明的這25個微衛(wèi)星標記能用于亞麻品種分類和遺傳關系分析。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表1中F表示5'端引物，R表示3'端引物。本發(fā)明提供了25個亞麻微衛(wèi)星位點的DNA序列及擴增上述25個亞麻微衛(wèi)星位點的引物序列和擴增方法，25個亞麻微衛(wèi)星位點用于亞麻品種分類、遺傳關系分析和標記輔助育種，重復性好，是一種可靠有效的分子標記。SEQUENCELISTING<110>中國農業(yè)科學院麻類研究所<120>亞麻的DNA分子遺傳標記<130>亞麻的DNA分子遺傳標記<160>25<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>214<220><221>重復<222>(107)..(165)<400>13C3cttccctclatctctctctattcctctccccctcttcatctctctccccccctctccctcgctcttttcttctctctccccctctctccctcgctctcttctcctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctttctctctctctgcaaccatttgtgtaattagggagaagtcctaatagctcccccttact<210>2<211>265<212>DNA<213>亞麻<220><221>重復<222>(54)..(97)<400>2atgttggcctgtttggttaggttggaattcgctcggtctctctccttctctgactctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctcttgctgccactctgaacttggcactttccgcctcacctgagacctac33cggcggctacgccacaaaactctgtcctcgg3tcttacggttcgtttcttgtctttatcattcccttctgctatatctccttgtttgtttacagaac3atct3t3cctccccggctctgt<210>3<211>328<212>DNA60120化O21460120180240265<213>亞麻<220><221>重復<222>(119)..(160)<400>3C3ggggccgatttcg3cggc3gtgcc33g3ccatgscggcaagtggagcaacg3tgg33t60tctaatcccaaggggccaagtttggttaggttggaattcctcgccaagggcccactgact120ctctctctctctctctctctctctctctctctctctctcttgctgccactctgaaagggg180ccctttccgcctcacctgagacctacaacggcggctacgccacaaaactctgtcctcgga240tcttacggttcgtttcttgtctttatcattcccttctgctatatctccttgtttgtttac300agaacaatctatacctccccggctctgt328<210>4<2">250<212>DNA<213>亞麻<220><221>重復<222>(113)..(178)<400>4aaaattgggcgtgggggc3gacctacgttacgtcgtatat3gtagcttagctagctttgs60tacttctctatcagttggaactgcgaattcctccttgggactctctactcatctctctct120ctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctgt180gaattctaaaagactggaaacaaacaggggaaagagaggaagaagaagtagaagaaggac240tacaattact250<210>5<211>173<212>DNA<213>亞麻<220><221>重復<222>(40)..(115)<400>5tcttcatctctctccccccctctccctcgctcttttcttctctctccccctctctccctc60gctctcttctcctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctttctc120tctctgcaaccatttgtgtaattagggagaagtcctaatagctcccccttact173<210>6<211>202<212>DNA<213>亞麻<220><221>重復<222>(49)..(150)<400>6gacccctccactccctttattcccctttgcttccaactcaccccttccctctctctctct60ctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctct120ctctctccctctctctctctctctctctctatttcctccccttcttctct謹ttat180ttttttttatttctccctctct202<210>7<2">364<212>DNA<213>亞麻<220><221>重復<222>(261)..(308)<400>7accgtactgcattttggcaggagtcacaagtggtacgaaccagattggtggaaattcggt60aacaagaaatcgtaagttgctctttctccataaccattttcagtctcaactacttgctcg120tcccaattggagatgttcagtsggccttttcagcaattgatttctttctctctaacsggt180actttcgccatgctcccggcgsgatgtatgtcctgtcaca3gccctcgct3agttc3t3t240cgatcaacaggtgagctcatctctctctctctctctctctctctctctctctctctctct300ctctctccacctttcgattctcccactacaagttaccgagttgagccacattctaagcga360get363<210>8<211>199<212>DNA<213>亞麻<220><221>重復<222>(108)..(151)3C3cttccctct3tctctctctattcctctccccctcttc3tctctctcccccccctctc60cctcgctcttttcttctctctccccctctctccctcgctctcttctcctctctctctctc120tctctctctctctctctctttctctctctctgcaaccatttgtgtaattagggagaagtc180ct33t3gctcccccttsct199<210>9<211>206<212>DNA<213>亞麻<220><221>重復<222>(75)..(158)<400>9acacttccctccatctctctctattcctctccccctcttcatctctctccccccctctcc60ctcgctcttttcttctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctct120ctctctctctctctctctctctctctttctctctctctgcaaccatttgtgtaattaggg180agaagtcctaatagctcccccttact206<210>10<211>270<212>DNA<213>亞麻<220><221>重復<222>(151)..(夠<400>10aatttaaggctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctc60tctctctctctctctctctctttctttttt3tttactgagagggtcgcagtcgcaggggg120ggtccgtgtcctgcagccgttagctgcccactctctctctctctctctctctctctctct180ctctctgtttctgcagcctgcagcccagcagccagccaaccagcctgcagccttctcaca240atcgcagcttcaagaaattcatcattcact270<210>11<211>511<212>DNA<213>亞麻<220><221>重復<222>(128)..(147)<400>11aatgttgggaagcagca3g3cttgcggttggc33agttctggstgcsggggggtg33tgt60tatctagttctttgttatttttccatttttattcttcttcttgtgagatgtttggattgt120gtgttagctctctctctctctctctctgcatatttgttacccccttctcccttatggctt180atactgacttgacttgtgggagtatttgccttctgtatgttaggaaactgtttttttgta240atggattg3tt3tgt33tsg33t3ttgtatcttggtctttac3tttgggctttcgggtcs300agggatccgacaatcaagcccsttcccacccttcaacgtcggccctttcgactgggtttc360gcggcccgtacatggtatcatatctgggatatttgtcaaggttgatgtagagaggtttgt420tctcaccctatgtcacctcccacgagataactatggtttaatgattgggagtcataggct480ataactcaatggagtacccagtctcatg3tt511<210>12<2">196<212>DNA<213>亞麻<220><221>重復<222>(112)..(123)<400>12asaattgggcgtgggggcagacctacgttscgtcgtatatagt3gctt3cctsgctttgs60tacttctctatcagttggaactgcgaattcctccttgggactctctactcatctctctct120ctctgtgaattctaaasgactgg33acaaacagggga33gagsggaagsaga3gtag3ag180aaggactacaattact196<210>13<211>302<212>DNA<213>亞麻<220><221>重復<222>(191),.(241)<400>13ataataacaatagagtagcttcatttacacctacgaactgscacaaccgttggacacttt60ccaacgtgacaaatcctctaa3cttat3gtgacaagasctagtgttctacaata3t3gag120ttgcgatcaag3tcaacac3ctccgtcgstctcaccgacttaccsagggtscctacgctc180actcactcattctctctctctctctctctctctctctctctctccctctctctctctctc240ttcgaacactacctaagagcttttcatccgaaaccttctt3gtgacaatatgatcacact300at302<210>14<211>196<212>DNA<213>亞麻<220><221>重復<222>(98)..(143)<400>14aattcctgat3tagta33ctgtc3cctttccagaggtctcggc33gcattC3tttggcgc60ctctcccactctctgtctcttcagtcttccaagttcatctctctctctctctctctctct120ctctctctctctctctctctctcgaatcttcgaaatctttcgtttctcttgacaccattg180ttggccttctgatcat196<210>15<211>393<212>DNA<213>亞麻<220><221>重復<222>(85)..(130)<400>15acatagatggtcatttecgtttcatgcgggcctttcctttcaccgacgccg3c3actccc60cttcatcctctctcacatcctgacctctctctctctctctctctctctctctctctctct120ctctctctctttcttagtttcccttccaaccaaatcatactatcaaattcaaaccc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U19、LU20、LU21、LU22、LU23、LU24、LU25二十五個位點的引物序列為UJ1-F:CTCGCTCTTTTCTTCTCTCTCLU1-R:GGACTKCTCCCTAATTACACALU2-F:CCTGTTTGGTTAGGTTGGAATLU2陽R:AGCCGCCGTTGTAGGTCTCALU3-F:GGGCCAAGTTTGGTTAGGTTLU3陽R:GCCGTTGTAGGTCTCAGGTGUJ4陽F:TCCTCCTTGGGACTCTCTACTCm4國R:CCCTGTTTGTTTCCAGTCTTTTLU5-F:CTCCCTCGCTCTTTTCTTLU5-R:GGGGGAGCTATTAGGACTTUJ6畫F:CCTTTGCTTCCAACTCACCCLU6陽R:AAAAAGAGAAGAAGGGGAGGLU7-F:TCACAAGCCCTCGCTAAGTTCLU7畫R:AGAATGTGGCTCAACTCGGTUJ8-F:CCTCGCTCTTTTCTTCTCTCLU8-R:GGGGAGCTATTAGGACTTCTLU9-F:CTCTCCCTCGCTCTTTTCTTLU9-R:GGGGGAGCTATTAGGACTTCTLU10畫F:TACTGAGAGGGTCGCAGTCGLU10畫R:AAGCTGCGATTGTGAGAAGGLU11-F:ATGTTGGGAAGCAGCAAGACTLUl1畫R:CCATAAGGGAGAAGGGGGTALU12隱F:TGGGGGCAGACCTACGTTACLUl2-R:CCCCTGTTTGTTTCCAGTCTTTIAJ13-F:TGACACAACCGTTGGACACTLU13-R:GAAGGTTTCGGATGAAAAGCLU14-F:GTCTCGGCAAGCATTCATTTLU14-R:GCCAACAATGGTGTCAAGAGLU15-F:CCCCTTCATCCTCTCTCACALU15-R:TTTGCTTGGGAAGATCAGGTTGUJ16-F:TCCTTTCTTTCCAGTTCTCACCLU16-R:GCATTTCCCAGGCATCAALU17-F:GTGTGGGAATTGGACACTTGLU17-R:CAAACCGAAGAGGCAAGAAGLU18-F:GTGCGGCTGAGGACGATTTUJ18-R:CCAGCCACTACAGCACCACTLU19-F:CTGAGTGCGAAAGCCTATTGLU19-R:TACTGCCCTCTTCCACCTGALU20-F:CCATTGATGTGATGCCTGAGLU20-R:GGTGGGAGTATGATAGTCGTTTCLU21-F:CACCACAGAATCAAGAGAAATCCUJ21-R:TGACCCACCATCTTGTTCTTTCUJ22-F:TGTTGCCAAAGACTGCATTTLU22-R:CATGGAGGTGTTGAAAACGALU23-F:AAGAGGGCACCTGAACTTTGLU23-R:GACAAAACAAGCCTCCTTGGLU24國F:TCCCTTTATTCCCCTTTGCTLU24-R:AGACAGAACCGCAGTCATCGUJ25隱F:CTTGGCTCGATGTTTCCTTGLU25-R:GTATACACCGCCACGTTTCC。專利摘要本發(fā)明公開了一種亞麻微衛(wèi)星DNA標記，提供了25個亞麻微衛(wèi)星位點的DNA序列及擴增了上述25個亞麻微衛(wèi)星位點的引物序列和擴增方法，25個亞麻微衛(wèi)星位點用于亞麻品種分類、遺傳關系分析和標記輔助育種，重復性好，是一種可靠有效的分子標記。文檔編號C12Q1/68GKCN101665829SQ200910044219公開日2010年3月10日申請日期2009年8月31日發(fā)明者王玉富,欣鄧,陳信波,龍松華申請人:中國農業(yè)科學院麻類研究所導出引文BiBTeX,EndNote,RefMan