專(zhuān)利名稱(chēng):一種編碼產(chǎn)堿桿菌腈水解酶的基因及其用于制備扁桃酸單一對(duì)映體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種編碼腈水解酶的堿基序列，一種含有這種堿基序列的質(zhì)粒，以及由這種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化而得到的轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明還涉及一種可以催化扁桃腈高效且對(duì)映選擇性水解為(R)-(-)-扁桃酸的基因工程重組腈水解酶，以及使用這種酶由相應(yīng)的扁桃腈制備 (R)-(-)-扁桃酸及其類(lèi)似物的技術(shù)方法。本發(fā)明還涉及利用這種轉(zhuǎn)化體制備(R)-(-)_扁桃酸及其類(lèi)似物的方法。本發(fā)明另外還涉及通過(guò)利用腈水解酶的轉(zhuǎn)化體、其培養(yǎng)物或者其加工制品來(lái)催化扁桃腈的不對(duì)稱(chēng)水解制備相應(yīng)的(R)-(-)_扁桃酸單一對(duì)映體及其類(lèi)似物的方法。
技術(shù)背景
扁桃酸，或稱(chēng)α-羥基苯乙酸，是一種重要的手性合成中間體和大宗手性拆分劑， 在制藥行業(yè)具有廣泛的用途。相對(duì)于扁桃酸的消旋體，其單一對(duì)映體(右旋或左旋的扁桃酸)的應(yīng)用價(jià)值更高。因此，簡(jiǎn)潔高效、低成本的扁桃酸單一對(duì)映體的制備方法成為研究開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)。
(R)-(-)-扁桃酸及其類(lèi)似物是一類(lèi)重要的手性合成砌塊，被廣泛地應(yīng)用于多種藥物的合成。例如，作為頭孢類(lèi)半合成抗生素、抗腫瘤及抗衰老藥物的重要中間體；也可以作為手性拆分試劑，用于拆分其他的手性藥物或醫(yī)藥中間體。
(R)-(-)_扁桃酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為
傳統(tǒng)的化學(xué)拆分法，主要是利用手性胺類(lèi)化合物，如α -甲基芐胺、㈠-麻黃堿和辛可寧等，通過(guò)與外消旋的扁桃酸形成非對(duì)映異構(gòu)體鹽的方法，得到扁桃酸的單一對(duì)映體。 還可利用色譜法、結(jié)晶法、膜法和超臨界萃取法等物理化學(xué)方法來(lái)對(duì)扁桃酸進(jìn)行對(duì)映體拆分。此外，還可利用還原劑來(lái)不對(duì)稱(chēng)合成(R)-(-)_扁桃酸。
最近，利用生物法合成(R)-(-)-扁桃酸正在逐漸成為研究的熱點(diǎn)。例如，專(zhuān)利報(bào)道(CN 1710087,2005)以苯甲酰甲酸甲酯或苯甲酰甲酸的其它衍生物為底物，采用酵母或白地霉等微生物細(xì)胞作為催化劑，選擇性地將底物中的羰基還原為羥基，從而獲得以一種立體構(gòu)型為主的扁桃酸單一對(duì)映體。專(zhuān)利(CN 1840671,2006)以篩選到的黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)AS 1. 818作為催化劑，不對(duì)稱(chēng)轉(zhuǎn)化外消旋的扁桃酸得到產(chǎn)物(R)-扁桃酸，產(chǎn)物的光學(xué)純度可達(dá)90% e.e.以上。也有文獻(xiàn)報(bào)道利用脫氫酶選擇性降解(S)_(+)_ 扁桃酸而得到(R)-(-)-扁桃酸。例如，Miyamoto 等(Biotechnol. Lett.，1992,14 :1137-1142)利用Alcaligenes bronchis印ticus拆分外消旋的扁桃酸，產(chǎn)率為 42%, e. e.為 97%。Jamaluddin 等(J. Bacteriol.，1970，101 :786-793)利用 Aspergillus niger脫氫酶選擇性氧化外消旋的扁桃酸得到光學(xué)純的(R)-(_)_扁桃酸。Takahashi等 (J. Ferment. Bioeng.，1995,3 :247-250)利用 Pseudomonas polycolor 轉(zhuǎn)化外消旋的扁桃酸，得到(R)-(-)-扁桃酸，產(chǎn)率為 35%，e. e.為 99. 9%。Li GY等(Process Biochemistry, 2007,42 :1465-1469)利用殼聚糖固定化Saccharomyces cerevisiae來(lái)不對(duì)稱(chēng)還原苯甲酰甲酸為⑶-㈠-扁桃酸，產(chǎn)率為62%，e.e.為98%。
然而，上述公開(kāi)報(bào)道的方法一般僅限于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模，還不適用于工業(yè)化生產(chǎn) (R)-(-)_扁桃酸，主要是由于還原催化劑或拆分試劑價(jià)格昂貴，物理化學(xué)方法技術(shù)要求嚴(yán)格，而在生物化學(xué)方法中需要先合成其轉(zhuǎn)化的前體，其步驟相當(dāng)繁瑣且反應(yīng)條件劇烈，對(duì)生態(tài)不夠友好，同時(shí)還需要消耗昂貴的輔酶。
腈水解酶能夠催化有機(jī)腈化合物一步水解為羧酸并產(chǎn)生一分子的氨，該過(guò)程反應(yīng)條件溫和，不需要任何輔因子的參與，反應(yīng)效率極高，同時(shí)反應(yīng)過(guò)程具有較好的區(qū)域和立體選擇性。另一方面，反應(yīng)底物扁桃腈易于大規(guī)模生產(chǎn)且成本低廉；更為重要的是，當(dāng) (R)-(-)_扁桃腈被對(duì)映選擇性地酶促水解為(R)-(-)_扁桃酸后，剩余的(S)-(+)_扁桃腈在弱堿性條件下可以自發(fā)地消旋轉(zhuǎn)化為外消旋的扁桃腈，這樣理論上可以得到100%的產(chǎn)率。因此，如果能夠獲得對(duì)扁桃腈具有高水解活性和對(duì)映選擇性的腈水解酶，則有望實(shí)現(xiàn) (R)-(-)-扁桃酸的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
目前已有一些文獻(xiàn)報(bào)道利用腈水解酶催化扁桃腈水解合成(R)-(-)-扁桃酸。例如，Yamamoto 等(Appl. Environ. Microbiol. ,1991,57 :3028-3032)利用 Alcaligenesfaecalis ATCC 8750轉(zhuǎn)化外消旋的扁桃腈合成(R) _ (_)-扁桃酸；Kaul等 (Tetrahedron =Asymmetry, 2004,15 :207-211)利用 Pseudomonas putida 將扁桃腈水解為 (R)-(-)_扁桃酸，轉(zhuǎn)化率大于40%，e.e.大于98%。但是，上述報(bào)道的方法存在的主要問(wèn)題是野生菌株中酶的產(chǎn)量很低，催化活力不高，酶的穩(wěn)定性較差，而且不能耐受高濃度的底物，因此它們的總體催化效率不高，難以應(yīng)用于扁桃酸的批量生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種編碼腈水解酶的堿基序列，同時(shí)提供了含有上述堿基序列的質(zhì)粒，以及由這種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主而得到的轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明還提供了一種對(duì)扁桃腈顯示出高活性和對(duì)映選擇性的重組腈水解酶，以及利用該酶由扁桃腈制備(R)-(-)-扁桃酸的方法。
本發(fā)明所述的腈水解酶來(lái)源于產(chǎn)堿桿菌屬菌株ECU0401 (保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號(hào)為CGMCC No. 2009)。該菌株是發(fā)明人從土壤中分離、純化得到的，已經(jīng)申請(qǐng)發(fā)明專(zhuān)利，公開(kāi)號(hào)為CN 101134943和CN101186933。
本發(fā)明所述腈水解酶的編碼DNA片段可以通過(guò)如下步驟分離從產(chǎn)堿桿菌CGMCC No. 2009中提取基因組DNA，用限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)基因組DNA進(jìn)行消化，得到的DNA片段通過(guò)電泳分離純化，回收DNA片段，將其插入載體質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化相應(yīng)的微生物宿主得到轉(zhuǎn)化體庫(kù)。 從庫(kù)中篩選出含腈水解酶基因序列的克隆，通過(guò)對(duì)相應(yīng)重組質(zhì)粒測(cè)序、分析該腈水解酶基因的堿基序列，確定出編碼目標(biāo)腈水解酶的DNA堿基序列，并從該DNA堿基序列推斷出腈水解酶的氨基酸序列。[0014]通過(guò)如上分離得到的編碼本發(fā)明所述腈水解酶的DNA堿基序列包含序列表中SEQ NO. 1的堿基序列。堿基序列SEQ NO. 1編碼了 SEQ NO. 2的氨基酸序列，由于密碼子的簡(jiǎn)并性，編碼SEQ NO. 2的氨基酸序列的堿基序列不僅僅局限于SEQ NO. 1。另外，還可以通過(guò)適當(dāng)引入替換、缺失、改變、插入或增加來(lái)提供一個(gè)多聚核苷酸的同系物。本發(fā)明中多聚核苷酸的同系物可以通過(guò)對(duì)堿基序列SEQ NO. 1的一個(gè)或多個(gè)堿基在保持酶活性范圍內(nèi)進(jìn)行替換、缺失或增加來(lái)制得。
SEQ NO. 1的同系物也指啟動(dòng)子變體。在所述的堿基序列之前的啟動(dòng)子或信號(hào)序列可通過(guò)一個(gè)或多個(gè)核苷酸的替換、插入或缺失而改變，但這些改變對(duì)啟動(dòng)子的功能沒(méi)有負(fù)面影響。而且通過(guò)改變啟動(dòng)子的序列或甚至用來(lái)自不同種生物體的更有效的啟動(dòng)子完全替換，可提高目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。
SEQ NO. 1或其同系物是一種具有能夠在標(biāo)準(zhǔn)條件下和具有與SEQ NO. 1互補(bǔ)序列的多聚核苷酸進(jìn)行雜交的堿基序列的多聚核苷酸。在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行雜交可根據(jù)“分子克隆”中描述的方式進(jìn)行Cold Spring Harbor Laboratory I^ress，分子生物學(xué)中的通用協(xié)議(Current Protocols in Molecular Biology)。具體來(lái)說(shuō)，雜交可以按照如下步驟進(jìn)行， 將一個(gè)載有被轉(zhuǎn)錄的待測(cè)DNA或RNA分子的膜與一個(gè)標(biāo)記探針在雜交緩沖液中進(jìn)行雜交。 雜交緩沖液的組成為0. Iwt% SDS、5wt%硫酸右旋糖苷、一盒1/20的稀釋抑制劑以及2 8 X SSC0 20 X SSC為3M氯化鈉和0.3M的檸檬酸組成的溶液。雜交溫度為50 70°C。在培養(yǎng)幾個(gè)小時(shí)或過(guò)夜后，用清洗緩沖液清洗膜。清洗溫度為室溫，更優(yōu)選為雜交溫度。清洗緩沖液的組成為6XSSC+0. Iwt % SDS溶液，更優(yōu)選為5XSSC+0. Iwt % SDS0當(dāng)用這種清洗緩沖液清洗完膜后，就可以通過(guò)在DNA或RNA分子內(nèi)被雜交的探針上的標(biāo)記來(lái)識(shí)別DNA或 RNA分子。
本發(fā)明所述的腈水解酶具有序列表中SEQ N0. 2的氨基酸序列，或者在保持腈水解酶的活性下，將SEQ N0. 2的氨基酸進(jìn)行替換、缺失、改變或插入其中的一個(gè)或兩個(gè)，優(yōu)選為幾個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列。
將所得到的編碼本發(fā)明所述腈水解酶的DNA插入到一個(gè)表達(dá)質(zhì)粒中，例如，當(dāng)宿主是大腸桿菌時(shí)，典型的表達(dá)質(zhì)粒包括PUC18、pUC19、pSClOl、pBR322、pHSl、pHS2，這樣可以得到表達(dá)腈水解酶的質(zhì)粒。對(duì)于宿主的選擇不僅僅局限于大腸桿菌等，任何微生物只要滿(mǎn)足重組載體可以穩(wěn)定地和自動(dòng)地生長(zhǎng)，并且一些外源的DNA可以被表達(dá)即可作為轉(zhuǎn)化宿主。
在本發(fā)明中，由質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主得到的轉(zhuǎn)化體可以基于已知信息生長(zhǎng)并產(chǎn)生本發(fā)明所述的腈水解酶。任何一種人工的或天然的含有適量的碳源、氮源、無(wú)機(jī)和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的介質(zhì)，只要能夠滿(mǎn)足使宿主菌株生長(zhǎng)并產(chǎn)生腈水解酶均可使用。培養(yǎng)方法和培養(yǎng)條件沒(méi)有特殊的限制，可以根據(jù)培養(yǎng)類(lèi)型和方法等因素的不同而進(jìn)行適當(dāng)?shù)倪x擇，只要使宿主菌株能夠生長(zhǎng)并產(chǎn)生腈水解酶即可。
用于制備本發(fā)明的(R)-(-)-扁桃酸及其衍生物的方法中的腈水解酶，可以是上述產(chǎn)生腈水解酶的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物，也可以是通過(guò)將培養(yǎng)基離心分離后得到的轉(zhuǎn)化體細(xì)胞或者用其加工的制品。這里“加工的制品”是指由轉(zhuǎn)化體得到的提取物、或通過(guò)對(duì)提取物的腈水解酶進(jìn)行分離和/或純化得到的分離產(chǎn)品、或者通過(guò)固定化轉(zhuǎn)化體細(xì)胞或提取物或轉(zhuǎn)化體的分離產(chǎn)品而得到的固定化制品。為了改善目標(biāo)反應(yīng)的反應(yīng)性和選擇性，可以使用有機(jī)溶劑或者在反應(yīng)前和反應(yīng)中處理反應(yīng)體系、轉(zhuǎn)化體細(xì)胞或者轉(zhuǎn)化體的加工制品。有機(jī)溶劑適當(dāng)?shù)倪x擇一種或多種醇類(lèi)，如甲醇和乙醇等；可與水混合的有機(jī)溶劑，例如丙酮、二甲基亞砜、乙醚、氯仿、乙酸乙酯、四氫呋喃和二甲基甲酰胺；芳香族有機(jī)溶劑如苯和甲苯；燒烴類(lèi)如正己烷和辛烷。有機(jī)溶劑的用量可根據(jù)腈水解酶活性的穩(wěn)定性范圍而定。其他處理方法，比如利用CTAB對(duì)細(xì)胞進(jìn)行通透處理，CTAB的濃度為1 10% (w/v)，處理時(shí)間為 0. 1 池。為了進(jìn)一步提高反應(yīng)的效率，還可以向反應(yīng)體系中加入各種添加劑，例如有些金屬離子會(huì)抑制腈水解酶的活性，因此，可向反應(yīng)體系中加入金屬離子螯合劑，例如EDTA。而有些還原試劑，如半胱氨酸和二硫蘇糖醇則有利于腈水解酶的酶活。
在由腈水解酶催化相應(yīng)的腈化合物水解制備本發(fā)明的(R)-(-)-扁桃酸及其衍生物時(shí)，選擇對(duì)反應(yīng)性如腈水解酶的活性和穩(wěn)定性有利的條件有利于反應(yīng)的進(jìn)行。
反應(yīng)中使用的介質(zhì)可以是水或含有不同緩沖液的水介質(zhì)。其中的緩沖液可以是向水中加入一種或多種適當(dāng)選自磷酸、Tris、檸檬酸、乙酸、硼酸、氨基乙酸、HEPES、M0PS、MES、 CAPS、CHES, PIPES和其他的酸成分而得到。
本發(fā)明方法所述的pH值優(yōu)選保持在腈水解酶可以表達(dá)其活性的PH范圍內(nèi)，優(yōu)選 SpH 4.0 10.0。反應(yīng)溫度優(yōu)選保持在腈水解酶可以表達(dá)其活性的溫度范圍內(nèi)，優(yōu)選為 20 60 。
本發(fā)明方法所述的底物濃度沒(méi)有限制，通常為5 200mmol/L?？紤]到反應(yīng)的效率，底物濃度優(yōu)選為大于等于50mmol/L，更優(yōu)選為大于等于lOOmmol/L并且優(yōu)選為小于等于200mmol/L。同時(shí)為了提高生產(chǎn)效率，可以在反應(yīng)時(shí)批次添加腈。反應(yīng)所生成的產(chǎn)物可以在反應(yīng)結(jié)束后分離，也可以通過(guò)原位分離的方法不斷地將產(chǎn)物移走。
本發(fā)明的方法中，當(dāng)所使用的催化劑是靜息細(xì)胞時(shí)，其用量為1 100g/L ；當(dāng)使用的催化劑是固定化細(xì)胞時(shí)，其用量為5 500g/L ；當(dāng)催化劑是細(xì)胞提取物時(shí)，其用量為5 100mg/L。
本發(fā)明所述的腈水解酶可以提供由扁桃腈及其衍生物得到相應(yīng)的扁桃酸及其衍生物。因此，本發(fā)明中的腈水解酶可以在工業(yè)上方便地由扁桃腈及其衍生物制備光學(xué)純的扁桃酸及其衍生物。本發(fā)明中所選的底物通式為
權(quán)利要求
1. 一種催化扁桃腈水解合成(R)-(-)_扁桃酸的腈水解酶，其特征在于，所述的腈水解酶是由產(chǎn)堿桿菌屬Alcaligenes sp. ECU0401，保藏號(hào)為CGMCC No. 2009的菌株得到的，其由如下核苷酸序列所編碼ATGCAGACAAGAAAAATCGTCCGGGCAGCCGCCGTACAGGCCGCCTCTCCCAACTACGACCTGGCAGCAGGTGTTGATAAAACCATTGAACTGGCTCGACAAGCGCGTGATGAAGGCTGCGACCTGATCGTATTTGGTGAAACCTGGTTGCCAGGCTATCCCTTCCACGTCTGGCTAGGTGCGCCGGCCTGGTCACTGAAATACAGTGCTCGTTACTATGCCAACTCACTCTCGCTGGACAGTGCAGAGTTTCAGCGCATTGCCCAGGCTGCGCGAACCTTGGGCATTTTCATCGCATTGGGCTATAGCGAACGCAGCGGTGGCAGCCTGTATCTGGGCCAATGCCTGATCGACGACAAAGGCGAGATGCTGTGGTCACGTCGCAAACTCAAACCCACGCATGTAGAGCGCACCGTATTTGGTGAGGGTTATGCCCGTGATCTGATTGTGTCCGACACAGAACTGGGACGCGTCGGCGCTCTATGCTGCTGGGAGCATTTGTCGCCCTTGAGCAAGTACGCGCTGTACTCCCAGCATGAAGCCATTCACATTGCTGCCTGGCCGTCGTTTTCGCTATACAGCGAACAGGCCCACGCCCTCAGCGCCAAGGTGAACATGGCCGCCTCGCAAATCTATTCGGTGGAAGGCCAATGCTTTACCATCGCCGCCAGCAGTGTGGTCACCCAAGAGACGCTAGACATGCTGGAAGTGGGTGAGCACAACGCCTCTTTGCTGAAAGTGGGCGGTGGCAGTTCCATGATTTTTGCACCGGACGGACGTACACTGGCTCCCTACCTGCCTCACGATGCCGAGGGCTTGATCATTGCCGATCTGGATATGGAGGAGATTGCCTTCGCCAAGGCGATCAATGACCCCGTGGGCCACTATTCCAAACCTGAAGCCACCCGTCTGGTGCTGGACTTGGGGCACCGAGAACCCATGACTCGGGTGCACTCCAAAAGCGTGACCAAGGCAGAGGCTTCCGAGCCAGGTGTGCAAAGTACGGCTACCTCAGTCGCTATCAGCCATCCACAGGACTCGGACACACTGCTCGTGCAAGAACCGTCCTGA0
2.一種含有如權(quán)利要求
1所述的核苷酸序列的重組質(zhì)粒。
3.—種權(quán)利要求
2所述的重組質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞而得到的轉(zhuǎn)化體。
4.如權(quán)利要求
1所述的腈水解酶，其特征在于，它是由權(quán)利要求
1所述的核苷酸序列編碼，其氨基酸序列為MQTRKIVRAAAVQAASPNYDLAAGVDKTIELARQARDEGCDLIVFGETWLPGYPFHVWLGAPAWSLKYSARYYANSLSLDSAEFQRIAQAARTLGIFIALGYSERSGGSLYLGQCLIDDKGEMLWSRRKLKPTHVERTVFGEGYARDLIVSDTELGRVGALCCWEHLSPLSKYALYSQHEAIHIAAWPSFSLYSEQAHALSAKVNMAASQIYSVEGQCFTIAASSVVTQETLDMLEVGEHNASLLKVGGGSSMIFAPDGRTLAPYLPHDAEGLIIADLDMEEIAFAKAINDPVGHYSKPEATRLVLDLGHREPMTRVHSKSVTKAEASEPGVQSTATSVAISHPQDSDTLLVQEPS。
5.一種如權(quán)利要求
1所述的腈水解酶用于催化合成(R)-(-)_扁桃酸及(R)-(-)_鄰氯扁桃酸的用途。
6.如權(quán)利要求
5所述的用途，其特征在于所述的腈水解酶采用如下步驟催化合成(R)-(-)-扁桃酸及(R)-(-)-鄰氯扁桃酸(1)對(duì)權(quán)利要求
3所述的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行增殖培養(yǎng)，表達(dá)目標(biāo)蛋白，收集重組微生物細(xì)胞；(2)將收獲的重組微生物靜息細(xì)胞或?qū)χ亟M微生物細(xì)胞進(jìn)行海藻酸鈣包埋固定化處理后得到的固定化重組細(xì)胞懸浮于pH為4. 0 10. 0的Tris-HCl或檸檬酸鹽緩沖液中，加入扁桃腈或鄰氯扁桃腈作為底物，在20 60°C反應(yīng)1 10小時(shí)，然后從反應(yīng)液中分離提取目標(biāo)產(chǎn)物。
7.根據(jù)權(quán)利要求
6所述的用途，其特征在于所述的步驟( 中，所述的底物濃度為5 200 mmol/L ；所述的靜息細(xì)胞在緩沖液中的含量為1 100 g/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求
6所述的用途，其特征在于，使用固定化重組細(xì)胞轉(zhuǎn)化時(shí)，固定化重組細(xì)胞在緩沖液中的含量為5 500 g/L。
專(zhuān)利摘要
本發(fā)明涉及編碼具有腈水解酶活性的多肽的堿基序列，涉及包含該堿基序列的載體，并涉及含有該堿基序列或載體的轉(zhuǎn)化體，其中所述的載體包含該堿基序列或堿基序列與相應(yīng)的信號(hào)序列相連接的組合體。本發(fā)明還涉及由該堿基序列編碼的氨基酸序列。本發(fā)明另外還涉及利用該重組表達(dá)的腈水解酶作為催化劑，由相應(yīng)的扁桃腈制備扁桃酸單一對(duì)映體及其類(lèi)似物的技術(shù)方法。
文檔編號(hào)C12N15/63GKCN101701222 B發(fā)布類(lèi)型授權(quán) 專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朇N 200910049506
公開(kāi)日2011年11月16日 申請(qǐng)日期2009年4月17日
發(fā)明者劉俊峰, 張志鈞, 潘江, 許建和 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專(zhuān)利引用 (2), 非專(zhuān)利引用 (2),