專利名稱:一種干細(xì)胞培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種干細(xì)胞培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
干細(xì)胞(stem cells)是一類具有自我復(fù)制能力(self-renewing)的多潛能細(xì)胞，在一定條件下，它可以分化成多種功能細(xì)胞。干細(xì)胞有兩種分類方法，一是根據(jù)干細(xì)胞所處的發(fā)育階段分為胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell,ES細(xì)胞)和成體干細(xì)胞(somatic stemcell)。第二種分類方法是根據(jù)干細(xì)胞的發(fā)育潛能分為三類全能干細(xì)胞(totipotent stemcell, TSC)、多能干細(xì)胞(pluripotent stem cell)和單能干細(xì)胞(unipotent stem cell)
胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells, ES細(xì)胞)主要來自囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)及受精卵發(fā)育至桑椹胚之前的早期胚胎細(xì)胞。人ES細(xì)胞具有2個(gè)顯著特征一是它具有體外高度自我更新的能力，二是它可被定向誘導(dǎo)分化為體內(nèi)各種細(xì)胞類型。
誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞(又稱iPS細(xì)胞)是通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將某些因子導(dǎo)入動(dòng)物或人的體細(xì)胞，可將體細(xì)胞直接重構(gòu)成為ES細(xì)胞樣的多潛能細(xì)胞，該類細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)特性、表面標(biāo)志物和形成畸胎瘤等方面與ES細(xì)胞非常相似。(Okita K, IchisakaT,Yamanaka S.. Nature 2007;448:313-317 ；ffernig M,Meissner A,et al.Nature2007;448:318-324 ；Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, et al. Cell 2007;131:861-872 ；YuJ, Vodyanik MA, Smuga-Otto K, et al. Science 2007;318:1917-1920)
成體干細(xì)胞(somatic stem cell)包括骨髓或臍帶或外周造血干細(xì)胞、骨髓或臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、表皮干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、胰腺干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞等成體組織中存在的干細(xì)胞，理論上在特定條件下可分化為特定的組織器官，是修復(fù)和再生的基礎(chǔ)。
干細(xì)胞有著巨大的醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景，但要將其成功地用于臨床實(shí)踐，必須解決的首要課題是如何保持干細(xì)胞在體外不斷增殖的同時(shí)又維持著不分化狀態(tài)，即自我更新。干細(xì)胞體外培養(yǎng)必須滿足2個(gè)基本條件，即促進(jìn)細(xì)胞的分裂增殖的同時(shí)抑制細(xì)胞的分化。現(xiàn)有的干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中常采用飼養(yǎng)層細(xì)胞和/或細(xì)胞因子來滿足上述條件。如ES細(xì)胞，常用的飼養(yǎng)層細(xì)胞有小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(murine embryonic fibroblasts, MEF)和STO細(xì)胞等，經(jīng)喪失分裂能力處理，如Y射線照射或絲裂霉素C等處理，這些細(xì)胞雖失去分裂能力，但仍可生存并有同化培養(yǎng)液的能力。使用MEF作為飼養(yǎng)層培養(yǎng)ES細(xì)胞是最早和最常用的方法[Takahama Y, Ochiya T, Sasaki H, et al. J. Oncogene, 1998, 16(24) : 3189-3196];同時(shí)培養(yǎng)液加入白血病抑制因子(leukemiainhibitory factor, LIF)等細(xì)胞分化抑制因子[Horak V, Flechon JE. Reprod Nutr Dev, 1998，38 (6) : 683-695]。然而，使用MEF培養(yǎng)ES細(xì)胞有以下幾方面的不足①培養(yǎng)和擴(kuò)增人ES細(xì)胞時(shí)，MEF可能將動(dòng)物病原通過培養(yǎng)系統(tǒng)傳播給人ES細(xì)胞；②需要制備大量的MEF。因?yàn)镸EF生命期有限，不能在體外長(zhǎng)期傳代，且其產(chǎn)生促增生因子和抑制分化因子的能力會(huì)隨著傳代時(shí)間的延長(zhǎng)而減弱甚至喪失；③不易獲得純的ES細(xì)胞作為生化和分子生物學(xué)方面的分析；④死亡的MEF的染色體的釋放可能會(huì)引起ES細(xì)胞的突變及影響正常核型的保持。為了將來臨床使用因MEF帶來的問題，多位學(xué)者建立了以人來源的胚胎或成體細(xì)胞作為飼養(yǎng)層的無動(dòng)物來源成分的培養(yǎng)系統(tǒng)。分別用人胚胎成纖維細(xì)胞或成體輸卵管上皮細(xì)胞、人的骨髓基質(zhì)細(xì)胞、人包皮細(xì)胞等代替MEF作為飼養(yǎng)層，均可以維持人ES細(xì)胞長(zhǎng)期未分化的增殖狀態(tài)[RichardsM, Fong CY,Chan WK, et al. Nat Biotechnol, 2002, 20(9):933-936 ；Cheng L，HammondH, Ye Z, et al. Stem Cells, 2003，21 (2) : 131-142 ;Meng G, Liu S, Krawetz R, et al. StemCells Dev. 2008，17 (3): 413-22]。然而，以人飼養(yǎng)層為基礎(chǔ)的培養(yǎng)系統(tǒng)仍然需要飼養(yǎng)層細(xì)胞和ES細(xì)胞的同時(shí)生長(zhǎng)，人體組織由于來源困難，無法滿足ES細(xì)胞體外培養(yǎng)和擴(kuò)增的需要。為解決人體組織來源困難的問題，人們開始采用人胎盤組織并分離其細(xì)胞來培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞° Genbacev[Genbacev O. , Krtolica A. , Zdravkovic T. , et al. Fertil Steril2005, 83，1517-1529.]等從6_9周流產(chǎn)的妊娠物中分離人胎盤成纖維細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)它們可以支持人胚胎干細(xì)胞的生長(zhǎng)并保持未分化狀態(tài)。而滋養(yǎng)層細(xì)胞喪失分裂能力處理，如Y射線照射或絲裂霉素C等處理，不僅增加了操作步驟，而且增加了潛在風(fēng)險(xiǎn)，其中絲裂霉素C是一種DNA抑制劑，可能導(dǎo)致ES細(xì)胞的染色體畸變。
為此，克服了動(dòng)物源性污染的問題，人們嘗試采用無血清無飼養(yǎng)層體系來培養(yǎng)干細(xì)胞，通過添加各種生長(zhǎng)因子來保障干細(xì)胞在體外不斷增殖的同時(shí)又維持著不分化狀態(tài)，但這些生長(zhǎng)因子及含其的培養(yǎng)基及其昂貴，大大增加了研究和應(yīng)用成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題為提供一種安全的有效的廉價(jià)的干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，以克服現(xiàn)有干細(xì)胞培養(yǎng)方法的缺陷。
為此，本發(fā)明一種干細(xì)胞培養(yǎng)方法，包括下列步驟
a)制備未經(jīng)喪失分裂能力處理的羊膜上皮細(xì)胞滋養(yǎng)層；
b)接種干細(xì)胞于羊膜上皮細(xì)胞滋養(yǎng)層上,在培養(yǎng)液中培養(yǎng)。
本發(fā)明所述制備未經(jīng)喪失分裂能力處理的羊膜上皮細(xì)胞滋養(yǎng)層的步驟為選取剖宮產(chǎn)分娩的胎盤并剝離羊膜，分離羊膜上皮細(xì)胞，接種在細(xì)胞培養(yǎng)容器中，置于37°C，5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
在一優(yōu)選實(shí)施例中，所述羊膜上皮細(xì)胞為人羊膜上皮細(xì)胞，以避免人源干細(xì)胞培養(yǎng)中動(dòng)物源性的污染。
在一優(yōu)選實(shí)施例中，所述羊膜上皮細(xì)胞為Ptl-P3代的羊膜上皮細(xì)胞，其中優(yōu)選Ptl代的羊膜上皮細(xì)胞。
在一優(yōu)選實(shí)施例中，所述干細(xì)胞可為胚胎干細(xì)胞、胚胎生殖細(xì)胞、iPS細(xì)胞或成體干細(xì)胞，其中優(yōu)選為胚胎干細(xì)胞、胚胎生殖細(xì)胞或iPS細(xì)胞。
在一優(yōu)選實(shí)施例中，所述干細(xì)胞為胚胎干細(xì)胞和/或iPS細(xì)胞時(shí)，所述培養(yǎng)液中LIF的濃度為0-12ng/ml，其中優(yōu)選為Ong/ml，這既可避免LIF加入導(dǎo)致的潛在風(fēng)險(xiǎn)，也可減少培養(yǎng)的成本。
在一優(yōu)選實(shí)施例中，所述培養(yǎng)液可為無血清培養(yǎng)液或含血清培養(yǎng)液；所述血清優(yōu) 選為人全血清或臍帶血清。
本發(fā)明所述干細(xì)胞的培養(yǎng)方法不需對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行喪失分裂能力處理，步驟簡(jiǎn)捷、安全，有效地解決了目前人干細(xì)胞培養(yǎng)中動(dòng)物源性污染的問題，并極大地降低了干細(xì)胞的培養(yǎng)成本，為今后干細(xì)胞的產(chǎn)業(yè)化提供了一種安全的有效的廉價(jià)的干細(xì)胞培養(yǎng)方法。


圖I. Western blotting檢測(cè)兩種滋養(yǎng)層細(xì)胞LIF的表達(dá)情況。
具體實(shí)施方式
為進(jìn)一步詳細(xì)描述在本發(fā)明的實(shí)踐中所使用的常規(guī)技術(shù)，實(shí)踐者可參看有關(guān)細(xì)胞生物學(xué)、組織結(jié)構(gòu)學(xué)以及胚胎學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)的教科書及評(píng)論。包括Teratocarcinomasand embryonic stem cell: A practical approach[E. J. Robertson 編，IRL 出版有限公司，1987] ；Guide to techniques in Mouse Development[P. M. Wasserman 等編，學(xué)術(shù)出版社，1993] ；Embryonic Stem Cell Differentiation in Vitro[Μ. V. Wiles, Meth. EnzymoI. 225:900，1993] ；Properties and uses of Embryonic Stem Cells:Prospectsfor Application to Human Biology and Gene Therapy[P. D. Rathjen等，Reprod. Fertil.Dev. 10:31，1998]。
細(xì)胞生物學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)、和抗體技術(shù)可以在“蛋白科學(xué)中的當(dāng)前方案” [J.E. Colligan等編輯，Wiley & Sons]、“細(xì)胞生物學(xué)中的當(dāng)前方案” [J. S. Bonifacino等，Wiley & Sons]和“兔疫學(xué)功時(shí)當(dāng)亦方案” [J. Ε· Colligan等編輯，Wiley & Sons]中找到。與本發(fā)明相關(guān)的試劑、克隆載體、和基因操作試劑盒可從商業(yè)供應(yīng)商那得到，例如BioRad、Stratagene> InvitrogeruClonTech 以及 sigma-AIdrich 公司。
細(xì)胞培養(yǎng)方法通常在“動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)手冊(cè)”最新版本(R. I. Freshney編輯，Wiley & Sons); “細(xì)胞培養(yǎng)一般技術(shù)”(M. A. Harrison和I. F. Rae，劍橋大學(xué)出版)；和“胚胎干細(xì)胞方法和操作規(guī)定”(K. Turksen編輯，Humana出版)中有描述。組織培養(yǎng)基供應(yīng)和試劑可從商業(yè)供應(yīng)商那得到，例如Gibco/BRL、Nalgene-Nunc International、SigmaChemical Co.、以及 ICN Biomedicals。
本發(fā)明術(shù)語“喪失分裂能力處理”是指通過物理或化學(xué)手段，如Y射線照射或絲裂霉素C等處理，使細(xì)胞雖失去分裂能力，但仍可生存并有同化培養(yǎng)液的能力的過程。
羊膜組織樣品處理。
從離體的哺乳動(dòng)物胎盤分離羊膜，采用生理緩沖液沖洗除去血細(xì)胞，機(jī)械剔除殘留絨毛膜和血管。
如本文所用，術(shù)語“哺乳動(dòng)物”是脊椎動(dòng)物中最高等的一個(gè)類群，由爬行動(dòng)物進(jìn)化而來，主要特征是身體表面有毛，一般分頭、頸、軀干、四肢和尾五個(gè)部分；用肺呼吸；體溫恒定，是恒溫動(dòng)物；腦較大而發(fā)達(dá)；哺乳；胎生。哺乳和胎生是哺乳動(dòng)物最顯著的特征。
如本文所用，術(shù)語“羊膜”(Amnion)，也可稱作胎膜，是母體與胎兒間進(jìn)行物質(zhì)交換的重要組織。羊膜主要可分為上皮層、基底層、致密層、纖維母細(xì)胞層和海綿層五部分。人羊膜細(xì)胞(Amniotic cells)主要由上皮層的羊膜上皮細(xì)胞(human amniotic epithelialcells，hAEC)和基底層的間充質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成，是與發(fā)育中的胎兒的聯(lián)系緊密的胚胎發(fā)育早期產(chǎn)物。羊膜上皮細(xì)胞可表達(dá)胚胎干細(xì)胞及一些早期干細(xì)胞的一些不同分子標(biāo)記如0ct4、Nanog, S0X-2、SSEA-3、SSEA-4等；神經(jīng)細(xì)胞特異的膠質(zhì)纖維相關(guān)蛋白、神經(jīng)元特異性標(biāo)記(MAP2)、神經(jīng)干細(xì)胞特異性標(biāo)記(Nestin)等；肝薄壁組織細(xì)胞蛋白、甲胎蛋白等。這說明既然羊膜保留胚胎樣未成熟低分化的細(xì)胞特征，具有多能分化潛能。[Knezevic V, Anat1996;189 (Pt I):1-7;Yugel, Transplantation 2004;77 (9):1452-4;Takashima S, CellStruct Funct 2004;29 (3):73-84;Sakuragawa N, Neurosci Lett 1996;209 (I):9-12;WeiJ. P, Cell Transplant 2003; 12 (5) : 545-52]。同時(shí)，羊膜細(xì)胞本身自身缺乏 I、II類抗原如HLA — A、一 B、一 C和一R抗原以及β 2免疫球蛋白[Akle CA, Lance1981; 2 (8254) : 1003-5 ;M. Adinolfi, Nature295:28]移植后不會(huì)產(chǎn)生免疫原性，此外羊膜細(xì)胞同時(shí)存在HLA — E、G抗原，它們具有免疫抑制活性[Ueta Met al Clin Exp Imunol2002;129(3):464-70]。
羊膜上皮細(xì)胞分離和培養(yǎng)。
“分離”指的是從組織樣品中移出細(xì)胞且與另外的非組織干細(xì)胞分開。使用任何常規(guī)技術(shù)或方法將完整的組織分離為單細(xì)胞，這些技術(shù)或方法包括機(jī)械力(切碎力或剪切力)，用一種或組合的蛋白酶例如膠原酶、胰蛋白酶、脂肪酶、如US專利5，952，215中公開的釋放酶(Iiberase)Hl和胃蛋白酶進(jìn)行酶消化或機(jī)械和酶方法的組合。例如，可通過以下方法將完整組織片段的消化使用膠原酶介導(dǎo)的組織消化的方法；或參考用于本發(fā)明的使用膠原酶的其它方法公開在US專利5，830，714和5，952，215中。類似地，可使用中性蛋白酶來代替膠原酶，如在 Twentyman, P. R.和 J. M. Yuhas (Cancer Lett 1980 :9(3) : 225 —228)中公開的方法。此外，方法可采用酶的組合，例如膠原酶與胰蛋白酶的組合，如在Russell, S.W.F. Doc 等人(Int J Cancer 1976:18 (3) : 322-30)中公開的方法；或酶如胰蛋白酶與機(jī)械離解的組合，如在Engelholm. S. A, M. Spang. Thomsen等人(Br J Cancer1985:51(1) :93-98)中公開的方法。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法將活性細(xì)胞群體濃縮.這些加工后洗滌/濃縮步驟可單獨(dú)或同時(shí)施行。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過讓細(xì)胞群體連續(xù)流過旋轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)或類似系統(tǒng)例如在US專利034，135和5，234，608中公開的系統(tǒng)來將細(xì)胞濃縮和除去酶。
除了上述方法以外，還可在細(xì)胞洗滌后或培養(yǎng)后，進(jìn)一步純化或富集活性細(xì)胞群體，減少雜細(xì)胞和死細(xì)胞。分離懸浮液中的細(xì)胞可通過以下技術(shù)來實(shí)現(xiàn)浮力密度沉降離心、有差別的與固相的粘著和從固相上洗脫、免疫磁性珠、熒光激光細(xì)胞分選(FACS )或其它技術(shù)。這些不同技術(shù)以及進(jìn)行這些技術(shù)的裝置的實(shí)例可參見現(xiàn)有技術(shù)和上市商品。如免疫磁珠法，針對(duì)W003042405中所公開的羊膜上皮細(xì)胞抗原，采用SSEA-4、Nanog、CK-3等特異性抗體，通過免疫磁珠法進(jìn)一步純化或富集SSEA-4 ( + ) ,Nanog ( + )、CK_3 ( + )的羊膜上皮細(xì)胞。
對(duì)本發(fā)明使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的類型沒有限制，只要可用于細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基即可。優(yōu)選的培養(yǎng)基包括DMEM培養(yǎng)基和NPBM培養(yǎng)基。對(duì)上面提到的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中可能含有的其他組份類型沒有限制，優(yōu)選的成分包括F-12、FCS和神經(jīng)存活因子。在這類培養(yǎng)基中，例如，F(xiàn)-12和FCS的濃度分別是50%和10%。在這類培養(yǎng)基中CO2的濃度優(yōu)選是5%，但本發(fā)明不限于此。
而且，在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，向上面提到的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加bFGF(堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)或EGF (表皮生長(zhǎng)因子)。在這種情況下，可以加入一種或者兩者都加入。上面提到的bFGF或EGF的舉例濃度是lng/ml至100ng/ml，優(yōu)選的濃度為IOng/ml ο對(duì)添加的時(shí)間和方法沒有限制。優(yōu)選地，在將上面提到的羊膜上皮細(xì)胞在基礎(chǔ)培養(yǎng)基、中培養(yǎng)時(shí)每天加入試劑。
按照本發(fā)明，向上面提到的基礎(chǔ)培養(yǎng)基或含有其它成分的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中還可添加人全血清、臍帶血清或人工腦脊液。
干細(xì)胞的來源和培養(yǎng)
本發(fā)明可用各種類型的干細(xì)胞進(jìn)行操作，除非另有說明，本發(fā)明可用任何脊椎動(dòng)物的干細(xì)胞進(jìn)行操作。其中包括但不限于胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells, ES細(xì)胞)、誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞(又稱i PS細(xì)胞)、胚胎生殖(EG)細(xì)胞、成體干細(xì)胞(somatic stemcell)等。
ES細(xì)胞可以從靈長(zhǎng)類動(dòng)物的胚泡中獲得[Thomson等，Proc. Natl. Acad. Sci.USA 92:7844,1995]。如采用Thomson等所描述的技術(shù)[美國專利5，843，780，Science 282:1145，1998]或 Reubinoff 等描述的技術(shù)[Nature Biotech. 18:399,2000]。
胚胎生殖(EG)細(xì)胞合適的制備方法描述可參見Shamblott等，Prco. Natl. Acad.Sci. USA 95:13726，1998 以及美國專利 6，090，622。
誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞(又稱iPS細(xì)胞)是通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將某些因子導(dǎo)入動(dòng)物或人的體細(xì)胞，可將體細(xì)胞直接重構(gòu)成為ES細(xì)胞樣的多潛能細(xì)胞，其制備和培養(yǎng)可參見 OkitaK, Ichisaka T, Yamanaka S. Nature 2007;448:313-317 ；ffernigM,Meissner A,et al.Nature 2007;448:318-324 ;Takahashi K,Tanabe K,OhnukiM, et al.Cell 2007;131:861-872;Yu J,Vodyanik MA,Smuga-Otto K, et al. Science2007;318:1917-1920。
成體干細(xì)胞(somatic stem cell)包括骨髓或臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、胰腺干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、表皮干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、骨髓或臍帶或外周造血干細(xì)胞等成體組織中存在的干細(xì)胞，包括以下非限制性的實(shí)施例。美國專利5，851，832中報(bào)道了從腦組織中獲得的多能神經(jīng)干細(xì)胞；美國專利5，766, 948中報(bào)道了從新生兒大腦半球制造成神經(jīng)細(xì)胞；美國專利5，654，183和5，849，553號(hào)報(bào)道了哺乳類神經(jīng)峭干細(xì)胞的應(yīng)用；W02009040458公開了血液多能間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法；
除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例I.人羊膜上皮細(xì)胞滋養(yǎng)層的制備
人羊膜上皮細(xì)胞(Human amniotic epithelia cell, HAEC)的分離、培養(yǎng)選取剖宮產(chǎn)分娩的胎盤(各項(xiàng)病毒指標(biāo)陰性者，包括甲肝，乙肝，丙肝，戊肝，HIV，梅毒等)并剝離羊膜，分離羊膜上皮細(xì)胞，PBS沖洗除去血細(xì)胞，O. 25%胰蛋白酶37°C消化30min，吹打，加入含10%人臍帶血血清的RPMI1640終止消化，100目篩子過濾，I, 500rpm離心，棄上清，以I X 104/cm2接種在IOcm平皿，置于37°C，5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至80%密度。
實(shí)施例2.小鼠胚胎成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層的制備
小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonicfibroblast, MEF)的分離、培養(yǎng)取妊娠12. 5天的小鼠胚胎，清除內(nèi)臟、頭、尾，PBS清洗兩次，剪碎組織，0. 25%的胰蛋白酶消化30min，用滴管打勻組織，離心1000rpmX5min，去上清，打勻細(xì)胞團(tuán)，加入DMEM培養(yǎng)液(含10% FBS),置37°C，5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，傳至2_3代后經(jīng)絲裂霉素C處理。
實(shí)施例3. LIF對(duì)胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)的影響
采用實(shí)施例I人羊膜上皮細(xì)胞滋養(yǎng)層，接種小鼠胚胎干細(xì)胞株129，小鼠胚胎干細(xì)胞株 129 分別采用 DMEM 培養(yǎng)液 A (含 10% FBS、10ng/mlbFGF、12ng/mlLIF)和 DMEM 培養(yǎng)液B (含10% FBS、10ng/mlbFGF)培養(yǎng)，傳代30代。分別收集I X 106129細(xì)胞注射至4_8周齡SCID小鼠后腿肌間隙，約7-8周后觸摸有腫瘤形成，處死小鼠，作石蠟切片HE染色及病理檢查。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)液中有無LIF的情況下，小鼠胚胎干細(xì)胞株129均表現(xiàn)生長(zhǎng)的克隆規(guī)則，采用機(jī)械法進(jìn)行顯微分割時(shí)不易碎裂，傳代30代后形成的克隆較均一；且均能在SCID小鼠體內(nèi)致瘤，腫瘤組織石蠟切片HE染色及病理檢查發(fā)現(xiàn)的畸胎瘤能形成三個(gè)胚層，包括不成熟的腺體組織，肌纖維，骨骼及毛發(fā)。
實(shí)施例4.滋養(yǎng)層細(xì)胞的LIF表達(dá)檢測(cè)
采用Western blotting檢測(cè)了實(shí)施例1、2滋養(yǎng)層細(xì)胞上LIF的表達(dá)情況，其具體步驟為收集MEF及hAEC細(xì)胞，進(jìn)行勻漿，采用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測(cè)定，分別取20mg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)膜。與LIF抗體(兔抗人或鼠，I 200，武漢博士德)及β-actin抗體(兔抗人或鼠，I 1000,Cell signaling, USA)孵育I小時(shí)，再用二抗(I : 1000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)孵育 I 小時(shí)，米用Westen lightning ECL kit (Perkin Elmer life science, USA)顯色，成像系統(tǒng)(G:B0XSYNGENE, Gene company limited, Hongkong)掃描分析。
結(jié)果HAEC表達(dá)的LIF顯著高于MEF上LIF的表達(dá)(圖I)。
人體胎盤由三層結(jié)構(gòu)組成羊膜，絨毛膜和蛻膜。其中，羊膜(Amnion)，也可稱作胎膜，位于胎盤的最內(nèi)層，構(gòu)成胚胎羊水腔的內(nèi)壁，為半透明的薄膜，主要由表面外胚層的羊膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)中少量的中胚層細(xì)胞構(gòu)成，是與發(fā)育中的胎兒的聯(lián)系緊密的胚胎發(fā)育早期產(chǎn)物，提供胚胎生長(zhǎng)發(fā)育的環(huán)境。采用人羊膜上皮細(xì)胞作為滋養(yǎng)層具有其合理性，在胚胎發(fā)育過程中，未分化的胚胎被胎盤包饒，不論從解剖學(xué)還是從組織學(xué)上看是來自于胎盤人羊膜上皮細(xì)胞可能含有早期外胚層的多能性。據(jù)報(bào)道人羊膜上皮細(xì)胞還分泌多種生長(zhǎng)因子，如 GF、KGF、HGF、bFGF、TGF- a、TGF- β I、TGF- β 2、TGF- β 3 以及表達(dá) EGF、KGF, HGF,TGF-a、TGF_ β I、TGF_ β 2 等受體[Koizumi NJ, Inatomi TJ, Sotozono CJ et al. Curr Eye Res 2000,20:173-177]o
在發(fā)明中我們報(bào)道了人羊膜上皮細(xì)胞能支持胚胎干細(xì)胞的生長(zhǎng)，并保持未分化的狀態(tài)，保持自我更新，多向分化的干細(xì)胞特征，與MEF滋養(yǎng)層系統(tǒng)比較，人羊膜上皮細(xì)胞上培養(yǎng)的ES克隆不易分化，生長(zhǎng)狀態(tài)優(yōu)于MEF上的ES細(xì)胞，高表達(dá)Oct-4, Nanog, Sox-2, Rex, bFGF, and TERT等干細(xì)胞因子，這可能與HAEC比MEF表達(dá)更多的LIF有關(guān)，而LIF是一種能促進(jìn)ES細(xì)胞自我更新且抑制細(xì)胞分化的因子[Ying，Q.L. , Stavridis, M. , Griffiths, D. , et al. Nat Biotech 2003, 21, 183本發(fā)明所述干細(xì)胞的培養(yǎng)方法采用未經(jīng)喪失分裂能力處理的人羊膜上皮細(xì)胞作為滋養(yǎng)層具有很重要的意義，它可能解決目前人體組織來源困難或由于倫理方面的原因而受限，人羊膜上皮細(xì)胞來源于廢棄的胎盤組織，不存在倫理的問題，每張羊膜可獲得I X IO8HAEC,且人羊膜 上皮細(xì)胞不表達(dá)端粒酶，僅可擴(kuò)增3-4代，增殖緩慢，不需絲裂霉素C處理，因此，人羊膜上皮細(xì)胞作為滋養(yǎng)層培養(yǎng)人干細(xì)胞是一個(gè)良好的來源，可能解決動(dòng)物源性污染的問題。
本發(fā)明的范圍不受所述具體實(shí)施方案的限制，所述實(shí)施方案只欲作為闡明本發(fā)明各個(gè)方面的單個(gè)例子，本發(fā)明范圍內(nèi)還包括功能等同的方法和組分。實(shí)際上，除了本文所述的內(nèi)容外，本領(lǐng)域技術(shù)人員參照上文的描述和附圖可以容易地掌握對(duì)本發(fā)明的多種改進(jìn)。所述改進(jìn)也落入所附權(quán)利要求
書的范圍之內(nèi)。上文提及的每篇參考文獻(xiàn)皆全文列入本文作為參考。
權(quán)利要求
1.一種干細(xì)胞培養(yǎng)方法，包括下列步驟 a)制備未經(jīng)喪失分裂能力處理的羊膜上皮細(xì)胞滋養(yǎng)層； b)接種干細(xì)胞于羊膜上皮細(xì)胞滋養(yǎng)層上，在培養(yǎng)液中培養(yǎng)； 所述干細(xì)胞不包含人胚胎干細(xì)胞和人胚胎生殖細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求
I所述的干細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于所述步驟a為選取剖宮產(chǎn)分娩的胎盤并剝離羊膜，分離羊膜上皮細(xì)胞，接種在細(xì)胞培養(yǎng)容器中，置于37°C，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3.如權(quán)利要求
I所述的干細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于所述羊膜上皮細(xì)胞為人羊膜上皮細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求
I所述的干細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于所述羊膜上皮細(xì)胞為PcrP3代的羊膜上皮細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求
I所述的干細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于所述羊膜上皮細(xì)胞為Ptl代的羊膜上皮細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求
I所述的干細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于所述干細(xì)胞可為胚胎干細(xì)胞、胚胎生殖細(xì)胞、誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞或成體干細(xì)胞。
7.如權(quán)利要求
I所述的干細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于所述干細(xì)胞為胚胎干細(xì)胞或iPS細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求
I所述的干細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于所述干細(xì)胞為胚胎干細(xì)胞、胚胎生殖細(xì)胞或iPS細(xì)胞時(shí)，所述培養(yǎng)液中LIF的濃度為0-12ng/ml。
9.如權(quán)利要求
I所述的干細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于所述培養(yǎng)液可為無血清培養(yǎng)液或含血清培養(yǎng)液。
10.如權(quán)利要求
9所述的干細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于所述血清為人全血清或臍帶血清。
專利摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種干細(xì)胞的培養(yǎng)方法。本發(fā)明公開了一種干細(xì)胞培養(yǎng)方法，包括下列步驟制備未經(jīng)喪失分裂能力處理的羊膜上皮細(xì)胞滋養(yǎng)層；接種干細(xì)胞于羊膜上皮細(xì)胞滋養(yǎng)層上，在培養(yǎng)液中培養(yǎng)；所述干細(xì)胞不包含人胚胎干細(xì)胞和人胚胎生殖細(xì)胞。本發(fā)明所述干細(xì)胞的培養(yǎng)方法不需對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行喪失分裂能力處理，步驟簡(jiǎn)捷、安全，有效地解決了目前人干細(xì)胞培養(yǎng)中動(dòng)物源性污染的問題，并極大地降低了干細(xì)胞的培養(yǎng)成本，為今后干細(xì)胞的產(chǎn)業(yè)化提供了一種安全的有效的廉價(jià)的干細(xì)胞培養(yǎng)方法。
文檔編號(hào)C12N5/071GKCN101880649 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請(qǐng)?zhí)朇N 200910050582
公開日2012年9月5日 申請(qǐng)日期2009年5月5日
發(fā)明者劉天津, 程蔚蔚, 蔣麗珍, 賴東梅, 郭禮和, 黃勤 申請(qǐng)人:中國福利會(huì)國際和平婦幼保健院, 中美國聯(lián)(上海)生物技術(shù)研究有限公司, 中美賽傲(上海)生物技術(shù)有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (1), 非專利引用 (2),