專利名稱:制備含eb病毒潛伏膜蛋白1,2基因的重組腺相關(guān)病毒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域：
。具體地說(shuō)是ー種含EB病毒潛伏膜蛋白1，2和熱休克蛋白70基因的重組腺相關(guān)病毒制備方法，以及該重組腺相關(guān)病毒在預(yù)防和治療EB病毒相關(guān)腫瘤的疫苗中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鼻咽癌為上皮源性惡性腫瘤。傳統(tǒng)的鼻咽癌治療是以放射治療為主，以誘導(dǎo)化療為輔。這種傳統(tǒng)的治療模式在過(guò)去幾十年里，發(fā)揮了很大的作用，挽救了許多患者的生命。但是，晩期鼻咽癌占NPC總病例的70%，其5年生存率一直未見(jiàn)提高，治療失敗的主要原因是局部未控、復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。如何進(jìn)ー步提高鼻咽癌的治療效果，特別提高晚期及耐藥病人的生存率，是擺在 我們面前的ー個(gè)急待解決的問(wèn)題。
近年來(lái)，大量實(shí)驗(yàn)資料證明EB病毒與鼻咽癌密切相關(guān)。EB病毒膜蛋白LMPl和LMP2是在鼻咽癌中僅有的可誘發(fā)特異性免疫反應(yīng)的靶抗原，可作為治療性疫苗的靶點(diǎn)。
Khanna R通過(guò)構(gòu)建重組痘病毒，體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中觀察到LMPl特異的CTL反應(yīng)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中該疫苗能使腫瘤消退。Duraiswamy等用LMPl多表位聚合的疫苗可在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中觀察到LMPl特異的CTL反應(yīng)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中該疫苗能使腫瘤消退。以痘病毒或腺病毒載體的疫苗能夠刺激免疫系統(tǒng)，但是這也同時(shí)帶來(lái)病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)，特別是對(duì)于免疫缺陷的病人。
國(guó)內(nèi)曾毅等發(fā)明了一個(gè)攜帶EB病毒潛伏膜蛋白2的DNA編碼序列的復(fù)制缺陷型重組腺病毒，并提出了 3項(xiàng)申請(qǐng)。含EB病毒潛伏膜蛋白2基因的重組腺病毒疫苗，公開(kāi)號(hào)CN1548532 ;含重組質(zhì)粒和復(fù)制缺陷型重組腺病毒的聯(lián)合免疫制劑，公開(kāi)號(hào)CN1927405 ;含EB病毒潛伏膜蛋白2基因的Ad5F35-LMP2重組腺病毒疫苗，公開(kāi)號(hào)CN1907493，但該項(xiàng)研究也是基于腺病毒載體系統(tǒng)，然而腺病毒有致病性，應(yīng)用于免疫力低下的腫瘤患者會(huì)帶來(lái)感染風(fēng)險(xiǎn)。
為避免感染風(fēng)險(xiǎn)，就必須選取ー個(gè)安全、高效的適合治療的基因表達(dá)載體。重組腺相關(guān)病毒(又名依賴性腺聯(lián)病毒)是目前基因治療載體系統(tǒng)研究的熱點(diǎn)之一，同時(shí)也是最安全的ー種載體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的ー個(gè)目的是提供一種重組腺相關(guān)病毒，它攜帶有編碼EB病毒潛伏膜蛋白1，2的DNA序列。
本發(fā)明的另ー個(gè)目的是提供生產(chǎn)如上限定的重組腺相關(guān)病毒的方法，本發(fā)明的再ー個(gè)目的是提供如上限定的重組腺相關(guān)病毒作為EB病毒相關(guān)腫瘤的治療性疫苗的應(yīng)用。
本發(fā)明的病毒攜帯有編碼EB病毒潛伏膜蛋白1，2的DNA序列，已如2009年4月16日送中國(guó)武漢武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)CCTCCNO :V200907，分類命名依賴性腺聯(lián)病毒2型病毒rAAV-LMP2/l-hsp所述。[0011]本發(fā)明含EB病毒潛伏蛋白1，2基因的重組腺相關(guān)病毒，其中所說(shuō)的重組腺相關(guān)病韋的病韋滴度不小于I X 10n/ml viral particles。
本發(fā)明含EB病毒潛伏蛋白1，2基因的重組腺相關(guān)病毒，其中所說(shuō)的重組腺相關(guān)病毒可在體內(nèi)誘導(dǎo)EB病毒特異性細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞反應(yīng)。
制備本發(fā)明含EB病毒潛伏膜蛋白1，2基因的重組腺相關(guān)病毒，該方法包括
I)將編碼LMP1，LMP2和HSP70蛋白質(zhì)的DNA序列克隆到適當(dāng)?shù)南傧嚓P(guān)病毒載體質(zhì)粒中，得到攜帶LMP1，LMP2和HSP70之DNA編碼序列的重組腺相關(guān)病毒載體質(zhì)粒。
2)用步驟I的重組腺相關(guān)病毒載體質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)陌b細(xì)胞，得到所需的重組腺相關(guān)病毒。
根據(jù)本發(fā)明 方法的一個(gè)實(shí)施方案，其中所說(shuō)的腺相關(guān)病毒載體質(zhì)粒是質(zhì)粒pAAV (D+)。
根據(jù)本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案，其中所說(shuō)的腺相關(guān)病毒輔助質(zhì)粒是質(zhì)粒pHelper 和 pXX2。
根據(jù)本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案，其中所說(shuō)的腺相關(guān)病毒包裝細(xì)胞是293細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案，其中所說(shuō)的疫苗的靶抗原是EB病毒的潛伏膜蛋白I和2.
根據(jù)本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案，其中所說(shuō)的重組腺相關(guān)病毒可在體內(nèi)誘導(dǎo)抗EB病毒潛伏膜蛋白I和2特異性抗體生成反應(yīng)和特異性細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞反應(yīng)。
本發(fā)明用于基因治療具有顯著的優(yōu)點(diǎn)(I)抗原性，毒性很小，不致病，安全性好；
(2)基因組小而易于操作。大部分基因可被替代而保留感染能力；(3)感染譜廣，可感染分裂期和非分裂期細(xì)胞；(4)利用包裝細(xì)胞，在體外可制備高滴度病毒；放射線照射可以使病毒從潛隱感染進(jìn)入復(fù)制狀態(tài)，為基因治療聯(lián)合放射治療創(chuàng)造了條件。(5)可以有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)腦、骨骼肌、肝臟等許多類型的細(xì)胞。
同吋，我們利用熱休克蛋白HSP70與LMPl和LMP2構(gòu)建融合基因白。結(jié)核分枝桿菌HSP70不僅能誘導(dǎo)特異性Thl型細(xì)胞反應(yīng)，還直接參與和促進(jìn)抗原的提呈與識(shí)別，激活自然殺傷細(xì)胞，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌ILl a、ILl P、腫瘤壞死因子和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子等多種細(xì)胞因子，發(fā)揮類似免疫佐劑的功能，能夠增強(qiáng)針對(duì)LMPl和LMP2表位的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)。


圖lrAAV-LMP2/l_HSP重組腺相關(guān)病毒載體質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖
圖2被免疫BABL/c小鼠血清中LMP2抗體的檢測(cè)
rAAV-LMP2/l-HSP免疫小鼠的可誘導(dǎo)特異性的體液免疫。
圖3rAAV LMP2/1CTL-HSP 疫苗誘導(dǎo)的 CTL 反應(yīng)
圖3aSP2/0_LMP2 細(xì)胞；
圖3b SP2/0 細(xì)胞；
圖 3cSP2/0 細(xì)胞 +LMP2p印tide131_139，
圖3dSP2/0細(xì)胞+非特異性肽。
結(jié)果顯示，rAAV-LMP2/l-HSP免疫后的小鼠對(duì)SP2/0-LMP2細(xì)胞有明顯的CTL效應(yīng)[0032]圖4重組腺相關(guān)病毒疫苗的預(yù)防性作用(A)五天監(jiān)測(cè)一次腫瘤直徑，計(jì)算腫瘤體積；(B) 5周后殺死小鼠，腫瘤稱重。結(jié)果顯示，rAAV-LMP2/l-HSP免疫小鼠的腫瘤生長(zhǎng)明顯抑制。
圖5重組腺相關(guān)病毒疫苗的治療性作用rAAV-LMP2/l_HSP免疫小鼠的生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)例用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1 :rAAV-LMP2/l_HSP重組腺相關(guān)病毒的構(gòu)建
1. pAAV-LMP2/l-HSP重組腺相關(guān)病毒載體質(zhì)粒的構(gòu)建
(I)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備
取出-80°C保 存的E. Coli DH5 a菌種，用接種環(huán)挑取少量菌液在LB瓊脂板上劃線，37°C倒置培養(yǎng)過(guò)夜；次日挑取單個(gè)DH5a菌落，接種于3ml LB培養(yǎng)基(不含抗生素，)中，置37°C搖床280rpm振搖過(guò)夜；次日取上述菌液0. 5ml接種于50mlLB培養(yǎng)基中，37°C搖床280 300rpm振搖至菌液OD值A(chǔ)600達(dá)到0. 4 0. 6時(shí)取出；4°C 5，OOOrpm離心IOmin,棄上清，用20ml預(yù)冷CaCl2 (0. lmol/L)重懸細(xì)菌,冰浴30min后4°C 5, OOOrpm離心IOmin,同樣棄上清，再用2ml預(yù)冷CaCl2 (0. lmol/L)重懸細(xì)菌；按每管IOOiU分裝后繼續(xù)冰浴Ih以上或置4°C過(guò)夜后即可使用。如要長(zhǎng)期保存，可加入30%甘油，置于_80°C冰箱保存。
(2)質(zhì)粒的小量制備、酶切和電泳分析
為了小量制備攜帶LMPl、LPM2 和 HSP70 基因的質(zhì)粒 pMD18T_LMPl、pMD18T_LMP2pMD18T-HSP70(均為本試驗(yàn)室克隆和構(gòu)建)，首先按已知方法用質(zhì)粒(Iyl)轉(zhuǎn)化如上的大腸桿菌細(xì)胞。取連接反應(yīng)物10 Ul加入200 ill感受態(tài)細(xì)菌中，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，冰上放置30分鐘JfEp管放入42°C熱水浴中，恰恰放置90秒，不要搖動(dòng)。快速將Ep管轉(zhuǎn)移到冰上，使細(xì)菌冷卻2分鐘；加入無(wú)抗生素的LB培養(yǎng)基600 u 1，輕輕吹打，置37°C搖床200轉(zhuǎn)/分緩慢振搖45分鐘，使細(xì)菌復(fù)蘇；然后取100 u I菌液均勻涂布于含100 u g/ml氨芐青霉素，1.5%瓊脂的LB固體培養(yǎng)平板上，室溫放置數(shù)分鐘，待接種物吸收后，置于37°C培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)12 16小時(shí)，直至有菌落長(zhǎng)出。
(3)堿裂解法快速小量制備質(zhì)粒DNA
隨機(jī)挑取單個(gè)菌落接種于3ml含100 U g/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C搖床280轉(zhuǎn)/分振搖過(guò)夜至細(xì)菌生長(zhǎng)至飽和狀態(tài)；取1. 5ml菌液轉(zhuǎn)入EP管中，10，OOOrpm離心30秒，棄上清；加入100 u I預(yù)冷的溶液I，劇烈振蕩重懸細(xì)菌；加入200 u I溶液II，上下顛倒數(shù)次混勻；加入150 u I預(yù)冷的溶液III，顛倒數(shù)次混勻，冰上放置5分鐘，12，OOOrpm離心10分鐘；將上清轉(zhuǎn)移至一新EP管中，加入2倍體積的無(wú)水こ醇混勻，室溫靜置數(shù)分鐘，12，OOOrpm離心15分鐘，棄上清，用70%的こ醇洗沉淀一次；空氣干燥數(shù)分鐘后，加入適量TE(10mmol/L Tris-HCL, ImmoI/L EDTA，pH8. 0)，置于 _20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>(4)測(cè)序鑒定
將提取的重組質(zhì)粒送上海生エ公司測(cè)序鑒定。
(5)重組中間質(zhì)粒的構(gòu)建和酶切鑒定
分別用HindIII和ApaI雙酶切消化帶有CMV啟動(dòng)子的腺相關(guān)病毒載體質(zhì)粒pAAV(D+)和帶有LMP2片段的質(zhì)粒PMD18T-LMP2，然后用玻璃奶回收pAAV(D+)的載體片段和pMD18T-LMP2的目的基因片段，按1: 5比例混合，加入10XT4DNA連接酶緩沖液和T4連接酶(反應(yīng)體積10 yl)，16°C連接過(guò)夜。然后，用所得到的連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞。
以堿裂解法提取如上得到的中間質(zhì)粒pAAV (D+) -LMP2。分別用ApaI和Bam HI雙酶切消化中間質(zhì)粒pAAV(D+)-LMP2和帶有LMPl片段的質(zhì)粒pMD18T_LMPl，然后用玻璃奶回收pAAV(D+)-LMP2的載體片段和PMD18T-LMP1的目的基因片段，按1: 5比例混合，加入10父了40嫩連接酶緩沖液和了4連接酶(反應(yīng)體積10 yl)，16°C連接過(guò)夜。然后，用所得到的連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞。
以堿裂解法提取如上得到的中間質(zhì)粒pAAV (D+) -LMP2/1。
分別用BamHI和XbaI雙酶切消化中間質(zhì)粒pAAV (D+) -LMP2/1和帶有HSP70片段的質(zhì)粒PMD18T-HSP70，然后用玻璃奶回收pAAV(D+) -LMP2/1的載體片段和pMD18T_HSP70的目的基因片段，按1: 5比例混合，加入IOX T4DNA連接酶緩
分別用BamHI和XbaI雙酶切消化中間質(zhì)粒pAAV (D+) -LMP2/1和帶有HSP70片段的質(zhì)粒pMD18T-HSP70，然后用玻璃奶回收pAAV (D+)-LMP2/1的載體片段和pMD18T_HSP70的目的基因片段，按1: 5比例混合，加入10XT4DNA連接酶緩沖液和T4連接酶(反應(yīng)體積10 ill)，16°C連接過(guò)夜。然后，用所得到的連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞。
以堿裂解法提取如上得到的中間質(zhì)粒pAAV(D+)-LMP2/l-HSP。(見(jiàn)圖1)
2重組腺相關(guān)病毒的包裝
(I) pXX2、phe Iper、pAAV (D+) -LMP2/1-HSP 和 pAAV (D+) -GFP 質(zhì)粒的大提挑取酶切鑒定正確的陽(yáng)性克隆單菌落，接種于5ml含IOOii g/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C搖床280 300rpm振搖培養(yǎng)過(guò)夜；將此菌液加入含900ml TB培養(yǎng)基(含100 y g/ml氨芐青霉素)的3L燒瓶中，37°C搖床280 300rpm振搖培養(yǎng)至飽和狀態(tài)；采用質(zhì)粒大量提取法大量制備所需質(zhì)粒DNA。首先5，OOOrpm離心IOmin沉淀細(xì)菌，每升菌液加入30ml溶液I，劇烈振蕩重懸細(xì)菌；接著每升菌液加入60ml溶液II，上下顛倒離心管數(shù)次混勻；每升菌液加入45ml溶液III，同樣上下顛倒離心管數(shù)次混勻，置冰上10分鐘，4°C 14，OOOg離心15min ;將上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中；加入0. 6倍體積異丙醇，混勻，_20°C放置30min，4°C 14，OOOg離心15min ;用4ml TE重懸沉淀，加等體積預(yù)冷的5M氯化鋰溶液冰上放置30分鐘，4°C 8，OOOg離心IOmin ;將上清轉(zhuǎn)移到另ー離心管中，加入0. 6倍體積的異丙醇充分混勻，-20°C放置30分鐘；4°C 8，OOOg離心IOmin ;棄上清，70 %こ醇洗一次，晾干；加入2mlTE (PH8. 0)，溶解沉淀；加入RNA酶，終濃度20iig/ml，37°C作用2小時(shí)以上。
(2)質(zhì)粒的純化
取1. 5L菌液大提質(zhì)粒置于50ml離心管中，加入10_15ml Merlin BidingBuffer,3-5ml Merlin Resin Slurry(用前劇烈震蕩)；混合液置于搖床上搖動(dòng)至少20分鐘；將濾柱和聚こ烯管連接負(fù)壓裝置，將振蕩混合后的混合液裝入濾柱中，在負(fù)壓下形成Resin沉積層；待沉積層抽吸干燥后，再用25ml Merlin-5洗2次，同樣通過(guò)負(fù)壓吸引裝置將洗滌液吸棄；向?yàn)V柱中加入預(yù)熱的TElml (70-800C )后2500rpm離心5分鐘洗脫質(zhì)粒DNA ;將洗脫的質(zhì)粒DNA加入2倍體積的無(wú)水こ醇，1/20體積的醋酸鈉溶液，-20°C放置30分鐘，8，OOOg離心lOmin，70%こ醇洗滌一次，干燥后，無(wú)菌TE溶解；_20°C保存?zhèn)溆谩?br>(3)細(xì)胞的復(fù)蘇和傳代
取液氮凍存的293細(xì)胞一管37°C快速融化，接種于培養(yǎng)瓶中，用含10%小牛血清DMEN培養(yǎng)基置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)成均勻單層細(xì)胞并達(dá)90%以上聚集度時(shí)傳代。吸出培養(yǎng)基，加入0.25%胰蛋白酶，室溫下短暫消化，置于顯微鏡下觀察至細(xì)胞皺縮、變圓時(shí)，立即吸棄胰蛋白酶，加入含培養(yǎng)基，反復(fù)吹打成細(xì)胞懸液后分瓶傳代。
(4) rAAV-LMP2/l-HSP 和 rAAV-GFP 病毒的包裝
三質(zhì)粒鈣磷共轉(zhuǎn)染法
在直徑為15cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)將293細(xì)胞按1: 1_1 3的比例傳代；待細(xì)胞至75-80%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前3小時(shí)換培養(yǎng)基，按以下方法配制鈣磷混合液
I) 15cm培養(yǎng)皿中加入質(zhì)?？偭繛?0微克，三種質(zhì)粒摩爾比1:1 : 1，質(zhì)量比例為
phelper25 微克
pXX26. 25 微克
pAAV (D+) -LMP2/1-HSP (或 pAAV (D+) -GFP)18. 75 微克
2)將質(zhì)粒加入到0. 25MCaCl2溶液中，每盤(pán)需2ml CaCl2
3)將配制的混合液置于漩渦震蕩器上(轉(zhuǎn)速800-1000rpm/min)，再向其中加入2XHEBS,每盤(pán)需2ml2XHEBS，震蕩10-20秒，充分混勻后，每盤(pán)滴入4ml混合液。振搖混合液逐滴加入，以形成較小的鈣磷顆粒。
過(guò)6-16小時(shí)后，換無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基。
(5)病毒收集
轉(zhuǎn)染后72小時(shí)吸棄培養(yǎng)基，離心800rpmX 10分鐘，棄上清，留沉淀；PBS10ml輕輕吹打盤(pán)子里的細(xì)胞，將盤(pán)子里的細(xì)胞清洗干凈，轉(zhuǎn)至離心管，SOOrpmX 10分鐘離心；棄上清，重復(fù)步驟2 ;用PBS重懸細(xì)胞沉淀,800rpmX 10分鐘離心，留取沉淀,盡可能除盡培養(yǎng)基；用10mMTris+15mMNaCl(PH8. 0)或I XPBS溶液充分溶解細(xì)胞(lml/15cm培養(yǎng)皿)可直接進(jìn)入后面的凍融程序，也可將其存放于-80度；細(xì)胞反復(fù)凍融3-4次；離心IOOOrpmX 10分鐘，取上清-80度保存。
(6)病毒的純化
病毒上清加入等體積冰冷的飽和硫酸銨(PH7. 0)，冰上放置20分鐘，15，OOOg離心IOmin0沉淀用氯化銫-PBS溶液(PH7. 5)(密度1. 38g/ml)溶解，加入0. 5ml氯化銫-PBS緩沖液(密度1. 5g/ml)，40，OOOrpm離心48小吋，收集病毒帯，如上所述再次離心48小吋。最后，收集病毒帶，用DMEM進(jìn)行透析。
實(shí)施例2 rAAV-LMP2/l-HSP和rAAV-GFP病毒滴度的測(cè)定
(I)探針標(biāo)記
采用隨機(jī)引物法標(biāo)記試劑盒(Random Primer Labeling Kit,Promega),將載體中的CMV啟動(dòng)子片段標(biāo)記[a -32p] dCTP作為探針
溶解CMV于消毒TE中，濃度為25 u g/mL, 100°C煮沸2min立即置于冰上；
冰上依次加入下列反應(yīng)物
成分量終濃度[0078]5X標(biāo)記緩沖液IOiilIX
dNTPs 混合物2 U I20 U M/ 每種
CMV 模板IU I500ng/ml
BSA2u I400 U g/ml
[a-32P]-dCTP(3000Ci/mmol) 5u I333nM
Klenow 酶IU IlOOu/ml
滅菌水29 u I
總量50 U I
將上述反應(yīng)物輕輕混勻，室溫孵育60min ；
100°C煮沸2min后立即置于冰上；
加入EDTA至終濃度為20mM終止反應(yīng)，直接用于雜交反應(yīng)或_20°C保存?zhèn)溆谩?br>(2)滴度測(cè)定
將含有病毒的293細(xì)胞反復(fù)凍融三次，8，OOOrpm離心(4°C，15min)收集上清，除去細(xì)胞碎片。
取40 ill含有病毒的上清液按下列反應(yīng)體系除去其中游離的DNA和RNA
rAAV-CRP(rAAV-GFP)40U I
IOXDNase 緩沖液20 U I
DNase IIU I
RNase4 U I
無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基135 y I
于37°C 孵育 3h
上述反應(yīng)液200 U I再按下列反應(yīng)體系除去其中的DNase和RNase，及去除病毒的蛋白質(zhì)外殼。
上述反應(yīng)液200 V-1
2X蛋白酶K緩沖液200iU
蛋白酶KIOu I
于37で孵育3h
加入等體積的酚氯仿異戊醇(25 24 I)抽提一次，12，000gX15min(4°C)回收水相，再用等體積的氯仿抽提一次，回收水相；取含有病毒DNA水相加入等體積的0. 4MNaOH/1OmM EDTA溶解變性；將含有已知分子數(shù)的對(duì)照質(zhì)粒和步驟4的病毒DNA溶液分別于沸水加熱5min后，冰上冷卻2分鐘，隨后用0. 4MNa0H/10mM EDTA各按一定的比例稀釋；裁ニ張與抽濾加樣器一祥大小的濾紙，用6XSSC浸濕，然后平鋪于加樣器的夾層中；
將預(yù)裁減好的尼龍膜，用去離子水浸泡，再置于6XSSC中讓其自然浸沒(méi)，浸泡IOmin后，置于斑點(diǎn)雜交儀夾層中的雙層濾紙上。將尼龍膜鋪平后，將斑點(diǎn)雜交儀的頂層按要求安裝好，并確保裝置中不漏氣；連接真空泵與抽濾加樣器，每孔加400 Ul去離子水，真空抽干；將對(duì)照質(zhì)粒和病毒DNA按稀釋順序分別點(diǎn)樣，同時(shí)真空抽干。每孔再加400 ii 1，0.4M NaOH/1 OmM EDTA，清洗一次并抽干；拆卸裝置，將膜置于ー張浸過(guò)變性液的濾紙上，放置lOmin，將膜轉(zhuǎn)至一張濾紙上，晾干；將膜夾于2張濾紙之間，放在干烤箱中，80°C烤膜2小時(shí)；將膜正面朝外，置于雜交瓶中，加入預(yù)雜交液5ml，在雜交爐中42°C預(yù)雜交I小時(shí)；將CMV片段用隨機(jī)引物法(Primer-1t II Random Primer LabelingKit)按說(shuō)明要求標(biāo)記[a -32P] dCTP作為探針。標(biāo)記好的CMV探針于100°C變性lOmin，之后冰浴2min。加入預(yù)雜交液中雜交12 16小時(shí);棄雜交液，用2XSSC/0. 1%505和0.5父55〇/0. 1%SDS于42°C條件下洗膜各3次，每次進(jìn)行15min ；0.1X SSC/0.1 % SDS于56°C條件洗膜2次，每次30min ；取出尼龍膜在室溫下用2XSSC漂洗膜，并吸干多余的液體，用塑料薄膜包裹后于-80°C放射自顯影2 3小時(shí)；根據(jù)樣本病毒DNA和對(duì)照質(zhì)粒的斑點(diǎn)強(qiáng)度，確定病毒的滴度。
實(shí)施例3 rAAV-LMP2/l-HSP的免疫活性分析
常規(guī)培養(yǎng)BALB/c骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0細(xì)胞)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)中期時(shí)，以脂質(zhì)體法(Lipofectamine 2000Reagent, Invitrogen)用攜帶LMP2基因序列的重組質(zhì)粒p⑶NA3. 1-LMP2轉(zhuǎn)染之。轉(zhuǎn)染后，用含10%牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)24小時(shí)，然后換成含600 ii g/ml G418的選擇培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。三周后得到有穩(wěn)定抗性的陽(yáng)性細(xì)胞。繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)后，將其用作靶細(xì)胞。4周齡BALB/c (H-2d)雄性小鼠隨機(jī)分為2組，每組6只，按每只動(dòng)物5X 101°病毒顆粒數(shù)經(jīng)肌肉注射的途徑分別用本大名的重組腺相關(guān)病毒和對(duì)照病毒，免疫動(dòng)物。第4周加強(qiáng)免疫一次。第6周采血并分離血清進(jìn)行抗體檢測(cè)，然后處死動(dòng)物分離脾細(xì)胞進(jìn)行CTL活性分析。
(I) rAAV-LMP2/l-HSP誘發(fā)的小鼠LMP2特異性抗體生成
使用LMP2抗原肽PYLFWLAAI包板，以常規(guī)間接酶聯(lián)免疫法檢測(cè)被免疫小鼠血清內(nèi)抗LMP2特異性抗體的滴度。rAAV LMP2/1CTL-HSP免疫小鼠后，可誘導(dǎo)特異性的體液免疫反 應(yīng)。
(見(jiàn)圖2)
(2) rAAV-LMP2/l-HSP 誘發(fā)的小鼠 LMP2 特異性 CTL 反應(yīng)
使用被免疫小鼠的脾淋巴細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，并使用SP2/0-LMP2細(xì)胞作為靶細(xì)胞，以乳酸脫氫酶法檢測(cè)接種了本發(fā)明的重組腺相關(guān)病毒之小鼠的LMP2特異性細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞(CTL)活性殺傷率)。結(jié)果顯示，rAAV LMP2/1CTL-HSP免疫后的小鼠對(duì)SP2/0-LMP2細(xì)胞有明顯的CTL效應(yīng)(見(jiàn)圖3)
實(shí)施例4 :腫瘤攻擊實(shí)驗(yàn)
(I)疫苗的預(yù)防作用
4周齡BALB/c雄性小鼠隨機(jī)分為3組，每組12只。按每只動(dòng)物5X 101°病毒顆粒數(shù)的劑量經(jīng)肌肉注射的途徑分別用本發(fā)明的重組腺相關(guān)病毒rAAV-LMP2/l-hsp、rAAV GFP和生理鹽水免疫動(dòng)物。免疫后3周，每組分別接種SP2/0-LMP2細(xì)胞或SP2/0野生型細(xì)胞(106CellS/mOUSe)，各6只。接種后動(dòng)態(tài)檢測(cè)30天，游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤直徑(見(jiàn)圖4A)。第30天，處死動(dòng)物，稱量腫瘤重量，結(jié)果顯示，rAAV LMP2/1CTL-HSP免疫小鼠的腫瘤生長(zhǎng)明顯抑制。(見(jiàn)圖4B)
(2)疫苗的治療作用
4周齡BALB/c雄性小鼠隨機(jī)分為2組，每組10只，接種SP2/0-LMP2細(xì)胞(106CellS/mOUSe)。接種10天后，按每只動(dòng)物5X IOltl病毒顆粒數(shù)的劑量經(jīng)肌肉注射的途徑分別用本發(fā)明的重組腺相關(guān)病毒rAAV-LMP2/l-hsp、rAAV GFP免疫動(dòng)物，每種病毒各10只。接種后動(dòng)態(tài)檢測(cè)32天，可見(jiàn)rAAV LMP2/1CTL-HSP免疫小鼠的生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)。(見(jiàn)圖5)
權(quán)利要求
1.含EB病毒潛伏蛋白1，2基因的重組腺相關(guān)病毒，特征在于該病毒保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC NO :V200907，分類命名為依賴性腺聯(lián)病毒2型病毒rAAV-LMP2/l-hsp0
2.權(quán)利要求
1所述的含EB病毒潛伏蛋白1，2基因的重組腺相關(guān)病毒在制備EB病毒相關(guān)腫瘤的治療性疫苗的應(yīng)用。
專利摘要
制備含EB病毒潛伏膜蛋白1，2基因的重組腺相關(guān)病毒及其應(yīng)用，本發(fā)明它攜帶有編碼EB病毒潛伏膜蛋白1，2的DNA序列，如CCTCC NOV200907所述。其中所說(shuō)的重組腺相關(guān)病毒的病毒滴度不小于1×1011/ml viral particles。所說(shuō)的重組腺相關(guān)病毒可在體內(nèi)誘導(dǎo)EB病毒特異性細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞反應(yīng)。制備本發(fā)明方法包括1)將編碼LMP1，LMP2和HSP70蛋白質(zhì)的DNA序列克隆到適當(dāng)?shù)南傧嚓P(guān)病毒載體質(zhì)粒中，得到攜帶LMP1，LMP2和HSP70之DNA編碼序列的重組腺相關(guān)病毒載體質(zhì)粒。2)用步驟1的重組腺相關(guān)病毒載體質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)陌b細(xì)胞，得到所需的重組腺相關(guān)病毒。
文檔編號(hào)C12N15/85GKCN101775375 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請(qǐng)?zhí)朇N 200910063378
公開(kāi)日2013年4月10日 申請(qǐng)日期2009年7月31日
發(fā)明者汪道文, 潘建青, 肖嘯 申請(qǐng)人:華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (2), 非專利引用 (6),