專利名稱:抗乙型肝炎病毒尼古丁藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種組合物，尤其是涉及一種用尼古丁處理樹突狀細(xì)胞的方法，以及用HBV抗原HBe、HBx負(fù)載尼古丁處理后樹突狀細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
乙型肝炎病毒(Hepatisis B virus,HBV)引起的病毒性肝炎是嚴(yán)重威脅人類健康的常見病和多發(fā)病，目前，全世界有乙型肝炎病毒(HBV)感染者約3.5億，中國(guó)占1/3以上，約為1.2億，其中有1/4約3000萬(wàn)為慢性乙型肝炎患者。因此，研究慢性乙型肝炎預(yù)防和治療的措施已成為生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。
RongQ等人以分子生物學(xué)手段對(duì)HBV在肝外組織的存在狀態(tài)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，HBV不僅可在肝細(xì)胞中增殖，而且可在包括淋巴細(xì)胞、心肌細(xì)胞、腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞等多種細(xì)胞中增殖和潛伏。肝外組織中HBV的潛伏可逃避以肝細(xì)胞特異性受體為特異靶點(diǎn)的免疫治療的打擊，成為HBV慢性化的根源之一。Agostini C等的研究發(fā)現(xiàn)，HBV在淋巴細(xì)胞中的存在可影響淋巴細(xì)胞的增殖分化與功能，肝臟內(nèi)HBV特異性CTL (殺傷性T細(xì)胞)的失能以及機(jī)體對(duì)HBV抗原的免疫耐受是HBV感染慢性化的關(guān)鍵。
病毒感染細(xì)胞的清除主要依靠適應(yīng)性免疫應(yīng)答產(chǎn)生的病毒抗原特異性CTL，以及適應(yīng)性免疫應(yīng)答和固有免疫應(yīng)答過(guò)程中分泌的IFN-Y等細(xì)胞因子。樹突狀細(xì)胞作為適應(yīng)性免疫應(yīng)答的啟動(dòng)者，是目前所知抗原提呈功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞(antigenpresenting cell，APC)，而且是連接適應(yīng)性免疫和固有免疫的橋梁。對(duì)樹突狀細(xì)胞的研究有助于深入了解機(jī)體免疫應(yīng)答的產(chǎn)生和調(diào)控機(jī)制。通過(guò)人為干預(yù)樹突狀細(xì)胞的功能來(lái)調(diào)控機(jī)體的免疫應(yīng)答，以達(dá)到對(duì)HBV病毒感染的治療作用，對(duì)乙型肝炎的防治具有重要的實(shí)際意義。[0005]隨著對(duì)HBV慢性化進(jìn)程中免疫細(xì)胞失能和免疫逃逸機(jī)制的深入研究，以HBV抗原特異性CTL過(guò)繼免疫和固有分子TRM22抗HBV研究也逐步開展。蔡大川等以人HBsAg負(fù)載的人臍血來(lái)源的樹突狀細(xì)胞與同源靶細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)行混合培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)樹突狀細(xì)胞可在體外特異性殺傷HBsAg負(fù)載的靶細(xì)胞。HBV抗原負(fù)載的樹突狀細(xì)胞雖然可在HBV轉(zhuǎn)基因鼠體內(nèi)成功打破已有的免疫耐受，誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)抗原的特異性免疫應(yīng)答，但此類樹突狀細(xì)胞在體內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的效率有待于進(jìn)一步提高。經(jīng)細(xì)胞因子IL-15、IL-4、IL-18、IFN-Y刺激或其基因轉(zhuǎn)染，聯(lián)合抗原負(fù)載以增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)效率的研究方興未艾，但上述方法有操作復(fù)雜、價(jià)格昂貴、活性不穩(wěn)定的缺點(diǎn)而限制其在臨床的廣泛應(yīng)用。
乙酰膽堿煙堿樣受體(nicotineacetylcholine receptor, nAchR)在神經(jīng)系統(tǒng)和非神經(jīng)細(xì)胞(如免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞)中有廣泛的表達(dá)。nAchR配體——尼古丁，是由芳族六元環(huán)(吡啶)和脂族五元環(huán)(吡咯烷)通過(guò)單鍵連接而形成的天然化合物。提純后的尼古丁是一種味苦、無(wú)色透明的油質(zhì)液體，揮發(fā)性強(qiáng)，在空氣中極易氧化成暗灰色，能迅速溶于水及酒精中，通過(guò)口鼻支氣管粘膜很容易被機(jī)體吸收，粘在皮膚表面的尼古丁亦可被吸收滲入體內(nèi)。它具有性質(zhì)穩(wěn)定、易于獲得和價(jià)廉的優(yōu)點(diǎn)。[0007]尼古丁的英文通用名稱為nicotine，中文化學(xué)名稱為(S)_3_(1-甲基_2_吡咯燒基)卩比唳，英文化學(xué)名稱為(S)-3-(l-Methyl-2-pyrrolidinyl)pyridine,國(guó)際編號(hào)為61868，CAS編碼為54-11-5，其結(jié)構(gòu)式為:
權(quán)利要求
1.一種抗乙型肝炎樹突狀細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述抗乙型肝炎樹突狀細(xì)胞為抗乙型肝炎樹突狀細(xì)胞表面⑶80、⑶86、⑶40、CCR7表面分子的表達(dá)量顯著增加，表明細(xì)胞處于活化狀態(tài)，激活乙型肝炎病毒e抗原和乙型肝炎病毒X抗原特異性T細(xì)胞的能力顯著增強(qiáng)；MHC I類分子表達(dá)增加，表明此細(xì)胞具有更強(qiáng)的提呈乙型肝炎病毒e抗原和乙型肝炎病毒X抗原的能力； 所述制備方法包括以下步驟: 1)將未成熟的樹突狀細(xì)胞在培養(yǎng)液中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)液為RPMIMedium 1640培養(yǎng)液，在RPMI Medium 1640培養(yǎng)液中含有摩爾濃度為I X 1(Γ8 I X l(T6mol/L的尼古丁 ； 2)使乙型肝炎病毒e抗原，或/和 乙型肝炎病毒X抗原，與 步驟I)中經(jīng)尼古丁處理的樹突狀細(xì)胞接觸； 3)收集樹突狀細(xì)胞，即得到抗乙型肝炎樹突狀細(xì)胞。
2.按權(quán)利要求
1所述的一種抗乙型肝炎樹突狀細(xì)胞的制備方法，其特征在于在步驟I)中，所述未成熟的樹突狀細(xì)胞為獲自哺乳動(dòng)物的未成熟樹突狀細(xì)胞。
3.按權(quán)利要求
1所述的一種抗乙型肝炎樹突狀細(xì)胞的制備方法，其特征在于在步驟I)中，所述尼古丁的摩爾濃度為I X l(T7mol/L。
4.按權(quán)利要求
1或3所述的一種抗乙型肝炎樹突狀細(xì)胞的制備方法，其特征在于在步驟I)中，所述尼古丁的來(lái)源為化學(xué)合成或提取自天然植物，所述天然植物選自煙草、番茄或枸杞子 。
5.按權(quán)利要求
1所述的一種抗乙型肝炎樹突狀細(xì)胞的制備方法，其特征在于在步驟I)中，所述尼古丁為尼古丁水溶液。
6.按權(quán)利要求
1所述的一種抗乙型肝炎樹突狀細(xì)胞的制備方法，其特征在于在步驟I)中，所述培養(yǎng)的時(shí)間為12 16h。
7.按權(quán)利要求
6所述的一種抗乙型肝炎樹突狀細(xì)胞的制備方法，其特征在于所述培養(yǎng)的時(shí)間為12 14h。
8.按權(quán)利要求
7所述的一種抗乙型肝炎樹突狀細(xì)胞的制備方法，其特征在于所述培養(yǎng)的時(shí)間為12h。
9.按權(quán)利要求
1所述的一種抗乙型肝炎樹突狀細(xì)胞的制備方法，其特征在于在步驟2)中，所用HBe、HBx抗原濃度為I 10 μ g/ml,所述HBV的抗原HBeAg、HbxAg來(lái)自重組工程菌所表達(dá)的蛋白；所述接觸的時(shí)間為4 6h。
10.按權(quán)利要求
9所述的一種抗乙型肝炎樹突狀細(xì)胞的制備方法，其特征在于所用HBe、HBx抗原濃度為I 5 μ g/ml，所述接觸的時(shí)間為6h。
11.按權(quán)利要求
10所述的一種抗乙型肝炎樹突狀細(xì)胞的制備方法，其特征在于所用HBe、HBx抗原濃度為I 2 μ g/ml。
12.按權(quán)利要求
11所述的一種抗乙型肝炎樹突狀細(xì)胞的制備方法，其特征在于所用HBe、HBx抗原濃度為I μ g/ml。
專利摘要
抗乙型肝炎病毒尼古丁藥物組合物，涉及一種組合物。提供一種抗乙型肝炎樹突狀細(xì)胞及其制備方法，以及抗乙型肝炎樹突狀細(xì)胞在制備用于預(yù)防和/或治療乙型肝炎藥物中的應(yīng)用。將未成熟的樹突狀細(xì)胞在培養(yǎng)液中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)液為RPMI Medium 1640培養(yǎng)液，在RPMI Medium 1640培養(yǎng)液中含有尼古?。皇挂倚透窝撞《緀抗原，或/和乙型肝炎病毒x抗原，與經(jīng)尼古丁處理的樹突狀細(xì)胞接觸；收集樹突狀細(xì)胞，即得到抗乙型肝炎樹突狀細(xì)胞。所述抗乙型肝炎樹突狀細(xì)胞可應(yīng)用于制備用于預(yù)防和/或治療乙型肝炎藥物。用于預(yù)防和/或治療乙型肝炎藥物包括抗乙型肝炎樹突狀細(xì)胞和藥學(xué)上可接受的載體。
文檔編號(hào)C12N5/0784GKCN101693885 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請(qǐng)?zhí)朇N 200910112670
公開日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2009年10月16日
發(fā)明者李海濤, 高豐光, 倪曉妍 申請(qǐng)人:廈門大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (2), 非專利引用 (2),