專利名稱:治療或預防癌癥的多肽或衍生產(chǎn)品及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及多肽及其用途，尤其涉及能治療或預防癌癥的多肽，本發(fā)明還涉及由該肽所衍生的具有治療或預防癌癥功效的產(chǎn)品，本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域。
背景技術：
近年來我國惡性腫瘤的發(fā)病率呈明顯上升趨勢，腫瘤已經(jīng)成為嚴重威脅著人類安全和健康的主要疾病之一。中國衛(wèi)生部的統(tǒng)計資料表明目前中國每年新生腫瘤患者總數(shù)約220萬人左右，其中，每年有121萬左右的惡性腫瘤新生患者，占中國每年新生腫瘤患者總數(shù)的55% ；同時，全國約有310萬左右的腫瘤現(xiàn)有患者，其中，惡性腫瘤現(xiàn)有患者約182 萬左右，占中國現(xiàn)有腫瘤患者總數(shù)58%。目前，化療仍是腫瘤治療的主要手段之一，可以預見，隨著腫瘤發(fā)病率的增長，對抗腫瘤藥物的需求將進一步增加。
順氯氨鉬是上世紀60年代首先發(fā)現(xiàn)的金屬絡合物，具有抗腫瘤活性，1971年臨床證實順氯氨鉬對人體的某些腫瘤有強烈的抑殺作用。順氯氨鉬的抗瘤譜較廣，是目前治療乳腺癌、卵巢癌、睪丸癌的一線藥物(李以欣(譯)“癌癥化學治療的首選藥物”國外醫(yī)藥-合成藥生化藥制劑分冊，89-101，19，1998)，并常與其它化療藥如依托泊苷、博來霉素、 阿霉素以及5-氟尿嘧啶合用來治療頭部、頸部的癌癥以及胃癌等。順氯氨鉬抗癌藥物的主要缺點有(1)毒副反應嚴重包括腎毒性、胃腸道毒性、耳毒性及神經(jīng)毒性；( 對某些瘤細胞活性較低如乳腺癌、結腸癌等；C3)易產(chǎn)生耐藥性；(4)水溶性小，在體內(nèi)不易代謝； (5)須注射給藥(余邦良等，“鉬類抗癌藥物研究進展”海南大學學報自然科學版，72-80， 23,2005)。因此，提高抗腫瘤化療藥物的藥效和降低藥物對正常組織細胞的毒性是醫(yī)藥學界一直不斷努力的研究目標。
從公開號為CN 1816564A(
公開日期2006年8月9日)的中國專利申請中了解到 RasGAP317^326肽能加強順氯氨鉬殺傷癌細胞的能力，RasGAP317^326肽必須和能殺傷癌細胞的化療藥物合用才能發(fā)揮作用，并且該肽的增敏作用有限；而且當順氯氨鉬的濃度為0 μ M時它對癌細胞沒有抑制作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種能治療或預防癌癥的多肽及其衍生產(chǎn)品，所述多肽或其衍生產(chǎn)品不僅能單獨用于治療或預防癌癥，而且其與基因毒素聯(lián)用時能顯著增強基因毒素選擇性地殺傷癌細胞的能力。
本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究后發(fā)現(xiàn)，一種具有下述技術方案中的所列的特征的多肽可以達到上述目的。
一種能治療或預防癌癥的多肽，其氨基酸序列為SEQ ID NO. 1所示。
一種能治療或預防癌癥的多肽，其氨基酸序列為SEQ ID NO. 2所示。
一種分離和純化的核苷酸序列，其能編碼SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列的多肽。[0010]一種表達載體，包括至少一個拷貝的編碼氨基酸序列為SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2所示多肽的核苷酸序列。
一種原核或真核宿主細胞，該宿主細胞含有上述表達載體。
本發(fā)明還進一步提供了將SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2所述的多肽與能增加其在細胞中積累的制劑相綴合或混合后所得到的產(chǎn)品。
上述與所述肽綴合的制劑是能協(xié)助所述肽穿透細胞膜的載體。SEQ IDN0. 1或 SEQ ID NO. 2所述的肽和能協(xié)助肽穿透細胞膜的載體，如HIV48-57肽，F(xiàn)HV-外被35-49肽， HTLV-II Rex 4_16肽或BMV gag7_25肽綴合，綴合后生成的化合物可以有效的通過細胞膜， 在癌細胞局部起作用，因此具有更強的殺傷癌細胞的效果。
能與SEQ ID NO. 1或SEQ ID N0. 2所述的多肽綴合的制劑還可以是納米材料、脂質體或油性化合物。
SEQ ID NO. 1或SEQ ID N0. 2所述的多肽和納米材料、脂質體等高分子材料綴合， 綴合后生成的化合物可以使本發(fā)明涉及的多肽在機體內(nèi)更穩(wěn)定地被運輸?shù)桨屑毎?。本發(fā)明涉及的多肽也可以和油性化合物或多種油性化合物的混合物相混合，所得到的混合物也可以使本發(fā)明多肽在機體內(nèi)更穩(wěn)定地被運輸?shù)桨屑毎?br>一種治療或預防癌癥的藥用組合物，包括作為活性物質的藥用有效量的SEQ ID NO. 1或SEQ ID N0. 2肽與藥用載體、稀釋劑和/或佐劑組成。
本發(fā)明還提供了 SEQ ID NO. 1或SEQ ID N0. 2所述多肽用于制備治療或預防癌癥的藥物中的用途。
所述癌癥包括但不限于肺癌、肝癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、食管癌、乳腺癌、白血病、膀胱癌、子宮頸癌或鼻咽癌等。
本發(fā)明還提供了將SEQ ID NO. 1或SEQ ID N0. 2所述多肽用于制備增強基因毒素選擇性地殺傷癌細胞的藥物中的用途。
所述癌細胞包括但不限于肺癌、肝癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、食管癌、乳腺癌、白血病、膀胱癌、子宮頸癌或鼻咽癌等癌細胞。
所述基因毒素包括但不限于順氯氨鉬、奧沙利鉬、紫杉醇、表柔比星、多柔比星、 吡柔比星、柔紅霉素、絲裂霉素、達卡巴嗪、環(huán)磷酰胺、吉西他濱或卡培他濱等。
本發(fā)明的多肽可以和基因毒素混合再添加藥學上可接受的輔料或載體得到更有效的抗癌藥物。
本發(fā)明的多肽通常是以能實現(xiàn)預期目的的用量使用。在用于預防和治療癌癥時， 本發(fā)明多肽或它的藥用組合物是以治療有效量服用或使用的。對于系統(tǒng)性用藥來說，可以根據(jù)體外實驗估算治療有效量或用量，還可以應用本領域的常用方法通過動物模型估算出本發(fā)明多肽體內(nèi)的起始劑量。當然，本發(fā)明多肽的具體有效量要取決于具體的治療對象、治療對象的體重、疾病的嚴重程度、用藥方式以及主治醫(yī)生的臨床判斷。
本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究以后發(fā)現(xiàn)上述可用于治療或預防癌癥的多肽。該多肽不僅在單獨使用時對癌細胞有著明顯的殺傷力，而且可以和臨床上常用的化療藥物(如順氯氨鉬)合用，顯著地增加化療藥物對癌細胞的敏感性，增強其對癌細胞的殺傷力，降低它的使用劑量。本發(fā)明多肽能對肺癌，肝癌，胃癌，結腸癌，直腸癌，食管癌，乳腺癌，白血病等多種癌細胞起殺傷作用。本發(fā)明的多肽具有抗腫瘤作用；本發(fā)明的多肽與順氯氨鉬合用對癌細胞的作用顯著強于RasGAP317_32Ji (RasGAP317_32Ji的氨基酸殘基序列為WMWVTNLRTD)與順氯氨鉬合用的效果。本發(fā)明涉及的多肽對正常細胞無明顯的毒性增強作用，且本發(fā)明涉及的多肽可以采用化學合成的方法制備得到，純度高，分子量小，特異性強，無免疫原性，安
全可靠。
本發(fā)明多肽可以單獨用于癌癥的治療和預防且有良好的效果，本發(fā)明多肽還可以和化療藥物(如順氯氨鉬、紫杉醇等)合用，能選擇性增強化療藥物對腫瘤細胞的敏感性， 明顯降低了化療藥物的起效劑量，由于對正常細胞的毒性作用小，從而降低了化療藥物的毒性和副作用。


圖1表示HPLC檢測純化以后RasGAP317_326肽在分析柱上洗脫的特征峰圖。
圖2表示HPLC檢測純化以后SEQ ID NO. 1所述的多肽在分析柱上洗脫的特征峰圖。
圖3表示HPLC檢測純化以后SEQ ID NO. 2所述的多肽在分析柱上洗脫的特征峰圖。
圖4 SEQ ID NO. USEQ ID NO. 2、RasGAP317_326肽及順氯氨鉬分別對腫瘤細胞的抑制作用結果。
圖5 SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、RasGAP317_326肽與順氯氨鉬分別合用后對腫瘤細胞的抑制作用結果。
圖6 SEQ ID N0. 1、SEQ ID NO. 2、RasGAP317_3M肽與順氯氨鉬分別合用后對正常細胞的抑制作用結果。
圖7 SEQ ID N0. 1、SEQ ID NO. 2、RasGAP317_3M肽及順氯氨鉬分別對正常細胞的抑制作用結果。
圖8 SEQ ID NO. 1肽與順氯氨鉬合用對胃癌細胞的抑制作用結果。
圖9 SEQ ID NO. 1肽與順氯氨鉬合用對肺癌細胞的抑制作用結果。
圖10 SEQ ID NO. 1肽與順氯氨鉬合用對結腸癌細胞的抑制作用結果。
圖11 SEQ ID N0. 2肽與順氯氨鉬合用對結腸癌細胞的抑制作用結果。
SEQ ID NO. 1 :FLK⑶MFIVHNELEDG
SEQ ID NO. 2 :FLK⑶MFIVHNELEDGWMWVT
具體實施方式
下面結合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
實施例1 RasGAP317_326肽的合成
1)實驗儀器與材料
二甲基甲酰胺(DMF)，哌啶，樹脂，二氯甲烷(DCM)，Kaiser試劑盒，1_羥基苯并三唑(HOBt)，四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)，二異丙基乙胺(DIEA)，甲醇，各種氨基酸，多肽固相合成管。
2)實驗步驟
稱量樹脂并投入到多肽固相合成管(以下簡稱反應器)中，加入適量的DMF溶脹 10分鐘。抽掉DMF進行Fmoc去保護反應，即加適量含20%哌啶的DMF溶液，充分攪拌，5 分鐘后抽掉溶液，重新加入20%哌啶的DMF溶液去保護7分鐘。抽掉去保護液，用DMF洗滌樹脂4-5次，抽掉DMF，用DCM洗滌1_2次，從反應器中取少量樹脂(約5 IOmg)于試管中，用乙醇洗滌2次，Kaiser法檢測并記錄顏色，準備投料，進入氨基酸縮合反應。按照 RasGAP317^326肽的氨基酸序列順序取相應氨基酸、HOBt于適當?shù)娜萜髦校肈MF溶解，溶解完全后加入DIEA活化5分鐘，加入稱量好的HBTU，冰水浴下溶解活化5分鐘，投入到反應器中，攪拌反應。90分鐘后，從反應器中取少量樹脂于試管中，用乙醇洗滌2次，Kaiser法檢測。抽掉反應器中的液體，用DMF洗滌2次，抽掉DMF，得到第一個氨基酸縮合后的肽樹脂。 對所得肽樹脂重復進行以上“Fmoc去保護——氨基酸縮合”反應步驟，至最后一個氨基酸反應完畢，得到RasGAP317_326肽。采用上述方法，按照HIV48_57肽的序列在RasGAP317_326肽上繼續(xù)化學合成連接對應的氨基酸，得到綴合了 HIV48_57的RasGAP317_326肽。反應完畢后，DCM洗滌樹脂2-3次，抽掉溶劑，加入甲醇攪拌收縮(5min+5min)，抽掉甲醇，繼續(xù)抽干15-20min。反應器中取出合成完的肽樹脂，轉移到圓底燒瓶，于干燥器中抽干，在室溫下裂解兩小時。將樹脂過濾后溶液在真空下濃縮凍干。粗肽使用島津LC-6AD制備型反相HPLC純化，使用HPLC 檢測純度> 90%。所得到的純肽使用質譜(MS，electr0Spray)鑒定，其分子量為觀13. 29, 與理論計算值觀13. 29 一致。
實施例2 SEQ ID NO. 1所述肽的合成
1)實驗儀器與材料
二甲基甲酰胺(DMF)，哌啶，樹脂，二氯甲烷(DCM)，Kaiser試劑盒，1_羥基苯并三唑(HOBt)，四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)，二異丙基乙胺(DIEA)，甲醇，各種氨基酸，多肽固相合成管。
2)實驗步驟
稱量樹脂并投入到多肽固相合成管(以下簡稱反應器)中，加入適量的DMF溶脹 10分鐘。抽掉DMF進行Fmoc去保護反應，即加適量含20%哌啶的DMF溶液，充分攪拌，5分鐘后抽掉溶液，重新加入20 %哌啶的DMF溶液去保護7分鐘。抽掉去保護液，用DMF洗滌樹脂4-5次，抽掉DMF，用DCM洗滌1_2次，從反應器中取少量樹脂(約5 IOmg)于試管中， 用乙醇洗滌2次，Kaiser法檢測并記錄顏色，準備投料，進入氨基酸縮合反應。按照SEQ ID NO. 1所述肽的氨基酸序列的順序稱取相應氨基酸、HOBt于適當?shù)娜萜髦校肈MF溶解，溶解完全后加入DIEA活化5分鐘，加入稱量好的HBTU，冰水浴下溶解活化5分鐘，投入到反應器中，攪拌反應。90分鐘后，從反應器中取少量樹脂于試管中，用乙醇洗滌2次，Kaiser法檢測。抽掉反應器中的液體，用DMF洗滌2次，抽掉DMF，得到第一個氨基酸縮合后的肽樹脂。 對所得肽樹脂重復進行以上“Fmoc去保護——氨基酸縮合”反應步驟，至SEQ ID NO. 1序列的最后一個氨基酸反應完畢，得到SEQ ID NO. 1肽。采用上述方法，按照HIV48_5Ji的序列在SEQ ID NO. 1肽上繼續(xù)化學合成連接對應的氨基酸，得到綴合了 HIV48_57的SEQ ID NO. 1 肽。反應完畢后，DCM洗滌樹脂2-3次，抽掉溶劑，加入甲醇攪拌收縮(5min+5min)，抽掉甲醇，繼續(xù)抽干15-20min。反應器中取出合成完的肽樹脂，轉移到圓底燒瓶，于干燥器中抽干，在室溫下裂解兩小時。將樹脂過濾后溶液在真空下濃縮凍干。粗肽使用島津LC-6AD制備型反相HPLC純化，使用HPLC檢測純度> 90%。所得到的純肽使用質譜(MS，electrospray) 鑒定，其分子量為3411. 01，與理論計算值3412. 96 一致。
按照上述方法可以把FHV-外被35_49肽，HTLV-II Rex 4_16肽或BMV gag7_25肽和本發(fā)明的SEQ ID NO. 1肽綴合在一起。
實施例3 SEQ ID NO. 2所述肽的合成
1)儀器與材料
二甲基甲酰胺(DMF)，哌啶，樹脂，二氯甲烷(DCM)，Kaiser試劑盒，1_羥基苯并三唑(HOBt)，四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)，二異丙基乙胺(DIEA)，甲醇，各種氨基酸，多肽固相合成管。
2)實驗步驟
稱量樹脂并投入到多肽固相合成管(以下簡稱反應器)中，加入適量的DMF溶脹 10分鐘。抽掉DMF進行Fmoc去保護反應，即加適量含20%哌啶的DMF溶液，充分攪拌，5分鐘后抽掉溶液，重新加入20 %哌啶的DMF溶液去保護7分鐘。抽掉去保護液，用DMF洗滌樹脂4-5次，抽掉DMF，用DCM洗滌1_2次，從反應器中取少量樹脂(約5 IOmg)于試管中， 用乙醇洗滌2次，Kaiser法檢測并記錄顏色，準備投料，進入氨基酸縮合反應。按照SEQ ID NO. 2所述肽的氨基酸序列稱取相應氨基酸、HOBt于適當?shù)娜萜髦校肈MF溶解，溶解完全后加入DIEA活化5分鐘，加入稱量好的HBTU，冰水浴下溶解活化5分鐘，投入到反應器中，攪拌反應。90分鐘后，從反應器中取少量樹脂于試管中，用乙醇洗滌2次，Kaiser法檢測。抽掉反應器中的液體，用DMF洗滌2次，抽掉DMF，得到第一個氨基酸縮合后的肽樹脂。對所得肽樹脂重復進行以上“Fmoc去保護——氨基酸縮合”反應步驟，至SEQ ID N0.2序列的最后一個氨基酸反應完畢，得到SEQ ID N0. 2肽。采用上述方法，按照HIV48_57肽的序列在 SEQ IDN0. 2肽上繼續(xù)化學合成連接對應的氨基酸，得到綴合了 HIV48_57的SEQ ID N0. 2肽。 反應完畢后，DCM洗滌樹脂2-3次，抽掉溶劑，加入甲醇攪拌收縮(5min+5min)，抽掉甲醇，繼續(xù)抽干15-20min。反應器中取出合成完的肽樹脂，轉移到圓底燒瓶，于干燥器中抽干，在室溫下裂解兩小時。將樹脂過濾后溶液在真空下濃縮凍干。粗肽使用島津LC-6AD制備型反相HPLC純化，使用HPLC檢測純度>90%。所得到的純肽使用質譜(MS，electrospray)鑒定，其分子量為4660. 41，符合理論計算值。
按照上述方法可以把FHV-外被35_49肽，HTLV-II Rex 4_16肽或BMV gag7_25肽和本發(fā)明的SEQ ID N0. 2肽綴合在一起。
實驗例1 MTT法檢測SEQ ID N0. 1、SEQ ID NO. 2及I asGAP317_3M肽分別對腫瘤細胞的抑制作用實驗
一、實驗樣品實施例1-3所合成的多肽RasGAP317_3M肽、SEQ ID NO. 1肽、SEQ ID N0. 2 肽；
二、實驗方法
將人宮頸癌細胞株Hela(購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心武漢大學中心)懸浮于含10%熱滅活胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，以5000-10000個/孔的密度接種于96孔板。細胞在37°C，5% CO2培養(yǎng)。當細胞密度達到70% -80%時，加入順氯氨鉬、RasGAP317_326 肽、SEQ ID NO. 1所述肽或SEQ ID N0. 2所述肽，其中每種藥物的濃度梯度均為40 μ mol/L、30 μ mol/L、20 μ mol/L、10 μ mol/L、0 μ mol/L,每個濃度設3個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)20小時后每孔加入MTT (5mg/ml) 20 μ 1，4小時后吸去培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO) 150 μ 1，震蕩 10分鐘使紫色結晶充分溶解。酶標儀570nm測定吸光度。 細胞抑制率按下式計算
細胞抑制率=(空白對照組OD值-實驗組OD值)/空白對照組OD值X 100 %
數(shù)據(jù)統(tǒng)計以均數(shù)士標準差表示，采用t檢驗。
三、實驗結果
由圖4可以看出，總體上SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2所述多肽對Hela細胞的抑制作用比RasGAP317_326肽顯著。當藥物在低濃度，即濃度小于10 μ mol/L的時候，SEQ ID N0. 1、SEQ ID NO. 2所述肽對Hela細胞就有抑制作用且比相同濃度的順氯氨鉬或 RasGAP317_3aJ太的作用更明顯，兩者之間差異顯著，有統(tǒng)計學意義。SEQ ID N0. 1、SEQ ID NO. 2所述肽對Hela細胞有顯著的抑制作用，而相同濃度的RasGAP317_3a;肽對Hela細胞幾乎沒有抑制作用。說明本發(fā)明的多肽可以作為治療和預防癌癥的藥物。
實驗例2 MTT法檢測不同肽和順氯氨鉬合用對腫瘤細胞的作用實驗
一、實驗樣品實施例1-3所合成的多肽RasGAP317_3M肽、SEQ ID NO. 1肽、SEQ ID N0. 2 肽；
二、實驗方法
將人宮頸癌細胞株Hela懸浮于含10%熱滅活胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，以 5000-10000個/孔的密度接種于96孔板。培養(yǎng)M小時后，分別加入順氯氨鉬和RasGAP317_326 肽混合液，順氯氨鉬和SEQ ID NO. 1所述肽混合液、或順氯氨鉬和SEQ ID N0. 2所述肽混合液。其中每種混合液中順氯氨鉬濃度梯度為1. lumol/L.O. 37ymol/L,0. 12 μ mol/L, 0 μ mol/L,各肽終濃度均為20 μ mol/L,每個濃度設3個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)20小時后每孔加入 MTT (5mg/ml) 20 μ 1，4小時后吸去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μ 1，震蕩10分鐘使紫色結晶充分溶解。酶標儀570nm測定吸光度。
細胞抑制率按下式計算
細胞抑制率=(空白對照組OD值-實驗組OD值)/空白對照組OD值X 100%
數(shù)據(jù)統(tǒng)計以均數(shù)士標準差表示，采用t檢驗。
三、實驗結果
由圖5可以看出，當順氯氨鉬與SEQ ID NO. 1合用、或者與SEQ ID N0. 2肽合用， 或者與RasGAP317_326肽合用時，它們對Hela細胞的抑制作用均明顯強于單獨使用順氯氨鉬， 說明本發(fā)明多肽可以增加順氯氨鉬對Hela細胞的敏感性，增強其對Hela細胞的抑制作用。 本實驗中三種多肽對增加順氯氨鉬對Hela細胞敏感性的能力是不同的，其中SEQ ID N0. 2 所述肽對順氯氨鉬的增敏作用最為明顯，其次是SEQ ID NO. 1所述肽；當順氯氨鉬的濃度為 0 μ mol/L時，SEQ IDN0. 1所述肽、SEQ ID N0. 2所述肽對Hela細胞的抑制率分別為17. 6% 和17. 7 %，而RasGAP317J6肽的抑制率僅為2.5%，SEQ ID NO. 1所述肽和SEQ ID N0. 2所述肽對順氯氨鉬的增敏作用強于RasGAP317_326肽對順氯氨鉬的增敏作用，且具有統(tǒng)計學意義。
實驗例3 MTT法檢測不同肽和順氯氨鉬合用對正常細胞的抑制作用實驗
一、實驗樣品實施例1-3所合成的多肽:RasGAP317_3M肽、SEQ ID NO. 1肽、SEQ ID N0. 2 肽；[0077]二、實驗方法
將人成肌細胞(購于中國科學院上海細胞庫)懸浮于含10%熱滅活胎牛血清的 RPMI1640培養(yǎng)液中，以5000-10000個/孔的密度接種于96孔板。培養(yǎng)M小時后，當細胞密度達到70% -80%時，分別加入順氯氨鉬和RasGAP317_326肽的混合液、順氯氨鉬和SEQ ID NO. 1所述肽的混合液、順氯氨鉬和SEQ ID NO. 2所述肽的混合液。其中順氯氨鉬的濃度梯度為 250 μ mol/L、200 μ mol/L、150 μ mol/L、100 μ mol/L、50 μ mol/L、0 μ mol/L,多月太的終濃度均為20 μ mol/L,每個濃度設3個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)20小時后每孔加入MTT (5mg/ml) 20 μ 1， 4小時后吸去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μ 1，震蕩10分鐘使紫色結晶充分溶解。酶標儀 570nm測定吸光度。
細胞抑制率按下式計算
細胞抑制率=(空白對照組OD值-實驗組OD值)/空白對照組OD值X 100 %
三、實驗結果
由圖6可以看出，當50 μ mol/L的順氯氨鉬和SEQ ID NO. 1合用，或者與SEQ ID N0. 2所述肽合用時，對人成肌細胞的抑制率分別為17%和9. 6%，單獨使用相同濃度順氯氨鉬、或相同濃度順氯氨鉬和RasGAP317_326肽合用，其抑制率分別為25. 3%和四.1%。隨著順氯氨鉬濃度的逐步增加，順氯氨鉬和SEQ IDN0. 1合用或與SEQ ID N0. 2所述肽合用對人成肌細胞的抑制作用也逐步增強，但是與單獨使用相同濃度順氯氨鉬相比或與相同濃度順氯氨鉬和RasGAP317_32fJi合用相比并沒有明顯差異。實驗結果表明本發(fā)明多肽和順氯氨鉬合用時對正常細胞無毒性增強作用，即本發(fā)明多肽對正常細胞無毒性或毒性小。
實驗例4 MTT法檢測SEQ ID N0. 1、SEQ ID NO. 2及I asGAP317_3M肽分別對正常細胞的抑制作用實驗
一、實驗樣品實施例1-3所合成的多肽RasGAP317J6肽、SEQ ID NO. 1肽、SEQ ID N0. 2 肽；
二、實驗方法
將人成肌細胞(購于中國科學院上海細胞庫)懸浮于含10%熱滅活胎牛血清的 RPMI1640培養(yǎng)液中，以5000-10000個/孔的密度接種于96孔板。培養(yǎng)M小時后，當細胞密度達到70% -80%時，分別加入順氯氨鉬、RasGAP訓-鄉(xiāng)肽、SEQID NO. 1所述肽、SEQ ID N0. 2所述肽，其中每種藥物的濃度梯度均為80ymol/L、40ymol/L、20ymol/L、10ymol/ L、0ymol/L，每個濃度設3個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)20小時后每孔加入MTT (5mg/ml) 20 μ 1，4小時后吸去培養(yǎng)液，每孔加入DMS0150 μ 1，震蕩10分鐘使紫色結晶充分溶解。酶標儀570nm 測定吸光度。
細胞抑制率按下式計算
細胞抑制率=(空白對照組OD值-實驗組OD值)/空白對照組OD值X 100 %
三、實驗結果
由圖7可以看出順氯氨鉬對人成肌細胞有明顯的殺傷作用，而相同濃度的SEQ ID NO. 1所述肽、SEQ ID而.2所述肽、妝$4 317_326肽對人成肌細胞的殺傷作用較小，即本發(fā)明的SEQ ID NO. 1所述肽、SEQ ID N0. 2所述肽對正常細胞無明顯殺傷作用。
實驗例5 MTT法檢測SEQ ID NO. 1肽和順氯氨鉬合用對人胃癌SGC-7901細胞的作用
9[0092]一、實驗樣品實施例2所合成的SEQ ID NO. 1肽；
二、實驗方法
將人胃癌細胞株SGC_7901(購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心武漢大學中心)懸浮于含10 %熱滅活胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，以5000-10000個/孔的密度接種于96孔板。 培養(yǎng)M小時后，對照組加入順氯氨鉬，實驗組加入順氯氨鉬和SEQ ID NO. 1所述肽混合液。 其中對照組和實驗組中順氯氨鉬濃度梯度為90 μ mol/L、30 μ mol/L、10 μ mol/L、3. 3 μ mol/ L、1· 1 μ mol/L,0. 37 μ mol/L,實驗組混合液中SEQ ID NO. 1所述肽終濃度均為20 μ mol/L, 每個濃度設3個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)20小時后每孔加入MTT (5mg/ml) 20μ 1,4小時后吸去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μ 1，震蕩10分鐘使紫色結晶充分溶解。酶標儀570nm測定吸光度。
細胞抑制率按下式計算
細胞抑制率=(空白對照組OD值-實驗組OD值)/空白對照組OD值X 100 %
三、實驗結果
由圖8可以看出，當順氯氨鉬與SEQ ID NO. 1合用時，它們對SGC-7901細胞的抑制作用明顯強于單獨使用順氯氨鉬，說明SEQ ID NO. 1可以增加順氯氨鉬對SGC-7901細胞的敏感性，增強其對SGC-7901細胞的抑制作用。
實驗例6 MTT法檢測SEQ ID NO. 1肽和順氯氨鉬合用對人肺癌A549細胞的作用實驗
一、實驗樣品實施例2所合成的SEQ ID NO. 1肽；
二、實驗方法
將人肺癌細胞株A549(購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心武漢大學中心)懸浮于含 10%熱滅活胎牛血清的F-II培養(yǎng)液中，以5000-10000個/孔的密度接種于96孔板。培養(yǎng)M小時后，對照組加入順氯氨鉬，實驗組加入順氯氨鉬和SEQ IDN0. 1所述肽混合液。其中對照組和實驗組中順氯氨鉬濃度梯度為90 μ mol/L、30 μ mol/L、10 μ mol/L、3. 3 μ mol/L、 1. 1 μ mol/L,0. 37 μ mol/L,實驗組混合液中SEQ ID NO. 1所述肽終濃度均為20 μ mol/L,每個濃度設3個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)20小時后每孔加入MTT (5mg/ml) 20 μ 1，4小時后吸去培養(yǎng)液， 每孔加入DMS0150 μ 1，震蕩10分鐘使紫色結晶充分溶解。酶標儀570nm測定吸光度。
細胞抑制率按下式計算
細胞抑制率=(空白對照組OD值-實驗組OD值)/空白對照組OD值X 100%
三、實驗結果
由圖9可以看出，當順氯氨鉬與SEQ ID NO. 1所述肽合用時，它們對A549細胞的抑制作用明顯強于單獨使用順氯氨鉬，說明SEQ ID NO. 1所述肽可以增加順氯氨鉬對A549 細胞的敏感性，增強其對A549細胞的抑制作用。
實驗例7 MTT法檢測SEQ ID NO. 1肽、SEQ ID N0. 2肽分別和順氯氨鉬合用對人結腸癌HCT-116細胞的作用實驗
一、實驗樣品實施例2所合成的SEQ ID NO. 1肽，實施例3所合成的SEQ IDN0. 2 肽；
二、實驗方法
將人結腸癌細胞株HCT-116(購于中國科學院上海細胞庫)懸浮于含10%熱滅活胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，以5000-10000個/孔的密度接種于96孔板。培養(yǎng)M小時后，對照組加入順氯氨鉬，實驗組加入順氯氨鉬和SEQ ID NO. 1所述肽的混合液或順氯氨鉬和SEQ ID NO. 2所述肽的混合液。其中對照組和實驗組中順氯氨鉬濃度梯度為90 μ mol/ L.30 μ mol/L, 10 μ mol/L,3. 3 μ mol/L, 1. Iymol/L、0. 37 μ mol/L，實驗組混合液中 SEQ ID NO. 1所述肽或SEQ ID NO. 1所述肽終濃度均為20 μ mol/L,每個濃度設3個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)20小時后每孔加入MTT (5mg/ml) 20 μ 1，4小時后吸去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μ 1，震蕩10分鐘使紫色結晶充分溶解。酶標儀570nm測定吸光度。
細胞抑制率按下式計算
細胞抑制率=(空白對照組OD值-實驗組OD值)/空白對照組OD值X 100 %
三、實驗結果
由圖10可以看出，當順氯氨鉬與SEQ ID NO. 1合用時，它們對HCT-116細胞的抑制作用明顯強于單獨使用順氯氨鉬，說明SEQ ID NO. 1可以增加順氯氨鉬對HCT-116細胞的敏感性，增強其對HCT-116細胞細胞的抑制作用。
由圖11可以看出，當順氯氨鉬與SEQ ID N0. 2合用時，它們對HCT-116細胞的抑制作用明顯強于單獨使用順氯氨鉬，說明SEQ ID N0. 2可以增加順氯氨鉬對HCT-116細胞的敏感性，增強其對HCT-116細胞細胞的抑制作用。
IC5tl在凋亡方面，可以理解為一定濃度的某種藥物誘導腫瘤細胞凋亡50%，該濃度稱為50%抑制濃度，即凋亡細胞與全部細胞數(shù)之比等于50%時所對應的濃度，IC50值可以用來衡量藥物誘導凋亡的能力，即誘導能力越強，該數(shù)值越低，當然也可以反向說明某種細胞對藥物的耐受程度。SEQ ID NO. 1和順氯氨鉬合用對人腫瘤細胞作用的結果如表1 所示，SEQ ID NO. 1和順氯氨鉬合用時對腫瘤細胞的抑制作用明顯，而且SEQ ID NO. 1肽單獨使用或和順氯氨鉬合用對正常細胞的作用都比較小，說明本發(fā)明的肽可以作為治療和預防癌癥的藥物。
表1 SEQ ID NO. 1半數(shù)抑制濃度(IC50)觀察
權利要求
1.一種具有殺傷癌癥細胞效應的肽，其特征在于，所述肽的氨基酸序列為SEQ ID NO. 1 所示。
2.一種具有殺傷癌癥細胞效應的肽，其特征在于，所述肽的氨基酸序列為SEQ ID NO. 2 所示。
3.編碼權利要求
1或2所述肽的核苷酸序列。
4.一種表達載體，其特征在于，含有至少一個拷貝的如權利要求
3所述的核苷酸序列。
5.含有權利要求
4所述表達載體的宿主細胞。
6.權利要求
1或2所述的肽通過化學鍵與HIV48_57肽、FHV-外被35_49肽、HTLV-IIRex 4_16肽或BMV gag7_25肽相綴合所得到的產(chǎn)品。
7.一種治療或預防癌癥的藥用組合物，其特征在于，由治療或預防上有效量的權利要求
1或2所述的肽和藥學上可接受的輔料或載體所組成。
8.權利要求
1或2所述的肽在制備治療或預防癌癥的藥物中的用途。
9.權利要求
6所述的產(chǎn)品在制備治療或預防癌癥的藥物中的用途。
10.如權利要求
8或9所述的用途，其特征在于，所述癌癥選自肺癌、肝癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、食管癌、乳腺癌、白血病、膀胱癌、子宮頸癌或鼻咽癌。
11.權利要求
1或2所述的肽在制備用于增強基因毒素選擇性地殺傷癌細胞的藥物中的用途。
12.如權利要求
11所述的用途，其特征在于，所述基因毒素選自順氯氨鉬、奧沙利鉬、 紫杉醇、表柔比星、多柔比星、吡柔比星、柔紅霉素、絲裂霉素、達卡巴嗪、環(huán)磷酰胺、吉西他濱或卡培他濱。
13.如權利要求
11所述的用途，其特征在于，所述癌細胞選自肺癌、肝癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、食管癌、乳腺癌、白血病、膀胱癌、子宮頸癌或鼻咽癌的癌細胞。
專利摘要
本發(fā)明公開了治療或預防癌癥的多肽或衍生產(chǎn)品及其應用，屬于生物醫(yī)藥領域。本發(fā)明多肽的氨基酸序列為SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明還公開了該多肽和促進其在細胞中積累的制劑相綴合或混合后所得到的產(chǎn)品。本發(fā)明多肽可以單獨用于癌癥的治療和預防，其與化療藥物聯(lián)用時能顯著增強化療藥物選擇性地殺傷癌細胞的能力，明顯降低化療藥物的起效劑量，本發(fā)明多肽對正常細胞的毒性作用小，從而有效降低了化療藥物的毒性和副作用。本發(fā)明多肽可以采用化學合成的方法制備得到，純度高，分子量小，特異性強，無免疫原性，安全可靠。
文檔編號C12N1/00GKCN101891802 B發(fā)布類型授權 專利申請?zhí)朇N 200910163852
公開日2011年11月16日 申請日期2009年8月11日
發(fā)明者熊駿宇, 陳建華, 陳彩虹, 黃毅 申請人:武漢凱泰新生物技術有限公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (2),