專利名稱:1b20 pcsk9拮抗劑的制作方法
1B20 PCSK9拮抗劑
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本申請要求申請日為2008年2月7日的美國臨時專利申請61/063，980的優(yōu)先權(quán)。
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枯草溶菌素轉(zhuǎn)化酶9(下文稱為“PCSK9”)，亦稱作神經(jīng)細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化酶 1("NARC-I")是蛋白酶K樣的枯草桿菌酶，經(jīng)鑒定為分泌性枯草桿菌酶家族中的第9個成員 (見 Seidah 等人，2003 PNAS100 :928_933)。PCSK9 基因位于人類染色體 1ρ33_ρ34. 3 (Seidah 等人，同上)。PCSK9表達(dá)于具有增殖和分化能力的細(xì)胞中，包括，例如肝細(xì)胞、腎間質(zhì)細(xì)胞、 回腸與結(jié)腸上皮細(xì)胞和胚胎端腦神經(jīng)元等(Seidah等人，同上)。
最初合成的PCSK9為非活性酶前體或酶原的形式，其分子量約為大約72kDa，該酶 原可于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(‘‘ER”)內(nèi)進(jìn)行自我催化性分子內(nèi)加工過程以激活其功能。據(jù)報道，這種內(nèi) 部加工事件發(fā)生于SSVFAQ丨SIPWNL158基序(序號分別為SEQ ID 19和20) (Benjannet 等人，2004 J. Biol. Chem. 279 :48865_48875。據(jù)報道，這種內(nèi)部加工是蛋白脫離內(nèi)質(zhì)網(wǎng)所必 需的(Benjarmet等人，同上；Seidah等人，同上)。經(jīng)過切割并因此被激活的蛋白與切割的 多肽一起分泌(同上)。
人類PCSK9基因序列(長度約22kb，包括12個外顯子，編碼含692個氨基酸的 蛋白質(zhì))的一個例子見保藏號NP_777596.2PCSK9。已經(jīng)收藏了人類、小鼠和大鼠的PCSK9 的核酸序列，分別參見例如GenBank條目號AX127530(亦即AX207686)、NP_705793 (亦即 Q80W65)和P5996。PCSK9含有若干在其他前蛋白轉(zhuǎn)化酶中發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)域，包括N端信號序 列、前體結(jié)構(gòu)域、催化結(jié)構(gòu)域和富含半胱氨酸的C端結(jié)構(gòu)域。PCSK9催化結(jié)構(gòu)域與枯草桿菌 酶的蛋白酶K家族具有高度序列同一性，特別是都具有D186、H226和S386催化三元體。
PCSK9在若干專利公開物中被公開和/或要求保護(hù)，包括但不限于下列PCT公開 號W0 01/31007,WO 01/5708UW0 02/14358,WO 01/98468,WO 02/102993,WO 02/102994、 WO 02/46383、W002/90526、WO 01/77137 和 WO 01/34768 ；美國公開號US2004/0009553 和 US 2003/0119038 ；以及歐洲公開號EP 1 440 981, EP 1 067 182 和 EP 1 471 152。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PCSK9在肝細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞的分化中發(fā)揮作用(Seidah等人，同上)，在 胚胎肝臟中高度表達(dá)，并對膽固醇體內(nèi)平衡具有非常重要的意義。研究結(jié)果表明，PCSK9在 膽固醇生物合成或攝取中具有特異性作用。在一項膽固醇飼喂大鼠的研究中，Maxwell等 人發(fā)現(xiàn)，PCSK9表達(dá)水平下調(diào)與參與膽固醇生物合成的其他三個基因相似(Maxwell等人， 2003 J. Lipid Res. 44 =2109-2119) 實際上，已有研究顯示PCSK9基因受固醇調(diào)控元件結(jié) 合蛋白(‘‘SREBP”)調(diào)控，這與觀察到的其他參與膽固醇代謝的基因相同(同上)。后來一 項關(guān)于PCSK9轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究支持這些發(fā)現(xiàn)，該研究證實，這種調(diào)控對于其他參與脂蛋白代謝基因是非常典型的(Dubuc等人，2004《動脈硬化和栓塞血管生物學(xué)》。24 =1454-1459) 0 已經(jīng)表明抑制素(statin)使PCSK9的表達(dá)上調(diào)，這歸結(jié)于藥物的降低膽固醇水平的效應(yīng) (同上)。此外，研究還顯示，PCSK啟動子具有兩個與膽固醇調(diào)節(jié)有關(guān)的保守位點，一個為 固醇調(diào)控元件，另一個為Spl位點(同上)。
尤其是，數(shù)套研究證據(jù)均證明，PCSK9降低肝LDLR的數(shù)量，因此減弱了肝臟清 除循環(huán)中LDL膽固醇的能力。腺病毒介導(dǎo)的PCSK9在小鼠肝臟中的過度表達(dá)導(dǎo)致循環(huán) 的LDL-C因肝LDLR蛋白大量喪失而積累，對于LDLR mRNA水平無影響(Benjannet等人， 2004, J.Biol. Chem. 279 48865-48875 ；Maxwell & Breslow，2004 PNAS101 :7100_7105 ； Park 等人，2004 J. Biol. Chem. 279 :50630_50638 ；和 Lalanne 等人，2005 J. Lipid Res. 46 1312-1319)。PCSK9過度表達(dá)對小鼠中循環(huán)的LDL-C水平升高的影響完全依賴于LDLR的 表達(dá)，這再次表明，PCSK9對LDL-C的調(diào)節(jié)是通過下調(diào)LDLR蛋白而介導(dǎo)的。與這些發(fā)現(xiàn)相 一致，缺乏PCSK9的小鼠或PCSK9mRNA水平因反義寡聚核苷酸抑制劑而降低的小鼠具有更 高水平的肝臟LDLR蛋白和更強(qiáng)的清除循環(huán)的LDL-C的能力(Rashid等人，2005，PNAS 102 5374-5379 ；和 Graham 等人，2007 J. Lipid Res. 48 (4) :763_767)。此外，通過 siRNA 使培 養(yǎng)的人肝細(xì)胞中PCSK9水平下降也會引起LDLR蛋白水平升高，且使吸收LDL-C的能力增強(qiáng) (Benjannet 等人，2004 J. Biol. Chem. 279 48865-48875 ；和 Lalanne 等人，2005 J. Lipid Res. 46 1312-1319)?？傊?，這些研究數(shù)據(jù)表明，PCSK9作用導(dǎo)致通過降低LDLR蛋白水平引 起LDL-C水平升高。
另有研究證實，PCSK9基因的多個突變與常染色體顯性高膽固醇血癥(“ADH”)有 關(guān)，該病癥是遺傳性代謝紊亂，其特征為血漿中低密度脂蛋白(“LDL”)顆粒顯著增加，這會 導(dǎo)致早期心血管功能衰竭(見 Abitadel 等人，2003，Nature Genetics 34 154-156 ；Timms 等人，2004，Hum. Genet. 114 :349_353 ；Leren, 2004, Clin. Genet. 65 :419_422)。Abifadel 等 人后來發(fā)表的一項關(guān)于S127R突變的研究(同上)顯示，攜帶這種突變的患者表現(xiàn)出總膽 固醇含量升高，以及在血漿中含有apoBlOO，這是由于(1)含apoBlOO脂蛋白，如低密度脂蛋 白(“LDL”)、極低密度脂蛋白(“VLDL”)和中等密度脂蛋白(“IDL”)的過量產(chǎn)生，和(2) 所述脂蛋白的清除或轉(zhuǎn)化作用相應(yīng)減弱(Ouguerram等人，2004，Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 24 :1448_1453)。
因此，毫無疑問，PCSK9在LDL調(diào)控中發(fā)揮作用。PCSK9的表達(dá)或上調(diào)表達(dá)與血 漿LDL膽固醇水平升高有關(guān)，且PCSK9相應(yīng)的抑制或表達(dá)缺失與血漿LDL膽固醇水平下降 相關(guān)。已有研究發(fā)現(xiàn)，與PCSK9序列變異有關(guān)的LDL膽固醇水平賦予抵抗冠心病的保護(hù) (Cohen, 2006，N. Engl. J. Med. 354 1264-1272)。
治療心血管病有效的化合物和/或制劑的鑒定是非常需要的。臨床試驗已經(jīng)表 明，LDL膽固醇水平下降與冠心病發(fā)病直接相關(guān)(Law等人，2003，BMJ 326:1423-1427)。最 近的研究發(fā)現(xiàn)，血漿LDL膽固醇水平中度終身降低與冠心病發(fā)病率顯著降低相關(guān)(Cohen等 人，同上)。即使在非脂類相關(guān)性心血管風(fēng)險因素普遍存在的人群中情況亦是如此(同上)。 因此，LDL膽固醇水平的可調(diào)控性控制具有重大的意義。
本發(fā)明通過提供用于抑制PCSK9活性以及PCSK9在各種治療病癥中的相應(yīng)作用的 PCSK9拮抗劑，進(jìn)一步提升了這些研究結(jié)果的意義。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及PCSK9拮抗劑，在特別的實施方式中，涉及同時抑制人類和鼠PCSK9的 拮抗劑以及那些對已加工的PCSK9表現(xiàn)出優(yōu)先靶向作用的PCSK9拮抗劑。廣義地說，PCSK9 的蛋白特異性拮抗劑(以下稱為“PCSK9特異性拮抗劑”)為PCSK9蛋白結(jié)合分子或有效地 選擇性結(jié)合PCSK9并抑制PCSK9功能的分子。這些分子在治療與PCSK9功能有關(guān)的或受其 功能影響的病癥中具有重要意義，所述病癥包括但不限于高膽固醇血癥、冠心病、代謝綜合 癥、急性冠脈綜合癥及相關(guān)病癥。PCSK9特異性拮抗劑的特點為，選擇性識別PCSK9并與之 結(jié)合。PCSK9特異性拮抗劑不顯示與除PCSK9之外的其他蛋白有顯著結(jié)合作用，除非以下特 例即該拮抗劑補(bǔ)充或被專門設(shè)計為對PCSK9特異性結(jié)合成分提供額外的不同的特異性。
本文中特定實施方式中的PCSK9特異性拮抗劑包含(a)重鏈可變區(qū)，其包含⑶R3 結(jié)構(gòu)域，其包含SEQ ID N0:17或SEQ IDNO :17的等同物，所述等同物的特征在于在⑶R3結(jié) 構(gòu)域中具有一個或更多個保守性氨基酸取代；和/或(b)輕鏈可變區(qū)，其包含CDR3結(jié)構(gòu)域， 其包含SEQ ID NO :7或SEQ ID NO :7的等同物，所述等同物的特征在于在⑶R3結(jié)構(gòu)域中 具有一個或更多個保守性氨基酸取代。在具體的實施方式中，PCSK9特異性拮抗劑與人類 和/或鼠PCSK9結(jié)合，其Kd為1. 2X10_6M或更小。在另外的實施方式中，PCSK9特異性拮抗 劑與人類和/或鼠PCSK9結(jié)合的Kd為1X10_7M或更小。在另外的實施方式中，PCSK9特異性 拮抗劑與人類和/或鼠PCSK9結(jié)合的Kd為IXlCT8M或更小。在進(jìn)一步的實施方式中，PCSK9 特異性拮抗劑與人類和/或鼠PCSK9結(jié)合的Kd為5X10_9M或更小，或1X10_9M或更小。在選 擇性實施方式中，PCSK9特異性拮抗劑與人類和/或鼠PCSK9結(jié)合的Kd為ΙΧΙΟ,Μ或更小， 1Χ10_"Μ或更小，或1Χ10_12Μ或更小。在具體的實施方式中，PCSK9特異性拮抗劑在上述與 PCSK9結(jié)合的水平上不與PCSK9之外的蛋白結(jié)合。
本發(fā)明的特定實施方式包括PCSK9特異性拮抗劑，其在上述水平之一顯示出與 PCSK9結(jié)合并且與1Β20抗體分子競爭性結(jié)合PCSK9。1Β20抗體分子構(gòu)成本文重要的PCSK9 特異性拮抗劑。1Β20抗體分子的特征在于包括⑴包含SEQ ID Ν0:11的重鏈可變區(qū) (“VH”)；和(ii)包含SEQ ID N0:27的輕鏈可變區(qū)(“VL”)。所述VH與VL區(qū)分別包含 VH 區(qū)(SEQ ID NO :13、15 和 17)和 VL 區(qū)(SEQ ID NO :3、5 和 7)的公布的 CDR 1、2 和 3 的 全長互補(bǔ)序列。1B20抗體分子的例子包括但不限于(i)Fab，其包含包含SEQ IDNO 1的 輕鏈和包含包括SEQ ID NO 9的氨基酸1-221 (或SEQ IDNO 9)的氨基酸的Fd鏈；和(ii) 全長抗體分子，其包含包含SEQ ID NO 26的輕鏈和包含SEQ ID NO 25的重鏈。
PCSK9特異性拮抗劑可有效抵消PCSK9依賴性的對于細(xì)胞LDL攝取的抑制，尤其對 人類和/或鼠PCSK9依賴性的對于細(xì)胞LDL攝取的抑制特別有效。再次證實，PCSK9特異性 拮抗劑1B20對于PSCK9對LDL攝取的效應(yīng)具有劑量依賴性抑制。因此，本文公布的PSCK9 特異性拮抗劑對于降低血漿LDL膽固醇水平意義重大。本文公布的拮抗劑亦可用于不同的 診斷目的，包括PSCK9的檢測和定量。選擇性1B20拮抗與人類和鼠PCSK9具有交叉反應(yīng)， 因而是特別有用的。這種特點使得可以在不需要確保小鼠表達(dá)人類PCSK9的鼠科模型中進(jìn) 行特定的1B20拮抗劑的藥理學(xué)研究。在此類實驗中，鼠科模型足以代表目標(biāo)蛋白的天然活 性和拮抗劑對其具有的抑制作用。
在具體的實施方式中，本發(fā)明包括PCSK9特異性拮抗劑。在特定實施方式中，本發(fā) 明包括抗體分子，其包含本文公布的重鏈和/或輕鏈可變區(qū)，具有一個或更多個保守性氨基酸取代的所述區(qū)域的等同物，及其同源物。選擇性實施方式包括分離的PSCK9特異性拮 抗劑，其包含公布的CDR結(jié)構(gòu)域或成套重鏈和/或輕鏈CDR結(jié)構(gòu)域，以及具有一個或更多 個保守氨基酸取代的此類結(jié)構(gòu)域的等同物。正如本領(lǐng)域許多技術(shù)人員認(rèn)為的那樣，維持拮 抗PCSK9能力的PCSK9特異性拮抗劑的片段可插入不同的框架區(qū)，例如，參見美國專利號 6，818，418及其參考文獻(xiàn)，這些公開物共同通過引用并入本文，該文獻(xiàn)討論了不同的骨架， 這些骨架可用于展示之前通過抗原結(jié)合選擇的抗體環(huán)(loop)。此外，運(yùn)用重組技術(shù)可使編 碼VL和VH的基因連接，例如運(yùn)用合成連接子使其產(chǎn)生單鏈蛋白，在這個蛋白分子內(nèi)VH和 VL結(jié)合形成單價分子，也稱為單鏈Fvs ( “ScFVs")(見例如Bird等人，1988，Science 242 423-426，和 Huston 等人，1988，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :5879_5883，這些公開物通過 引用并入本文)。
PCSK-9特異性拮抗劑及片段可以以不同的非抗體骨架形式存在，包括但不限 于 avimer (Avidia)、DARPin(分子伴侶)、Adnectin(Adnexus)、Anticalin(Pieris)禾口 Affibody(Affibody)。在科學(xué)文獻(xiàn)中對蛋白結(jié)合的替代骨架運(yùn)用給予了很高的評價，例如 參見 Binz 和 Pliieckthun，2005，Curr. Opin. Biotech 16:1-11 ；這些公開物通過引用并入 本文。因此，包含(i)公布的重鏈和/或輕鏈可變區(qū)⑶R3序列(分別為SEQ ID NO: 17和 7)，和(ii)公布的重鏈可變⑶R1、⑶R2和⑶R3序列或公布的輕鏈可變⑶R1、⑶R2和⑶R3 序歹Ij :CDR1 (分別為 SEQ ID NO 13 和 3)，CDR2 (分別為 SEQ IDNO 15 和 5)和 CDR3 (分別為 SEQ ID N0:17和7)，(iii)人類重鏈和/或輕鏈序列的可變區(qū)框架內(nèi)的公布的重鏈和輕鏈 CDR的全長互補(bǔ)序列(分別為SEQ ID N0:13、15、17、3、5和7)，或(iv)公布的重鏈和/或 輕鏈可變區(qū)SEQ ID N0:11和/或SEQ ID NO :27的非抗體骨架或拮抗劑分子構(gòu)成本發(fā)明 的重要實施方式，其中這樣的骨架或拮抗劑分子顯示出PCSK9選擇性，并抵消細(xì)胞LDL攝入 的PCSK9依賴性抑制作用。在另一方面，本發(fā)明提供了編碼公布的PCSK9特異性拮抗劑的 核酸，在特定實施方式中，本發(fā)明提供了 PCSK9特異性拮抗劑，其包含公布的重鏈和輕鏈、 公布的可變重鏈區(qū)和可變輕鏈區(qū)以及其選擇性成分(包括CDR 1、2和/或3)，尤其是公布 的各個CDR3區(qū)。另一方面，本發(fā)明提供了包含所述核酸的載體。此外，本發(fā)明提供了包含 編碼公布的PCSK9特異性拮抗劑的核酸的分離的細(xì)胞。另一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā) 明的多肽或載體的分離的細(xì)胞。
本發(fā)明提供了制備本文公布的PCSK9特異性拮抗劑的方法，所述拮抗劑包括但不 限于抗體、抗原結(jié)合片段、衍生物、嵌合分子、上述任一項與其他多肽的融合物，或者包含所 公布序列的能夠特異結(jié)合PCSK9的替代性結(jié)構(gòu)/成分。方法包括(i)孵育一種細(xì)胞，該 細(xì)胞包含編碼PCSK9特異性拮抗劑的核酸，或者包含編碼其一個或更多個成分的單個核 酸，在可表達(dá)并組裝PCSK9特異性拮抗劑的條件下表達(dá)時，所述核酸共同產(chǎn)生該拮抗劑；和 ( )從細(xì)胞中分離所述拮抗劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)DNA重組技術(shù)也能獲得本文公布 的PCSK9特異性拮抗劑。
本發(fā)明提供一種方法，該方法用于拮抗PSCK9的活性或功能或PCSK9的顯著效 應(yīng)，該方法包括在允許所述拮抗劑結(jié)合PCSK9的條件下，使表達(dá)PCSK9 (或經(jīng)過人類或鼠 PCSK9處理或者其中含有PCSK9)的細(xì)胞、細(xì)胞群或目標(biāo)組織樣品與本文公布的PCSK9特異 性拮抗劑結(jié)合。本發(fā)明的具體實施方式
包括這樣的方法其中所述細(xì)胞是人類或鼠細(xì)胞。 在附加實施方式中，細(xì)胞表達(dá)人類或鼠衍生的PCSK9。[0025]另一方面，本發(fā)明還提供一種方法，該方法用于拮抗受試者中的PCSK9的活性或 功能或者PCSK9的顯著效應(yīng)，該受試者表現(xiàn)出與PCSK9活性相關(guān)的病癥或特定患者中對 PCSK9功能禁忌的病癥，該方法包括，向受試者施用處于藥物組合物或其它組合物中的治療 上有效量的本發(fā)明的PCSK9特異性拮抗劑。
因此，本發(fā)明包含一種方法，該方法用于治療與PCSK9活性相關(guān)的病癥或特定患 者中對PCSK9功能禁忌的病癥，該方法包括，向受試者施用處于藥物組合物或其它組合物 中的治療上有效量的本發(fā)明的PCSK9特異性拮抗劑。在選擇性實施方式中，所述病癥為高 膽固醇血癥、冠心病、代謝綜合癥、急性冠脈綜合癥或相關(guān)病癥。
在具體的實施方式中，本發(fā)明包括向受試者施用公布的PCSK9特異性拮抗劑的方 法，該方法包括，輸送治療上有效量的包含本文公布的PCSK9特異性拮抗劑的藥物組合物 或其他組合物。
在另一方面，本發(fā)明提供一種包含本發(fā)明的PCSK9特異性拮抗劑的藥物組合物或 其它組合物，其特征在于，包含藥學(xué)上可接受的載體，所述載體包括但不限于賦形劑、稀釋 劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、或設(shè)計為促進(jìn)拮抗劑以理想劑量向治療個體施用的替代物。
下表列出了本申請中討論的序列的一般性總結(jié)。序列列表包括所有注釋、序列及 特點，其共同構(gòu)成本公開的文字部分。
表 1
權(quán)利要求
一種分離的PCSK9特異性拮抗劑，其包括(a)包含CDR3結(jié)構(gòu)域的重鏈可變區(qū)，該CDR3結(jié)構(gòu)域包含SEQID NO17或其等同物，所述等同物的特征在于在CDR3結(jié)構(gòu)域中具有一個或更多個保守性氨基酸取代；且/或(b)包含CDR3結(jié)構(gòu)域的輕鏈可變區(qū)，該CDR3結(jié)構(gòu)域包含SEQID NO7或其等同物，所述等同物的特征在于在CDR3結(jié)構(gòu)域中具有一個或更多個保守性氨基酸取代；其中所述PCSK9特異性拮抗劑拮抗PCSK9對細(xì)胞LDL攝取的抑制。
2.權(quán)利要求
1所述的PCSK9特異性拮抗劑，其中CDR3結(jié)構(gòu)域位于CDR3區(qū)域中的人類 胚系區(qū)。
3.權(quán)利要求
1所述的PCSK9特異性拮抗劑，其與人類PCSK9結(jié)合的平衡解離常數(shù)(Kd) 小于 1200nM。
4.權(quán)利要求
1所述的PCSK9特異性拮抗劑，其與人類PCSK9結(jié)合的Kd小于500nM。
5.權(quán)利要求
1所述的PCSK9特異性拮抗劑，其與人類PCSK9結(jié)合的Kd小于ΙΟΟηΜ。
6.權(quán)利要求
1所述的PCSK9特異性拮抗劑，其與人類PCSK9結(jié)合的Kd小于5nM。
7.權(quán)利要求
1所述的PCSK9特異性拮抗劑，其對PCSK9抑制細(xì)胞LDL攝取的拮抗作用 的 IC5tl 低于 500nM。
8.權(quán)利要求
1所述的PCSK9特異性拮抗劑，其對PCSK9抑制細(xì)胞LDL攝取的拮抗作用 的 IC5tl 低于 200nM。
9.權(quán)利要求
1所述的PCSK9特異性拮抗劑，其對PCSK9抑制細(xì)胞LDL攝取的拮抗作用 的 IC50 低于 IOOnMo
10.權(quán)利要求
1所述的PCSK9特異性拮抗劑，其對PCSK9抑制細(xì)胞LDL攝取至少產(chǎn)生 20%的拮抗作用。
11.權(quán)利要求
1所述的PCSK9特異性拮抗劑，其是抗體分子。
12.權(quán)利要求
1所述的PCSK9特異性拮抗劑，其進(jìn)一步包括(a)包含SEQID NO 13的重鏈可變區(qū)⑶Rl序列；(b)包含SEQID NO 15的重鏈可變區(qū)⑶R2序列；(c)包含SEQID NO 3的輕鏈可變區(qū)⑶Rl序列；和/或(d)包含SEQID NO 5的輕鏈可變區(qū)⑶R2序列。
13.權(quán)利要求
12所述的PCSK9特異性拮抗劑，其中⑶R1、⑶R2和/或⑶R3結(jié)構(gòu)域處 于各自的CDR1、CDR2和/或CDR3區(qū)域中的人類胚系區(qū)。
14.權(quán)利要求
1所述的PCSK9特異性拮抗劑，其包括(a)包含⑶R3結(jié)構(gòu)域的重鏈可變區(qū)，該⑶R3結(jié)構(gòu)域包含SEQIDNO 17 ；(b)包含⑶R3結(jié)構(gòu)域的輕鏈可變區(qū)，該⑶R3結(jié)構(gòu)域包含SEQIDNO 7 ；(c)重鏈可變區(qū)CDRl序列，其包含SEQID NO 13 ；(d)輕鏈可變區(qū)⑶Rl序列，其包含SEQID NO 3 ；(e)重鏈可變區(qū)⑶R2序列，其包含SEQID NO 15 ；及(f)輕鏈可變區(qū)CDR2序列，其包含SEQID NO :5。
15.權(quán)利要求
14所述的PCSK9特異性拮抗劑，其中⑶R1、⑶R2和/或⑶R3結(jié)構(gòu)域位 于各自的CDR1、CDR2和/或CDR3區(qū)域中的人類胚系可變區(qū)。
16.權(quán)利要求
12所述的PCSK9特異性拮抗劑，其包括包含SEQIDNO=Il的重鏈可變區(qū)，和/或包含SEQ ID NO 27的輕鏈可變區(qū)。
17.權(quán)利要求
12所述的PCSK9特異性拮抗劑，其包括重鏈，所述重鏈具有包含SEQID NO 24的恒定序列。
18.權(quán)利要求
16所述的PCSK9特異性拮抗劑，其包括重鏈，所述重鏈具有包含SEQID NO 24的恒定序列。
19.PCSK9特異性拮抗劑，其包括(a)包含SEQID NO 1的輕鏈；和(b)包含SEQID NO 11的重鏈；其中所述PCSK9特異性拮抗劑是抗體分子，其對PCSK9抑制細(xì)胞LDL攝取具有拮抗作用。
20.權(quán)利要求
19所述的PCSK9特異性拮抗劑，其中SEQID NO=Il之后跟隨氨基酸序 列，所述氨基酸序列選自 SEQ ID NO :21、SEQID NO 22、SEQ ID NO 23 禾P SEQ ID NO :24。
21.分離的PCSK9特異性拮抗劑，其包括(a)包含SEQID NO 26的輕鏈；以及(b)包含SEQID NO 25的重鏈；其中所述PCSK9特異性拮抗劑是抗體分子，其對PCSK9抑制細(xì)胞LDL攝取具有拮抗作用。
22.分離的PCSK9特異性拮抗劑，其包括(a)SEQ ID NO 39的重鏈可變區(qū)CDR3序列；(b)SEQ ID NO 98的重鏈可變區(qū)CDR3序列；(c)SEQID NO 39的重鏈可變區(qū)CDR3序列；SEQ ID NO 37的重鏈CDRl序列；禾口 SEQ ID NO 38的重鏈CDR2序列；(d)SEQID NO 98的重鏈可變區(qū)CDR3序列；SEQ ID NO 37的重鏈CDRl序列；禾口 SEQ ID NO 97的重鏈CDR2序列；(e)SEQ ID NO 42的輕鏈可變區(qū)CDR3序列；(f)SEQ ID NO 101的輕鏈可變區(qū)CDR3序列；(g)SEQID NO 42的輕鏈可變區(qū)CDR3序列；SEQ ID NO 40的輕鏈CDRl序列；和SEQ ID NO 41的輕鏈CDR2序列；(h)SEQID NO 101的輕鏈可變區(qū)CDR3序列；SEQ ID NO 99的輕鏈CDRl序列；禾口 SEQ ID NO 100的輕鏈CDR2序列；⑴(a)和(e)皆有； (j) (b)和(f)皆有； (k) (c)和(g)皆有； (1) (d)和(h)皆有；(m)分別包含SEQ ID NO 44和SEQ ID NO 43的重鏈和/或輕鏈可變區(qū)； (η)分別包含SEQ ID NO 109和SEQ ID NO 108的重鏈和/或輕鏈可變區(qū)；或者 (ο)包含SEQ ID NOs :45-96或102-107中任一項的重鏈可變區(qū)及任選的包含SEQ ID NO 27的輕鏈可變區(qū)；其中所述PCSK9特異性拮抗劑是抗體分子，其對PCSK9抑制細(xì)胞LDL攝取具有拮抗作用。
23.包含權(quán)利要求
1-21中任一項所述的PCSK9特異性拮抗劑和藥學(xué)上可接受的載體的 組合物。
24.一種用于蛋白給藥的組合物，其包括(a)大約50mg/mL至大約200mg/mL的蛋白；(b)多羥基烴(包括但不限于山梨醇、甘露醇、甘油和半乳糖醇)和/或二糖(包括但 不限于蔗糖、乳糖、麥芽糖和海藻糖)；所述多羥基烴和/或二糖合計占制劑的大約至大 約 6% w/v ；(c)大約5mM至大約200mM的組氨酸、咪唑、磷酸鹽或乙酸；(d)大約5mM-200mM精氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸、賴氨酸、谷氨酸、天冬 氨酸或蛋氨酸；(e)大約0.OlM至大約0. IM鹽酸(“HCl ”)，其數(shù)量足以使pH介于大約5. 5至大約7. 5 之間；以及(f)液體載體，包括但不限于無菌水、石油、動物油、植物油、礦物油、合成油、生理鹽水、 右旋糖或其他糖溶液或二醇類如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇；其中所述的藥物組合物的PH介于大約5. 5至大約7. 5 ；并且其中所述的藥物組合物 任選包括占制劑大約0.01%至大約w/v的非離子表面活性劑(包括但不限于聚山 梨酯-80 (Tween 80 )、聚山梨酯-60 (Tween 60 )、聚山梨酯-40 (Tween 40 )和聚山梨 酯-20 (Tween 20 )、聚氧乙烯烷基醚，包括但不限于，Bri j58 、Brij35 以及其它的，例如 TritonX-100 、Triton X-114TM、NP40 、Span 85 及 Pluronic 系列的非離子表面活性劑(例 如 Pluronicl21))。
25.權(quán)利要求
24所述的組合物，其包括(a)大約50mg/mL至大約200mg/mL的蛋白；(b)大約至大約6%w/v的甘露糖、海藻糖或蔗糖；(c)大約IOmM至大約150mM的組氨酸；(d)大約IOmM至大約150mM的精氨酸或脯氨酸；(e)大約0.003M至大約0.005M的鹽酸(“HC1”)，其數(shù)量足以使pH介于大約5. 8至大 約6. 5之間；以及(f)液體載體，包括但不限于無菌水、石油、動物油、植物油、礦物油、合成油、生理鹽水、 右旋糖或其他糖溶液或二醇類如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇；其中所述的藥物組合物的PH介于大約5. 8至大約6. 5 ；并且其中所述的藥物組合物 任選包括大約0. 01%至大約w/v的聚山梨酯-80 (Tween 80 )或聚山梨酯-20 (Tween 20 )。
26.權(quán)利要求
24所述的組合物，其包括(a)大約50至大約200mg/mL的蛋白；(b)大約2%至大約6%w/v的蔗糖；(c)大約25mM至大約IOOmM的組氨酸；(d)大約25至大約IOOmM的精氨酸；(e)大約0.0040M至大約0. 0045M的鹽酸(“HC1 ”)，其數(shù)量足以使pH達(dá)到大約6的范圍；以及(f)無菌水；其中所述的藥物組合物的PH為大約6的范圍；并且其中所述的藥物組合物任選包括大 約0. 01%至大約1% w/v的聚山梨酯-80 (Tween 80 )或聚山梨酯-20 (Tween 20 )。
27.權(quán)利要求
23所述的組合物，其包括(a)大約50至大約200mg/mL的PCSK9特異性拮抗劑；(b)蔗糖、組氨酸和精氨酸，其數(shù)量為以下之一(i)大約3% w/v的蔗糖，大約50mM組 氨酸及大約50mM精氨酸；或(ii)大約6% w/v的蔗糖，大約IOOmM組氨酸及大約IOOmM精氨酸；(c)大約0.0040M至大約0. 0045M的鹽酸(“HC1”)，其數(shù)量足以使pH達(dá)到大約6的范 圍；以及(d)無菌水；其中所述的藥物組合物的PH為大約6的范圍；并且其中所述的藥物組合物任選包括大 約0. 01%至大約1% w/v的聚山梨酯-80 (Tween 80 )或聚山梨酯-20 (Tween 20 )。
28.拮抗PCSK9功能的方法，其包括施用權(quán)利要求
1-22中任意一項所述的PCSK9特異 性拮抗劑。
29.權(quán)利要求
1-22中任意一項所述的PCSK9特異性拮抗劑在制備用于減輕由PCSK9功 能引起的和/或由PCSK9功能加劇的紊亂、病癥或疾病的藥物中的用途。
30.編碼權(quán)利要求
1-22中任意一項所述的PCSK9特異性拮抗劑的分離的核酸。
31.編碼權(quán)利要求
1所述的PCSK9特異性拮抗劑的分離的核酸；其中重鏈可變區(qū)的 ⑶R3結(jié)構(gòu)域由包含SEQ ID NO 18的核苷酸序列編碼；和/或其中輕鏈可變區(qū)的⑶R3結(jié)構(gòu) 域由包含SEQ ID NO 8的核苷酸序列編碼。
32.權(quán)利要求
31所述的分離的核酸，其進(jìn)一步包括(a)分別由包含SEQID NO: 14和SEQ ID NO 16的核苷酸序列編碼的位于重鏈可變區(qū) 的CDRl和/或CDR2結(jié)構(gòu)域；(b)分別由包含SEQID NO :4和SEQ ID NO :6的核苷酸序列編碼的位于輕鏈可變區(qū)的 CDRl和/或CDR2結(jié)構(gòu)域。
33.編碼權(quán)利要求
1所述的PCSK9特異性拮抗劑的分離的核酸；其中所述PCSK9特異 性拮抗劑包括(a)由包含SEQID NO 12的核苷酸序列編碼的重鏈可變區(qū)；和/或(b)由包含SEQID NO :28的核苷酸序列編碼的輕鏈可變區(qū)。
34.編碼權(quán)利要求
1所述的PCSK9特異性拮抗劑的分離的核酸；其中所述PCSK9特異 性拮抗劑包括(a)由包含SEQID NO 29的核苷酸序列編碼的重鏈區(qū)；和/或(b)由包含SEQID NO :30的核苷酸序列編碼的輕鏈區(qū)。
35.包含權(quán)利要求
30-34中任意一項的核酸的載體。
36.體外或原位的分離的宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞的群體，其包含權(quán)利要求
30-34中任意 一項的核酸。
37.生產(chǎn)PCSK9特異性拮抗劑的方法，其包括(a)在適合生產(chǎn)PCSK9特異性拮抗劑的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求
36的細(xì)胞；及(b)分離所產(chǎn)生的PCSK9特異性拮抗劑。
38.體外或原位的分離的宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞的群體，其包含權(quán)利要求
1的PCSK9特異 性拮抗劑。
專利摘要
本文公開了人類枯草溶菌素轉(zhuǎn)化酶9(“PCSK9”)的拮抗劑。本文公開的拮抗劑能有效抑制PCSK9的功能，因此是目前用于治療與PCSK9活性相關(guān)的病癥的合意的拮抗劑。本發(fā)明還公開了編碼所述拮抗劑的核酸、包含所述拮抗機(jī)的載體、宿主細(xì)胞及組合物。本文還公開了制備PCSK9特異性拮抗劑的方法及利用該拮抗劑抑制或拮抗PCSK9功能的方法，這些構(gòu)成了本公開的其他方面。
文檔編號C12N9/64GKCN101939338SQ200980104396
公開日2011年1月5日 申請日期2009年2月6日
發(fā)明者A·西特拉尼, D·D·伍德, D·K·瑙羅基, F·董, H·A·哈蒙德, H·尤德, H·馬赫, J·C·桑托羅, J·H·康德拉, J·T·布呂, K·王, L·B·彼得森, P·羅, P·鐘, R·M·庫邦, S·M·格里戈里, S·潘迪特, T·麥凱布, Y·李 申請人:默沙東公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan