專利名稱:蔗糖磷酸化酶的突變體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蔗糖磷酸化酶突變體及其應(yīng)用，特別涉及一種對(duì)蔗糖磷酸化酶的改造，使其能夠提高對(duì)蔗糖降解的活性。
背景技術(shù)：
蔗糖作為植物中通過(guò)光合作用產(chǎn)生的糖類物質(zhì)，是一種含量豐富的生物質(zhì)，全球蔗糖的年產(chǎn)量超過(guò)了 5億噸。蔗糖是由α-D-葡萄糖和β-D-果糖通過(guò)1，2糖苷鍵組成的二糖，該二糖分解而成的單糖長(zhǎng)期以來(lái)作為發(fā)酵工業(yè)中的碳源而被利用，特別是水解發(fā)酵產(chǎn)酒精工業(yè)的應(yīng)用。
蔗糖磷酸化酶Sucrose phosphorylase (EC 2. 4. 1. 7)是一類催化蔗糖生成果糖和1-磷酸葡萄糖的酶。1-磷酸葡萄糖跟著被轉(zhuǎn)化成6-磷酸葡萄糖，6-葡萄糖和果糖進(jìn)入微生物的糖酵解發(fā)酵途徑得到有機(jī)醇、氨基酸及生物聚合物等高附加值的化工產(chǎn)品(Van Laere, K. Μ. J., et al. ，2000， Fermentation of Plant Cell Wall Derived Polysaccharides and Their Corresponding 01igosaccharides by Intestinal Bacteria. Journal of Agricultural and Food Chemistry,48(5) : 1644-1652.)。
g ItrS^^ WffKi Bifidobacterium species, Streptococcus species，Leuconostoc species and Pseudomonas這些菌中純化或是克隆、表達(dá)這些酶并進(jìn)行功能鑒定。Broek等人對(duì)來(lái)自Bifidobacterium adolescentis DSM20083的蔗
(van den Brock, L. Α. , et al. ,2004, Physico-chemical and transglucosyIation properties of recombinant sucrose phosphorylase from Bifidobacterium adolescentis DSM20083. Appl Microbiol Biotechnol，65 (2) 219-27.) JALeuconostoc mesenteroides B-1149 中 Lee 等人克隆和表達(dá)了一個(gè)蔗糖磷酸化酶 Spase (Lee，J. -H.，et al.，2006，Molecular cloning of a gene encoding the sucrose phosphorylase from Leuconostoc mesenteroides B_1149and the expression in Escherichia coli. Enzyme and Microbial Technology,39 (4) :612_620.) ；Sugimoto 等人克隆和鑒定了一個(gè)來(lái)自Streptococcus mutens的蔗糖磷酸化酶(Sugimoto，K.， et al.,2007, Novel transglucosylating reaction of sucrose phosphorylase to carboxylic compounds such as benzoic acid. J Biosci Bioeng，104 (1) :22_9·)； Lee等人從Leuconostoc mesenteroides NRRL B-742中克隆了一個(gè)蔗糖磷酸化酶基因， 并在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)(Lee, J. H.，et al.，2008，Cloning and expression of the sucrose phosphorylase gene from Leuconostoc mesenteroides in Escherichia coli. Biotechnol Lett,30 (4) :749_54.)。
蔗糖水解酶類(蔗糖水解酶、蔗糖磷酸化酶等)是降解蔗糖代謝途徑的第一個(gè)酶， 也是微生物蔗糖代謝途徑中的關(guān)鍵酶之一，是決定蔗糖發(fā)酵時(shí)間的最主要的因素之一。因此尋找新的蔗糖水解酶于構(gòu)建新的更適合工業(yè)化生產(chǎn)各種化工產(chǎn)品的基因工程菌，提高微生物水解蔗糖的轉(zhuǎn)化效率和水解速度，從而縮短發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)間，對(duì)于降低直接發(fā)酵甘蔗汁生產(chǎn)各種化工產(chǎn)品的生產(chǎn)成本具有十分重要的意義。
蔗 糖磷酸化酶屬于糖基水解酶類(glycosyl hydrolases)，許多糖基水解酶由一個(gè)催化功能域和一個(gè)或更多個(gè)其它的功能域組成，根據(jù)催化功能域的氨基酸序列相似性，糖基水解酶類被劃分成不同的家族(families) (Davies G.，Henrissat B. 1995. Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases. Structure 3 :853_859 ；Henrissat B. , Bairoch A. 1996.Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases. Biochem. J. 316 =695-696) 根據(jù)碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫(kù)(http//www. cazy.org/fam/acc_GH.html)上所列糖基水解酶類的最新清單，目前糖基水解酶類有112 個(gè)家族。蔗糖磷酸化酶屬于糖基水解酶類家族13。
美國(guó)密蘇里州孟山都公司公開了有關(guān)蔗糖磷酸化酶的中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?96193014公開號(hào)1180380發(fā)明名稱植物中蔗糖磷酸化酶的表達(dá)，發(fā)明人G. F.巴爾萊； J. W.德韋爾德；G.M.基肖雷；M.L.維爾登，文摘通過(guò)用一種基因的轉(zhuǎn)化作用向植物引入蔗糖磷酸化酶活性，因?yàn)檫@種酶提高蔗糖水解速度，產(chǎn)生提高的淀粉，油和蛋白質(zhì)水平。優(yōu)選的基因來(lái)自變異鏈球菌。出人意料地實(shí)現(xiàn)在馬鈴薯塊莖中轉(zhuǎn)化以表達(dá)該基因，減小擦傷變色敏感性和提高淀粉在塊莖中分布的均勻度。主權(quán)利要求
一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括下面步驟(a)向植物細(xì)胞基因組中插入重組雙鏈DNA分子，該分子包括(i)在靶植物組織細(xì)胞中起作用的啟動(dòng)子，(ii)引起編碼蔗糖磷酸化酶的RNA序列產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)DNA 序列，(iii)在植物細(xì)胞中起作用，引起轉(zhuǎn)錄中止和向RNA序列3'末端加入聚腺苷酸化核苷酸的3'非翻譯DNA序列；(b)獲得轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；和(c)從所述轉(zhuǎn)化過(guò)的植物細(xì)胞中再生出一種基因工程轉(zhuǎn)化的植物，其基因組包含步驟(a)所述重組雙鏈DNA分子。優(yōu)先權(quán)項(xiàng)US 1995-2-1008/386，860PCT項(xiàng)進(jìn)入國(guó)家階段日1997年9月30日，國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT/ US96/01959國(guó)際申請(qǐng)日1996年2月8日，國(guó)際公布日1996年8月15日，國(guó)際公布號(hào) Μ^βΛΑΘΤΘΖΟ ^-ΙΙ-ΖΘ。
上述公開文獻(xiàn)報(bào)道的是變異鏈球菌在馬鈴薯塊莖中轉(zhuǎn)化以表達(dá)該基因，得到基因工程轉(zhuǎn)化的植物。
本發(fā)明人在教學(xué)和科研中，對(duì)蔗糖磷酸化酶研究的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)磷酸蔗糖酶蔗糖的降解可以進(jìn)行改造，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)，提出了一種人工缺失逆反應(yīng)的蔗糖磷酸化酶的基因及其應(yīng)用的課題，并于2008年申請(qǐng)了中國(guó)專利，申請(qǐng)?zhí)?00810073985，
公開日2009/12/23公告日公開號(hào)101608185，發(fā)明名稱一種人工缺失逆反應(yīng)的蔗糖磷酸化酶的基因及其應(yīng)用，發(fā)明人杜麗琴；黃日波；韋宇拓，申請(qǐng)人廣西大學(xué)，申請(qǐng)人地址廣西壯族自治區(qū)南寧市西鄉(xiāng)塘區(qū)大學(xué)路100號(hào)，文摘一種編碼蔗糖磷酸化酶的基因spgx，含有 SEQ ID NO :1的核苷酸序列或其功能等同變異體。它是通過(guò)對(duì)一個(gè)磷酸蔗糖酶進(jìn)行DNA分子改造而得到。所述基因所編碼的蛋白質(zhì)具有水解蔗糖生成1-磷酸葡萄糖和果糖的功能， 但是缺失了逆向反應(yīng)，不能把1-磷酸葡萄糖和果糖逆向生成蔗糖。同時(shí)也缺失了對(duì)各種單糖的轉(zhuǎn)糖苷作用。獲得的新的基因可用于構(gòu)建高效降解利用蔗糖的宿主菌，在蔗糖的降解中具有廣泛的用途。主權(quán)利要求
一種編碼蔗糖磷酸化酶的基因，其特征在于，所述基因具有SEQ IDNO :1核苷酸序列或其功能等同變異體。但是該專利申請(qǐng)雖然公開了基因的表達(dá)以及缺失逆反應(yīng)的蔗糖磷酸化酶水解蔗糖的酶活，但沒(méi)有給出缺失逆反應(yīng)的蔗糖磷酸化酶基因的效果，儀器測(cè)量的結(jié)果也沒(méi)有給出。
發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是通過(guò)對(duì)蔗糖磷酸化酶的改造，使之獲得新的蔗糖磷酸化酶突變體，這個(gè)突變體酶可用于構(gòu)建高效降解利用蔗糖的宿主菌，突變體酶的特殊在于水解蔗糖活性提高2. 1倍，該突變體酶可用于蔗糖的降解。
以上所述的新的蔗糖磷酸化酶突變體Spgx-478V(SEQ ID NO :1)，其是通過(guò)分子改造蔗糖磷酸化酶基因unspase (GenBank序列號(hào)FJ472846)而得到的，具體是通過(guò)在unspase 分子上加入一段人工設(shè)計(jì)的核苷酸序列同時(shí)突變478位的氨基酸(由賴氨酸Lys突變成纈氨酸Val)，改造得到一個(gè)新的蔗糖磷酸化酶突變體。與原酶(Unspase)相比，新的蔗糖磷酸化酶突變體Spgx-478V的酶活提高2. 1倍。
SEQ ID NO 1的蛋白質(zhì)是蔗糖磷酸化酶突變體Spgx_478V，由501個(gè)氨基酸組成。
序列表具體如下
SEQ ID NO. 1
(1)序列特征
a.長(zhǎng)度501氨基酸
b.類型多肽
c.鏈型單鏈
d.幾何結(jié)構(gòu)立體
(2)分子類型蛋白質(zhì)
(3)序列描述
Met Lys Asn Lys Val Gln Leu lie Ala Tyr Val Asp Arg lie Ser
151015
Gly Gly Gly Phe Arg Lys Leu His Ala Pro Leu Thr Gly Pro Leu
16202530
Ala Glu lie Phe Gly Gly Ala His Leu Leu Pro Phe Phe Thr Pro
31354045
lie Asp Gly Ala Asp Ala Gly Phe Asp Pro Ser Asp His Thr Gln
46505560
Val Asp Pro Arg Leu Gly Thr Trp Asp Asp Val Arg lie Leu Gly
61657075
Gly Ala lie Glu Leu Val Ala Asp Leu lie Val Asn His Val Ser
76808590
Ser Ser Ser Pro Gln Phe lie Asp Tyr Ser Lys Lys Gly Ser Asp
9195100105
Ser Leu Tyr Ala Gly Met Phe Leu Thr Tyr Asp Arg Val Phe Pro
106110115120
Glu Gly Ala Arg Glu Ala Asp lie Leu Arg lie Tyr Arg Pro Arg
121125130135
Pro Thr Leu Pro Phe Ser Pro Val Thr Leu Ser Ser Arg Glu Arg[0041]136140145150
Lys Leu LeuTrp Thr ThrPhe Asn Pro GluGln Val Asp lie Asp
151155160165
Val Arg HisPro Glu AlaGlu Ala Tyr LeuHis Ser lie Leu Lys
166170175180
Lys Phe GlnAla Ala Glylie Arg Met lieArg Leu Asp Ala Val
181185190195
Gly Tyr Ala lie Lys LysPro Gly Ala SerCys Phe Met lie Pro
196200205210
Glu Thr PheAsp Phe lieAla Glu Leu ThrGlu Lys Ala Arg Ala
211215220225
Leu Gly lieGlu Val LeuVal Glu lie HisSer His Tyr Arg Lys
226230235240
Gln lie Glulie Ala ArgGln Val Asp TrpVal Tyr Asp Phe Ala
241245250255
Leu Pro ProLeu Val LeuHis Ala Leu PheAla Ser Asp Pro His
256260265270
Pro Leu Ala Gln Trp LeuSer lie Ser ProArg Asn Ala Val Thr
271275280285
Val Leu AspThr His AspGly lie Gly Vallie Asp Val Gly Ala
286290295300
Asp Ala GluGly Asn ProGly Leu Leu SerPro Ala Ala lie Asp
301305310315
Ser Leu ValGlu Thr lieHis Ser Arg SerGln Gly Gln Ser Arg
316320325330
Glu Ala ThrGly Ala AlaAla Asn Asn LeuAsp Leu Tyr Gln Val
330335340345
Asn Cys ThrPhe Leu AspAla Leu Gly GlyArg Glu Pro Asp Tyr
346350355360
Leu lie Ala Arg Ala LeuGln Phe Phe AlaPro Gly lie Pro Gln
361365370375
Val Tyr TyrVal Gly LeuLeu Gly Gly ThrAsn Asp Met Asp Leu
376380385390
Leu Gly Arg Ser Gly ValGly Arg Asp lieAsn Arg His Tyr Tyr
391395400405
Thr Asp Ala Glu lie AspAla Ala Leu AlaArg Pro Leu Val Arg
406410415420
Thr Leu lieAla Leu lieArg Leu Arg AsnThr His Pro Ala Phe
421425430435[0080]Ala Gly Glu Phe Asp Val Ser Val Pro Ala Ala Thr Gln lie Arg
436440445450
Leu Arg Trp Arg Gly Glu Thr Ser Gln Ala Thr Leu Thr Phe Glu
451455460465
His Trp lie Glu Leu His Val Asp Leu Ser lie Pro Val Ala Ser
466470475480
lie Thr Gly Thr Gly lie His Pro lie Thr lie Pro Gly Ala Ala
481485490495
Asp Ala Gly Ala Pro Ser0
496500
由上述可見，上述SEQ ID NO :1蔗糖磷酸化酶突變體的蛋白質(zhì)478位的氨基酸發(fā)生了突變一由賴氨酸Lys突變成纈氨酸Val，雖然這個(gè)簡(jiǎn)單的氨基酸改變，卻是本發(fā)明人經(jīng)過(guò)很多次實(shí)驗(yàn)，從引物的設(shè)計(jì)到基因的表達(dá)等都進(jìn)行了研究，并采用了很多科學(xué)手段和儀器才能夠測(cè)量和重現(xiàn)的結(jié)果，屬于非顯而易見性。
以上的新的蔗糖磷酸化酶突變體Spgx-478V(SEQ ID NO 1)的具體制備方法包括 unspase基因的克隆、蔗糖水解酶突變體基因的獲得、蔗糖磷酸化酶突變體基因spgx-478V 的獲得、蔗糖磷酸化酶突變體基因spgx-478V的表達(dá)和表達(dá)產(chǎn)物的純化及蔗糖磷酸化酶突變體Spgx-478V水解蔗糖酶活的測(cè)定步驟。
具體方案如下
材料包括大腸桿菌(Escherichia coli)、載體、基因突變?cè)噭┖?、Ni-NTA蛋白質(zhì)組氨酸純化介質(zhì)、內(nèi)切酶、修飾酶。
l)unspase基因的克隆
用正向引物
5，-AGACAATTGATGCACCACCACCACCACCACAAAAATAAGGTTCAGCTTATTGCC-3，(包含一個(gè) MunI酶切位點(diǎn)和一個(gè)6xHis標(biāo)簽在5，末端)和反向引物，5，_CACAAGCTTCGATGGAGCGCCGGCA TCGGC-3，(包含一個(gè)Hindi11酶切位點(diǎn)在5，端)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用MunI和Hindi11 進(jìn)行雙酶切，然后連接到PSE380表達(dá)載體中，獲得的重組質(zhì)粒命名為pSE-imspase。
2)蔗糖磷酸化酶突變體基因spgx-478V的獲得
spgx-478V基因是根據(jù)unspase基因序列信息通過(guò)在正向引物中加入一段核苷酸序列(GCGGCGAAACCAGCCAGGCCACGCTGACGTTCG)和將編碼賴氨酸的AAG人為地突變成編碼纈氨酸的GTG來(lái)進(jìn)行改造。以1)中構(gòu)建的pSE-imspase為模板，使用正向引物5’_CGCGGC GAAACCAGCCAGGCCACGCTGACGTTCGAACACTGGATTGAGCTGCATGTGGACTTGTCCATTCCAGTGGCT-3'禾P 反向引物 5，-GAACGTCAGCGTGGCCTGGCTGGTTTCGCCGCGCCAGCGAAGCCGGATTTG-3’ )進(jìn)行 PCR， PCR反應(yīng)程序第一步95°C 2分鐘；第二步進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，循環(huán)為98°C 10秒，48°C 15秒， 720C 6分鐘；第三步72°C 10分鐘。PCR產(chǎn)物使用IyL Dpn I在37°C酶切一個(gè)小時(shí)，然后轉(zhuǎn)化XLlO-Gold感受態(tài)細(xì)胞(CaCl2化學(xué)法轉(zhuǎn)化)。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物克隆送交大連寶生物公司進(jìn)行 DNA測(cè)序分析確定正確的轉(zhuǎn)化子。
3)蔗糖磷酸化酶突變體基因spgx-478V的表達(dá)和表達(dá)產(chǎn)物的純化
將含有質(zhì)粒pSE-spgX-478V的重組大腸桿菌XLl-Blue菌株接種到20mL含氨芐青霉素(ΙΟΟμ g/mL)的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)，待OD6tltl為0. 6時(shí)，加入IPTG (終濃度為 0. 5mmol/L)、L-三梨醇(終濃度為100mmol/L)和甜菜堿(終濃度為2. 5mmol/L)，20°C誘導(dǎo) 20小時(shí)。11000轉(zhuǎn)離心3min，收集菌體，用4mL裂解緩沖液(50mmol/L NaH2PO4, 300mmol/L NaCl，10mmol/L咪唑，pH 8.0)重懸菌體，超聲波破胞9min。12000轉(zhuǎn)離心lOmin，取上清進(jìn)行后面的蛋白質(zhì)純化。按每4ml上清液加入ImL 50%的鎳親和層析膠體，在4°C用200轉(zhuǎn)搖 60分鐘，把混合物灌注到柱子，收集流出物。加Iml沖洗緩沖液(50mmo VLNaH2PO4, 300mmol/ L NaCl，20mmol/L咪唑，pH 8.0)到柱子里，緩慢攪拌，收集流出物 。重復(fù)沖洗步驟4次。加入洗脫緩沖液(50mmol/L NaH2PO4, 300mmol/L NaCl，250mmol/L 咪唑，pH 8.0)洗脫蛋白質(zhì)。 收集洗脫的蛋白質(zhì)溶液，用變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)有目的大小的蛋白質(zhì)條帶。
4)蔗糖磷酸化酶突變體SpgX-478V水解蔗糖酶活的測(cè)定
蔗糖磷酸化酶突變體Spgx_478V水解蔗糖反應(yīng)取5 μ L蔗糖磷酸化酶Spgx_478V 純化物，與(w/v)蔗糖溶液(50mmol/L磷酸緩沖液(pH 7. 0))在500 μ L的反應(yīng)體系中 37°C作用30分鐘。反應(yīng)時(shí)間到后，在100°C加熱10分鐘終止反應(yīng)。蔗糖的水解能力用高效液相色譜法(HPLC)進(jìn)行檢測(cè)。HPLC檢測(cè)的結(jié)果顯示在使用相同酶量的酶情況下，蔗糖磷酸化酶突變體Spgx-478V的水解蔗糖活性比突變前的蔗糖磷酸化酶Unspase提高2. 1倍。 這樣，微生物水解蔗糖的速度將提高20%。
HPLC條件儀器AgilentllOO色譜儀；色譜柱氨基柱；流動(dòng)相乙腈水 (70 30)；流速1. OmL/min ；檢測(cè)器RID (折光檢測(cè)器)。
由上述可見，SEQ ID NO 1是蔗糖磷酸化酶突變體Spgx，由501個(gè)氨基酸組成， 與本發(fā)明人原先的中國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)101608185，發(fā)明名稱一種人工缺失逆反應(yīng)的蔗糖磷酸化酶的基因及其應(yīng)用，不同的地方是根據(jù)unspase基因序列信息通過(guò)在正向引物中加入一段核苷酸序列(GCGGCGAAACCAGCCAGGCCACG CTGACGTTCG)和將478位編碼賴氨酸的AAG人為地突變成編碼纈氨酸的GTG同時(shí)進(jìn)行改造而獲得的。這個(gè)新的蔗糖磷酸化酶突變體和原酶相比具有水解蔗糖的活性獲得提高，蔗糖的水解能力用高效液相色譜法 (HPLC)進(jìn)行檢測(cè)。HPLC檢測(cè)的結(jié)果顯示在使用相同酶量的酶情況下，蔗糖磷酸化酶突變體Spgx-478V的水解蔗糖活性比突變前的蔗糖磷酸化酶Unspase提高2. 1倍。這樣，微生物水解蔗糖的速度將提高20%。


圖1是蔗糖磷酸化酶突變體SpgX-478V純化物的SDS-PAGE圖。
圖2是突變前蔗糖磷酸化酶Unspase的水解蔗糖活性的H PLC圖。
圖3是蔗糖磷酸化酶突變體Spgx-478V的水解蔗糖活性的HPLC圖。
從圖1 了解到，蔗糖磷酸化酶突變體Spgx-478V純化物的分子量為55kDa。
從圖2以及圖3 了解到，蔗糖磷酸化酶Unspase的蔗糖水解產(chǎn)物果糖的峰面積只有1. 47336e5 (見圖2和以下表1)，而蔗糖磷酸化酶突變體SpgX_478V的蔗糖水解產(chǎn)物果糖的峰面積為3. 13619e5,是蔗糖磷酸化酶Unspase中果糖峰面積的2. 1倍(見圖3和表2)。
這表明蔗糖磷酸化酶突變體SpgX-478V的酶活力是蔗糖磷酸化酶Unspase的酶活力的2. 1倍。[0111]表1
權(quán)利要求
1.一種蔗糖磷酸化酶突變體，其特征在于-^iunspase分子上加入一段人工設(shè)計(jì)的核苷酸序列同時(shí)突變478位的氨基酸一由賴氨酸Lys突變成纈氨酸Val，改造得到一個(gè)新的蔗糖磷酸化酶突變體，蔗糖磷酸化酶突變體的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.一種宿主細(xì)胞，其是含有權(quán)利要求
1所述的蔗糖磷酸化酶突變體的原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
3.權(quán)利要求
1所述的蔗糖磷酸化酶突變體在蔗糖降解和對(duì)含蔗糖材料的處理中的應(yīng)用。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種蔗糖磷酸化酶突變體，其特征是在unspase分子上加入一段人工設(shè)計(jì)的核苷酸序列同時(shí)突變478位的氨基酸-由賴氨酸Lys突變成纈氨酸Val，改造得到一個(gè)新的蔗糖磷酸化酶突變體，這個(gè)突變體酶相對(duì)于突變前的酶具有更高的水解蔗糖能力，比原酶Unspase的酶活提高2.1倍。
文檔編號(hào)C12P19/02GKCN102021152 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請(qǐng)?zhí)朇N 201010506913
公開日2012年1月11日 申請(qǐng)日期2010年10月14日
發(fā)明者龐浩, 杜麗琴, 胡媛媛, 陸堅(jiān), 韋宇拓, 黃日波 申請(qǐng)人:廣西大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan