專利名稱:適合腫瘤干細(xì)胞富集與培養(yǎng)的無血清細(xì)胞培養(yǎng)液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞生物學(xué)研究領(lǐng)域。更具體的，本發(fā)明涉及用于人腫瘤細(xì)胞及腫瘤干細(xì)胞的富集與培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域：
。
技術(shù)背景
腫瘤是一種異質(zhì)性的組織，腫瘤細(xì)胞受復(fù)雜的微環(huán)境影響，在增殖過程中不斷獲得基因突變，導(dǎo)致腫瘤組織中有多種表型和分化程度不同的腫瘤細(xì)胞。近年來，通過對腫瘤研究的進(jìn)ー步深入，越來越多的研究者支持腫瘤干細(xì)胞(Cancer Stem Cells, CSC)假說。CSC是存在于腫瘤組織中具有自我更新，自我復(fù)制能力的細(xì)胞，CSC對化療藥物和放射線治療具有很強(qiáng)的耐受性，并且可以分化出不同表型的腫瘤細(xì)胞，重建腫瘤組織的異質(zhì)性。對CSC的深入研究，有助于了解腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)理，對腫瘤的早期檢測、治療和診斷都有重要的臨床意義，因此如何從腫瘤中富集到CSC便成為關(guān)注的焦點(diǎn)。
目前富集CSC的方法主要有以下兩種
(I)利用一個或幾個細(xì)胞表面分子標(biāo)記物，通過流式細(xì)胞分選得到目的細(xì)胞。CD 133是利用最多的分子，利用CD133從前列腺癌、肺癌、胰腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、大腸癌等組織中分離出的陽性細(xì)胞有很強(qiáng)的自我更新能力，只需100-500個細(xì)胞即可致瘤，而CD133—細(xì)胞的成瘤性較差或無成瘤能力。其次是CD44，應(yīng)用于乳腺癌、大腸癌、頭頸部鱗癌等干細(xì)胞的分離。也有利用幾種分子的組合，如⑶347⑶38用于AML干細(xì)胞的分離，⑶447⑶24_A°7Lin用于乳腺癌，⑶447⑶24+/ESA+用于胰腺癌等。另外還有利用其它分子進(jìn)行分選，如 CD20, CD90, CD26, c-kit, ALDHl，ABCB5 等。
(2)側(cè)群(side population, SP)分選是分離腫瘤干細(xì)胞的另ー種常用手法。由于干細(xì)胞大多高表達(dá) ABCG2 (ATP-binding cassette superfamily G member 2),可以將藥物有效地泵出胞外，因此在利用Hoechst熒光染料進(jìn)行流式細(xì)胞分選時，就會形成Hoechst低染區(qū)，即SP細(xì)胞群。SP細(xì)胞既具有類似干細(xì)胞的自我更新和多向分化潛能，還具有獨(dú)特的表型標(biāo)記和生物學(xué)特征，已有越來越多的研究者采用此方法分離腫瘤干細(xì)胞。通常情況下，SP分析與CSC表面標(biāo)志聯(lián)合應(yīng)用會大大提高分選的效率。
但是，現(xiàn)有的篩選方法不能得到高度純化的CSC，在ー些文獻(xiàn)中，分選后的CSC與非CSC的總和大于未分選時細(xì)胞的總量。而且大多數(shù)的腫瘤還沒有合適的CSC表面分子標(biāo)志。最近的研究發(fā)現(xiàn)，CD133_的癌細(xì)胞群中也有CSC。SP分析篩選方法與實驗前細(xì)胞的培養(yǎng)條件，細(xì)胞狀態(tài)都有密切關(guān)系，添加不同濃度的血清，SP細(xì)胞所占總細(xì)胞的比例就不同。研究人員將腫瘤細(xì)胞注射到免疫缺陷的小鼠體內(nèi)，不斷地對致瘤后的小鼠進(jìn)行化療，從而富集到了一株乳腺癌干細(xì)胞。這ー實驗方法忽略了小鼠體內(nèi)微環(huán)境對人腫瘤干細(xì)胞的影響。而且實驗操作過程中的一些機(jī)械的，物理的，化學(xué)的，生物的因素可能損害了部分CSC，使其被歸為非CSC。另外，所得到的CSC—般是通過懸浮培養(yǎng)進(jìn)行維持和擴(kuò)增的。現(xiàn)有的培養(yǎng)方法不僅CSC擴(kuò)增速度慢，不易傳代，而且很容易分化，無法滿足研究需求。
公開號為CN101851605A，
公開日為2010年10月6日，發(fā)明名稱為“肝干細(xì)胞的選擇培養(yǎng)基、選擇性分離并擴(kuò)增肝干細(xì)胞的方法及用于治療糖尿病的藥物組合物”的中國發(fā)明專利申請公開了ー種肝干細(xì)胞的選擇培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基以液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，含有胎牛血清、人表皮生長因子和堿性成纖維細(xì)胞生長因子。使用該培養(yǎng)基可以擴(kuò)增肝干細(xì)胞。該發(fā)明是針對肝干細(xì)胞的分離和擴(kuò)增所做出的改進(jìn)。但是血清中含有上千種不明成分，這些不明成分對干細(xì)胞的影響是不可忽視的。如果含有血清，干細(xì)胞就很容易分化，并且很難人為地控制誘導(dǎo)分化的方向。另外血清批次間的質(zhì)量變動會影響細(xì)胞培養(yǎng)和實驗結(jié)果的重復(fù)性。這些因素限制了該專利的生產(chǎn)應(yīng)用。
公開號為CN101580816A，
公開日為2009年11月18日，發(fā)明名稱為“誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞高效產(chǎn)生的新型無血清培養(yǎng)基以及使用其的方法”的中國發(fā)明專利申請公開了ー種能將體細(xì)胞誘導(dǎo)重編程為多能性干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，以及使用該無血清培養(yǎng)基在無需 飼養(yǎng)層的條件下誘導(dǎo)重編程體細(xì)胞的方法。同一年，Silvia Penuelas等人應(yīng)用無血清培養(yǎng)體系從神經(jīng)膠質(zhì)瘤病人的腫瘤組織中富集到了神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞。上述兩種無血清培養(yǎng)基雖然避免了血清培養(yǎng)的弊端，但它們的添加物都含有Invitrogen(GIBCO)公司研發(fā)的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液B27和(或)N2。B27可以提高iPS和CSC的富集效率，但是其中的ー些成份是沒有公開的，這樣會使實驗背景不清，而且實驗成本較高，限制了其應(yīng)用范圍。
綜上所述，科研工作者雖然開發(fā)了數(shù)種富集CSC的方法，但每種方法都有其應(yīng)用的局限性。免疫篩選不僅需要大量的標(biāo)記抗體與試劑，還需要昂貴復(fù)雜的篩選設(shè)備。抗藥性富集又需要很長的實驗周期，費(fèi)時費(fèi)力。因此，本領(lǐng)域迫切需要建立一種適用范圍廣，實驗周期短，成本低廉，簡便高效的富集CSC的方法。富集到的CSC如果能傳代培養(yǎng)，一方面能夠保證實驗過程中CSC的穩(wěn)定供應(yīng)，節(jié)省了毎次實驗前的富集時間。另ー方面，能夠保證毎次實驗的可重復(fù)性及實驗結(jié)果的一致性，更有助于腫瘤干細(xì)胞領(lǐng)域的相關(guān)研究。但目前市面上還沒有針對腫瘤干細(xì)胞的培養(yǎng)液。因此，本領(lǐng)域迫切需要一種適用于腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)、應(yīng)用性強(qiáng)、完全是化學(xué)成分清晰的無血清細(xì)胞培養(yǎng)液。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一就是提供一種適用于人腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)液。
本發(fā)明的目的之ニ就是提供一種適用于人腫瘤干細(xì)胞富集的培養(yǎng)方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案為一種適合腫瘤干細(xì)胞富集與培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)液，是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM/F12中添加以下成份一種或多種必須氨基酸及非必須氨基酸、一種或多種維生素、一種或多種鹽類、一種或多種脂類、ー種或多種微量元素、ー種或多種激素類化合物、一種或多種緩沖液、ー種或多種轉(zhuǎn)金屬蛋白、一種或多種抗氧化齊U、血清白蛋白及粘多糖類物質(zhì)。
本發(fā)明的培養(yǎng)基是以DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在其中添加轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、脂類如氨基こ醇、微量元素如亞硒酸鈉、3 -巰基こ醇代替?zhèn)鹘y(tǒng)有血清培養(yǎng)液，避免了血清組分對實驗研究的影響。大多數(shù)惡性程度高的腫瘤細(xì)胞株，在快速除掉血清后，在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加上述成分，培養(yǎng)一段時間，即可以富集到腫瘤干細(xì)胞。某些惡性細(xì)胞株在添加上述成分后，加入2-6ug/L的人TGF-P I可以極大地促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞的富集效率。在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加上述成份后，再添加牛血清白蛋白-油酸，人FGF2，肝素鈉，L-抗壞血酸-2-磷酸三鈉鹽后，即可懸浮培養(yǎng)富集到的腫瘤干細(xì)胞，并可以傳代培養(yǎng)。從而開發(fā)出ー種適用于人腫瘤干細(xì)胞富集的培養(yǎng)液。
所述的氨基酸包括谷丙氨酸ニ肽，還包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸中的ー種或多種。
所述的維生素包括L-抗壞血酸-2-磷酸三鈉鹽，還包括生物素、氯化膽堿、葉酸、肌醇、腐胺、維生素B6、泛酸鈣、核黃素、吡多素HCL、維生素B12、鹽酸硫胺中的ー種或多種。
所述的鹽類為氯化鈣、氯化鈉、氯化鉀、磷酸ニ氫鈉、磷酸氫ニ鈉、丙酮酸鈉。
所述的微量元素為硫酸銅、硝酸鐵、硫酸亞鐵、氯化鎂、硫酸鎂、硫酸鋅、亞硒酸鈉。所述的脂類為油酸、亞油酸、氨基こ醇、硫辛酸。
所述的緩沖劑為碳酸氫鈉、HEPES。
所述激素為胰島素。
所述的無血清細(xì)胞培養(yǎng)液適用于從惡性腫瘤細(xì)胞株和新鮮的腫瘤組織中富集腫瘤干細(xì)胞，針對某些惡性腫瘤細(xì)胞株，添加2-6ug/ml的TGF-P 1，可以加快并提高腫瘤干細(xì)胞的富集率。
優(yōu)選地，所述的無血清培養(yǎng)液中各種成分的含量為
丙氨酸 4 5mg/L精氨酸134 155mg/L
天冬酰胺 6. 5 8. 2mg/L天冬氨酸6. 5 7. 5mg/L
半胱氨酸 16. I 18. 3mg/L 胱氨酸30 35mg/L
谷氨酸 7.0 8. Omg/L谷氨酰胺335 450mg/L
甘氨酸 16 19mg/L組氨酸31 33mg/L
異亮氨酸52. 3 56.6mg/L 亮氨酸55. 5 60mg/L
賴氛酸90.8 96. 5mg/L甲硫氛酸16. 5 18. 5mg/L
苯丙氛酸33. 25 37. 75mg/L 腦氛酸16. 5 18. 5mg/L
絲氛酸24.8 27.6mg/L蘇氛酸51. 25 55. 45mg/L
色氛酸8. 5 9. 6mg/L釀氛酸54. 35 57. 25mg/L
纈氨酸50. 55 55. 75mg/L 生物素0. 003 0. 004mg/L
氯化膽堿7. 8 9. 5mg/L葉酸2. 2 2. 76mg/L
肌醇11. 28 13. 46mg/L 煙酸胺I. 9 2. lmg/L
泛酸I丐I. 9 2. 3mg/L維生素 B6I. 9 2. 2mg/L
批多素0.03 0.033mg/L 核黃素0. 2 0. 25mg/L
鹽酸硫胺 1.9 2.3mg/L胸苷0. 315 0. 385mg/L
維生素B12 0. 6 0. 72mg/LL-抗壞血酸-2-憐酸 9. 5 12. 5mg/L
三鈉鹽
硫酸銅0.001 0.0015mg/L 硝酸鐵0.045 0. 065mg/L
硫酸亞鐵0. 38 0.42mg/L 氯化鎂58. 2 62.8mg/L
硫酸鎂 48 5 lmg/L硫酸鋅0. 4 0. 5mg/L
氯化鈣110 120mg/L氯化鉀280 320mg/L
碳酸氫鈉1900 2300mg/L 氯化鈉6800 7000mg/L
憐酸氧二納"70 75mg/L憐酸二氧納50. 5 55. 5mg/L
丙酮酸鈉 200 230mg/L亞硒酸鈉0. 0017 0. 002mg/L
葡萄糖3000 3300mg/LHEPES4553.6 4868. 2mg/L
次黃嘿呤I. 88 2. 2mg/L亞油酸0. 038 0. 044mg/L
油酸88 126mg/L酌■紅納8. 18 8. 98mg/L
腐胺0. 078 0. 082mg/L 硫辛酸0. 098 0. 146mg/L
膜島素I. 6 12. 8mg/L人 TGF-P I2 6ug/L
轉(zhuǎn)鐵蛋白 3. 6 5. 8mg/LP -疏基こ醇0. 52 0. 88mg/L
氛基こ醇 0. 48 I. lmg/L牛血清白蛋白 450 600mg/L
肝素鈉0. I lmg/L人堿性纖維細(xì)胞生5 20ug/L
長因子
谷丙氨酸ニ肽400_460mg/L
本發(fā)明所述的無血清細(xì)胞培養(yǎng)液采用常規(guī)配制方法，將上述組分溶解于無熱源超純水中(電阻率為18. 2Q)即可配置而成。本發(fā)明所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)液是指含有細(xì)胞生長繁殖所需的基本營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基，可供大多數(shù)細(xì)胞生長。將酸堿度調(diào)至7. 0 7. 2，經(jīng)過濾滅菌處理后，即為基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基。
本發(fā)明所述的無血清細(xì)胞培養(yǎng)液的使用方法是腫瘤細(xì)胞株在本發(fā)明的無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)即可富集到腫瘤干細(xì)胞。對于腫瘤組織的原代培養(yǎng)，只需將組織塊剪碎或消化成單細(xì)胞接種到本發(fā)明所述的無血清培養(yǎng)液中，然后再適合的培養(yǎng)條件(37°C，5% CO2)培養(yǎng)48-72h后，即可在培養(yǎng)液中見到懸浮的呈球狀的腫瘤干細(xì)胞。
本發(fā)明的無血清培養(yǎng)液的積極效果是
(I)不含血清，實驗體系清晰、成份確定，有利于實驗結(jié)果的分析，避免了不可知成份所造成的實驗背景不清對實驗結(jié)果所帶來的影響。
(2)適用范圍廣，適用于多種類型的腫瘤干細(xì)胞的培養(yǎng)。
(3)適用于富集腫瘤干細(xì)胞，不僅適用于從腫瘤細(xì)胞株中富集腫瘤干細(xì)胞，也適用于從新鮮的腫瘤組織中富集腫瘤干細(xì)胞。富集到的腫瘤干細(xì)胞具有很好的生物學(xué)活性和干細(xì)胞特性，并且可以傳代培養(yǎng)。
(4)富集腫瘤干細(xì)胞的方法操作簡便、實驗周期短、適用范圍廣，不對細(xì)胞進(jìn)行復(fù)雜的處理，不會對細(xì)胞造成物理的、化學(xué)的、生理的損傷，最大程度的維持腫瘤干細(xì)胞的細(xì)胞活性的生理學(xué)特性。適用于從惡性腫瘤細(xì)胞株和新鮮的腫瘤組織中富集腫瘤干細(xì)胞。
本發(fā)明的無血清培養(yǎng)液首次將谷丙氨酸ニ肽應(yīng)用于腫瘤干細(xì)胞的富集與培養(yǎng)。谷丙氨酸ニ肽在培養(yǎng)條件下比L-谷氨酰胺穩(wěn)定，不僅可以持續(xù)為干細(xì)胞提供能量，而且可以避免因自然代謝而造成的有毒代謝物的積累。
維生素C參與細(xì)胞多種生物化學(xué)反應(yīng)，是ー種非常重要的氧化劑。2009年，MiguelAngel Esteban等人研究發(fā)現(xiàn)，VC可以顯著提高iPS的誘導(dǎo)效率。但VC非常不穩(wěn)定,極易被氧化分解。本發(fā)明的無血清培養(yǎng)液中添加的L-抗壞血酸-2-磷酸三鈉鹽是一種比維生素C更穩(wěn)定的抗氧化劑，它在培養(yǎng)液中可以長時間保持活性，大大延緩腫瘤干細(xì)胞衰老的速度，且有助于為細(xì)胞提供一個穩(wěn)定的還原性的微環(huán)境。本發(fā)明的無血清培養(yǎng)液還添加了肝素鈉，以促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)FGF2的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
本發(fā)明的無血清培養(yǎng)是ー種化學(xué)成分完全明確的合成培養(yǎng)液。與公開號為CN101580816A，
公開日為2009年11月18日，發(fā)明名稱為“誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞高效產(chǎn)生的新型無血清培養(yǎng)基以及使用其的方法”的中國發(fā)明專利申請相比，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)液成 分明確，添加物成分簡單易配制，成本更低廉，應(yīng)用范圍更廣范。


圖I為顯示利用本發(fā)明的無血清細(xì)胞培養(yǎng)液從骨肉瘤細(xì)胞株MNNG中富集干細(xì)胞的過程的鏡下細(xì)胞圖，各圖分別為培養(yǎng)第二天、第四天、第六天及第八天。
圖2為顯示本發(fā)明的無血清細(xì)胞培養(yǎng)液中添加2_6ug/ml的TGF ^ I前后對腫瘤干細(xì)胞富集效率影響的鏡下細(xì)胞圖，其中圖2a為不含TGF-P I的培養(yǎng)至第5天的圖，圖2b為添加了 TGF-P I的培養(yǎng)至第5天的圖。
圖3為利用本發(fā)明的培養(yǎng)液富集到的腫瘤干細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志性基因。
圖4為將富集到的骨肉瘤干細(xì)胞進(jìn)行消化，并在本發(fā)明的無血清細(xì)胞培養(yǎng)液中進(jìn)行傳代培養(yǎng)的鏡下細(xì)胞圖，其中圖4a采用的無血清培養(yǎng)液沒有添加谷丙氨酸ニ肽，圖4b采用的無血清培養(yǎng)液添加了谷丙氨酸ニ肽。
具體實施例
下面結(jié)合具體實施例進(jìn)ー步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的應(yīng)用范圍。
一種適用于人腫瘤干細(xì)胞富集的細(xì)胞培養(yǎng)液包括氨基酸、維生素、鹽類、脂類、微量元素、激素、緩沖劑及葡萄糖、非必須氨基酸、胸苷、次黃嘌呤、酚紅、3 -巰基こ醇、轉(zhuǎn)鐵蛋白、牛血清白蛋白，其各組分的含量如以下實施例I 3所示
實施例I
丙氨酸 4mg/L 精氨酸 134mg/L
天冬酰胺 6. 8mg/L 天冬氨酸6. 5mg/L
半胱氨酸 16. lmg/L 胱氨酸30mg/L
谷氨酸 7. Omg/L 谷氨酰胺335mg/L
甘氨酸16mg/L組氨酸3 lmg/L
異亮氨酸52. 3mg/L 亮氨酸55. 5mg/L
賴氨酸90.8mg/L 甲硫氨酸16. 5mg/L
苯丙氨酸33. 25mg/L 脯氨酸16. 5mg/L絲氨酸24. 8mg/L 蘇氨酸51. 25mg/L[0084]色氨酸8. 5mg/L酪氨酸54. 35mg/L
纈氨酸50. 55mg/L生物素0.003mg/L
氯化膽堿I. 8mg/L葉酸2. 2mg/L
肌醇11.28mg/L煙酰胺I. 9mg/L
泛酸鈣1.9mg/L維生素 B6I. 9mg/L
卩比多素0. 03mg/L核黃素0. 2mg/L
鹽酸硫胺I. 9mg/L胸苷0. 315mg/L
維生素B120. 6mg/LL-抗壞血酸-2_ 憐酸 9. 5mg/L
三鈉鹽
硫酸銅0. 00 lmg/L硝酸鐵0. 045mg/L
硫酸亞鐵0. 38mg/L氯化鎂58. 2mg/L
硫酸鎂48mg/L硫酸鋅0. 4mg/L
氯化I丐11 Omg/L氯化鉀280mg/L
碳酸氫鈉1900mg/L氯化鈉6800mg/L
磷酸氫ニ鈉70mg/L磷酸ニ氫鈉50. 5mg/L
丙酮酸鈉200mg/L亞硒酸鈉0. 0017mg/L
葡萄糖3000mg/LHEPES4553.6mg/L
次黃嘌呤1.88mg/L亞油酸0.038mg/L
油酸88mg/L酹紅鈉8. 18mg/L
腐胺0.078mg/L硫辛酸0.098mg/L
胰島素1.6mg/L￠-巰基こ醇0. 52mg/L
轉(zhuǎn)鐵蛋白3.6mg/L牛血清白蛋白450mg/L
氨基こ醇0.48mg/L人堿性纖維細(xì)胞生 5ug/L
長因子
肝素鈉0. lmg/L 谷丙氨酸ニ肽400mg/L
實施例2
丙氨酸5mg/L 精氨酸155mg/L
天冬酰胺8. 2mg/L 天冬氨酸7. 5mg/L
半胱氨酸18. 3mg/L 胱氨酸35mg/L
谷氨酸8. Omg/L 谷氨酰胺450mg/L
甘氨酸19mg/L 組氨酸33mg/L
異亮氨酸56.6mg/L 亮氨酸60mg/L
賴氨酸96. 5mg/L 甲硫氨酸18. 5mg/L
苯丙氨酸37. 75mg/L 脯氨酸18. 5mg/L
絲氨酸27.6mg/L 蘇氨酸55.45mg/L
色氨酸9.6mg/L 酪氨酸57. 25mg/L
纈氨酸55.75L 生物素0.04mg/L
氯化膽堿9. 5mg/L 葉酸2. 76mg/L
肌醇13.46mg/L 煙酰胺2. lmg/L[0123]泛酸鈣2.3mg/L維生素 B62. 2mg/L
批多素0.033mg/L核黃素0. 25mg/L
鹽酸硫胺2.3mg/L胸苷0. 385mg/L
維生素B120. 72mg/LL-抗壞血酸-2_ 憐酸 12. 5mg/L
三鈉鹽
硫酸銅0.0015mg/L硝酸鐵0.065mg/L硫酸亞鐵0.42mg/L氯化鎂62.8mg/L
硫酸鎂5 lmg/L硫酸鋅0.5mg/L
氯化鈣120mg/L氯化鉀320mg/L
碳酸氫鈉2300mg/L氯化鈉7000mg/L
磷酸氫ニ鈉75mg/L磷酸ニ氫鈉55. 5mg/L
丙酮酸鈉230mg/L亞硒酸鈉0. 002mg/L
葡萄糖3300mg/LHEPES4868. 2mg/L
次黃嘌呤2.2mg/L亞油酸0. 044mg/L
油酸126mg/L酚紅鈉8. 98mg/L
腐胺0.082mg/L硫辛酸0. 146mg/L
人TGF-316ug/L胰島素12. 8mg/L
轉(zhuǎn)鐵蛋白5.8mg/LP -巰基こ醇0.88mg/L
氨基こ醇I. lmg/L牛血清白蛋白600mg/L
肝素鈉lmg/L人堿性纖維細(xì)胞生20ug/L
長因子
谷丙氨酸ニ肽430mg/L
實施例3
丙氨酸4. 5mg/L精氨酸145mg/L
天冬酰胺7. 5mg/L天冬氨酸7. Omg/L
半胱氨酸17. lmg/L胱氨酸33mg/L
谷氨酸7. 3mg/L谷氨酰胺350mg/L
甘氨酸18mg/L組氨酸32mg/L
異亮氨酸55mg/L亮氨酸57. lmg/L
賴氨酸94.8mg/L甲硫氨酸17. 5mg/L
苯丙氨酸35. 25mg/L脯氨酸17. 5mg/L
絲氨酸25. Omg/L蘇氨酸52. 5mg/L
色氨酸9. 2mg/L酪氨酸55. 35mg/L
纈氨酸53.55mg/L生物素0.035mg/L
氯化膽堿8. 5mg/L葉酸2.4mg/L
肌醇12mg/L煙酰胺2. Omg/L
泛酸鈣2. Omg/L維生素 B62. Omg/L
批多素0.032mg/L核黃素0. 22mg/L
鹽酸硫胺2. lmg/L胸苷0. 35mg/L[0162]維生素B12 0. 67mg/L L-抗壞血酸-2_ 憐酸 10. 2mg/L
三鈉鹽
硫酸銅0.0012mg/L 硝酸鐵0.055mg/L硫酸亞鐵0.40mg/L 氯化鎂59. 2mg/L
硫酸鎂49mg/L硫酸鋅0. 45mg/L
氯化鈣112mg/L 氯化鉀298mg/L
碳酸氫鈉2000mg/L 氯化鈉6900mg/L
磷酸氫ニ鈉 72mg/L 磷酸ニ氫鈉53. 5mg/L
丙酮酸鈉 212mg/L 亞硒酸鈉0.0018mg/L
葡萄糖3200mg/L HEPES4768. 2mg/L
次黃嘌呤 2. Omg/L 亞油酸0. 04mg/L
油酸100mg/L 酚紅鈉8. 48mg/L
腐胺0.08mg/L 硫辛酸0. 126mg/L
ATGF-Pl 2ug/L胰島素10mg/L
轉(zhuǎn)鐵蛋白 4. 6mg/L P -巰基こ醇 0. 68mg/L
氨基こ醇 0.78mg/L 牛血清白蛋白 545mg/L
肝素鈉0. 15mg/L 人堿性纖維細(xì)胞生10ug/L
長因子
谷丙氨酸ニ肽460mg/L
實施例4
應(yīng)用本發(fā)明實施例I的無血清細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)骨肉瘤細(xì)胞株MNNG/H0CS#，即可富集到骨肉瘤干細(xì)胞。如圖I所示，分別為培養(yǎng)第二天、第四天、第六天、第八天的的顯微鏡下的細(xì)胞生長情況。
如果在富集過程中，在本發(fā)明的無血清培養(yǎng)液中添加2_6ug/L的人TGF-P 1，即可大大縮短富集腫瘤干細(xì)胞所需的時間，并且提高富集效率如圖2所示，圖2b為添加了
2-6ug/L的人TGF-P I培養(yǎng)了 5天的骨肉瘤細(xì)胞，圖2a為沒有添加人TGF-P I培養(yǎng)了 5天的骨肉瘤細(xì)胞。圖2a中顯示，沒有添加人TGF-P I時富集到的骨肉瘤干細(xì)胞，圖2b中顯示，添加了人TGF-Pl后，培養(yǎng)到第五天時富集到的骨肉瘤干細(xì)胞，證明了在本發(fā)明的無血清培養(yǎng)液中添加2-6ug/L的人TGF-P 1，即可大大縮短富集腫瘤干細(xì)胞所需的時間，并且提高富集效率。
實施例5
利用免疫熒光染色的分析方法，檢測應(yīng)用本發(fā)明的實施例I的無血清細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)骨肉瘤干細(xì)胞中干細(xì)胞標(biāo)志性基因的表達(dá)，見附圖3。從圖中可見，本發(fā)明的無血清細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)骨肉瘤干細(xì)胞表達(dá)人胚胎干細(xì)胞的標(biāo)志基因Sox2，SSEA-I，TRA-1-81。
實施例6
將富集到的骨肉瘤干細(xì)胞進(jìn)行消化，在本發(fā)明的培養(yǎng)液中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。應(yīng)用本發(fā)明的無血清培養(yǎng)液能很好的維持腫瘤干細(xì)胞特有的細(xì)胞形態(tài)和生理特性。應(yīng)用本發(fā)明實施例3的添加了谷丙氨酸ニ肽的無血清培養(yǎng)液進(jìn)行傳代培養(yǎng)(圖4b)與未添加谷丙氨酸ニ肽的無血清培養(yǎng)液(即谷丙氨酸ニ肽含量為零，其它成份與實施例3成份相同)進(jìn)行傳代培養(yǎng)(圖4a)相比較，骨肉瘤干細(xì)胞的形態(tài)更規(guī)則，邊緣更整齊，結(jié)構(gòu)更致密，說明谷丙氨酸ニ肽的添加對于骨肉瘤干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)具有顯著的優(yōu)勢
權(quán)利要求
1.一種適合腫瘤干細(xì)胞富集與培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)液，其特征在于，其各種成分的含量為 丙氨酸4~5mg/L精氨酸134 155mg/L 天冬酰胺6.5 8.2mg/L天冬氨酸6.5 7.5mg/L 半胱氨酸16.1 18.3mg/L胱氨酸30 35mg/L 谷氨酸7.0 8.0mg/L谷氨酰胺335 450mg/L 甘氨酸16 19mg/L組氨酸31 33mg/L 異亮氨酸52.3 56.6mg/L亮氨酸55.5 60mg/L 賴氨酸90.8~96.5mg/L甲硫氨酸16.5~18.5mg/L 苯丙氨酸33.25 37.75mg/L脯氨酸16.5 18.5mg/L 絲氨酸24.8 27.6mg/L蘇氨酸51.25 55.45mg/L 色氨酸8.5 9.6mg/L酪氨酸54.35 57.25mg/L 纈氨酸50.55 55.75mg/L生物素0.003 0.004mg/L 氯化膽堿7.8 9.5mg/L葉酸2.2 2.76mg/L 肌醇11.28 13.46mg/L煙酰胺1.9 2.1mg/L 泛酸鈣1.9 2.3mg/L維生素B61.9 2.2mg/L 吡多素0.03 0.033mg/L核黃素0.2 0.25mg/L 鹽酸硫胺1.9 2.3mg/L胸苷0.315 0.385mg/L 維生素 B120.6~0.72mg/LL-抗壞血酸-2-磷酸 9.5 12.5mg/L

三鈉鹽 硫酸銅0.001 0.0015mg/L硝酸鐵0.045 0.065mg/L 硫酸亞鐵0.38 0.42mg/L氯化鎂58.2 62.8mg/L 硫酸鎂48 51mg/L硫酸鋅0.4 0.5mg/L 氯化鈣110 120mg/L氯化鉀280 320mg/L 碳酸氧鈉1900~2300mg/L氯化鈉6800 7000mg/L 磷酸氫二鈉70 75mg/L磷酸二氫鈉50.5 55.5mg/L 丙酮酸鈉200 230mg/L亞硒酸鈉0.0017 0.002mg/L葡萄糖3000~3300mg/LHEPES4553.6~4868.2mg/L 次黃嘌呤1.88 2.2mg/L亞油酸0.038 0.044mg/L 油酸88 126mg/L酚紅鈉8.18 8.98mg/L 腐胺0.078 0.082mg/L硫辛酸0.098 0.146mg/L 人TGF-Pl2 6昭/L胰島素1.6 12.8mg/L轉(zhuǎn)鐵蛋白 3.6~5.8mg/LP-巰基乙醇0.52 0.88mg/L 氨基乙醇 0.48 l.lmg/L牛血清白蛋白450 600mg/L 肝素鈉0.1 lmg/L人堿性纖維細(xì)胞生 5 20pg/L 。

長因子 谷丙氨酸二肽400 460mg/L/
2.一種如權(quán)利要求
I所述的無血清培養(yǎng)液的使用方法，其特征在于使腫瘤細(xì)胞株在如權(quán)利要求
I所述的無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)；或?qū)⒛[瘤組織的組織塊剪碎或消化成單細(xì)胞接種到如權(quán)利要求
I所述的無血清培養(yǎng)液中進(jìn)行原代培養(yǎng)，在37°C ,5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)48 72小時。
專利摘要
本發(fā)明提供了適合于人體腫瘤干細(xì)胞富集和培養(yǎng)的無血清細(xì)胞培養(yǎng)液。所述的培養(yǎng)液是以DMEM/F12為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，并添加了轉(zhuǎn)鐵蛋白，胰島素和其他物質(zhì)。本發(fā)明的無血清富集培養(yǎng)液可從惡性腫瘤細(xì)胞株和腫瘤組織中高效地富集腫瘤干細(xì)胞。本發(fā)明的無血清培養(yǎng)液能使腫瘤干細(xì)胞穩(wěn)定生長，并維持其良好的細(xì)胞活性和生理特性，非常適合應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞及腫瘤干細(xì)胞的相關(guān)研究領(lǐng)域。
文檔編號C12N5/095GKCN101984051 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 201010552225
公開日2012年8月29日 申請日期2010年11月19日
發(fā)明者張海霞, 張雁 申請人:中山大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (3), 非專利引用 (1),