專利名稱:一種煙草煙堿轉(zhuǎn)化株苗期的分子生物學(xué)鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種煙草煙堿轉(zhuǎn)化株的鑒定方法，特別是涉及一種煙草煙堿轉(zhuǎn)化株苗期的分子生物學(xué)鑒定方法。
背景技術(shù)：
目前研究結(jié)果表明，煙草中的生物堿主要有四種煙堿、降煙堿、新煙草堿和假木賊堿四種。普通煙草屬煙堿積累型，以煙堿為主，其含量占總生物堿的90%以上，降煙堿是第二大生物堿，含量一般只占總生物堿的3-5%，另外兩種生物堿僅占很少部分。煙堿含量的高低是決定煙葉感官品質(zhì)的重要因素，一般要求煙堿含量適宜，以達(dá)到生理強(qiáng)度適中、吃味醇和、刺激性小的目的。降煙堿亦稱去甲基煙堿，主要由煙堿在去甲基酶的作用下脫甲基形成。由于降煙堿易于在煙葉調(diào)制和陳化過程中發(fā)生一系列亞硝化和?；壬磻?yīng)，形成具有致癌作用的煙草特有亞硝胺(TSNAs)的主要成分N-亞硝基降煙堿(NNN)及麥斯明、 甲酰降煙堿、乙酰降煙堿等?；a(chǎn)物，導(dǎo)致煙葉有害成分增加和香味品質(zhì)下降，直接影響著吸煙者的身體健康。因此，煙葉減害、降低煙草特有的亞硝胺含量成為目前國(guó)際煙草界的共識(shí)和主攻方向，一直是研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。
我國(guó)對(duì)煙堿轉(zhuǎn)化的研究起于世紀(jì)90年代末期，研究結(jié)果表明，中國(guó)白肋煙、馬里蘭煙和香料煙均不同程度的存在煙堿轉(zhuǎn)化株比例、降煙堿含量和煙堿轉(zhuǎn)化率過高的問題。 目前，美國(guó)已將降煙堿含量作為考核新品種的主要指標(biāo)，制定了降煙堿(區(qū)域試驗(yàn)和小區(qū)試驗(yàn))不超過被測(cè)樣品總生物堿13%的最高限額，超限品種不得種植(王曉云，鄧云龍，李紅鶯.國(guó)外烤煙育種概況.云南農(nóng)業(yè)科技，1999，4 :16-19)。
群體中的轉(zhuǎn)化株必須在煙葉生長(zhǎng)的早期甚至苗期階段被鑒定和清除，以保證品種群體材料非轉(zhuǎn)化株的高度純合性，由于在外觀形態(tài)上無(wú)法區(qū)分非轉(zhuǎn)化株和轉(zhuǎn)化株，因此，需要通過化學(xué)或者生物技術(shù)手段來加以鑒定區(qū)分。中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院申請(qǐng)的專利號(hào)“ZL2007100M0^8”，公開號(hào)“CN 101070535A”的發(fā)明專利一種誘導(dǎo)煙草煙堿提前轉(zhuǎn)化方法及其應(yīng)用，是在團(tuán)棵期取8-12葉位(自下而上)的煙葉1片，噴施誘導(dǎo)煙堿轉(zhuǎn)化性狀在綠葉中早期表達(dá)的藥品3，5-二硝基水楊酸，濃度為0. 1%，然后進(jìn)行調(diào)制處理后測(cè)定煙堿和降煙堿含量，以此判斷煙株的煙堿轉(zhuǎn)化高低屬性，再進(jìn)行田間轉(zhuǎn)化株剔除。本方法雖然有效，但存在以下不足1、取樣時(shí)期在移栽后的團(tuán)棵期，仍然偏遲，剔除轉(zhuǎn)化株后浪費(fèi)了田地，且難以保證目標(biāo)群體大小；2、需化學(xué)藥品誘導(dǎo)方可；3、鑒定結(jié)果受環(huán)境因素影響比如藥品濃度、調(diào)制溫度和時(shí)間、化學(xué)檢測(cè)的影響因子等。因此，雖有較好的借鑒作用，但仍不夠高效與及時(shí)，無(wú)法滿足現(xiàn)實(shí)的需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足提供一種苗期鑒定和純化非轉(zhuǎn)化品種群體的方法，具體是一種煙草煙堿轉(zhuǎn)化株苗期的分子生物學(xué)鑒定方法，將鑒定時(shí)期從團(tuán)棵期提前至苗期，而且鑒定手段簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確性高，試驗(yàn)效果只決定于其內(nèi)在的遺傳物質(zhì)而不受外部環(huán)境條件的影響，這為提高煙葉安全性和改善煙葉品質(zhì)，為低危害煙葉開發(fā)奠定了堅(jiān)實(shí)的理論與技術(shù)基礎(chǔ)。
所述一種煙草煙堿轉(zhuǎn)化株苗期的分子生物學(xué)鑒定方法，其特征在于具體步驟依次如下
A、對(duì)需鑒定的煙苗逐個(gè)掛牌以標(biāo)識(shí)，然后于苗期對(duì)每個(gè)被標(biāo)識(shí)的煙苗進(jìn)行鮮葉取樣，每個(gè)煙苗取樣量為1-2個(gè)葉片，取好的鮮葉樣品用密封袋裝好，并做好與原煙苗一致的標(biāo)識(shí)，迅速放入冰盒或超低溫冰箱中保存；
B、提取基因組DNA 取出每個(gè)密封袋中的鮮葉樣品，采用CTAB法提取各樣品煙苗基因組DNA，純化后保存?zhèn)溆茫?br>C、對(duì)基因組DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)用紫外分光光度計(jì)測(cè)定B步驟中提取的煙苗基因組DNA的濃度，然后取各樣品煙苗基因組DNA溶液少許，將其濃度稀釋成50ng/ μ L作為反應(yīng)模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)中的特異引物序列
正向引物5，-ATGGTTTTTCCCATAGAAGCC-3，，
反向引物5，-TCGAGGTCGACGGTATC-3，；
D、PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳及電泳結(jié)果的讀取將步驟C中所獲得的PCR產(chǎn)物與溴酚藍(lán)-甘油溶液以4 1的體積比混合，注入樣品槽，同時(shí)注入對(duì)照l(shuí)adder進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后取出凝膠，清除表面的溴化乙錠溶液，然后將膠板放入凝膠成像儀的觀察板上，利用電腦成像系統(tǒng)在波長(zhǎng)254nm紫外燈下進(jìn)行觀察，拍照記錄下電泳圖譜，并保存以進(jìn)行比較分析；
E、轉(zhuǎn)化株的鑒定與淘汰將通過PCR特異引物擴(kuò)增已知高轉(zhuǎn)化株所獲得的分子帶譜數(shù)值作為比較分析的參照數(shù)據(jù)，其具體數(shù)值的大小介于1700-1800bp之間；將步驟D中樣品PCR擴(kuò)增所得的分子帶譜與兩邊對(duì)照l(shuí)adder帶譜進(jìn)行對(duì)比，其中能擴(kuò)增出分子帶譜且?guī)ёV數(shù)值大小介于1700-1800bp之間的樣品為高轉(zhuǎn)化株，有分子帶譜但大小小于1700bp的樣品為中等轉(zhuǎn)化株，淘汰高轉(zhuǎn)化株和中等轉(zhuǎn)化株；無(wú)法擴(kuò)增出分子帶譜或者帶譜信號(hào)微弱的樣品為非轉(zhuǎn)化株煙苗，保留備用。
在步驟A摘取的鮮葉樣品，需要馬上提取DNA就迅速用冰盒保存，若不立即提取 DNA則應(yīng)置于超低溫冰箱長(zhǎng)期保存待用。
在步驟C中PCR反應(yīng)在PTC-225型熱循環(huán)儀上進(jìn)行，其反應(yīng)體系為2. 5 μ L帶 (NH4)2SO4 的 IOX 反應(yīng)緩沖液，MgCl22. Ommol/L，dNTPs 200 μ mol/L，1. 2U Tag 酶，50ng 模板 DNA，正向和反向引物各0.45μπιΟ1/1，不足部分用dd H2O補(bǔ)足，總體積為25 μ L ；反應(yīng)程序?yàn)榈谝浑A段在94°C環(huán)境下反應(yīng)％iin，第二階段在94°C的環(huán)境下反應(yīng)30sec，第三階段先在 55°C環(huán)境下反應(yīng)35sec，然后在72°C的環(huán)境下反應(yīng)90sec，第二和第三階段共循環(huán)觀次；第四階段在72°C環(huán)境下反應(yīng)％iin，并在4°C的環(huán)境下保存。
PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳過程中，在樣品進(jìn)膠前可用6.5V/cm的電壓，防止樣品擴(kuò)散，樣品進(jìn)膠后，應(yīng)控制電壓不高于5V/cm。
本發(fā)明所涉及的一種煙草煙堿轉(zhuǎn)化株苗期的分子生物學(xué)鑒定方法，具有精準(zhǔn)高效、操作簡(jiǎn)便、易于推廣，可用于苗期鑒定和剔除煙草煙堿轉(zhuǎn)化株、保留非煙堿轉(zhuǎn)化株、極大提高目標(biāo)品種群體尤其是親本群體的非轉(zhuǎn)化株比例、煙草親本種子提純，種子煙堿轉(zhuǎn)化性狀鑒定，可降低平均煙堿轉(zhuǎn)化率，提高煙葉質(zhì)量，為早期鑒定和篩選低有害物質(zhì)特有亞硝胺CN 102230011 A
說明書
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(TSNAs)煙株開辟了一條新的高效途徑。本發(fā)明適用范圍于白肋煙、馬里蘭煙、香料煙、烤煙和其它地方晾曬煙的常規(guī)種和雄性不育雜交種的品種選育和原種提純，還適用于減少煙葉中有害成分TSNAs為目標(biāo)的非煙堿轉(zhuǎn)化株的早期鑒定和篩選。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實(shí)施例1、白肋煙煙堿轉(zhuǎn)化株的苗期分子生物學(xué)鑒定，其具體步驟依次如下
A、煙苗標(biāo)識(shí)與鮮葉樣品獲取對(duì)需鑒定的白肋煙煙苗逐個(gè)掛牌以標(biāo)識(shí)，然后于苗期(只要可以取到1個(gè)葉片的生長(zhǎng)時(shí)期均可)對(duì)每個(gè)被標(biāo)識(shí)煙苗進(jìn)行鮮葉取樣，每個(gè)煙苗取樣量為1個(gè)葉片，取好的鮮葉樣用密封袋裝好，并做好與原煙苗一致的標(biāo)識(shí)，迅速放入冰盒中保存；
B、煙苗基因組DNA提取取出每個(gè)封口袋中的鮮葉樣品，采用CTAB法提取各樣品煙苗基因組DNA，具體提取方法依次如下
a、將濃度為2%的CTAB抽提緩沖液65°C水浴預(yù)熱；
b、從其中一個(gè)密封袋中取出1片白肋煙鮮葉樣置于小研缽中，用液氮磨至粉狀， 將磨好的樣品粉末裝入1. 5ml的滅菌離心管中，并迅速加入約650 μ L的2% CTAB抽提緩沖液，輕輕攪動(dòng)混合，其混合液的量為管高的2/3 ；
C、然后將裝有混合液的離心管進(jìn)行65°C水浴，每IOmin輕輕搖動(dòng)一次，30-60min 后取出；
d、冷卻2. 5min后，在離心管中加入氯仿-異戊醇04:1)至滿管，輕微上下振蕩 2. 5min，使兩者混合均勻，放入離心機(jī)中，IOOOOrpm離心IOmin ；與此同時(shí)，將650 μ L的異丙醇裝入一支新的離心管中；
e、當(dāng)混合液在離心機(jī)中IOOOOrpm離心Imin后，使用移液器輕輕地吸取上清夜，轉(zhuǎn)入裝有異丙醇的離心管內(nèi)，將離心管慢慢上下?lián)u動(dòng)40seC，使異丙醇與水層充分混合至能見到DNA絮狀物，再在IOOOOrpm的條件下離心Imin后，立即倒掉液體，保留白色DNA沉淀，將離心管倒立于鋪開的紙巾上；
f Jmin后，直立離心管，加入650 μ L的75%乙醇及90 μ L濃度為5Μ的醋酸鈉，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，用手指彈管尖，使沉淀與管底的DNA塊狀物浮游于液體中，放置40min，使DNA塊狀物的不純物溶解；
g、然后再放入離心機(jī)中，IOOOOrpm離心Imin后，倒掉液體，再加入800 μ L 75 %的乙醇，將DNA放置40min以溶解，放入離心機(jī)，IOOOOrpm離心40sec后，立即倒掉液體，再將離心管倒立于鋪開的紙巾上，數(shù)分鐘后，直立離心管，干燥DNA ；
h、在干燥的DNA中加入50 μ L濃度為0. 5 X TE (含RNase)緩沖液，使DNA溶解，置于37°C恒溫箱約18h，使RNA消解。
C、基因組DNA的PCR反應(yīng)用紫外分光光度計(jì)測(cè)定B步驟中提取的煙苗基因組DNA 的濃度，取各樣品煙苗基因組DNA少許，將其濃度稀釋調(diào)成50ng/ μ L作為反應(yīng)模板進(jìn)行PCR 反應(yīng)，PCR反應(yīng)中的特異引物序列
正向引物5，-ATGGTTTTTCCCATAGAAGCC-3，，反向引物5，-TCGAGGTCGACGGTATC-3，；[0033]PCR反應(yīng)體系為2· 5μ L帶(NH4)2504 的 IOX 反應(yīng)緩沖液，2. Ommol/L MgCl2, dNTPs 200ymol/L, Tag酶1.2U (購(gòu)自MBI公司)，模板DNA 50ng，正向和反向引物各0. 45 μ mol/ L,不足部分用dd H2O補(bǔ)足，總體積為25 μ L0
PCR反應(yīng)程序?yàn)榈谝浑A段在94°C環(huán)境下反應(yīng)％iin，第二階段在94°C的環(huán)境下反應(yīng)30sec，第三階段先在55°C環(huán)境下反應(yīng)35sec，然后在72°C的環(huán)境下反應(yīng)90sec，第二和第三階段共循環(huán)觀次；第四階段在72°C環(huán)境下反應(yīng)-in，并在4°C的環(huán)境下保存。
D、PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳及電泳結(jié)果的讀取，其具體步驟如下
a、瓊脂糖膠液的制備稱取0. 7g瓊脂糖，置于三角燒瓶中，加入100ml pH為8. 3 的Tris-硼酸EDTA緩沖液，加熱配制成為0. 7%瓊脂，加入溴化乙錠(EB) 2 μ L ；
b、凝膠板的制備將熱的處于液體狀態(tài)的瓊脂糖膠液倒入預(yù)先制作好的凝膠模板槽中，插上樣品梳，四周用膠液封口，冷卻待用；
c、上樣用pH為8. 3的Tris-硼酸-EDTA緩沖液先填滿加樣槽，接著再倒入大量緩沖液直至浸沒過凝膠面2mm，將C步驟中獲得的PCR產(chǎn)物與溴酚藍(lán)-甘油溶液以4 1的體積比混合，用加樣槍將PCR產(chǎn)物注入樣品槽中，每個(gè)樣品加入量一般不超過20 μ L，最后在第一個(gè)和最后一個(gè)加樣孔加入對(duì)照l(shuí)adder λ DNA/HindIII ；
d、電泳加樣完畢，將靠近樣品槽一端連接負(fù)極.另一端連接正極，接通電源，開始電泳。在樣品進(jìn)膠前可用6. 5V/cm電壓，防止樣品擴(kuò)散，樣品進(jìn)膠后，應(yīng)控制電壓不高于 5V/cm(電壓值V/電泳板兩極之間距離比)，當(dāng)染料條帶移動(dòng)到距離凝膠前沿約Icm時(shí)，停止電泳；
e.觀察記錄電泳結(jié)果小心地取出凝膠置托盤上，并用水輕輕沖洗膠表面的溴化乙錠溶液，然后再將膠板小心放置入凝膠成像儀的觀察板上，關(guān)上門，利用電腦成像系統(tǒng)在波長(zhǎng)254nm紫外燈下進(jìn)行觀察DNA存在的位置呈現(xiàn)橘紅色熒光，肉眼可觀察到清晰的條帶， 初步觀察后，應(yīng)立即拍照記錄下電泳圖譜，并編號(hào)保存在電腦中以作后續(xù)分析判斷。
E、轉(zhuǎn)化株的鑒定與淘汰將通過PCR特異引物擴(kuò)增已知高轉(zhuǎn)化株所獲得的分子帶譜作為比較分析的參照數(shù)據(jù)，大小數(shù)值介于1700-1800bp之間；將樣品PCR擴(kuò)增所得的分子帶譜與兩邊對(duì)照l(shuí)adder帶譜進(jìn)行對(duì)比，將能擴(kuò)增出分子帶譜且大小介于1700_1800bp之間的樣品確定為高轉(zhuǎn)化株，有分子帶譜但大小小于1700bp的樣品確定為中等轉(zhuǎn)化株，淘汰高和中等轉(zhuǎn)化株；將無(wú)法擴(kuò)增出分子帶譜或者帶譜信號(hào)微弱的樣品確定為非轉(zhuǎn)化株煙苗，保留備用；由此獲得高度純合的非轉(zhuǎn)化株品種群體。
為驗(yàn)證本發(fā)明鑒定的準(zhǔn)確性，隨機(jī)選擇通過以上步驟鑒定為高轉(zhuǎn)化株和非轉(zhuǎn)化株的白肋煙煙苗各20株，于團(tuán)棵期測(cè)定其煙堿和降煙堿含量(參照煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T 383-2010，煙草及煙草制品煙堿、降煙堿、新煙堿、麥斯明和假木賊堿的測(cè)定-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法)，以此計(jì)算其煙堿轉(zhuǎn)化率，一般按煙堿轉(zhuǎn)化率大小對(duì)煙株進(jìn)行分級(jí)(1)非轉(zhuǎn)化株煙堿轉(zhuǎn)化率低于5%的煙株；(2)低轉(zhuǎn)化株煙堿轉(zhuǎn)化率低于5%至20%的煙株；(3) 中轉(zhuǎn)化株煙堿轉(zhuǎn)化率低于20%至50%的煙株；(4)高轉(zhuǎn)化率煙堿轉(zhuǎn)化率大于50% ；結(jié)果顯示，本發(fā)明鑒定的20株高轉(zhuǎn)化株經(jīng)過化學(xué)檢測(cè)確認(rèn)全部為高轉(zhuǎn)化株，平均轉(zhuǎn)化率為 95.5%，而本發(fā)明鑒定的20株非轉(zhuǎn)化株經(jīng)過化學(xué)檢測(cè)確認(rèn)全部為非煙堿轉(zhuǎn)化株，平均轉(zhuǎn)化率為2. 1%，由此可見，本發(fā)明所提供的方法具有高度的準(zhǔn)確性，與實(shí)際情況完全吻合。
實(shí)例2、馬里蘭煙煙堿轉(zhuǎn)化株的苗期分子生物學(xué)鑒定，其具體步驟依次如下[0044]A、煙苗標(biāo)識(shí)與鮮葉樣品獲取對(duì)需鑒定的馬里蘭煙苗逐個(gè)掛牌以標(biāo)識(shí)，然后于苗期(只要可以取到2個(gè)葉片的生長(zhǎng)時(shí)期均可)對(duì)每個(gè)被標(biāo)識(shí)煙苗進(jìn)行鮮葉取樣，每個(gè)煙苗取樣量為2個(gè)葉片，取好的鮮葉樣用密封袋裝好，并做好與原煙苗一致的標(biāo)識(shí)，迅速放入冰盒中保存，回實(shí)驗(yàn)后將鮮葉樣放入超低溫冰箱中保存20天后再取出提取基因組DNA ；
B、煙苗基因組DNA提取取出每個(gè)封口袋中的鮮葉樣品，采用CTAB法提取煙苗基因組DNA，具體提取方法依次如下
a、將濃度為2 %的CTAB抽提緩沖液65°C水浴預(yù)熱；
b、從其中一個(gè)封口袋中取出2片馬里蘭煙鮮葉樣置于小研缽中，用液氮磨至粉狀，用2ml的滅菌離心管收集磨好的樣品粉末，并立即加入約700μ L的2% CTAB抽提緩沖液，輕輕攪動(dòng)混合，混合液的量約為管高的2/3 ；
C、然后將裝有混合液的離心管進(jìn)行65°C水浴，每IOmin輕輕搖動(dòng)一次，30-60min 后取出；
d、冷卻^iin后，在離心管中加入氯仿-異戊醇04:1)至滿管，輕微上下振蕩 3min，使兩者混合均勻，放入離心機(jī)中，IOOOOrpm離心IOmin ；與此同時(shí)，將750 μ L的異丙醇加入另一新的滅菌離心管中；
e、當(dāng)混合液在離心機(jī)中IOOOOrpm離心Imin后，使用移液器輕輕地吸取上清夜，轉(zhuǎn)入裝有異丙醇的離心管內(nèi)，將離心管慢慢上下?lián)u動(dòng)50seC，使異丙醇與水層充分混合至能見到DNA絮狀物，再在IOOOOrpm的條件下離心Imin后，立即倒掉液體，保留白色DNA沉淀，將離心管倒立于鋪開的紙巾上；
f Jmin后，直立離心管，加入700 μ L的75%乙醇及100 μ L濃度為5Μ的醋酸鈉， 輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，用手指彈管尖，使沉淀與管底的DNA塊狀物浮游于液體中，放置50min，使DNA塊狀物的不純物溶解；
g、然后再放入離心機(jī)中，IOOOOrpm離心Imin后，倒掉液體，再加入800 μ L 75 %的乙醇，將DNA放置50min，然后放入離心機(jī)，IOOOOrpm離心50sec后，立即倒掉液體，將離心管倒立于鋪開的紙巾上，數(shù)分鐘后，直立離心管，干燥DNA ；
h、在干燥的DNA中加入50 μ L 0. 5 X TE (含RNase)緩沖液，使DNA溶解，置于37°C 恒溫箱約20h，使RNA消解。
C、基因組DNA的PCR反應(yīng)用紫外分光光度計(jì)測(cè)定B步驟中提取的煙苗基因組DNA 的濃度，取各種樣品煙苗基因組DNA溶液少許，將其濃度稀釋成50ng/ μ L作為反應(yīng)模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)中的特異引物序列
正向引物5，-ATGGTTTTTCCCATAGAAGCC-3，，
反向引物5，-TCGAGGTCGACGGTATC-3，；
PCR反應(yīng)體系為2· 5μ L帶(NH4)2504 的 IOX 反應(yīng)緩沖液，2. Ommol/L MgCl2, dNTPs 200ymol/L, Tag酶1.2U (購(gòu)自MBI公司)，模板DNA 50ng，正向和反向引物各0. 45 μ mol/ L,不足部分用dd H2O補(bǔ)足，總體積為25 μ L0
PCR反應(yīng)程序?yàn)榈谝浑A段在94°C環(huán)境下反應(yīng)％iin，第二階段在94°C的環(huán)境下反應(yīng)30sec，第三階段先在55°C環(huán)境下反應(yīng)35sec，然后在72°C的環(huán)境下反應(yīng)90sec，第二和第三階段共循環(huán)觀次；第四階段在72°C環(huán)境下反應(yīng)-in，并在4°C的環(huán)境下保存。
D、PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳及電泳結(jié)果的讀取，其具體步驟如下[0060]a、瓊脂糖膠液的制備稱取Ig瓊脂糖，置于三角燒瓶中，加入100ml pH為8. 3的 Tris-硼酸EDTA緩沖液，加熱配制成為1 %瓊脂，加入溴化乙錠(EB) 2. 5 μ L ；
b、凝膠板的制備將熱的處于液體狀態(tài)的瓊脂糖膠液倒入預(yù)先制作好的凝膠模板槽中，插上樣品梳，四周用膠液封口，冷卻待用；
c、上樣用pH為8. 3的Tris-硼酸-EDTA緩沖液先填滿加樣槽，接著再倒入大量緩沖液直至浸沒過凝膠面3mm，將C步驟中獲得的PCR產(chǎn)物與溴酚藍(lán)-甘油溶液以4 1的體積比混合，用加樣槍將PCR產(chǎn)物注入樣品槽中，每個(gè)樣品加入量一般不超過20 μ L，最后在第一個(gè)和最后一個(gè)加樣孔加入對(duì)照l(shuí)adder λ DNA/HindIII ；
d、電泳加樣完畢，將靠近樣品槽一端連接負(fù)極.另一端連接正極，接通電源，開始電泳。在樣品進(jìn)膠前可用6.5V/cm電壓.防止樣品擴(kuò)散，樣品進(jìn)膠后，應(yīng)控制電壓5V/ cm(電壓值V/電泳板兩極之間距離比)，當(dāng)染料條帶移動(dòng)到距離凝膠前沿約Icm時(shí)，停止電泳；
e.觀察記錄電泳結(jié)果小心地取出凝膠置托盤上，并用水輕輕沖洗膠表面的溴化乙錠溶液，然后再將膠板小心放置入凝膠成像儀的觀察板上，關(guān)上門，利用電腦成像系統(tǒng)在波長(zhǎng)254nm紫外燈下進(jìn)行觀察DNA存在的位置呈現(xiàn)橘紅色熒光，肉眼可觀察到清晰的條帶， 初步觀察后，應(yīng)立即拍照記錄下電泳圖譜，并編號(hào)保存在電腦中以作后續(xù)分析判斷。
E、轉(zhuǎn)化株的鑒定與淘汰將通過PCR特異引物擴(kuò)增已知高轉(zhuǎn)化株所獲得的分子帶譜大小數(shù)值作為比較分析的參照數(shù)據(jù)，數(shù)值大小介于1700-1800bp之間。將樣品PCR 擴(kuò)增所得的分子帶譜與兩邊對(duì)照l(shuí)adder帶譜進(jìn)行對(duì)比，將能擴(kuò)增出分子帶譜且大小介于 1700-1800bp之間的樣品確定為高轉(zhuǎn)化株，有分子帶譜但大小小于1700bp的樣品確定為中等轉(zhuǎn)化株，淘汰高和中等轉(zhuǎn)化株；將無(wú)法擴(kuò)增出分子帶譜或者帶譜信號(hào)微弱的樣品確定為非轉(zhuǎn)化株煙苗，保留備用。由此獲得了高度純合的非轉(zhuǎn)化株品種群體。
同樣，為驗(yàn)證本發(fā)明所提供技術(shù)的準(zhǔn)確性，采用同實(shí)例1的方法進(jìn)行了結(jié)果驗(yàn)證， 結(jié)果顯示，本發(fā)明鑒定的20株馬里蘭煙高轉(zhuǎn)化株經(jīng)過化學(xué)檢測(cè)確認(rèn)全部為高煙堿轉(zhuǎn)化株， 平均轉(zhuǎn)化率為93. 6%，而本發(fā)明鑒定的20株馬里蘭煙非轉(zhuǎn)化株經(jīng)過化學(xué)檢測(cè)確認(rèn)全部為非煙堿轉(zhuǎn)化株，平均轉(zhuǎn)化率為3. 3%，由此可見，本發(fā)明所提供的方法具有高度的準(zhǔn)確性，與實(shí)際情況完全吻合。
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權(quán)利要求
1.一種煙草煙堿轉(zhuǎn)化株苗期的分子生物學(xué)鑒定方法，其特征在于具體步驟依次如下A、對(duì)需鑒定的煙苗逐個(gè)掛牌以標(biāo)識(shí)，然后于苗期對(duì)每個(gè)被標(biāo)識(shí)的煙苗進(jìn)行鮮葉取樣， 每個(gè)煙苗取樣量為1-2個(gè)葉片，取好的鮮葉樣品用密封袋裝好，并做好與原煙苗一致的標(biāo)識(shí)，迅速放入冰盒或超低溫冰箱中保存；B、提取基因組DNA取出每個(gè)密封袋中的鮮葉樣品，采用CTAB法提取各樣品煙苗基因組DNA，純化后保存?zhèn)溆?；C、對(duì)基因組DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)用紫外分光光度計(jì)測(cè)定B步驟中提取的煙苗基因組DNA 的濃度，然后取各樣品煙苗基因組DNA溶液，將其濃度稀釋成50ng/ μ L作為反應(yīng)模板進(jìn)行 PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)中的特異引物序列正向引物5’ -ATGGTTTTTCCCATAGAAGCC-3，，反向引物5，-TCGAGGTCGACGGTATC-3，；D、PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳及電泳結(jié)果的讀取將步驟C中所獲得的PCR產(chǎn)物與溴酚藍(lán)-甘油溶液以4 1的體積比混合，注入樣品槽，同時(shí)注入對(duì)照l(shuí)adder進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后取出凝膠，清除表面的溴化乙錠溶液，然后將膠板放入凝膠成像儀的觀察板上，利用電腦成像系統(tǒng)在波長(zhǎng)254nm紫外燈下進(jìn)行觀察，拍照記錄下電泳圖譜，并保存以進(jìn)行比較分析；E、轉(zhuǎn)化株的鑒定與淘汰將通過PCR特異引物擴(kuò)增已知高轉(zhuǎn)化株所獲得的分子帶譜數(shù)值作為比較分析的參照數(shù)據(jù)，其具體數(shù)值的大小介于1700-1800bp之間；將步驟D中樣品 PCR擴(kuò)增所得的分子帶譜與兩邊對(duì)照l(shuí)adder帶譜進(jìn)行對(duì)比，其中能擴(kuò)增出分子帶譜且?guī)ёV數(shù)值大小介于1700-1800bp之間的樣品為高轉(zhuǎn)化株，有分子帶譜但大小小于1700bp的樣品為中等轉(zhuǎn)化株，淘汰高轉(zhuǎn)化株和中等轉(zhuǎn)化株；無(wú)法擴(kuò)增出分子帶譜或者帶譜信號(hào)微弱的樣品為非轉(zhuǎn)化株煙苗，保留備用。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種煙草煙堿轉(zhuǎn)化株苗期的分子生物學(xué)鑒定方法，其特征在于在步驟A摘取的鮮葉樣品，需要馬上提取DNA就迅速用冰盒保存，若不立即提取DNA則應(yīng)置于超低溫冰箱長(zhǎng)期保存待用。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種煙草煙堿轉(zhuǎn)化株苗期的分子生物學(xué)鑒定方法，其特征在于在步驟C中PCR反應(yīng)在PTC-225型熱循環(huán)儀上進(jìn)行，其反應(yīng)體系為2.5yL帶(NH4)2SO4 的 IOX 反應(yīng)緩沖液，MgCl22. Ommol/L，dNTPs 200 μ mol/L，1. 2U Tag 酶，50ng 模板 DNA，正向和反向引物各0.45 4!1101/1，不足部分用(1(1 H2O補(bǔ)足，總體積為25 μ L ；反應(yīng)程序?yàn)榈谝浑A段在94°C環(huán)境下反應(yīng)％iin，第二階段在94°C的環(huán)境下反應(yīng)30sec，第三階段先在55°C環(huán)境下反應(yīng)35sec，然后在72°C的環(huán)境下反應(yīng)90seC，第二和第三階段共循環(huán)觀次；第四階段在72°C環(huán)境下反應(yīng)％iin，并在4°C的環(huán)境下保存。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種煙草煙堿轉(zhuǎn)化株苗期的分子生物學(xué)鑒定方法，其特征在于PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳過程中，在樣品進(jìn)膠前可用6. 5V/cm的電壓，防止樣品擴(kuò)散， 樣品進(jìn)膠后，應(yīng)控制電壓不高于5V/cm。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種煙草煙堿轉(zhuǎn)化株苗期的分子生物學(xué)鑒定方法。該方法主要步驟是取苗期鮮葉樣采用CTAB法提取基因組DNA，以基因組DNA作為擴(kuò)增模板結(jié)合特異引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，然后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并在凝膠成像系統(tǒng)中觀察、讀取分子標(biāo)記帶譜，再與目標(biāo)帶譜進(jìn)行對(duì)比來判定樣品的轉(zhuǎn)化特性。本發(fā)明所述的方法不受環(huán)境因素影響，也無(wú)需人工化學(xué)誘導(dǎo)煙堿轉(zhuǎn)化，苗期即可取樣操作，將轉(zhuǎn)化株的鑒定與篩選提前到煙苗移栽前，大大節(jié)省了時(shí)間，而且精準(zhǔn)高效、操作簡(jiǎn)便、易于推廣，可用于煙草親本種子提純，種子煙堿轉(zhuǎn)化性狀鑒定，也可適應(yīng)于其他煙草類型煙堿轉(zhuǎn)化株的鑒定與剔除。
文檔編號(hào)C12Q1/68GKCN102230011SQ201110161870
公開日2011年11月2日 申請(qǐng)日期2011年6月16日
發(fā)明者朱天, 李宗平, 李進(jìn)平, 楊春雷, 楊樹, 林國(guó)平, 羅曉敏, 蔡長(zhǎng)春 申請(qǐng)人:湖北省煙草科研所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan