專利名稱:一種耐有機(jī)溶劑堿性蛋白酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于蛋白酶基因工程技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種耐有機(jī)溶劑蛋白酶，具體涉及其突變基因及其編碼的蛋白質(zhì)。
技術(shù)背景
蛋白酶是指能催化肽鍵水解的一類酶，自1914年被試驗(yàn)用于洗滌劑的添加成分以來，由于具有重要的商業(yè)用途而被廣泛關(guān)注。當(dāng)今蛋白酶的產(chǎn)量占據(jù)酶市場(chǎng)的40%以上，廣泛應(yīng)用與洗滌劑、食品、制藥、制革、診斷試劑、污水處理等領(lǐng)域。蛋白酶廣泛存在于動(dòng)物、植物、真菌及原核生物等所有生物中，其中微生物來源的蛋白酶占據(jù)目前蛋白酶生產(chǎn)總量的2/3以上。微生物來源的蛋白酶又可根據(jù)酶的反應(yīng)pH、活性基團(tuán)的特征等分為金屬蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和絲氨酸蛋白酶等。蛋白酶催化的最普遍的反應(yīng)是水解蛋白質(zhì)中的肽鍵。通常情況下，蛋白酶催化水解肽鍵的反應(yīng)是在特定的PH的緩沖液中進(jìn)行的，而且蛋白酶對(duì)其所催化肽鍵的氨基酸殘基具有特異性要求，即有著高度的區(qū)域選擇性和立體選擇性。隨著酶工程和溶劑工程技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)蛋白酶在有機(jī)溶劑中能夠在有機(jī)溶劑中能催化一些水溶液中不能進(jìn)行的反應(yīng)。如，1984年，Klibanov等人發(fā)現(xiàn)蛋白酶在一些有機(jī)溶劑中保存較長(zhǎng)時(shí)間仍然具有活性，而且可以催化合成肽鍵的反應(yīng)。大量研究表明，有機(jī)溶劑中進(jìn)行酶促反應(yīng)有著許多的優(yōu)點(diǎn)1、增大各種有機(jī)底物在溶劑中，特別是在親水性有機(jī)溶劑中的溶解度，提高反應(yīng)效率；2、具有高度的立體選擇性和區(qū)域選擇性，有機(jī)介質(zhì)可改變選擇性；3、控制反應(yīng)平衡向所需方向移動(dòng)，如水解酶在有機(jī)介質(zhì)中能催化脫水縮合反應(yīng)；4、有效防止微生物污染，產(chǎn)物易于分離純化等。這一發(fā)現(xiàn)促進(jìn)了非水酶學(xué)的興起。如本研究室利用自行篩選到的耐有機(jī)溶劑蛋白酶在親水性有機(jī)溶劑二甲基亞砜(DMSO)中實(shí)現(xiàn)了甜味劑Aspartame的前體和內(nèi)嗎啡呔I的合成，產(chǎn)率達(dá)到90%以上，而且在實(shí)現(xiàn)了底物與產(chǎn)物的反應(yīng)分離耦合，大大提高了產(chǎn)率，簡(jiǎn)化了產(chǎn)物的分離純化。說明在親水性有機(jī)溶劑體系中進(jìn)行酶催化反應(yīng)的市場(chǎng)前景是非常巨大的。
有機(jī)溶劑體系中酶催化的誘人前景與酶易失活的矛盾推動(dòng)了酶的改造與非水酶學(xué)的發(fā)展。過去20多年，研究者致力于提高酶在有機(jī)溶劑中的穩(wěn)定性，常用方法1、使用疏水性有機(jī)溶劑作為反應(yīng)介質(zhì)并控制介質(zhì)中的含水量，以保證酶的“必需水” ;2、在反應(yīng)介質(zhì)中加入保護(hù)劑甘油、乙二醇、多元醇聚合物等，或加入環(huán)糊精等冷凍干燥保護(hù)劑，以提高酶分子在有機(jī)介質(zhì)中的穩(wěn)定性。3、利用固定化、包埋法、大分子修飾等理化修飾方法提高酶在有機(jī)介質(zhì)中的活性和穩(wěn)定性；4、利用基因改造提高酶的有機(jī)溶劑穩(wěn)定性。例如，Arnold小組利用易錯(cuò)PCR定向改造枯草桿菌蛋白酶(Subtilisin),提聞其在有機(jī)相中的活力，對(duì)編碼該蛋白酶成熟肽的DNA片段進(jìn)行突變，并篩選得到在高濃度二甲基甲酰胺(DMF)中酶活性明顯提高的突變株，其中突變體PC3在60%和85%的DMF中的酶活力分別是天然酶的256和131倍。此后再在PC3的基礎(chǔ)上進(jìn)行突變，得到的突變體13M酶活力比PC3還要高3倍。[0005]雖然近年來在利用基因改造提高酶的有機(jī)溶劑穩(wěn)定性方面取得了一定的進(jìn)展，但往往出發(fā)酶的有機(jī)溶劑耐受性相對(duì)較低，有機(jī)溶劑耐性，特別是在親水性的有機(jī)溶劑中提高的幅度不大，對(duì)工業(yè)應(yīng)用還有一定的差距。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)目的在于提供一種高耐有機(jī)溶劑堿性蛋白酶的突變基因，使得本發(fā)明所述的這種蛋白酶相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)的同類蛋白酶而言，其有機(jī)溶劑，特別是親水性有機(jī)溶劑的耐受性進(jìn)一步大大提高。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)目的，本發(fā)明的技術(shù)方案在于
一、一種耐有機(jī)溶劑堿性蛋白酶，其特征在于其具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，其氨基酸序列示于SEQ ID NO :2 ;或者其具有SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列，其氨基酸序列示于 SEQ ID NO 4o本發(fā)明所述的耐有機(jī)溶劑堿性蛋白酶基因的出發(fā)原始蛋白酶基因來自于中國(guó)專利申請(qǐng)(專利申請(qǐng)公開號(hào)CN101215534A)所述的耐有機(jī)溶劑堿性蛋白酶基因，其核苷酸序列如本發(fā)明序列表SEQ ID NO 5所示。從序列表的SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :3可見，本發(fā)明所述耐有機(jī)溶劑堿性蛋白酶在原核苷酸序列的第385或第436發(fā)生了定點(diǎn)突變，即其成熟肽段的第24位突變氨基酸為谷氨酸或者谷氨酰胺；第41位氨基酸為丙氨酸或者賴氨酸。突變后的四種編碼后的蛋白質(zhì)的有機(jī)溶劑，特別是親水性有機(jī)溶劑的耐受性明顯大大加強(qiáng)。
二、本發(fā)明所述耐有機(jī)溶劑堿性蛋白酶基因的克隆及制備方法，包括如下步驟。
(I)選用專利申請(qǐng)公開號(hào) CN101215534A 中所述licheniformi YPlA(CCTCC NO: M207021)耐有機(jī)溶劑堿性蛋白酶編碼基因的克隆方法克隆編碼耐有機(jī)溶劑堿性蛋白酶基因，同時(shí)根據(jù)subti I is 168中p43啟動(dòng)子的基因序列(GenBank號(hào)K02714)設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增ρ43啟動(dòng)子，用重疊PCR的方法把啟動(dòng)子ρ43和上述耐有機(jī)溶劑堿性蛋白酶基因連接，最后與表達(dá)載體ΡΗΥ300 (由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)李順鵬教授惠贈(zèng))連接，轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌宿主WB800 (由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)李順鵬教授惠贈(zèng))，構(gòu)建好重組菌WB800-pHY300-p43-YP IA 進(jìn)行表達(dá)。
(2)選用構(gòu)建好的基因工程菌WB800-pHY300-p43-YPlA于37°C搖床培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒作為定向進(jìn)化的模板。
(3)根據(jù)易錯(cuò)滾環(huán)復(fù)制的原理，設(shè)計(jì)3’末端硫代修飾的六聚體引物5’ -NpNpNpNpsNpsN-3’。
(4)以獲得的質(zhì)粒DNA為模板，用Φ 29 DNA聚合酶(Fermentas #EP0097)進(jìn)行易錯(cuò)滾環(huán)復(fù)制擴(kuò)增，程序如下95°C變性3min ;迅速置冰上冷卻至室溫；30°C反應(yīng)24 h。
(5)反應(yīng)產(chǎn)物用Dpn I酶(Fermentas #ER1701)消化I h，進(jìn)行膠回收濃縮。
(6)膠回收產(chǎn)物轉(zhuǎn)化枯草桿菌WB800，涂布牛奶平板進(jìn)行初篩。
(7)選擇有透明圈的突變株進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)7天，離心取上清液即為粗酶液，進(jìn)行有機(jī)溶劑耐受性復(fù)篩，發(fā)現(xiàn)命名為K8和P8的突變株在50% (v/v)的DMF中的酶活力分別是原始酶的2. 29和I. 88倍；而命名為Z8和Z25的突變株在50% (v/v)的DMF中的酶活力分別是原始酶的I. 76和I. 8倍，如表二。[0017](8)對(duì)步驟(7)所述的突變株的主要性質(zhì)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)四種突變體最適反應(yīng)PH值，pH值穩(wěn)定性都沒有發(fā)生明顯變化；三種突變體P8、Z8、Z25的最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性也沒顯著改變；而1(8的最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性都有所提高了 ；突變株在各種有機(jī)溶劑中的穩(wěn)定性都有顯著的提高。核苷酸及氨基酸分析發(fā)現(xiàn)，突變基因與YPlA基因相比，分別從起始密碼子后385 bp (K8/P8)和436 bp (Z8/Z25)處發(fā)生了突變，在第385位分別從GCG突變?yōu)镃AG和GAG ;氨基酸分別從Ala突變?yōu)镚ln和Glu ;從GAC突變?yōu)镚CA和AAG ；氨基酸從Asp突變?yōu)锳la和Lys。
三、本發(fā)明所述耐有機(jī)溶劑堿性蛋白酶在有機(jī)溶劑中催化合成小肽中的應(yīng)用。
本發(fā)明的有益效果在于
(I)本發(fā)明從天然耐有機(jī)溶劑堿性蛋白酶出發(fā)，通過定向進(jìn)化的手段對(duì)其基因改造，獲得了四個(gè)各種有機(jī)溶劑，特別是親水性有機(jī)溶劑耐受性更強(qiáng)的突變基因，突變株在50% (v/V)親水性有機(jī)溶劑中的酶活比原始酶活高I. 5倍以上，在丙酮和乙腈溶劑中的酶活是原始酶活的30倍以上。目前未見有相關(guān)報(bào)道。
(2)本發(fā)明的YPlA基因的開放閱讀框含有1140bp，編碼379個(gè)氨基酸。核苷酸及氨基酸分析發(fā)現(xiàn)，突變基因與YPlA基因相比，分別從起始密碼子后385 bp (K8/P8)和436bp (Z8/Z25)處發(fā)生了突變；從序列表的SEQ ID NO 1或SEQ ID NO :3可見，本發(fā)明所述耐有機(jī)溶劑堿性蛋白酶在原核苷酸序列的第385或第436發(fā)生了定點(diǎn)突變，即其成熟肽段的第24位突變氨基酸為谷氨酸或者谷氨酰胺；第41位氨基酸為丙氨酸或者賴氨酸。突變后的四種編碼后的蛋白質(zhì)的有機(jī)溶劑，特別是親水性有機(jī)溶劑耐受性明顯大大加強(qiáng)。
(3)本發(fā)明所述的耐有機(jī)溶劑堿性蛋白酶能應(yīng)用于在有機(jī)溶劑中催化合成小肽中，其超高的有機(jī)溶劑，特別是親水性有機(jī)溶劑耐受性相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)的耐有機(jī)溶劑蛋白酶而言更加適用于小肽的合成領(lǐng)域。


圖I顯示易錯(cuò)滾環(huán)復(fù)制電泳圖和突變株做牛奶平板上的初步篩選。
圖2顯示突變株最適反應(yīng)pH值。
圖3顯示突變株pH值穩(wěn)定性。
圖4顯示突變株最適反應(yīng)溫度。
圖5顯示突變株溫度穩(wěn)定性。
圖6和7顯示突變株在DMF/DMS0中的穩(wěn)定性。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述。
實(shí)施例I
本實(shí)施例說明本發(fā)明所述耐有機(jī)溶劑堿性蛋白酶基因的定向進(jìn)化。
選用專利申請(qǐng)公開號(hào)CN101215534A 中所述licheniformi YPI AC CCTCCNO: M207021)耐有機(jī)溶劑堿性蛋白酶編碼基因的克隆方法克隆編碼耐有機(jī)溶劑堿性蛋白酶基因，同時(shí)根據(jù)Bacillus subtilis 168中p43啟動(dòng)子的基因序列(GenBank號(hào)K02714)設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增P43啟動(dòng)子，用重疊PCR的方法把啟動(dòng)子p43和耐有機(jī)溶劑堿性蛋白酶基因連接，最后與表達(dá)載體PHY300 (由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)李順鵬教授惠贈(zèng))連接，轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌宿主WB800 (由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)李順鵬教授惠贈(zèng))，構(gòu)建好重組菌WB800-pHY300-p43-YPlA進(jìn)行表達(dá)，具體實(shí)施方法如下
(O設(shè)計(jì)擴(kuò)增YPlA基因和啟動(dòng)子p43引物。
YPlA 引物
YPlAF:5-GAGAGGAATGTACACATGATGAGGAAAAAG-3 ；
YPIAR:5-CGGATCCTTATTGAGCGGCAGCTTC-3。
啟動(dòng)子引物
p43F:5-GCAGATCTTGATAGGTGGTATGTTTTCGCT-3 ；
p43R:5-CTCTTTTTCCTCATCATGTGTACATTCCTC-3。
(2)分別按以下程序擴(kuò)增YPlA基因和啟動(dòng)子p43。
①YPlA 基因的擴(kuò)增94°C 預(yù)變性 5min ;94°C 變性 30 sec ;55°C 退火 30 sec ；72°C 延伸I min ;30循環(huán)后，72°C保溫10 min，根據(jù)該反應(yīng)條件，擴(kuò)增到了約I. I kb的PCR片段。
②啟動(dòng)子p43的擴(kuò)增94°C預(yù)變性5 min ;94°C變性30 sec;50°C退火30 sec ；72 °C
延伸30 sec ;30循環(huán)后，72°C保溫10 min，根據(jù)該反應(yīng)條件，擴(kuò)增到了約300 bp的PCR片段。
③ΥΡ1Α-ρ43擴(kuò)增通過重疊PCR的方法連接YPlA基因與啟動(dòng)子p43，94°C預(yù)變性5 min ;94°C變性30 sec ;65°C退火30 sec (退火溫度設(shè)計(jì)梯度下降1°C);72°C延伸2 min ；19循環(huán)后；94°C變性30 sec;45°C退火30 sec ;72°C延伸2 min ;16循環(huán)后，72°C保溫10min。
④將重疊PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化后用限制性內(nèi)切酶Bgl II (大連寶生物公司)與BamH I(大連寶生物公司)進(jìn)行酶切，同時(shí)用同樣的酶對(duì)載體PHY300進(jìn)行酶切，純化酶切產(chǎn)物用T4(大連寶生物公司)連接酶在16°C下連接過夜，轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌WB800進(jìn)行表達(dá)。
選用構(gòu)建好的基因工程菌WB800-pHY300-p43_YPIA于37 °C搖床培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒作為突變模板；根據(jù)易錯(cuò)滾環(huán)復(fù)制的原理，設(shè)計(jì)3’末端硫代修飾的六聚體引物5’ -NpNpNpNpsNpsN-3’ ；按照以下程序進(jìn)行突變
(1)50 μ L反應(yīng)體系Tris-HCl (pH7. 5)終濃度50 mM ;硫酸銨終濃度10mM，MgCl2終濃度10 mM, DTT終濃度4 mM, BSA終濃度200 ng/ μ L, dNTPO. 2 mM，引物六聚體4 μ M，質(zhì)粒 DNA40 pM, MnCl2 O. 8 mM, Φ 29 DNA 聚合酶 5U。
(2)反應(yīng)程序把上述反應(yīng)組分除聚合酶和MnClJh，加到500 μ L反應(yīng)管中混勻，于95°C下變性3 min ;把反應(yīng)管迅速置于冰上冷卻至室溫；加入聚合酶和MnCl2 ;于30°C反應(yīng) 24 h0
(3)反應(yīng)產(chǎn)物按照一定的體系加入Dpn I酶消化I h，進(jìn)行膠回收。
(4)回收產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化到枯草桿菌WB800表達(dá)系統(tǒng)，于牛奶平板上選擇有透明圈突變株進(jìn)一步篩選(如圖I)。
(5)選擇有透明圈的突變株進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)7天，離心取上清液即為粗酶液，按照下列程序進(jìn)行有機(jī)溶劑耐受性篩選。[0043]把突變株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天，離心回收上清液即為突變株的粗酶液，在冰浴上取45% (V/V)體積的粗酶液，加入55% (V/V)體積親水性有機(jī)溶劑(DMF)于3mL密封小瓶子中，于37°C，200印!11振蕩1.5 h后測(cè)量殘留蛋白酶活力。對(duì)照組為加入55%體積(V/V)緩沖液。進(jìn)行有機(jī)溶劑耐受性篩選，選擇耐受性變化明顯的突變株提取質(zhì)粒測(cè)序，確定突變位點(diǎn)。發(fā)現(xiàn)突變株K8和P8在55%的DMF中的耐受性分別提高了 55%和30% ；而Z8和Z25分別提高了 29%和51%，如表一
表一突變篩選結(jié)果
權(quán)利要求
1. 一種耐有機(jī)溶劑堿性蛋白酶，其特征在于其具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，其氨基酸序列示于SEQ ID NO :2 ;或者其具有SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列，其氨基酸序列示于 SEQ ID NO :4。
專利摘要
本發(fā)明屬于蛋白酶基因工程技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種耐有機(jī)溶劑蛋白酶，具體涉及其突變基因及其編碼的蛋白質(zhì)。從序列表的SEQ ID NO1或SEQ ID NO3可見，本發(fā)明所述耐有機(jī)溶劑堿性蛋白酶在原核苷酸序列的第385或第436發(fā)生了定點(diǎn)突變，即其成熟肽段的第24位突變氨基酸為谷氨酸或者谷氨酰胺；第41位氨基酸為丙氨酸或者賴氨酸。突變后的四種編碼后的蛋白質(zhì)的有機(jī)溶劑，特別是親水性有機(jī)溶劑的耐受性明顯大大加強(qiáng)。
文檔編號(hào)C12N15/57GKCN102703482SQ201110217989
公開日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2011年8月1日
發(fā)明者何冰芳, 吳斌, 蘇龍 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan