專利名稱:鏈格孢α-L-鼠李糖苷酶基因及其應(yīng)用的制作方法
鏈格孢α-L-鼠李糖苷酶基因及其應(yīng)用
發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種α -L-鼠李糖苷酶基因，尤其涉及一種來源于鏈格孢的α _L_鼠李糖苷酶基因及其應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域：
。
技術(shù)背景
α -L-鼠李糖苷酶(α -L-rhamnosidase，EC 3. 2. 1. 40)廣泛存在于動物、植物和微生物中，能夠水解多糖和其他糖苷中的α-L-鼠李糖苷鍵，在食品、醫(yī)藥及化工領(lǐng)域有重要的應(yīng)用價值。α -L-鼠李糖苷酶能夠水解柑橘類果汁中主要的苦味物質(zhì)柚苷，大大降低苦味，改進果汁口感；還能夠水解葡萄酒中大量的鍵合態(tài)芳香物質(zhì)，釋放出糖苷配基，產(chǎn)生游離的芳香物質(zhì)，使葡萄酒增香并提高風(fēng)味。此外，α-L-鼠李糖苷酶在化合物的結(jié)構(gòu)鑒定、 改進抗癌藥物的活性方面也有廣泛應(yīng)用。
公開號為CN101914451A(申請?zhí)枮?01010220786. X)的中國專利，公開了一種產(chǎn)生α-L-鼠李糖苷酶的鏈格孢Ll (Alternaria sp. Li)菌株、特征、培養(yǎng)方法及其應(yīng)用于水解柚苷的方法。該菌株已于2010年3月25日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 3688。鏈格孢(Alternaria sp.)Ll菌株培養(yǎng)簡單，遺傳性質(zhì)穩(wěn)定，水解效率高，酶活穩(wěn)定，具有很強的工業(yè)化生產(chǎn)優(yōu)勢和廣闊的應(yīng)用前景，可應(yīng)用于食品工業(yè)中柑橘類果汁的酶法脫苦等領(lǐng)域。
目前，α -L-鼠李糖苷酶相關(guān)研究大多局限于原始酶的純化和性質(zhì)研究，其基因克隆尤其是真菌來源酶基因克隆研究很少，僅有3例真菌α -L-鼠李糖苷酶基因報道。 α -L-鼠李糖苷酶性質(zhì)研究主要涉及水解功能，其應(yīng)用于糖苷合成方面的研究報道較少。因此，獲得新的真菌來源的α-L-鼠李糖苷酶基因并擴展其在糖苷合成方面的應(yīng)用具有重要
眉、ο

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種來源于鏈格孢的α -L-鼠李糖苷酶基因及其應(yīng)用。
一種α -L-鼠李糖苷酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。該基因來源于菌種保藏號為CGMCC No. 3688的鏈格孢Ll (Alternaria sp. Li)，其全長2046堿基。
一種由上述α -L-鼠李糖苷酶基因編碼的α -L-鼠李糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。該序列全長681個氨基酸。
一種插入了上述SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的表達載體。
上述表達載體為pPIC9K表達載體。
一種插入了包含上述SEQ ID No. 1所示核苷酸序列或含有SEQ ID No. 1序列表達載體的重組細胞。
上述重組細胞為畢氏酵母GS115。
所述α -L-鼠李糖苷酶在食品、制藥領(lǐng)域方面的應(yīng)用。
3[0013]上述應(yīng)用，步驟如下
將(1-1^-鼠李糖苷酶基因克隆到？？扣91(表達載體上，轉(zhuǎn)化畢氏酵母65115( 化11化 pastoris GS115)，甲醇誘導(dǎo)高效表達重組α-L-鼠李糖苷酶，應(yīng)用該酶水解柑橘類果汁中主要的苦味物質(zhì)柚苷，或以鼠李糖為供體，甲醇、乙醇、異丙醇、葡萄糖、果糖、甘露糖、麥芽糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、七葉苷為受體進行轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)。
上述α-L-鼠李糖苷酶基因在畢氏酵母中表達的重組酶為二亞基糖蛋白，聚合體分子量為240士 IOkDa,單亞基分子量為120士5kDa，用糖酰胺酶-F (PNGase F)處理去除糖鏈修飾后單亞基分子量為70士5kDa ；酶對對硝基苯- α -L-鼠李糖苷(p-nitrophenyl-α -L-rhamnopyranoside, pNPR)適宜反應(yīng)的溫度為60_65°C，適宜反應(yīng)的pH為5. 5-7. 5 ；在 250C _60°C范圍內(nèi)保溫池，能夠保留80%以上的活性；在pH3. 5-9. 0的范圍內(nèi)4°C保存1 可以保留75%以上的活性；酶對對硝基苯-α -L-鼠李糖苷的Km值為1. 27mmol/L。
上述α -L-鼠李糖苷酶基因在畢氏酵母中表達的重組酶能夠水解柑橘類果汁中主要的苦味物質(zhì)柚苷，降低果汁苦味。
上述重組酶對pNPR的最適反應(yīng)溫度為65°C JfpNPR的最適反應(yīng)pH為6. 5 7. 0。
以上操作步驟、實驗條件及試劑如無特別說明，均采用本領(lǐng)域常規(guī)操作和常用試劑。
本發(fā)明有益效果如下
本發(fā)明所述α-L-鼠李糖苷酶基因克隆到PPIC9K表達載體上，轉(zhuǎn)化畢氏酵母 GS115，甲醇誘導(dǎo)表達，發(fā)酵液產(chǎn)酶量426mg/L。該α -L-鼠李糖苷酶基因在畢氏酵母中表達的重組酶能夠高效水解柑橘類果汁中的主要苦味物質(zhì)柚苷，并且能夠以鼠李糖為供體、多種物質(zhì)為受體合成轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物，在食品、制藥和化工行業(yè)有重要的潛在應(yīng)用價值。本發(fā)明提供了新的α -L-鼠李糖苷基因來源，并通過高效重組表達提供了大量的α -L-鼠李糖苷酶。


圖1是本發(fā)明所述的鏈格孢Ll重組α -L-鼠李糖苷酶的SDS-PAGE電泳圖；
其中，1、鏈格孢Ll重組α -L-鼠李糖苷酶，2、糖酰胺酶_F(PNGase F)處理后的鏈格孢Ll重組α-L-鼠李糖苷酶，3、蛋白分子量標準；
圖2是本發(fā)明所述鏈格孢Ll重組α -L-鼠李糖苷酶水解柚苷的HPLC檢測圖；
其中，a、鏈格孢Ll重組α -L-鼠李糖苷酶處理完柚苷后的HPLC檢測圖，峰1為柚苷，峰2為水解產(chǎn)物，b、對照組。
圖3是本發(fā)明所述鏈格孢Ll重組α -L-鼠李糖苷酶以鼠李糖為供體、葡萄糖為受體合成糖基產(chǎn)物的HPLC檢測圖；
其中，a、反應(yīng)后產(chǎn)物的HPLC檢測圖，峰1為鼠李糖，峰2為葡萄糖，峰3-4為合成的轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物，b、對照組。
具體實施方式
下面結(jié)合
和實施例對本發(fā)明做進一步說明，但本發(fā)明所保護范圍不限于此。實施例中未明確限定的均可按本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)。
實施例1 鏈格孢Ll (Alternaria sp. Li)總RNA的提取[0029]將鏈格孢Ll (Alternaria sp. Li)，菌種保藏號為CGMCC No. 3688的菌種接種于 150ml產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)液，28°C培養(yǎng)32h，用DEPC處理過的超純水洗滌菌體三次，濾紙過濾收集菌體，液氮研磨破壁。取IOOmg菌體，加入Iml Takara RNAiso Plus，混勻，于15 30°C 靜置5min，然后加入200 μ L氯仿，震蕩15s，在室溫靜置5min，12000轉(zhuǎn)/分、4°C離心30min， 將上清轉(zhuǎn)移到新管中，加入等體積異丙醇，上下顛倒混勻后，15 30°C靜置10min，2000轉(zhuǎn) /分，4°C離心lOmin，去除上清；加入75%乙醇ImL洗滌沉淀，7500轉(zhuǎn)/分、4°C離心5min去除乙醇，晾干5min ；沉淀溶于一定量的DEPC處理過的滅菌超純水中備用。
上述產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)液成分玉米漿30mL/L，酵母粉5g/L，磷酸氫二鉀5g/L，柚苷 5g/L，pH自然，115°C滅菌30分鐘。
實施例2 鏈格孢Ll α -L-鼠李糖苷酶基因部分cDNA序列的PCR擴增
從GenBank中檢索到不同菌株α -L-鼠李糖苷酶基因的cDNA序列，設(shè)計一對兼并 PCR 引物(N-TERiPGl-R)
oligo-dT 5' _xxxxxxxxxxxxxxxxxx_3‘ SEQ ID NO. 6
N-TER 5' -ACCCCHTACTCNCARTACATCYTCGC-3‘ SEQ ID NO. 7
Gl-R 5' -GGRCCNGYRGACCANCCRTG-3‘ SEQ ID N0. 8
以提取的鏈格孢總RNA為模板，采用上述oligo-dT引物進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈，其反應(yīng)總體積為20 μ L，先混合引物(10 μ mol/L) 1 μ L、模板RNA3 μ g與無RNA酶的超純水共12 μ L，65°C預(yù)變性5分鐘，置于冰上；然后加入5 X cDNA合成緩沖液4 μ L、RNA酶抑制劑(20U/μ L) 1 μ LUOmM dNTP 2 μ L、反轉(zhuǎn)錄酶(200U/μ L) 1 μ L，混勻，42°C 延伸 60 分鐘，70°C終止反應(yīng)5分鐘。以上述反應(yīng)合成的cDNA第一條鏈為模板，用N-TER和Gl-R引物進行 PCR 擴增，其總體積為 50 μ L,即超純水；35 μ L, 10XPCR buffer 5 μ L、dNTP2. 4mmol/L、 引物各 1 μ mol/L、MgCl2L 5mmol/L、模板 cDNAlOOng、TaKaRa Taq 酶 2. 5U 共 15 μ L。PCR 擴增條件95°C預(yù)變性5分鐘，反應(yīng)30個循環(huán)(95°C變性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸1分鐘)，30個循環(huán)結(jié)束后72°C延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，紫外分析儀檢測，然后回收，測序大小為1619bp。所得產(chǎn)物即為鏈格孢Ll α -L-鼠李糖苷酶基因部分cDNA序列，測得序列如SEQ ID No. 3。
實施例3 鏈格孢Ll α -L-鼠李糖苷酶基因cDNA 3 ‘端序列的擴增
根據(jù)SEQ ID No. 3的序列，除N-TER外，再設(shè)計一條嵌套PCR正義引物(F2)， 3' RACE法合成α-L-鼠李糖苷酶基因cDNA的3'端片段。引物序列如下
3' AP 5' -GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT-3' SEQ ID N0.9
第一輪PCR引物
N-TER 5' -ACCCCHTACTCNCARTACATCYTCGC-3‘ SEQ ID NO. 10
3' AUAP 5' -GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3‘ SEQIDN0.11
第二輪PCR引物
F2 5' -CTGGCTTCGCTTCGGTATGGG-3‘ SEQ ID N0. 12
3' AUAP 5' -GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3‘ SEQ ID N0. 13
以提取的鏈格孢總RNA為模板，采用上述3' AP引物進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈。以cDNA第一條鏈為模板，用N-TER和3' AUAP引物進行第一輪PCR擴增，再以上述 PCR產(chǎn)物為模板，用F2和3 ‘ AUAP引物進行第二輪PCR擴增驗證。PCR擴增條件和PCR產(chǎn)物回收方法同實施例2。PCR產(chǎn)物測序大小為2065bp。所得產(chǎn)物即為鏈格孢Ll α-L-鼠李糖苷酶基因cDNA3'端序列，測得序列如SEQ ID No. 4
實施例4 鏈格孢Ll α -L-鼠李糖苷酶基因cDNA 5 ‘端序列的擴增
根據(jù)SEQ ID No. 4的序列，設(shè)計兩條嵌套PCR反義引物(Rl和R2)，5 ‘ RACE法合成α-L-鼠李糖苷酶基因cDNA的5'端片段。引物序列如下
Rl 5' -CAATGAGGACTCGGAGAAGGTG-3‘ SEQ ID NO. 14
第一輪PCR引物
5' AP 5' -GGCCACGCGTCGACTAGTACCCCCCCCCCCCCCCCC-3' SEQ ID NO. 15
Rl 5' -CAATGAGGACTCGGAGAAGGTG-3‘ SEQ ID NO. 16
第二輪PCR引物
5' AUAP 5' -GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3‘ SEQ ID NO. 17
R2 5' -TGTTGCTACTTCGCCTGTGAAAA-3‘ SEQ ID NO. 18
以提取的鏈格孢總RNA為模板，采用上述Rl引物進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈。 將上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于37°C加Nase H反應(yīng)1小時，PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收。末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶(TaKaRa)在回收產(chǎn)物5'端加上polyG寡核苷酸序列，反應(yīng)條件是37°C保溫30分鐘，加等體積酚/氯仿(24 1)，混勻，12000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，取上清，加2倍體積的無水乙醇和1/10體積的醋酸鈉(3mol/L)沉淀DNA，離心收集沉淀，加適量體積的無 RNA酶的滅菌超純水溶解。以上述加polyG的cDNA第一條鏈為模板，用5' AP和Rl引物進行第一輪PCR擴增，再以該PCR產(chǎn)物為模板，用5' AUAP和R2引物進行第二輪PCR擴增驗證。PCR擴增條件和PCR產(chǎn)物回收方法同實施例2。PCR產(chǎn)物測序大小為534bp。所得產(chǎn)物即為鏈格孢Ll α-L-鼠李糖苷酶基因cDNA 5'端序列，測得序列如SEQ ID No. 5。
將上述三個序列拼接，獲得2305bp的cDNA全序列，該序列含一個2046bp的0RF， 編碼681個氨基酸，其中上述ORF前57bp編碼的19個氨基酸為信號肽序列，后1989bp (含終止密碼子)編碼的663個氨基酸為成熟酶。
該2046bp 的 ORF 即為鏈格孢 Ll (Alternaria sp. Li) CGMCC No. 3688 的 α -L-鼠李糖苷酶基因編碼區(qū)cDNA序列，其核苷酸序列及編碼的氨基酸序列分別為SEQ ID No. 1和 SEQ ID No. 2。
實施例5 成熟鏈格孢Ll α -L-鼠李糖苷酶的基因編碼區(qū)cDNA序列的擴增
設(shè)計引物pPIC9K-F和pPIC9K_R，分別引入能插入pPIC9K質(zhì)粒(Invitrogen，該質(zhì)粒載體具有α-factor信號肽序列，可分泌表達蛋白，便于重組蛋白的純化)的Sna BI.Not I酶切位點(下劃線所示)，序列如下
pPIC9K-F 5' -5，-GCCTACGTATCAACGCCCTACTCTC-3’ SEQ ID N0. 19
pPIC9K-R 5' -ACTGCGGCCGCCTCCGAACATCTAAAC-3，SEQ ID N0. 20
以提取的鏈格孢總RNA為模板，采用上述引物oligo-dT進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈。以cDNA第一條鏈為模板，用pPIC9K-F和pPIC9K_R引物進行PCR擴增。PCR擴增條件和PCR產(chǎn)物回收方法同實施例2。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收后連接到pMD18-T質(zhì)粒載體上 (TaKaRa)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，涂布氨芐青霉素平板，用菌落PCR方法篩選獲得重組菌，然后測序，將測得的序列進行分析，顯示由1989bp組成，與實施例4結(jié)果一致。
實施例6 鏈格孢Ll α -L-鼠李糖苷酶基因在畢氏酵母中的表達[0065]將實施例5篩選到的重組菌接種于30mL含100 μ g/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37°C搖床培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒，加Sna Bi、Not I (NEB)于37°C酶切5小時，回收目的片段，采用同樣酶切方法處理PPIC9K質(zhì)粒載體。將制備好的酶基因片段與PPIC9K載體按一定比例混合，采用連接試劑盒(TaKaRa DNALigation Kit Ver. 2. 0)于16°C連接M小時。 然后采用CaCl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化宿主菌大腸桿菌DH5 α，轉(zhuǎn)化菌液涂布氨芐青霉素平板，37°C過夜培養(yǎng)。提取陽性菌落質(zhì)粒，Sal I酶將重組質(zhì)粒及PPIC9K空質(zhì)粒線性化，采用電激轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化畢氏酵母GS115，轉(zhuǎn)化液涂布MD篩選平板，30°C培養(yǎng)3 4天，挑選生長良好的酵母菌落，采用菌落PCR法驗證陽性轉(zhuǎn)化子。將重組質(zhì)粒陽性轉(zhuǎn)化子及pPIC9K空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子的單菌落接種于BMGY培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)至0D_達到2 6，3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘收集細胞，棄去上清，用BMMY培養(yǎng)液重懸細胞，250C甲醇誘導(dǎo)表達，每M小時加一次100%甲醇至終濃度0.5% (ν/ν)以保持誘導(dǎo)。測定發(fā)酵上清液中鼠李糖苷酶水解活性，將完全符合要求的重組菌作為菌種保存。
上述LB 培養(yǎng)液成分蛋白胨 10g/L，酵母粉 5g/L，NaCl 7g/L，pH 7. 0 7. 5，121°C 滅菌20分鐘；
上述MD篩選平板成分無氨基酸酵母氮源(YNB) 13. 4g/L，生物素4X 10_4g/L，蛋白胨20g/L，瓊脂粉15g/L，pH自然，115°C滅菌30分鐘；
上述BMGY培養(yǎng)液成分酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，YNB 13. 4g/L，pH6. 0磷酸緩沖液lOOmmol/L，生物素4X10_4g/L，甘油1% (ν/ν), pH自然，115°C滅菌30分鐘;
上述BMMY培養(yǎng)液成分酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，YNB 13. 4g/L，pH6. 0磷酸緩沖液 100mmol/L，生物素 4X10_4g/L，甲醇 0. 5% (ν/ν), pH 自然，115°C滅菌 30 分鐘。
上述α -L-鼠李糖苷酶水解活性測定
取50 μ L 上清液，加 2mmol/L 的 pNPR 溶液 300 μ L，37 °C 反應(yīng) 10 分鐘，加 300 μ L 0. 005mol/L的Na2CO3溶液終止反應(yīng)，12，000轉(zhuǎn)/分離心2分鐘，上清液測OD4000酶的活力單位規(guī)定以1分鐘水解PNPR釋放1 μ mol對硝基苯酚的酶量為一個酶活力單位(U)。
實施例7 鏈格孢Ll α -L-鼠李糖苷酶基因在畢氏酵母中的表達和純化
將實施例6所保存的畢氏酵母GSl 15重組菌接種于50mLBMGY培養(yǎng)液，30°C培養(yǎng)M 小時，轉(zhuǎn)接于200mL BMMY培養(yǎng)液培養(yǎng)液，25°C培養(yǎng)，每M小時加入甲醇至終濃度0.5% (ν/ ν)，再繼續(xù)培養(yǎng)120小時，于3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，獲得發(fā)酵上清液，即粗酶液。用孔徑為0. 22 μ m的濾膜過濾粗酶液，然后用截流分子量為30kDa的膜超濾，即獲得到了電泳純重組α-L-鼠李糖苷酶。
實施例8 鏈格孢Ll重組α -L-鼠李糖苷酶的基本酶學(xué)性質(zhì)
(1)酶的分子量
酶蛋白分子量的測定采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)。根據(jù)樣品和標準蛋白的PAGE圖，測定樣品和標準蛋白的相對遷移值&，用標準蛋白的&值對分子量的對數(shù)作標準曲線。再根據(jù)純酶樣品的&值，就可求得其分子量。SDS-PAGE采用垂直板式不連續(xù)系統(tǒng)電泳方式，電泳分離膠濃度為10%，濃縮膠4% ；Nativegradient PAGE (非解離梯度聚丙稀酰胺凝膠電泳)采用5 12%線形梯度垂直板狀聚丙烯酰胺凝膠，40C電泳。
Native gradient PAGE顯示酶蛋白的分子量約為MO士 10kDa，SDS-PAGE顯示酶蛋白單亞基分子量約為120±^Da(如附圖1)，表明該酶為一個二亞基蛋白。SDS-PAGE中的條帶呈現(xiàn)彌散狀態(tài)，為糖蛋白的明顯特征，其彌散狀態(tài)是因蛋白分子糖基化不均一導(dǎo)致的， 用糖酰胺酶-F(PNGase F)處理鏈格孢Ll α -L-鼠李糖苷酶后再進行SDS-PAGE，其大小為 70 士 5kDa，與預(yù)測的分子量大小相近。
(2)酶的動力學(xué)參數(shù)
酶的動力學(xué)參數(shù)的測定采用雙倒數(shù)法。
將5 μ L酶與30 μ L不同濃度的pNPR(濃度范圍2 6. 67mmol/L)混合，于37°C反應(yīng)10分鐘，加150 μ L 0. 005mol/L的Na2CO3溶液終止反應(yīng)，測定OD4tltl,計算水解速率，用雙倒數(shù)作圖法測得酶對PNPR的Km值為1. 27mmol/L。
(3)溫度和pH對酶活性的影響
在適當?shù)臏囟确秶?25°C 80°C)內(nèi)，每5°C為一個梯度測定酶在該溫度下的相對酶活。結(jié)果表明酶適宜反應(yīng)的溫度為60°C 65°C，最適反應(yīng)溫度為65°C。將酶在上述溫度梯度下保溫2小時后測定相對酶活。結(jié)果表明在25°C 60°C范圍內(nèi)保溫池，能夠保留 80%以上的活性，60°C以上失活較快，70°C失去所有的酶活。用不同pH的緩沖液配制酶反應(yīng)體系，測定相對酶活，結(jié)果表明酶的最適反應(yīng)PH為6. 5 7.0 ；酶在不同pH的緩沖液中 4°C保存M小時，測定相對酶活，結(jié)果表明酶在pH 3. 5 9. 0范圍內(nèi)穩(wěn)定。
上述酶活測定方法為5 μ L酶與30 μ L2mmol/L的pNPR溶液混合，于37°C反應(yīng)10 分鐘，加150 μ L 0. 005mol/L的Na2CO3溶液終止反應(yīng)，測定OD400。
上述不同pH緩沖液為廣泛緩沖液pH2. 6 12. 0。每升混合液含檸檬酸6. 008g、 磷酸二氫鉀3. 893g、硼酸1. 769g、巴比妥5. 266g，每IOOml混合液滴加χ ml 0. 2mol/LNa0H 溶液至所需PH值。
實施例9 鏈格孢Ll重組α _L_鼠李糖苷酶用于水解柑橘類果汁的主要苦味物質(zhì)柚苷
將60yL、10mmol/L柚苷溶液與5yL酶液(酶量0. 05U) 37°C反應(yīng)10分鐘，100°C 煮沸10分鐘滅活酶液終止反應(yīng)。對照反應(yīng)先將酶液滅活，其余反應(yīng)體系相同。圖2顯示了該反應(yīng)的HPLC分析結(jié)果，重組酶在該條件下能夠水解24%的柚苷。
上述HPLC分析所用設(shè)備及條件安捷倫1200LC高效液相色譜儀；安捷倫VWD紫外檢測器；ZORBAX Eclipse XDB-C18 柱(4. 6mmX 150mm)；流動相為 23% 乙腈，流速為 ImL/ min,柱溫25 V ；檢測波長為^Onm。樣品用0. 22 μ m濾膜過濾后，進樣分析。
實施例10 鏈格孢Ll重組α -L-鼠李糖苷酶以葡萄糖為受體發(fā)生轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)
將1(^1^酶液(酶量0.川)、45口1^ 21%鼠李糖、45yL 83%葡萄糖混合，50°C反應(yīng) 32小時，100°C煮沸10分鐘滅活酶液終止反應(yīng)。對照反應(yīng)先將酶液滅活，其余反應(yīng)體系相同。圖3顯示了該反應(yīng)的HPLC分析結(jié)果，酶在該條件下生成的轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物產(chǎn)量為12.2%。
上述HPLC分析所用設(shè)備及條件安捷倫1200LC高效液相色譜儀；安捷倫RID示差折光檢測器；ZORBAX Carbohydrate柱(4. 6謹X25(toim)；流動相為70%乙腈，流速為ImL/ min,柱溫30°C。樣品用0. 22 μ m濾膜過濾后，進樣分析。
實施例11 鏈格孢Ll重組α -L-鼠李糖苷酶與其他來源α -L-鼠李糖苷酶的性質(zhì)比較
將上述鏈格孢Ll重組α -L-鼠李糖苷酶氨基酸序列于NCBI網(wǎng)站進行BLAST氨基酸序列比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除各種預(yù)測蛋白外，只有三種真菌α-L-鼠李糖苷酶與本專利涉及的鏈格孢Ll α -L-鼠李糖苷酶序列相似度較高。
參考發(fā)表文獻(Koseki T, et al. Characterization of an α -L-rhamnosidase from Aspergillus kawachii and its gene.Appl Microbiol Biotechnol,2008, 80 1007-1013 ；Manzanares P, et al. Purification and characterization of two different α-L—rhamnosidases, RhaA and RhaB, from Aspergillus aculeatus. Appl Environ Microbiol, 2001,67 :2230_2234)，將這三種α-L-鼠李糖苷酶與本專利中所說明的鏈格孢Ll重組α -L-鼠李糖苷酶進行性質(zhì)比較，表1結(jié)果顯示鏈格孢Ll重組α -L-鼠李糖苷酶與已報道的三種酶在氨基酸序列、分子量大小、動力學(xué)參數(shù)、酶學(xué)基本性質(zhì)如最適 PH及ρΗ穩(wěn)定性、最適溫度等方面均具有顯著差異，此外鏈格孢Ll重組α -L-鼠李糖苷酶具有轉(zhuǎn)糖基活性，其他酶未報道具有轉(zhuǎn)糖基活性。
表1.鏈格孢Ll重組α _L_鼠李糖苷酶與其他來源α _L_鼠李糖苷酶的性質(zhì)比較
權(quán)利要求
1.一種α -L-鼠李糖苷酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
2.一種由權(quán)利要求
1所述α -L-鼠李糖苷酶基因編碼的α -L-鼠李糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
3.—種插入了 SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的表達載體。
4.如權(quán)利要求
3所述的表達載體，其特征在于，表達載體為PPIC9K表達載體。
5.一種插入了包含SEQ ID No. 1所示核苷酸序列或含有SEQ ID No. 1序列表達載體的重組細胞。
6.如權(quán)利要求
5所述的重組細胞，其特征在于，重組細胞為畢氏酵母GS115。
7.權(quán)利要求
2所述α-L-鼠李糖苷酶在食品、制藥領(lǐng)域方面的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求
7所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟如下將α -L-鼠李糖苷酶基因克隆到PPIC9K表達載體上，轉(zhuǎn)化畢氏酵母GS1115 (Pichia pastoris GS115)，甲醇誘導(dǎo)高效表達重組α-L-鼠李糖苷酶，應(yīng)用該酶水解柑橘類果汁中主要的苦味物質(zhì)柚苷，或以鼠李糖為供體，甲醇、乙醇、異丙醇、葡萄糖、果糖、甘露糖、麥芽糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、七葉苷為受體進行轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種α-L-鼠李糖苷酶基因，尤其涉及一種來源于鏈格孢的α-L-鼠李糖苷酶基因及其應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域：
。一種α-L-鼠李糖苷酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。由上述α-L-鼠李糖苷酶基因編碼的α-L-鼠李糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本發(fā)明所述α-L-鼠李糖苷酶基因克隆到pPIC9K表達載體上，轉(zhuǎn)化畢氏酵母GS115，甲醇誘導(dǎo)表達，發(fā)酵液產(chǎn)酶量426mg/L。該α-L-鼠李糖苷酶基因在畢氏酵母中表達的重組酶能夠高效水解柑橘類果汁中的主要苦味物質(zhì)柚苷，并且能夠以鼠李糖為供體、多種物質(zhì)為受體合成轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物，在食品、制藥和化工行業(yè)有重要的潛在應(yīng)用價值。
文檔編號C12N1/19GKCN102321645SQ201110226051
公開日2012年1月18日 申請日期2011年8月8日
發(fā)明者劉倩, 盧麗麗, 肖敏 申請人:山東大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan