專利名稱:合成cDNA的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可用于合成cDNA的方法和可用于合成cDNA的試劑盒。
背景技術(shù)：
為了闡明生命現(xiàn)象，非常重要的是分析各種基因的mRNA分子。通過RNA依賴性的DNA聚合酶(換而言之,反轉(zhuǎn)錄酶)的發(fā)現(xiàn),使得使用RNA作為模板來合成cDNA的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)成為可能，從而在分析mRNA分子的方法中取得顯著進步。使用反轉(zhuǎn)錄酶來分析mRNA分子的方法，現(xiàn)在已經(jīng)變成涉及基因的研究中的一種基本實驗方法。使用通過反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成的cDNA作為模板的、用于擴增DNA片段的PCR方法被稱作RT-PCR方法。所述RT-PCR方法被用于克隆從mRNA衍生出的cDNA，或用于制造cDNA文庫，且也可用作檢查特定RNA的表達狀態(tài)的方法。但是，在用于cDNA合成的樣品中污染有DNA的情況下，可能會擴增編碼RNA的DNA上的區(qū)域或擬基因，因而難以選擇性地僅得到使用RNA作為模板合成的DNA。為了抑制由樣品中的污染DNA衍生出的擴增產(chǎn)物的生成，采用下述的方法在反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)過程中使用核苷酸類似物和會降低Tm值的化合物的方法(專利公開I)，包括使用脫氧核糖核酸內(nèi)切酶(在下文中，可以稱作endoDNase)諸如脫氧核糖核酸酶I (在下文中，可以稱作DNA酶I)降解樣品中的DNA并在之后進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的方法等。
在用DNA酶I降解樣品中的DNA后進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時，為了抑制cDNA的降解，通常在反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)之前通過熱處理、苯酚/氯仿萃取等滅活或去除所述DNA酶I。但是，已知的是，苯酚/氯仿萃取是復(fù)雜的，且在有二價金屬離子(它們是DNA酶I的反應(yīng)所必需的)存在下的熱處理會導(dǎo)致RNA的水解。盡管還提出了 DNA酶I和反轉(zhuǎn)錄酶同時起作用的方法(專利公開2和3)，DNA酶I也會降解DNA/RNA雜交物中的DNA，使得以此方式通過反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成的cDNA遭受DNA酶I的降解。
專利公開
專利公開I: WO 99/09213 專利公開2:日本專利公開號2005-304396 專利公開 3: WO 2006/103039。

發(fā)明內(nèi)容
_6] 本發(fā)明要解決的問題
本發(fā)明要解決的問題是提供一種合成cDNA的方法，所述方法能夠簡單地且方便地抑制由樣品中的污染DNA衍生出的擴增產(chǎn)物的生成。
解決問題的方式
發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，可以制備這樣的反應(yīng)溶液組合物其中endoDNase不表現(xiàn)出活性，且反轉(zhuǎn)錄酶表現(xiàn)出活性，且進一步，基于所述發(fā)現(xiàn)，已經(jīng)完成了可以解決上述問題的與合成cDNA的方法和用于合成cDNA的試劑盒有關(guān)的本發(fā)明。[0008]具體地，本發(fā)明涉及
[1]一種合成CDNA的方法，其特征在于，制備不需要熱滅活脫氧核糖核酸內(nèi)切酶或去除脫氧核糖核酸內(nèi)切酶即可使脫氧核糖核酸內(nèi)切酶不表現(xiàn)出其活性的反應(yīng)溶液，并進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，
其中所述反應(yīng)溶液含有處理過的樣品和反轉(zhuǎn)錄酶，所述處理過的樣品如下形成用脫氧核糖核酸內(nèi)切酶處理包含RNA和DNA的樣品，以降解所述樣品中的DNA ；
[2]根據(jù)[I]所述的方法，其中所述方法包括下述步驟(a)至(C)
(a)得到組合物，所述組合物包含含有RNA和DNA的樣品和脫氧核糖核酸內(nèi)切酶；
(b)在足以降解所述樣品中的DNA的條件下，用脫氧核糖核酸內(nèi)切酶處理在步驟(a) 中得到的組合物；和
(c)將添加劑和反轉(zhuǎn)錄酶加入在步驟(b)中處理過的組合物中，以制備使脫氧核糖核酸內(nèi)切酶不表現(xiàn)出其活性的反應(yīng)溶液，并使用反轉(zhuǎn)錄酶進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；
[3]根據(jù)[I]所述的方法，其中所述脫氧核糖核酸內(nèi)切酶是脫氧核糖核酸酶I;
[4]根據(jù)[I]所述的方法，其中所述反轉(zhuǎn)錄酶是從莫洛尼鼠白血病病毒衍生出的反轉(zhuǎn)錄酶；
[5]根據(jù)[2]所述的方法，其中所述添加劑是選自還原劑、一價陽離子和其鹽中的至少一種；
[6]根據(jù)[5]所述的方法，其中所述一價陽離子是銨離子；
[7]一種擴增cDNA的方法，所述方法包括下述步驟使用根據(jù)在[I]至[6]中任一項所定義的方法合成的cDNA作為模板，進行基因擴增方法；和
[8]一種用于[I]至[7]中任一項所定義的方法中的試劑盒，所述試劑盒包含(A)脫氧核糖核酸內(nèi)切酶、(B)緩沖劑、(C)反轉(zhuǎn)錄酶和(D)添加劑，其用于制備使所述反轉(zhuǎn)錄酶表現(xiàn)出其活性，且使所述脫氧核糖核酸內(nèi)切酶不表現(xiàn)出其活性的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)用組合物。
發(fā)明效果
根據(jù)本發(fā)明，使得在可操作性、定量等方面優(yōu)良的cDNA合成成為可能，該合成能夠抑制由樣品中的污染DNA衍生出的擴增產(chǎn)物的生成。


圖I是顯示實施例2中的瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果的圖。
圖2是顯示實施例8中的實時PCR的結(jié)果的圖。
具體實施方式
本發(fā)明的合成cDNA的方法的特征在于，制備不需要熱滅活脫氧核糖核酸內(nèi)切酶或去除脫氧核糖核酸內(nèi)切酶即可使脫氧核糖核酸內(nèi)切酶不表現(xiàn)出其活性的反應(yīng)溶液，并進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，
其中所述反應(yīng)溶液含有處理過的樣品和反轉(zhuǎn)錄酶，所述處理過的樣品如下形成用脫氧核糖核酸內(nèi)切酶處理包含RNA和DNA的樣品，以降解所述樣品中的DNA。
常規(guī)地，在包括使用endoDNase降解樣品中的DNA然后進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的方法中，需要在反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)之前，熱滅活所述endoDNase或去除所述endoDNase,但是本發(fā)明的方法不需要這些操作。換而言之，根據(jù)本發(fā)明，在用endoDNase降解樣品中的DNA和反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)之間，不需要進行在60°C或更高溫度的熱處理或特定組分的分離操作。因此，在本發(fā)明的說明書中，短語“熱滅活脫氧核糖核酸內(nèi)切酶(endoDNase) ”表示在60°C或更高溫度熱處理含有endoDNase的樣品，短語“去除脫氧核糖核酸內(nèi)切酶(endoDNase) ”表示從含有endoDNase的樣品中分離endoDNase，短語“不需要熱滅活脫氧核糖核酸內(nèi)切酶或去除脫氧核糖核酸內(nèi)切酶”是指不進行上述操作。
雖然不將本發(fā)明具體地限于此，但本發(fā)明的方法中使用的樣品可以是含有RNA的樣品，且包括，例如，含有RNA和DNA的樣品。具體地，所述樣品包括源于活體的樣品諸如細胞、組織或血液；借助于眾所周知的方法通過處理樣品得到的含有核酸的樣品；和可能含有生物體的樣品，諸如食物、土壤或廢水。借助于眾所周知的方法通過處理源于活體的樣品得到的含有核酸的樣品的一個實例包括，例如，從細胞破碎物得到的樣品或通過其分級分離得到的樣品；富含樣品中的總RNA或特定RNA分子的樣品，例如，富含mRNA的那些樣品，等等，且所述樣品可以是污染有DNA的樣品。
在本發(fā)明的說明書中，脫氧核糖核酸內(nèi)切酶(endoDNase)是指以內(nèi)切形式切斷 DNA鏈的酶?？捎糜诒景l(fā)明中的endoDNase優(yōu)選地包括雙鏈DNA特異性endoDNase,更優(yōu)選地包括，例如，序列非特異性內(nèi)切核酸酶諸如DNA酶I或蝦DNA酶，或序列特異性內(nèi)切核酸酶諸如限制性酶。
所述處理過的樣品(其中所述樣品中的DNA被endoDNase降解)沒有特別限制，只要所述樣品保持在使樣品中的DNA被endoDNase降解的條件下即可，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠根據(jù)endoDNase或樣品適當(dāng)?shù)刂苽渌鰳悠?。盡管沒有具體地將本發(fā)明限于此，在使用DNA酶I作為endoDNase的情況下,所述保持條件是這樣的條件優(yōu)選地在2(TC至45 保持10秒至12小時，更優(yōu)選地在25°C至44°C保持30秒至I小時，甚至更優(yōu)選地在30°C至43°C保持I分鐘至30分鐘。
可用于本發(fā)明中的反轉(zhuǎn)錄酶可以是這樣的酶其具有反轉(zhuǎn)錄活性，換而言之，使用RNA作為模板合成與其互補的DNA的活性，且所述反轉(zhuǎn)錄酶包括，例如，從病毒衍生出的反轉(zhuǎn)錄酶，諸如從莫洛尼鼠白血病病毒衍生出的反轉(zhuǎn)錄酶(MMLV-衍生的反轉(zhuǎn)錄酶)和從禽髓母細胞白血病病毒衍生出的反轉(zhuǎn)錄酶(AMV-衍生的反轉(zhuǎn)錄酶)；從真細菌衍生出的反轉(zhuǎn)錄酶，諸如從屬于芽孢桿菌屬的嗜熱細菌衍生出的DNA聚合酶(Bca DNA聚合酶等等)，和從屬于棲熱菌屬的細菌衍生出的具有反轉(zhuǎn)錄活性和DNA依賴性的DNA聚合酶活性的DNA聚合酶(Tth DNA聚合酶等等)。在本發(fā)明中，優(yōu)選地使用從病毒衍生出的反轉(zhuǎn)錄酶，且更優(yōu)選地使用MMLV-衍生的反轉(zhuǎn)錄酶。另外，天然存在的酶或重組酶可以在本發(fā)明中用作反轉(zhuǎn)錄酶，且還可以使用這樣的反轉(zhuǎn)錄酶在使所述反轉(zhuǎn)錄酶具有反轉(zhuǎn)錄活性的范圍內(nèi)，對天然存在的氨基酸序列進行修飾。
在本發(fā)明的說明書中，短語“使所述脫氧核糖核酸內(nèi)切酶不表現(xiàn)出其活性的反應(yīng)溶液”是指“其中所述脫氧核糖核酸內(nèi)切酶不表現(xiàn)出DNA降解活性的反應(yīng)溶液”。所述反應(yīng)溶液是指，例如，這樣的反應(yīng)溶液甚至當(dāng)含有40 μ g/mL牛胸腺DNA的反應(yīng)溶液在有8 U/mL DNA酶I (TAKARA BIO INC.)(在產(chǎn)品上指示的滴度)存在下在25°C保持10分鐘時，其在260 nm的吸光度也沒有實質(zhì)性變化。
使endoDNase不表現(xiàn)出其活性的反應(yīng)溶液含有所述處理過的樣品和反轉(zhuǎn)錄酶,且可以如下制備例如，在用endoDNase降解樣品中的DNA以后，將添加劑、反轉(zhuǎn)錄酶和其它組分加入反應(yīng)溶液中，以制備其中endoDNase不表現(xiàn)出DNA降解活性的組合物。換而言之，包括下述步驟的方法是本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方案(a)得到包含樣品和脫氧核糖核酸內(nèi)切酶的組合物；(b)在足以降解所述樣品中的DNA的條件下，用脫氧核糖核酸內(nèi)切酶處理在步驟(a)中得到的組合物；和(C)將添加劑和反轉(zhuǎn)錄酶加入在步驟(b)中處理過的組合物中，以制備使脫氧核糖核酸內(nèi)切酶不表現(xiàn)出其活性的反應(yīng)溶液，并進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
優(yōu)選地，在上述步驟(a)中含有樣品和脫氧核糖核酸內(nèi)切酶的組合物進一步含有緩沖劑諸如Tris-HCl、二價金屬離子諸如鎂離子或錳離子和還原劑諸如二硫蘇糖醇(在下文中，可以稱作DTT)?？梢栽诒憩F(xiàn)出在下一步驟(b)中用endoDNase降解樣品中的DNA的活性的范圍內(nèi)，基于酶學(xué)性質(zhì)(諸如e ndoDNase的反應(yīng)性質(zhì)或穩(wěn)定性)或?qū)嶒瀬磉m當(dāng)?shù)剡x擇緩沖劑、二價金屬離子和還原劑的種類或濃度。優(yōu)選地設(shè)定所述種類或濃度，使得endoDNase表現(xiàn)出高活性，并表現(xiàn)出高穩(wěn)定性。例如，在使用DNA酶I作為endoDNase的情況下，可以設(shè)定緩沖劑的種類或濃度，使得其加入會產(chǎn)生endoDNase的接近最佳pH，且能夠調(diào)節(jié)反應(yīng)溶液的PH至5-10的范圍內(nèi)的種類或濃度是優(yōu)選的。另外，可以設(shè)定還原劑的種類或濃度，使得endoDNase表現(xiàn)出高穩(wěn)定性；例如，在使用DNA酶I作為endoDNase的情況下，優(yōu)選地，所述組合物含有濃度為I mM或更高且小于5 mM的DTT。
在上述步驟(b)中足以用脫氧核糖核酸內(nèi)切酶降解所述樣品中的DNA的條件沒有特別限制，只要溫度和時間的條件是這些的條件在所述條件下降解DNA時，從樣品中的DNA衍生出的產(chǎn)物不能實質(zhì)性地確認,本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以根據(jù)endoDNase或樣品適當(dāng)?shù)卦O(shè)定條件。盡管沒有具體地將本發(fā)明限于此，在使用DNA酶I作為endoDNase的情況下，優(yōu)選地舉例在20°C至45°C保持10秒至12小時的條件，更優(yōu)選地舉例在25°C至44°C保持30秒至I小時的條件，甚至更優(yōu)選地舉例在30°C至43°C保持I分鐘至30分鐘的條件。
在上述步驟(C)中的添加劑包括選自還原劑、一價陽離子和其鹽中的至少一種。所述添加劑可以用于本發(fā)明中，例如，以含有添加劑的水溶液(優(yōu)選地含有添加劑的緩沖液)的形式。用于上述緩沖液中的緩沖劑的種類或濃度沒有特別限制，只要可以將反應(yīng)溶液調(diào)至希望的pH，通過其加入能夠?qū)⒎磻?yīng)溶液的pH改變至可用于反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中的反轉(zhuǎn)錄酶的接近最佳PH的種類或濃度是優(yōu)選的。盡管沒有具體地將本發(fā)明限于此，上述緩沖劑包括Good氏緩沖劑諸如Tris-HCl。上述還原劑包括，例如，硫醇還原劑諸如DTT或2-巰基乙醇。另外，上述一價陽離子包括銨離子和堿金屬離子諸如鉀離子、鋰離子和鈉離子和其鹽，例如，可以使用硫酸銨或氯化鉀。使用的還原劑、一價陽離子或其鹽的種類或量沒有特別限制，只要在添加了添加劑的組合物中所述endoDNase不表現(xiàn)出其活性，且反轉(zhuǎn)錄酶有效地起作用即可，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠根據(jù)本說明書的公開內(nèi)容適當(dāng)?shù)刈龀鰶Q定。盡管沒有具體地將本發(fā)明限于此，在所述endoDNase是DNA酶I的情況下，在所述組合物(其中所述endoDNase不表現(xiàn)出其活性，且所述反轉(zhuǎn)錄酶有效地起作用)中的組分包括例如，硫酸銨、DTT和氯化鉀。所述組合物中的硫酸銨的濃度優(yōu)選地包括5 mM或更高，更優(yōu)選地包括10-30 mM，甚至更優(yōu)選地包括14-28 mM。另外，DTT的濃度優(yōu)選地包括5 mM或更高，更優(yōu)選地包括11-30 mM，甚至更優(yōu)選地包括12-20 mM。另外，氯化鉀的濃度優(yōu)選地包括I mM或更高，更優(yōu)選地包括3-30 mM,甚至更優(yōu)選地包括5-20 mM。具體地，作為在所述組合物中的終濃度，混合上述添加劑，使得所述組合物優(yōu)選地含有5 mM或更高的硫酸銨、5 mM或更高的DTT和I mM或更高的氯化鉀，更優(yōu)選地含有10-30 mM硫酸銨、11-30 mM DTT和3_30 mM氯化鉀，甚至更優(yōu)選地含有14-28 mM硫酸銨、11-30 mM DTT和5_20 mM氯化鉀，甚至更優(yōu)選地含有14-28 mM硫酸銨、12-20 mM DTT和5-20 mM氯化鉀。
另外，上述添加劑可以以緩沖劑的形式用于制備如下制備的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溶液混合反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)必需的組分，諸如反轉(zhuǎn)錄酶、緩沖劑、寡核苷酸引物和dNTP?？紤]到操作和反轉(zhuǎn)錄酶的穩(wěn)定性，下述實施方案是優(yōu)選的所述緩沖液含有除了反轉(zhuǎn)錄酶以外的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)必需的組分，且僅僅單獨地向其中加入反轉(zhuǎn)錄酶。
反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的條件沒有特別限制，只要所述條件足以合成與模板RNA互補的引物延伸鏈。足以合成與模板RNA互補的引物延伸鏈的條件沒有特別限制，溫度條件優(yōu)選地是25°C至60°C，更優(yōu)選地是30°C至50°C。另外，反應(yīng)時間優(yōu)選地是5-120分鐘，更優(yōu)選地是15-60分鐘。另外，在反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以后，可以在滅活反轉(zhuǎn)錄酶的條件下，溫育所述反應(yīng)溶液。用于滅活反轉(zhuǎn)錄酶的條件包括，例如，在85°C持續(xù)5秒的條件。本發(fā)明的擴增cDNA的方法包括下述步驟使用根據(jù)本發(fā)明的合成cDNA的方法合成的cDNA作為模板，進行基因擴增反應(yīng)。在使用cDNA作為模板的核酸擴增中，可以使用本領(lǐng)域眾所周知的基因擴增方法，諸如PCR方法、ICAN方法、LAMP方法或SDA方法。例如，在核酸擴增中使用PCR方法的情況下，可以應(yīng)用一般的PCR條件，所述擴增如下進行例如，通過包括將雙鏈模板DNA解離成單鏈(變性)，將引物退火至單鏈模板DNA，和由所述引物合成互補鏈(延伸)的3個步驟的反應(yīng),或通過包括2步反應(yīng)的反應(yīng),其中在上述的3步反應(yīng)中，在相同溫度進行引物的退火和延伸，稱作“穿梭PCR” [ uPCR Ho Saizensen (FrontLine of PCR Method), ^(Tanpakushitsu Kakusan Koso (Proteins, Nucleic Acids andEnzymes) ”Supplement, 41 (5)，425-428 (1996)]。作為 PCR 方法，可以使用實時 PCR，其能夠用嵌入染料、FRET-標記的探針等等監(jiān)測核酸擴增。
本發(fā)明的試劑盒是用于本發(fā)明的合成cDNA的方法或本發(fā)明的擴增cDNA的方法中的試劑盒，且所述試劑盒含有(A)脫氧核糖核酸內(nèi)切酶、⑶緩沖劑、(C)反轉(zhuǎn)錄酶和(D)添加劑，其用于制備使所述反轉(zhuǎn)錄酶表現(xiàn)出其活性，且使所述脫氧核糖核酸內(nèi)切酶不表現(xiàn)出其活性的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)用組合物。上述緩沖劑(B)可以含有endoDNase的反應(yīng)必需的二價金屬離子等等。另外，所述添加劑(D)可以含有使用反轉(zhuǎn)錄酶的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)必需的寡核苷酸引物或dNTP。
實施例
在下文中將通過實施例具體地描述本發(fā)明，但是無意將本發(fā)明的范圍限于所述實施例。
實施例I. 用于扣3制EndoDNase活性的反應(yīng)組成的研究~1
制備了 5種20 μ L反應(yīng)溶液(反應(yīng)溶液1-5)，它們含有5 U DNA酶I [重組DNA酶I(無RNA酶)，TAKARA BIO INC. ], 200 ng小鼠基因組DNA和在表I中列出的組分。另外，制備了 5種20 μ L反應(yīng)溶液，它們具有與上述相同的組成，但是不含有DNA酶I。在這里，將反應(yīng)溶液I設(shè)定為，每種組分的濃度是DNA酶I的標準反應(yīng)溶液組成的一半，將反應(yīng)溶液2設(shè)定為，具有接近反轉(zhuǎn)錄酶的最佳pH的pH，且含有dNTP，所述dNTP用作反轉(zhuǎn)錄酶的底物。將這些反應(yīng)溶液在37°C溫育15分鐘，然后在85°C溫育5秒。接著，根據(jù)實時PCR (其中將RsplS基因區(qū)域用作靶向序列)，定量在每種反應(yīng)溶液中剩余的基因組DNA的量。在這里，在實時 PCR 中，使用 SYBR Premix ExTaq (Perfect Real Time, TAKARA BIO INC·)，并使用下述引物作為引物對由序列表的SEQ ID NO: I所示的核苷酸序列組成的引物，和由序列表的SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列組成的引物。
[表 I]
權(quán)利要求
1.一種合成CDNA的方法，其特征在于，制備不需要熱滅活脫氧核糖核酸內(nèi)切酶或去除脫氧核糖核酸內(nèi)切酶即可使脫氧核糖核酸內(nèi)切酶不表現(xiàn)出其活性的反應(yīng)溶液，并進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)， 其中所述反應(yīng)溶液含有處理過的樣品和反轉(zhuǎn)錄酶，所述處理過的樣品如下形成用脫氧核糖核酸內(nèi)切酶處理包含RNA和DNA的樣品，以降解所述樣品中的DNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的方法，其中所述方法包括下述步驟(a)至(c) (a)得到組合物，所述組合物包含含有RNA和DNA的樣品和脫氧核糖核酸內(nèi)切酶； (b)在足以降解所述樣品中的DNA的條件下，用脫氧核糖核酸內(nèi)切酶處理在步驟(a)中得到的組合物；和 (c)將添加劑和反轉(zhuǎn)錄酶加入在步驟(b)中處理過的組合物中，以制備使脫氧核糖核酸內(nèi)切酶不表現(xiàn)出其活性的反應(yīng)溶液，并使用反轉(zhuǎn)錄酶進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的方法，其中所述脫氧核糖核酸內(nèi)切酶是脫氧核糖核酸酶I。
4.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的方法，其中所述反轉(zhuǎn)錄酶是從莫洛尼鼠白血病病毒衍生出的反轉(zhuǎn)錄酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的方法，其中所述添加劑是選自還原劑、一價陽離子和其鹽中的至少一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求
5所述的方法，其中所述一價陽離子是銨離子。
7.一種擴增cDNA的方法，所述方法包括下述步驟使用根據(jù)權(quán)利要求
1-6中任一項所定義的方法合成的cDNA作為模板，進行基因擴增反應(yīng)。
8.一種用于權(quán)利要求
1-7中任一項所定義的方法中的試劑盒，所述試劑盒包含下述的(A)至⑶ (A)脫氧核糖核酸內(nèi)切酶， (B)緩沖劑， (C)反轉(zhuǎn)錄酶，和 (D)添加劑，其用于制備使所述反轉(zhuǎn)錄酶表現(xiàn)出其活性，且使所述脫氧核糖核酸內(nèi)切酶不表現(xiàn)出其活性的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)用組合物。
專利摘要
一種合成cDNA的方法，其特征在于，制備不需要熱滅活脫氧核糖核酸內(nèi)切酶或去除脫氧核糖核酸內(nèi)切酶即可使脫氧核糖核酸內(nèi)切酶不表現(xiàn)出其活性的反應(yīng)溶液，并進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，其中所述反應(yīng)溶液含有處理過的樣品和反轉(zhuǎn)錄酶，所述處理過的樣品如下形成用脫氧核糖核酸內(nèi)切酶處理包含RNA和DNA的樣品，以降解所述樣品中的DNA。本發(fā)明的用于合成cDNA的方法和試劑盒可廣泛地用于基因工程領(lǐng)域。
文檔編號C12Q1/68GKCN102884186SQ201180024002
公開日2013年1月16日 申請日期2011年5月9日
發(fā)明者中林祐子, 上森隆司, 向井博之, 淺田起代藏 申請人:寶生物工程株式會社導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan