專利名稱:富集精細(xì)胞群的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及富集精細(xì)胞群。具體而言，本發(fā)明一般涉及不物理分選細(xì)胞而對活精細(xì)胞群的富集。
發(fā)明背景
通過人工授精(Al)使動(dòng)物受精以及體外受精后的胚胎移植已經(jīng)是ー項(xiàng)成熟的操作。在家畜產(chǎn)業(yè)中，能夠?qū)Ψ敝辰Y(jié)果施加影響而使其后代具有ー種或多種期望特征有明顯的優(yōu)勢。例如，乳制品產(chǎn)業(yè)中如能預(yù)先選擇后代有利于雌性以保證奶牛的產(chǎn)量，則會(huì)帶來經(jīng)濟(jì)效益。將精子分離為富集的帶有X和Y染色體的細(xì)胞群，即稱作的性別富集精子或性別富集精液，便是實(shí)現(xiàn)預(yù)選后代的方法之一。
Johnson等人(美國專利號(hào)5，135，759)描述了使用流式細(xì)胞儀/細(xì)胞分選儀根據(jù)DNA內(nèi)容物將帶有完整X和Y染色體的精子群分離為帶有X和Y染色體精子富集的細(xì)胞群。如所述，將精子與DNA選擇性標(biāo)記物在30°C到39°C的溫度下混合I小時(shí)(39°C )到I. 5小時(shí)(30°C)。接著使用流式細(xì)胞儀測量當(dāng)精子通過激光束時(shí)發(fā)出的熒光量。由于帶有X染色體的精子比帶有Y染色體的精子含有更多的DNA(由物種決定約為3<%到5%)，帶有乂染色體的精子比帶有Y染色體的精子產(chǎn)生更大的熒光光強(qiáng)。使含有預(yù)定熒光強(qiáng)度的單個(gè)精子的液滴帶上電荷并使其靜電偏離至收集容器中。接著將收集的性別富集的精子群用于顯微注射或人工授精。顯然，這一方法需要物理分選精細(xì)胞以獲得性別富集的精子群。根據(jù)JOhnson的物理分選是費(fèi)時(shí)且高成本的。
發(fā)明概沭
本發(fā)明的多方面之一是關(guān)于一種特征富集的精子分散體(有時(shí)稱為懸浮液)的制備方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，例如，將本發(fā)明的方法用于制備關(guān)于X或Y染色體精子富集的精子分散體。
簡言之，因此，本發(fā)明涉及選擇性降低精細(xì)胞分散體中精細(xì)胞的亞群使卵受精的能力。該方法包括在液體中形成標(biāo)記的精細(xì)胞的分散體，所述液體包含誘導(dǎo)精子不運(yùn)動(dòng)性的化學(xué)劑或具有誘導(dǎo)精子不運(yùn)動(dòng)性的溫度，其中與精細(xì)胞結(jié)合的標(biāo)記的存在、缺少或數(shù)量指示分散體中精細(xì)胞亞群的遺傳、蛋白質(zhì)組學(xué)、結(jié)構(gòu)或功能特征。該方法還包括光學(xué)檢測分散體以鑒定作為亞群成員的個(gè)體精細(xì)胞；確定分散體中亞群成員的位置；和向分散體內(nèi)不同位置遞送能量劑量以選擇性降低亞群成員使卵受精的能力而不類似地影響在分散體中其它位置的精細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及使用富集的精細(xì)胞群授精雌性哺乳動(dòng)物的方法。該方法包括在液體中形成標(biāo)記的精細(xì)胞的分散體，所述液體包含誘導(dǎo)精子不運(yùn)動(dòng)性的化學(xué)劑或具有誘導(dǎo)精子 不運(yùn)動(dòng)性的溫度，其中與精細(xì)胞結(jié)合的標(biāo)記的存在、缺少或數(shù)量指示分散體中精細(xì)胞亞群的遺傳、蛋白質(zhì)組學(xué)、結(jié)構(gòu)或功能的特征。該方法還包括光學(xué)檢測分散體以鑒定作為亞群成員的個(gè)體精細(xì)胞；確定分散體中亞群成員的位置；向分散體內(nèi)不同位置遞送一定的能量以選擇性降低亞群成員使卵受精的能力而不類似地影響在分散體中其它位置的精細(xì)胞；和其后使用該分散體或其衍生物授精雌性哺乳動(dòng)物。
本發(fā)明還涉及體外受精的方法。該方法包括在液體中形成標(biāo)記的精細(xì)胞的分散體，所述液體包含誘導(dǎo)精子不運(yùn)動(dòng)性的化學(xué)劑或具有誘導(dǎo)精子不運(yùn)動(dòng)性的溫度，其中與精細(xì)胞結(jié)合的標(biāo)記的存在、缺少或數(shù)量指示分散體中精細(xì)胞亞群的遺傳、蛋白質(zhì)組學(xué)、結(jié)構(gòu)或功能的特征。該方法還包括光學(xué)檢測分散體以鑒定作為亞群成員的個(gè)體精細(xì)胞；確定分散體中亞群成員的位置、向分散體內(nèi)不同位置遞送能量劑量以選擇性降低亞群成員使卵受精的能力而類似地影響在分散體中其它位置的精細(xì)胞；和其后使用所述分散體或其衍生物使卵體外受精?？梢栽谄浜髮⑹芫褜?dǎo)入雌性哺乳動(dòng)物的子宮。
本發(fā)明還涉及形成冷凍的精子分散體的方法。該方法包括在液體中形成標(biāo)記的精細(xì)胞分散體，所述液體包含誘導(dǎo)精子不運(yùn)動(dòng)性的化學(xué)劑或具有誘導(dǎo)精子不運(yùn)動(dòng)性的溫度，其中與精細(xì)胞結(jié)合的標(biāo)記的存在、缺少或數(shù)量指示分散體中精細(xì)胞亞群的遺傳、蛋白質(zhì)組學(xué)、結(jié)構(gòu)或功能的特征。該方法還包括光學(xué)檢測分散體以鑒定作為亞群成員的個(gè)體精細(xì)胞；確定分散體中亞群成員的位置；向分散體內(nèi)不同位置遞送能量劑量以選擇性降低亞群成員使卵受精的能力而不類似地影響在分散體中其它位置的精細(xì)胞；和其后冷凍保藏該分散體。
本發(fā)明的其它方面和特征部分是顯而易見的，部分將于下文說明。
發(fā)明詳述
有利的是，不使用物理分選細(xì)胞可以關(guān)于根據(jù)本發(fā)明的一種特征富集活的精細(xì)胞群。這ー特征可以是，例如，精細(xì)胞帶有X還是Y染色體。備選地，該特征可以是另ー遺傳特征，例如單核苷酸多態(tài)性(“SNP”)的存在，所述多態(tài)性編碼提高的動(dòng)物生育力(例如，提高的奶產(chǎn)量)，或編碼改善所選細(xì)胞的冷藏的脂質(zhì)。該特征還可以是蛋白質(zhì)組特征，例如提高精子性能的蛋白質(zhì)，例如將會(huì)通過改善有益的頂體特征而提高在子宮內(nèi)的性能的蛋白質(zhì)。該特征還可以是結(jié)構(gòu)特征(例如頂體完整性)，或功能特征(例如前向運(yùn)動(dòng)性)。
可以關(guān)于遺傳、蛋白質(zhì)組、結(jié)構(gòu)或功能特征實(shí)現(xiàn)精細(xì)胞群的富集，其通過，例如標(biāo)記群體中具有(或，備選地，缺少)該特征的精細(xì)胞，使精細(xì)胞基本不動(dòng)和選擇性地向不動(dòng)的精細(xì)胞施加一定能量以降低所施用的細(xì)胞的存活力或至少降低所施用的細(xì)胞在體外或體內(nèi)使卵受精的能力(即，授精之后)。因?yàn)榉稚Ⅲw(有時(shí)稱為懸浮液)中的精細(xì)胞基本不運(yùn)動(dòng)并且被選擇性標(biāo)記，所以可以將能量束傳遞到分散體中的特定位置來向個(gè)體精細(xì)胞施用；通過重復(fù)這一方法步驟，即個(gè)別地向分散體中不同位置上不運(yùn)動(dòng)的精細(xì)胞施用，可以有效富集分散體中具有期望特征的精細(xì)胞亞群，例如就具有所期望特征的亞群細(xì)胞的百分比而論；就由于用精細(xì)胞受精而產(chǎn)生的具有某種遺傳或蛋白質(zhì)組特征的子代的百分?jǐn)?shù)而論或就這兩者而論有效富集。在任意事件中，可以不用物理分離具有期望特征的細(xì)胞與缺少期望特征的細(xì)胞(即，不用分離施用的細(xì)胞和未施用的細(xì)胞)而富集精細(xì)胞群的特定亞群。任選地，可以根據(jù)下述方法通過物理分離施用的和未施用的細(xì)胞成分開的亞群，另外地純化所述細(xì)胞以獲得細(xì)胞的進(jìn)ー步富集。
精細(xì)胞分散體[0018]精細(xì)胞密度
一般而言，可以用寬范圍精細(xì)胞密度制備具有可以以某種特征富集的群體的精細(xì)胞分散體。然而，通常精細(xì)胞密度在至少約I X IO3個(gè)精子/ml，并且通常不超過約5X IOltl個(gè)精子/ml，且更優(yōu)選地不超過約5X IO8個(gè)精子/ml分散體。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，分散體中可含有“相對低”密度的精子，即精子密度少于約IX IO7個(gè)精子/ml，優(yōu)選少于約IX IO6個(gè)精子/ml，更優(yōu)選約I X IO3至約5 X IO6個(gè)精子/ml，還更優(yōu)選約I X IO3至約I X IO6個(gè)精子/ml，甚至更優(yōu)選約I X IO4至約I X IO5個(gè)精子/m l，和最優(yōu)選約I X IO5個(gè)精子/ml分散體。在備選的實(shí)施方案中，分散體中可含有“中間”密度的精子，即密度為約I X IO7至約I X IO8個(gè)精子/ml分散體。在再一個(gè)實(shí)施方案中，分散體中可含有“相對高”密度的精子，即精子密度至少為約I X IO8個(gè)精子/ml，優(yōu)選約I X IO8至約5 X 101°個(gè)精子/ml，更優(yōu)選約I. 5 X IO8至約2 X 101°個(gè)精子/ml，甚至更優(yōu)選約I. 5 X IO8至約2 X IO8個(gè)精子/ml，還更優(yōu)選約I. 5 X IO8個(gè)精子/ml分散體。因此，例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，分散體中可含有至少約O. 04X 106、在另ー個(gè)實(shí)施方案中至少約I X 106、在另ー個(gè)實(shí)施方案中至少約I. 5X 106、在另ー個(gè)實(shí)施方案中至少約2X 106、在另ー個(gè)實(shí)施方案中至少約3 X 106、在另ー個(gè)實(shí)施方案中至少約O. 5X107、在另ー個(gè)實(shí)施方案中至少約IX 107、在另ー個(gè)實(shí)施方案中至少約I. 25X 107、在另ー個(gè)實(shí)施方案中至少約2X107、在另ー個(gè)實(shí)施方案中至少約3X107、在另ー個(gè)實(shí)施方案中至少約4X 107、在另ー個(gè)實(shí)施方案中至少約5X 107、在另ー個(gè)實(shí)施方案中至少約6X 107、在另ー個(gè)實(shí)施方案中至少約7. OX 107、在另ー個(gè)實(shí)施方案中至少約8X 107、在另ー個(gè)實(shí)施方案中至少約9X107、在另ー個(gè)實(shí)施方案中至少約IOX 107、在另ー個(gè)實(shí)施方案中至少約11X107、在另ー個(gè)實(shí)施方案中至少約12X107、在另ー個(gè)實(shí)施方案中至少約I. OX 108、在另ー個(gè)實(shí)施方案中至少約I. 25X 108、在另ー個(gè)實(shí)施方案中至少約I. 5X 108、在另ー個(gè)實(shí)施方案中至少約I. 75X 108、在另ー個(gè)實(shí)施方案中至少約2. OX 108、在另ー個(gè)實(shí)施方案中至少約2. 25X IO8,在另ー個(gè)實(shí)施方案中至少約2. 5X 108、在另ー個(gè)實(shí)施方案中至少約2. 75X 108、在另ー個(gè)實(shí)施方案中至少約3X108、在另ー個(gè)實(shí)施方案中至少約5X108、在另ー個(gè)實(shí)施方案中至少約
7.OX 108、或甚至至少約8 X IO8個(gè)精子/ml分散體。在備選的實(shí)施方案中，分散體可以含有少于約9/105、少于約7/105、少于約5/105、少于約2/105、少于約1/105、少于約1父104，或甚至少于約I X IO3個(gè)精子/ml分散體。
精子的密度可以基于許多因素改變，所述因素包括，例如哺乳動(dòng)物不同物種之間的差異、哺乳動(dòng)物單個(gè)物種之中的差異和甚至在單個(gè)哺乳動(dòng)物不同的，(一次射出的)精液中的差異。例如，牛精子可以高密度，但通常較小的體積存在于分散體中，例如在約O. 5ml到約25ml的體積中O. 5X IO6個(gè)精子/ml到約8X IO7個(gè)精子/ml。然而，豬精子可以較低密度，但通常較大的體積存在于分散體中，例如在約50ml到約250ml的體積中O. 04X IO6個(gè)精子/ml到約I X IO7個(gè)精子/ml。
精子分散體中的精子密度還取決于精細(xì)胞隨后被富集或分選的方法。例如，可以如在美國專利申請公開號(hào)US 2005/0112541(其內(nèi)容在此被完整引入作為參考)所述使用流式細(xì)胞儀分選精細(xì)胞。在這類情況下，分散體可以通常為“中間”或“相對高”密度的精子。使用標(biāo)記物(例如本文所述的染料和標(biāo)記物)標(biāo)記的較低密度的精子，如相對低”密度的精子可適用于如下文更詳細(xì)描述的其它的分選或富集技木。
還可以人工地操作精子分散體中的精子密度以獲得特定精子密度的分散體。精子分散體中(例如包含在授精吸管中的)精子密度的操作可以基于如下因素，如分散體可儲(chǔ)存的溫度、儲(chǔ)存時(shí)間長度、精子在精子分散體中是分選的或未分選的、從其收集精子的雄性哺乳動(dòng)物的物種、從其收集精子的哺乳動(dòng)物的生育力以及將被授精的雌性哺乳動(dòng)物的物種。[0023]還可以通過簡單地濃縮精子(例如通過離心)影響精子分散體中精子的密度。在這類情況下，所述分散體將被基本分成(通常稱為)沉淀(含有少量液體的細(xì)胞團(tuán))和上清液(可溶的液體級分)。接著可以不破壞沉淀地倒掉上清液，由此產(chǎn)生含有少量抑制劑的精細(xì)胞相對致密的沉淀，該作用減少分散體體積而不改變分散體的組分。結(jié)果，沉淀的精細(xì)胞保持在不運(yùn)動(dòng)狀態(tài)。
精細(xì)胞的不運(yùn)動(dòng)性
精細(xì)胞分散體含有相當(dāng)大程度上減少運(yùn)動(dòng)性的精細(xì)胞。精細(xì)胞分散體中精細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性的相當(dāng)大程度上的減少可通過多種方式獲得，其包括例如，通過將精細(xì)胞與運(yùn)動(dòng)性抑制劑接觸、通過降低精細(xì)胞或精細(xì)胞周圍緊鄰環(huán)境(即精子分散體)的溫度、或通過兩者的組合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的精子分散體中精細(xì)胞在某些方面表現(xiàn)出附睪精子特征性方式的行為，例如，群體中的精細(xì)胞基本不運(yùn)動(dòng)，和/或相對于洗滌或剛射出的精子而言，其內(nèi)源呼吸速率更低。有利地，不運(yùn)動(dòng)的精細(xì)胞(有時(shí)稱為靜止精細(xì)胞)在從抑制劑分離或暴露于升高的溫度中時(shí)，其運(yùn)動(dòng)性能夠表現(xiàn)出射出的精子的特征性行為，而在ー個(gè)實(shí)施方案中，其運(yùn)動(dòng)性和呼吸都可表現(xiàn)出射出精子的特征性行為。
在一個(gè)實(shí)施方案中，例如，通過HTM-IVOS精子分析(Hamilton-Thorne HTM-IVOS計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)，Hamilton-Thorne Research,Beverly MA)測量,抑制劑、溫度的降低或兩者的組合可使分散體中精細(xì)胞的路徑速度(有時(shí)稱為運(yùn)動(dòng)性或路徑運(yùn)動(dòng)性)、前向速度(有時(shí)稱為前向運(yùn)動(dòng)性)或兩者同時(shí)相對于相同物種剛射出精液中精細(xì)胞的路徑速度、前向速度或兩者同時(shí)，降低至少約50%。優(yōu)選通過HTM-IVOS精子分析測量，運(yùn)動(dòng)抑制齊U、溫度的降低或兩者的組合可使分散體中精細(xì)胞的路徑速度、前向速度或兩者同時(shí)相對于相同物種剛射出精液中精細(xì)胞的路徑速度、前向速度或兩者同時(shí)，降低至少約60%。更優(yōu)選通過HTM-IVOS精子分析測量，運(yùn)動(dòng)抑制劑、溫度的降低或兩者的組合可使分散體中精細(xì)胞的路徑速度、前向速度或兩者同時(shí)相對于相同物種剛射出精液中精細(xì)胞的路徑速度、前向速度或兩者同時(shí)，降低至少約70%。還更優(yōu)選通過HTM-IVOS精子分析測量，運(yùn)動(dòng)抑制齊U、溫度的降低或兩者的組合可使分散體中精細(xì)胞的路徑速度、前向速度或兩者同時(shí)相對于相同物種剛射出精液中精細(xì)胞的路徑速度、前向速度或兩者同時(shí)，降低至少約80%。甚至更優(yōu)選通過HTM-IVOS精子分析測量，運(yùn)動(dòng)抑制劑、溫度的降低或兩者的組合可使分散體中精細(xì)胞的路徑速度、前向速度或兩者同時(shí)相對于相同物種剛射出精液中精細(xì)胞的路徑速度、前向速度或兩者同時(shí)，降低至少約90%。甚至更優(yōu)選通過HTM-IVOS精子分析測量，運(yùn)動(dòng)抑制劑、溫度的降低或兩者的組合可使分散體中精細(xì)胞的路徑速度、前向速度或兩者同時(shí)相對于相同物種剛射出精液中精細(xì)胞的路徑速度、前向速度或兩者同時(shí)，降低至少約95%。最優(yōu)選通過HTM-IVOS精子分析測量，運(yùn)動(dòng)抑制劑可使分散體中精細(xì)胞的路徑速度、前向速度或兩者同時(shí)相對于相同物種剛射出精液中精細(xì)胞的路徑速度、前向速度或兩者同時(shí)，降低至少約99%。
可以使用運(yùn)動(dòng)抑制劑在相當(dāng)大程度上降低精細(xì)胞分散體中精細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性。抑制劑可以為對精子運(yùn)動(dòng)性具有抑制作用的一系列組合物中的任意ー種。此類組合物包括如鈉通道抑制劑，如毒毛花苷G ;包含鉀離子的組合物；以及包含鉀離子和鈉離子的組合物。例如，分散體中相對高濃度的鉀離子會(huì)抑制精子運(yùn)動(dòng)性。因此一般而言，優(yōu)選分散體包含鉀離子源且分散體中的鉀濃度為至少約O. 05mol/Lo更優(yōu)選鉀離子濃度為至少約O. 05mol/L至約O. 5mol/Lo還更優(yōu)選鉀離子濃度為至少約O. lmol/L至約O. 3mol/L。最優(yōu)選鉀離子濃度為約O. 173mol/L。此類分散體通常(但非必須)也包含鈉離子源。當(dāng)存在鈉時(shí)，鉀和鈉的摩爾比一般分別等于或大于I : 1，但摩爾比一般不超過8 I。優(yōu)選鉀和鈉的摩爾比為至少約I. 25 I。還更優(yōu)選鉀和鈉的摩爾比為至少約1.5 I。還更優(yōu)選鉀和鈉的摩爾比為 至少約I. 75 I。還更優(yōu)選鉀和鈉的摩爾比為至少約I. 78 I。在ー個(gè)具體實(shí)施方案中，鉀和鈉的摩爾比為至少約2 I。而在另一實(shí)施方案中，鉀和鈉的摩爾比為至少約3 I。在另ー實(shí)施方案中，鉀和鈉的摩爾比為至少約4 I。在另ー實(shí)施方案中，鉀和鈉的摩爾比為至少約5 I。在另ー實(shí)施方案中，鉀和鈉的摩爾比為至少約6 I。在另ー實(shí)施方案中，鉀和鈉的摩爾比為至少約7 I。在另ー實(shí)施方案中，鉀和鈉的摩爾比為至少約8 I。
精子分散體中還可另外含有能夠促進(jìn)運(yùn)動(dòng)性下調(diào)的離子或ニ氧化碳源。在該實(shí)施方案中，ニ氧化碳的來源可以為，例如ー種或多種碳酸鹽。在目前優(yōu)選的一個(gè)實(shí)施方案中，精子分散體含有NaHCO3和KHC03(由此提供鉀和鈉離子源)以及增加的ニ氧化碳分壓(相對于周圍大氣)。例如，在目前優(yōu)選的一個(gè)實(shí)施方案中，精子分散體含有NaHCO3和KHCO3的水溶液，優(yōu)選NaHC03、KHCO3和C6H8O7 · H2O的水溶液；ー般而言，分散體系中KHCO3的濃度可為至少約O. 05mol/Lo更優(yōu)選KHCO3的濃度為至少約O. 05mol/L至約O. 5mol/し還更優(yōu)選KHCO3的濃度為至少約O. lmol/L至約O. 3mol/L。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，如 Salisbury&Graves, J. Reprod. Fertil.，6 :351-359 (1963)中公開的那樣，使用含O. 097mol/L NaHCO3^O. 173mol/L KHC03、0. 090mol/L C6H8O7 · H2O 的水溶液的運(yùn)動(dòng)抑制劑形成分散體。只要精細(xì)胞暴露于運(yùn)動(dòng)抑制劑，它們一般都會(huì)保持靜止。
當(dāng)分散體中含有C6H8O7 ·Η20時(shí)，KHCO3與NaHCO3間的摩爾比可如上所述。KHCO3與C6H8O7A2O間的摩爾比一般分別等于或大于I : 1，但一般不會(huì)超過摩爾比8 I。優(yōu)選KHCO3與C6H8O7 -H2O間的摩爾比為至少約I. 25 I。還更優(yōu)選KHCO3與C6H8O7 -H2O間的摩爾比為至少約I. 5 I。還更優(yōu)選KHCO3與C6H8O7W2O間的摩爾比為至少約I. 75 I。在ー個(gè)具體實(shí)施方案中，KHCO3與C6H8O7^H2O間的摩爾比為至少約1.78 I。在另一具體實(shí)施方案中，KHCO3與C6H8O7 -H2O間的摩爾比為至少約2:1。在再一實(shí)施方案中，KHCO3與C6H8O7 -H2O間的摩爾比為至少約3 I。又在另ー實(shí)施方案中，KHCO3與C6H8O7^H2O間的摩爾比為至少約4 I。又在另ー實(shí)施方案中，KHCO3與C6H8O7 ·Η20_的摩爾比為至少約5 I。又在另ー實(shí)施方案中，KHCO3與C6H8O7^H2O間的摩爾比為至少約6 I。又在另ー實(shí)施方案中，KHCO3與C6H8O7 -H2O間的摩爾比為至少約7:1。又在另ー實(shí)施方案中，KHCO3與C6H8O7 -H2O間的摩爾比為至少約8 : I。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，如Salisbury&Graves, J. Reprod. Fertil. ,6 351-359(1963)中所公開的那樣，使用含O. 097mol/L NaHC03>0. 173mol/L KHCO3、(λ 09OmoI/L C6H8O7 · H2O的水溶液的抑制性緩沖液形成分散體。只要精細(xì)胞暴露于運(yùn)動(dòng)抑制劑，它們一般都會(huì)保持靜止。
迄今為止的實(shí)驗(yàn)證據(jù)還提示，如果將精細(xì)胞分散體保存在降低或防止氧氣向該分散體擴(kuò)散的大氣中，可以改善精細(xì)胞的整體健康和其他重要特征。通過用如ニ氧化碳、氮?dú)饣蚱渌栊詺怏w分壓比周圍空氣增高的氣體來代替精子分散體上方的大氣，可以達(dá)到這一目的。在具體的實(shí)施方案中，分散體維持在具有比周圍空氣高的ニ氧化碳分壓的大氣下。在優(yōu)選實(shí)施方案中，分散體上方空氣的ニ氧化碳分壓為至少約O. OOOlatm,但一般小于約5atm大氣壓。在一個(gè)實(shí)施方案中，ニ氧化碳分壓為約O. 5atm至約2atm大氣壓；在另ー實(shí)施方案中，ニ氧化碳分壓為約O. 9atm至約2atm大氣壓；在另ー實(shí)施方案中，ニ氧化碳分壓為約O. 95atm至約2atm大氣壓。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，分散體上方大氣的ニ氧化碳分壓為至少O. 9atm ;更優(yōu)選至少約O. 95atm。
除使用運(yùn)動(dòng)抑制劑之外或可替代之的是，可以改變精細(xì)胞或分散體的溫度以引起精細(xì)胞變得不運(yùn)動(dòng)。誘導(dǎo)精子不運(yùn)動(dòng)性的溫度可以被誘導(dǎo)，例如通過降低精細(xì)胞或分散體的溫度到約0°C至約15°C，優(yōu)選從約TC至約10°C ;更優(yōu)選從約2°C至約8V ;還更優(yōu)選從約3°C至約6V ;甚至更優(yōu)選為約4°C至約5°C ;更優(yōu)選約5°C。然而，優(yōu)選不將精細(xì)胞暴露于會(huì)對細(xì)胞存活力造成實(shí)質(zhì)不良影響或顯著影響精細(xì)胞結(jié)合或攝取標(biāo)記物能力的溫度下。
在另ー實(shí)施方案中，可以改變精細(xì)胞或精子分散體的溫度使其介于約4°C至約50°C范圍內(nèi)；優(yōu)選從約7°C至約43°C ;更優(yōu)選從約10°C至約39°C ;還更優(yōu)選從約15°C至約300C ;且最優(yōu)選從約17°C至約25°C的溫度。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，精細(xì)胞或其周圍分散體的溫度為約4°C。
在任何時(shí)間一旦從源哺乳動(dòng)物獲得精細(xì)胞，可以將其暴露于降低的溫度從而使其基本不運(yùn)動(dòng)。例如，可以在從源哺乳動(dòng)物收集細(xì)胞時(shí)、在將細(xì)胞與緩沖液混合時(shí)、在形成標(biāo)記混合物時(shí)(包括標(biāo)記過程之前、期間或之后)、或在形成標(biāo)記細(xì)胞的分散體時(shí)降低精細(xì)胞的溫度，由此引起精子不運(yùn)動(dòng)性。然而，通常在先于分散體的光學(xué)檢測之前通過降低溫度誘導(dǎo)精子不運(yùn)動(dòng)性。
例如，可以在標(biāo)記細(xì)胞之后降低精細(xì)胞溫度(即，誘導(dǎo)精子不運(yùn)動(dòng)性)，從而允許在下文討論的更優(yōu)選的溫度下進(jìn)行標(biāo)記。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以在標(biāo)記后和在光學(xué)檢測細(xì)胞之前降低精細(xì)胞或周圍分散體的溫度。
將精細(xì)胞暴露于抑制劑、降低的溫度或兩者的組合誘導(dǎo)精細(xì)胞不運(yùn)動(dòng)。在ー個(gè)實(shí)施方案中，例如，運(yùn)動(dòng)抑制劑、溫度的降低或兩者的組合可使分散體中精細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性、前向運(yùn)動(dòng)性或兩者同時(shí)相對于相同物種剛射出精液中精細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性、前向運(yùn)動(dòng)性或兩者同吋，降低至少60%。優(yōu)選地，運(yùn)動(dòng)抑制劑、溫度的降低或兩者的組合可使分散體中精細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性、前向運(yùn)動(dòng)性或兩者同時(shí)相對于相同物種剛射出精液中精細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性、前向運(yùn)動(dòng)性或兩者同時(shí)，降低至少70%。更優(yōu)選地，運(yùn)動(dòng)抑制劑、溫度的降低或兩者的組合可使分散體中精細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性、前向運(yùn)動(dòng)性或兩者同時(shí)相對于相同物種剛射出精液中精細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性、前向運(yùn)動(dòng)性或兩者同時(shí)，降低至少80%。優(yōu)選地，運(yùn)動(dòng)抑制劑、溫度的降低或兩者的組合可使分散體中精細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性、前向運(yùn)動(dòng)性或兩者同時(shí)相對于相同物種剛射出精液中精細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性、前向運(yùn)動(dòng)性或兩者同時(shí)，降低至少90%。優(yōu)選地，運(yùn)動(dòng)抑制劑、溫度的降低或兩者的組合可使分散體中精細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性、前向運(yùn)動(dòng)性或兩者同時(shí)相對于相同物種剛射出精液中精細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性、前向運(yùn)動(dòng)性或兩者同吋，降低至少99%。
無論所使用的方法，優(yōu)選使細(xì)胞不運(yùn)動(dòng)，從而允許充分的時(shí)間進(jìn)行分散體的光學(xué)檢測、確定亞群成員細(xì)胞的位置和將能量源施用于亞群的成員細(xì)胞。如果期望物理地分離被施用的細(xì)胞與未施用的細(xì)胞，還可以優(yōu)選在這ー過程步驟中維持精細(xì)胞在不運(yùn)動(dòng)狀態(tài)。同樣地，如果要冷藏精細(xì)胞，可以在冷藏步驟中使其維持在不運(yùn)動(dòng)狀態(tài)(無論在冷藏之前施用的細(xì)胞是否與未施用的細(xì)胞分離)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，冷藏步驟過程始終保持細(xì)胞不運(yùn)動(dòng)。
可以通過將細(xì)胞與運(yùn)動(dòng)性抑制劑分離，將其暴露于空氣，升高細(xì)胞或細(xì)胞分散體的溫度(優(yōu)選至剛射出精液的典型溫度)，通過使用生理鹽水(Salisbury等人，1963)或諸如TCA緩沖液或PBS的緩沖液稀釋，或通過以上任意的組合(其取決于誘導(dǎo)不運(yùn)動(dòng)性所用的方法)將不運(yùn)動(dòng)細(xì)胞恢復(fù)到活性狀態(tài)(即剛射出精液的行為特征)。 一般而言，根據(jù)HTM-IVOS精子分析測量，至少約20%、優(yōu)選至少約50%、更優(yōu)選至少約60%、還更優(yōu)選至少約70%、甚至更優(yōu)選至少約80%、甚至更優(yōu)選至少約90%、還更優(yōu)選至少約95%、最優(yōu)選至少約99%恢復(fù)活性狀態(tài)的細(xì)胞(即再活化細(xì)胞)具有這樣的路徑速度、前向性速度或兩者同時(shí)即其為與運(yùn)動(dòng)性抑制劑混合前的精細(xì)胞(即剛射出的精細(xì)胞)的路徑速度、前向性速度或兩者同時(shí)的至少約50%,優(yōu)選至少約60%,更優(yōu)選至少約70%,還更優(yōu)選至少約80%,甚至更優(yōu)選至少約90 %,甚至更優(yōu)選至少約95 %,最優(yōu)選至少約99 %。
從哺乳動(dòng)物收集細(xì)胞
已知多種收集活精子的方法。這類方法包括，例如，手握法、使用人エ陰道以及電刺激射精。
在收集時(shí)，或在其后，可以將收集的精液與適合精子的許多不同緩沖液中的任意一種混合，所述緩沖液為，諸如TCA、HEPES、PBS或在美國專利申請公布號(hào)US2005/0003472(其內(nèi)容在此處被完整地引入作為參考)中公開的任何其它的緩沖液。例如，可以將通常每毫升含有約5億至約100億精細(xì)胞的牛精液樣品直接從源哺乳動(dòng)物收集至含有緩沖液的容器中以形成精子懸浮液。備選地，可以將精液樣品收集至空的容器并隨即在收集后的數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)之內(nèi)使之與緩沖液接觸以形成精子懸浮液。
備選地，可以收集精細(xì)胞并且使之與代替緩沖液或緩沖液之外的運(yùn)動(dòng)抑制劑接觸，從而形成精子分散體?？梢詫⒕?xì)胞直接從動(dòng)物收集至含有運(yùn)動(dòng)抑制劑的容器中以形成精子分散體，或備選地，將其收集至空容器中井隨即在收集的數(shù)分鐘(或甚至數(shù)小吋)之內(nèi)使之與運(yùn)動(dòng)抑制劑接觸以形成精子分散體。
精子分散體還可以含有一系列其它添加劑以提高精子存活力。例示性的添加劑包括蛋白質(zhì)源、抗生素、生長因子以及調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)和/或細(xì)胞外氧化/還原反應(yīng)的組合物。這些添加劑的各種實(shí)例是本領(lǐng)域眾所周知的，如在，例如美國申請系列號(hào)60/557，407和11/092,313的公開(其各自內(nèi)容在這里被引入作為參考)中所證明。
細(xì)胞的標(biāo)記
可以使用多種不同標(biāo)記物的任意一種標(biāo)記精細(xì)胞，所述標(biāo)記物包括結(jié)合至細(xì)胞外部的標(biāo)記物(例如熒光標(biāo)記的抗體)以及跨細(xì)胞膜并結(jié)合至細(xì)胞內(nèi)容物的標(biāo)記物(例如，熒光DNA選擇性染料)。一般而言，標(biāo)記方法包括在允許快速和有效結(jié)合或攝取標(biāo)記物的溫度或PH下，將精細(xì)胞與一定濃度的標(biāo)記物接觸(從而形成標(biāo)記混合物，有時(shí)稱為染色混合物)，使時(shí)間足夠長以獲得期望的標(biāo)記程度而不實(shí)質(zhì)影響細(xì)胞的生存力。
精子可以是純精液形式，或備選地，含有精子的精液衍生物(其通過離心或使用其它方法分離精液為級分而獲得)。接著將精細(xì)胞與標(biāo)記物接觸或另外混合以形成標(biāo)記混合物；任選地，該標(biāo)記物可以是固體或溶液的形式。然而，一般而言，標(biāo)記物、精細(xì)胞或兩者同時(shí)是在介質(zhì)，例如緩沖液中。
在一個(gè)實(shí)施方案中，將精細(xì)胞與緩沖液混合以形成精子懸浮液。可以使用適合精子的許多不同緩沖液的任何ー種，諸如TCA、HEPES, PBS或在美國專利申請公布號(hào)US2005/0003472中公開的緩沖液。一旦形成精子懸浮液，可將其與標(biāo)記物源混合以形成標(biāo)記混合物；任選地，所述標(biāo)記物可以是固體或液體的形式并且，作為進(jìn)ー步選擇，可以另外地包含任ー種上述緩沖液。
在另ー實(shí)施方案中，標(biāo)記物可與緩沖液相混合形成標(biāo)記懸浮液并且該標(biāo)記懸浮液與精子源混合形成標(biāo)記混合物，所述精子源是純精液、含有精子的精液衍生物或精子懸浮液的形式。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用含有運(yùn)動(dòng)性抑制劑的緩沖液形成標(biāo)記混合物。例如，運(yùn)動(dòng)性抑制劑可以包含在用于形成精子懸浮液(其接著與標(biāo)記物混合)或標(biāo)記懸浮液(其接著與精子源混合)的緩沖液中以形成標(biāo)記混合物。在任一事件中，產(chǎn)生含有運(yùn)動(dòng)性抑制劑和標(biāo)記物的精子分散體。
可以通過使用多種標(biāo)記物的任何ー種，如以前在美國專利號(hào)5，135，759和WO02/41906中所述(均在此處引用作為參考)，一種或多種可經(jīng)UV或可見光激發(fā)的DNA選擇性染料形成標(biāo)記混合物。例示性的UV光激發(fā)的DNA選擇性染料包括Hoechst 33342和Hoechst 33258, 二者均可從Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)商購。例示性的可見光激發(fā)的染料包括可從 Molecular Probe, Inc. (Eugene, OR)商購的 SYBR-14,以及 WO 02/41906中所述的雙苯甲亞胺-BODIPY 綴合物6- {[3- ((2Z) -2- {[I- ( ニ氟硼烷基)-3，
5-ニ甲基-IH-吡咯-2-基]亞甲基}-2H-吡咯-5-基)丙酰基]氨基}-N-[3-(甲基{3-[({4-[6-(4-甲基哌嗪-I-基)-1H，3’ H_2，5，-雙苯并咪唑_2’ -基]苯氧基}こ?；?氨基]丙基}氨基)丙基]己酰胺(“BBC”)。這些染料中的每ー種都可以單獨(dú)使用或者組合使用；備選地，也可以單獨(dú)使用其它細(xì)胞通透性的UV和可見光激發(fā)的染料或?qū)⑵渑c前述染料組合使用，只要所述染料在可進(jìn)行別處所述分選的濃度下使用時(shí)不會(huì)對精細(xì)胞的存活力產(chǎn)生不良影響至不可接受的程度。
備選地，可使用熒光聚酰胺形成標(biāo)記混合物，更具體地綴合有熒光標(biāo)記物或報(bào)道分子的聚酰胺。此類標(biāo)記物在結(jié)合于核酸時(shí)會(huì)發(fā)出熒光。連接有熒光標(biāo)記物或報(bào)道分子的聚酰胺的實(shí)例包括，如Best等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，100 (21)12063-12068(2003) ;Gygi 等人，Nucleic Acids Res. ,30(13) :2790-2799(2002);美國專利號(hào)5，998，140 ;美國專利號(hào)6，143,901以及美國專利號(hào)6，090，947中公開的那些，其中每ー篇的內(nèi)容均在此處引入作為參考。
熒光核苷酸序列也可用于標(biāo)記精細(xì)胞。此類核苷酸序列在與含有靶序列或互補(bǔ)序列的核酸雜交時(shí)會(huì)發(fā)出突光，但在非雜交狀態(tài)時(shí)則不會(huì)發(fā)出突光。此類核苷酸公開見于如美國專利申請公開號(hào)2003/0113765(此處引入作為參考)。
性別特異性抗體也可用于標(biāo)記標(biāo)記混合物中的精細(xì)胞。例如，在該實(shí)施方案中，性別特異性抗體可綴合熒光部分(或等價(jià)報(bào)道分子)。由于抗體結(jié)合只存在于帶有X染色體 或，備選地，帶有Y染色體的細(xì)胞上的抗原，根據(jù)其熒光(相對于未標(biāo)記細(xì)胞的無熒光)能夠選擇性地鑒定此類細(xì)胞。此外，可以同時(shí)使用ー種以上的性別特異性抗體，每種抗體連接不同的熒光部分。從而能根據(jù)帶有X染色體或Y染色體的細(xì)胞間的不同熒光，對它們進(jìn)行區(qū)分。
也可使用發(fā)光的顏色選擇性納米晶體標(biāo)記標(biāo)記混合物中的精細(xì)胞。這些顆粒也稱為量子點(diǎn)，正如美國專利號(hào)6，322，901和美國專利號(hào)6，576，291所述為本領(lǐng)域所公知(均在此處引用作為參考)。這些納米晶體已被綴合于多種生物材料，包括如肽、抗體、核酸、鏈霉親和素及多糖(見如美國專利號(hào)6，207，392,6, 423，551,5, 990，479和6，326，144，均在此處引用作為參考)，且已用于檢測生物學(xué)靶標(biāo)(見如美國專利號(hào)6，207，392和6，247，323，兩者均在此處引用作為參考)。
標(biāo)記混合物中標(biāo)記物的優(yōu)選濃度為一系列變量的函數(shù),所述變量包括，例如，標(biāo)記物是否結(jié)合于細(xì)胞外部或它是否必須跨細(xì)胞膜；細(xì)胞對于所選標(biāo)記物的透性(如果標(biāo)記物必須跨細(xì)胞膜)；標(biāo)記混合物的溫度；進(jìn)行標(biāo)記的時(shí)間量以及期望的選擇性程度。一般而言，優(yōu)選的標(biāo)記物濃度足以在適度短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到細(xì)胞的所期望的標(biāo)記程度，而不會(huì)對精子存活力產(chǎn)生實(shí)質(zhì)的不良影響。例如，Hoechst 33342, Hoechst 33258、SYBR-14或BBC在標(biāo)記混合物中的濃度一般在約O. I μ M至約I. OM之間，優(yōu)選為從約O. I μ M至約700 μ Μ，更優(yōu)選為約100 μ M至約200 μ Μ。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，Hoechst 33342,Hoechst 33258、SYBR-14或BBC在染色混合物中的濃度一般在約400 μ M至約500 μ Μ，最優(yōu)選為約450 μ Μ。因此，在一種標(biāo)記條件設(shè)置下，Hoechst 33342的濃度優(yōu)選為約100 μ Μ。在另ー種標(biāo)記條件設(shè)置下，Hoechst 33342的濃度為約150 μ Μ。又在另ー種標(biāo)記條件設(shè)置下，濃度優(yōu)選為約200 μ M0而在另一種標(biāo)記條件設(shè)置下，Hoechst33342的濃度最優(yōu)選為約450 μ Μ。
又例如，熒光聚酰胺的濃度(例如美國申請公開號(hào)2001/0002314中所述的那些)一般為約O. I μ M至約ImM之間，優(yōu)選從約I μ M至約ImM，更優(yōu)選約5 μ M至約100 μ Μ，甚至更優(yōu)選約 ο μ Μ。
標(biāo)記混合物一旦形成，可以在一系列溫度范圍中的任意溫度下保存；例如，使用Hoechst 33342或Hoechst 33258標(biāo)記通常在約4°C至約50°C范圍內(nèi)進(jìn)行。例如，可以將標(biāo)記混合物保存干“相對低”的溫度下，即溫度為約4°C至約30°C ;在該實(shí)施方案中，溫度優(yōu)選從約200C至約300C，更優(yōu)選從約25°C至約30°C，最優(yōu)選為約28°C。備選地，可將標(biāo)記混合物保存干“中間”溫度范圍內(nèi)，即溫度為約30°C至約39°C ;在該實(shí)施方案中，溫度優(yōu)選在約34°C至約39°C，更優(yōu)選為約37°C。此外，還可將標(biāo)記混合物保存于“相對高”的溫度范圍內(nèi)，即溫度為約40°C至約50°C;在該實(shí)施方案中，溫度優(yōu)選從約40°C至約45°C，更優(yōu)選從約40°C至約43°C，最優(yōu)選為約41°C。對于優(yōu)選溫度的選擇一般取決于一系列變量，包括如標(biāo)記物是否結(jié)合于細(xì)胞外部或它是否必須跨細(xì)胞膜、細(xì)胞對于所選標(biāo)記物的透性(如果標(biāo)記物必須跨細(xì)胞膜)、標(biāo)記混合物中標(biāo)記物的濃度、進(jìn)行標(biāo)記的時(shí)間量以及期望的選擇性程度。
標(biāo)記混合物的pH可以保持在任何的pH值范圍內(nèi)。例如，使用Hoechst33342或Hoechst 33258標(biāo)記一般在約5. O至約9. O的pH范圍進(jìn)行。例如，可使標(biāo)記混合物保持在 “微酸性”PH下，即從約5. O至約7. O。在該實(shí)施方案中，優(yōu)選pH從約6. O至約7. O,更優(yōu)選從約6. O至約6. 5，最優(yōu)選為約6. 2。備選地，還可使標(biāo)記混合物保持在“微堿性” pH下，SP從約7. O至約9. O。在該實(shí)施方案中，優(yōu)選pH從約7. O至約8. O，更優(yōu)選從約7. O至約7. 5，而最優(yōu)選為約7. 3。然而，一般而言，如果在除了約7. O之外的pH形成標(biāo)記，一旦完成足以進(jìn)行期望程度的標(biāo)記所需要的時(shí)間，就將標(biāo)記混合物調(diào)節(jié)為約7. O的pH。[0058]任選地，標(biāo)記混合物還含有添加劑以提高精子存活力。例示性的添加劑包括如上文對于細(xì)胞樣品收集討論過的抗生素、生長因子或調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)和/或細(xì)胞外氧化/還原反應(yīng)的組合物。可以據(jù)此將這些添加劑加入標(biāo)記混合物。
精細(xì)胞攝取或結(jié)合標(biāo)記混合物中的標(biāo)記物可以持續(xù)足夠長的一段時(shí)間，以得到所期望程度標(biāo)記的精細(xì)胞的分散體。所述時(shí)間一般足以使標(biāo)記物結(jié)合于精細(xì)胞或精細(xì)胞的DNA，從而能鑒定細(xì)胞的亞群成員并確定其在分散體中的位置。優(yōu)選時(shí)間的選擇通常取決于一系列變量，包括例如標(biāo)記物是否結(jié)合于細(xì)胞外部或它是否必須跨細(xì)胞膜、細(xì)胞對于所選標(biāo)記物的透性(如果標(biāo)記物必須跨細(xì)胞膜)、標(biāo)記混合物中標(biāo)記物的濃度、標(biāo)記混合物的溫度以及期望的選擇性程度。例如，所述時(shí)間可以是足以使熒光DNA選擇性染料結(jié)合于帶有X和Y染色體的精細(xì)胞DNA的時(shí)間，從而能根據(jù)兩者之間不同的且可測量的熒光強(qiáng)度，將兩者分選開來。例如，當(dāng)使用Hoechst 33342或Hoechst 33258標(biāo)記時(shí),一般而言,這一標(biāo)記時(shí)間將不超過約160分鐘，優(yōu)選不超過約90分鐘，還更優(yōu)選不超過約60分鐘，最優(yōu)選從約5分鐘至約40分鐘。
某些標(biāo)記物，并且特別是某些染料，能夠滲透精細(xì)胞并特異性結(jié)合DNA而不用另外地干預(yù)以增加細(xì)胞的透性。然而，使用其它的標(biāo)記物可以期望先于標(biāo)記前處理精細(xì)胞以增加滲透速率而不會(huì)不可接受地降低生存力或運(yùn)動(dòng)性?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何合適的方法。這類方法包括電穿孔、使用促進(jìn)細(xì)胞滲透的溶液(如溫和的表面活性剤)或化學(xué)休克。其中使用其它的或更嚴(yán)格的技術(shù)是所期望的或有利吋，這類處理可以包括使用脂質(zhì)體或許多本領(lǐng)域技術(shù)人員使用將染色劑、染料、基因或載體導(dǎo)入活細(xì)胞的技木。這些方法包括，但不限于顯微注射(如Gordon等人所用(Proc. Natl. Acad. ScI. USA177 (12)7380-4(1980))，并且自此擴(kuò)展至兔、綿羊、牛和豬)、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移、使用磷酸鈣的共沉淀和其它技術(shù)，這些技術(shù)均為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。在另ー情況下，可期望離心精子并在另一介質(zhì)中重懸浮離心的精子(盡管是基于相同或基本相同的緩沖液體系)，以移去可能干擾后期操作步驟的某些組分(其可能在先前被加入精子分散體)。
增加精細(xì)胞對標(biāo)記物的透性的一個(gè)特別優(yōu)選的方法是眾所周知的光注射(optoinjection)法，如在美國專利號(hào)6，753，161所公開，其內(nèi)容在此處引用作為參考。一般而言，光注射法是通過使用輻射脈沖接觸細(xì)胞瞬時(shí)地透化細(xì)胞的方法?；诩?xì)胞照度的檢測來照亮、鑒定和定位細(xì)胞，并使用足以瞬時(shí)透化細(xì)胞的輻射脈沖照射細(xì)胞。例如，如本發(fā)明所應(yīng)用的，可以使用光注射瞬時(shí)透化精細(xì)胞從而使結(jié)合至細(xì)胞內(nèi)容物的標(biāo)記物(例如，結(jié)合至DNA或RNA的標(biāo)記物)更容易和有效地進(jìn)入細(xì)胞。因此，例如，可以使用光注射減少使用熒光DNA選擇性染料(如Hoechst 33342、Hoechst 33258)或使用熒光聚酰胺充分標(biāo)記精細(xì)胞所需時(shí)間。
光注射還可用于在降低的溫度下標(biāo)記細(xì)胞。先前，精細(xì)胞一般使用，例如熒光DNA選擇性染料在超過30°C和甚至40°C的溫度下標(biāo)記(由于更高的溫度幫助增加染料攝取)。在這些溫度下標(biāo)記當(dāng)然是可行的，然而避免將精細(xì)胞暴露于較高的溫度下(特別是在延長的時(shí)間)是有益的。因此，光注射可以用于透化精細(xì)胞，由此允許在較低溫度下標(biāo)記細(xì)胞而仍然保持或超過通常與更高溫度下標(biāo)記相關(guān)的染色效率和速度。
因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，形成含有精細(xì)胞、運(yùn)動(dòng)性抑制劑和濃度從約ΙΟΟμΜ至約200 μ M的染料的標(biāo)記混合物，且將該染色混合物于約41°C的溫度保持一段時(shí)間。在另一個(gè)實(shí)施方案中，運(yùn)動(dòng)性抑制劑于每25ml純化水中含有O. 204g NaHC03、0. 433g KHCO3和
O.473g C6H8O7 · H2O (NaHCO3O. 097mol/L、KHCO3O. 173mol/L、C6H8O7 · H2O 0. 090mol/L 的水溶液)。
在另ー個(gè)實(shí)施方案中，形成含有精細(xì)胞、運(yùn)動(dòng)性抑制劑和濃度從約400μ M至約500 μ M的染料的標(biāo)記混合物，且將該染色混合物于約41 V的溫度保持一段時(shí)間。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，染料濃度為450 μ Μ。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，運(yùn)動(dòng)性抑制劑于每25ml純化水中含有 O. 204g NaHCO3、O. 433g KHCO3 和 O. 473g C6H8O7 · H2O (NaHCO3O. 097mol/L、KHCO3O. 173mol/L、C6H8O7 · H2O 0. 090mol/L 的水溶液)。
在另ー個(gè)實(shí)施方案中，形成含有精細(xì)胞、運(yùn)動(dòng)性抑制劑和濃度從約100 μ M至約200 μ M染料的標(biāo)記混合物，且將該染色混合物于約28°C的溫度保持一段時(shí)間。在另ー個(gè)實(shí) 施方案中，運(yùn)動(dòng)性抑制劑于每25ml純化水中含有O. 204g NaHCO3^O. 433g KHCO3和O. 473gC6H8O7 · H2O (NaHCO3O. 097mol/L、KHCO3O. 173mol/L、C6H8O7 · H2O 0. 090mol/L 的水溶液)。
在再一個(gè)實(shí)施方案中，形成含有精細(xì)胞、運(yùn)動(dòng)性抑制劑和濃度從約400 μ M至約500 μ M的染料的標(biāo)記混合物，且將該染色混合物于約28°C的溫度下保持一段時(shí)間。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，染料濃度為450 μ M。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，運(yùn)動(dòng)性抑制劑于每25ml純化水中含有 O. 204g NaHCO3、O. 433g KHCO3 和 O. 473g C6H8O7 · H2O (NaHCO3O. 097mol/L、KHCO3O. 173mol/L、C6H8O7 · H2O 0. 090mol/L 的水溶液)。
標(biāo)記細(xì)胞分散體的形成
一旦形成標(biāo)記混合物，該標(biāo)記混合物用于形成標(biāo)記細(xì)胞的分散體，其隨即被檢測和施用。這類分散體包括標(biāo)記的精細(xì)胞和誘導(dǎo)精子不運(yùn)動(dòng)的化學(xué)剤。備選地，或另外地，分散體除標(biāo)記的精細(xì)胞之外還可以包含液體，例如如上所述的緩沖液，并且其中細(xì)胞或液體的溫度誘導(dǎo)精子不運(yùn)動(dòng)。
標(biāo)記的精細(xì)胞可以是多種形式的任意ー種。例如，標(biāo)記的細(xì)胞還可以是標(biāo)記混合物的部分。在這樣情況下，標(biāo)記細(xì)胞還可在多余的或未結(jié)合的標(biāo)記物中?；蛘撸瑯?biāo)記的細(xì)胞可以已經(jīng)與任何多余的或未標(biāo)記的標(biāo)記物分離,例如通過洗漆細(xì)胞或通過旋轉(zhuǎn)下來細(xì)胞(例如通過離心)，并接著將細(xì)胞與未結(jié)合的標(biāo)記物分離。在這類情況下，標(biāo)記細(xì)胞通常與如上文細(xì)胞樣品的收集中討論過的緩沖液混合。在任何事件中，分散體中的精細(xì)胞被標(biāo)記從而與一個(gè)或多個(gè)精細(xì)胞結(jié)合的標(biāo)記物的缺少或其數(shù)量使能夠鑒定分散體中精細(xì)胞亞群的遺傳、蛋白質(zhì)組、結(jié)構(gòu)或功能特征。該精細(xì)胞可以維持在引起或増加精子不運(yùn)動(dòng)性的溫度下。
標(biāo)記的細(xì)胞的分散體還可以含有誘導(dǎo)精子不運(yùn)動(dòng)性的化學(xué)剤，例如，如上討論過的運(yùn)動(dòng)性抑制劑?？梢栽诠鈱W(xué)檢測分散體之前的任何時(shí)間(例如，精細(xì)胞標(biāo)記之前、期間或之后)將該化學(xué)劑加入標(biāo)記混合物或標(biāo)記細(xì)胞。可以將化學(xué)劑與標(biāo)記細(xì)胞混合，標(biāo)記細(xì)胞為以上討論過的多種形式的任意ー種(即，仍然在標(biāo)記混合物中或從其移出)。在具體的實(shí)施方案中，形成的標(biāo)記混合物包含精細(xì)胞和標(biāo)記物，并隨即將標(biāo)記混合物與誘導(dǎo)精子不運(yùn)動(dòng)性的化學(xué)劑混合。相對于化學(xué)劑備選地，或在此之外，可以如上討論過的降低標(biāo)記混合物的溫度以弓丨起或増加精子不運(yùn)動(dòng)性。
細(xì)胞的檢測、確定和施用
一旦形成標(biāo)記細(xì)胞的分散體，光學(xué)檢測該分散體以鑒定作為亞群成員的個(gè)體精細(xì)胞，確定在分散體中的亞群成員的位置和將能量束傳遞至分散體內(nèi)的不同位置以選擇性地將能源施用于亞群成員，從而降低被施用細(xì)胞的生存力或至少它們的使卵受精的能力而不同時(shí)影響分散體中其它位置的精細(xì)胞。
這些步驟通常通過設(shè)備和以商業(yè)上稱為LEAP (激光激活的分析和加工)技術(shù)平臺(tái)(Cyntellect, Inc. , San Diego, CA)的方法進(jìn)行。一般而言，這ー方法需要使用標(biāo)記物標(biāo)記細(xì)胞以鑒定和定位在細(xì)胞混合物或更大群內(nèi)細(xì)胞亞群的個(gè)體細(xì)胞。接著照亮細(xì)胞群，使能夠鑒定亞群的個(gè)體細(xì)胞的位置。繼之定位處理激光器使其能夠發(fā)生能量束以誘導(dǎo)亞群的鑒定細(xì)胞的改變。該誘導(dǎo)的改變通常為細(xì)胞死亡。這些方法和設(shè)備在美國專利號(hào)6，534，308,6, 514，722,6, 753，161和6，642，018中被進(jìn)ー步描述，均在此處引用作為參考。本發(fā)明中使用的能源可以是任何來源，當(dāng)將其以某種劑量用于精細(xì)胞時(shí)，可降低被施用細(xì)胞的生存力，或至少它們使卵受精的能力，而對分散體種其它位置的精細(xì)胞具有最小或沒有相似的影響。通常，能源是能量束的形式。合適的能源的實(shí)例包括激光、平行或聚焦的非激光光、射頻能量(RF energy)、加速的顆粒、聚焦的超聲能量、電子束或其它輻射束。然而，優(yōu)選的能量源是激光，由于激光具有在緊湊體積中提供高強(qiáng)度能量和相對有效的能量利用以及最小產(chǎn)熱的優(yōu)勢，從而允許向個(gè)體細(xì)胞施用而不顯著地不利影響周圍細(xì)胞。
可以將細(xì)胞置于任何適于對細(xì)胞進(jìn)行光學(xué)檢測和施用的表面。一般而言，這類表面具有水平的表面(頂部、底部，或兩者同吋)，其對于用于光學(xué)檢測細(xì)胞的能源和用于向亞群成員施用的能源是光學(xué)上可透過的。這類合適的表面包括，例如玻璃、塑料或其它相關(guān)的聚合物，和Pyrex ,并且可以是平的載玻片、培養(yǎng)皿、單孔平板或多孔板的形式。實(shí)例在例如美國專利號(hào)6，534，308和6，514，722中被討論。
可以將精細(xì)胞的樣品分為幾個(gè)更小的個(gè)體樣品，例如通過分成許多個(gè)體樣品用于多孔板?？梢愿患嗤卣鞯母鞣N樣品(例如，在每個(gè)孔內(nèi))，由此產(chǎn)生各自由于ー種特征而被富集的多個(gè)樣品。然而，最好可以富集不同特征的各種樣品。例如，可以將精細(xì)胞樣品分為更小的個(gè)體樣品，并且將每個(gè)個(gè)體樣品置于96孔平板的ー個(gè)孔中。接著可以以與其它的每孔樣品不同的一種特征富集每孔的單獨(dú)樣品，產(chǎn)生各自以不同的特征富集的96個(gè)個(gè)體樣品。
—旦使用能源向亞群的成員細(xì)胞施用，可以通過純化未被施用的細(xì)胞(即沒有使用能量施用的精細(xì)胞)進(jìn)ー步富集細(xì)胞群?？梢酝ㄟ^從分散體移去被施用細(xì)胞或未被施用細(xì)胞進(jìn)行未施用細(xì)胞的純化，產(chǎn)生含有由特定特征富集的未施用細(xì)胞的亞群。例如，如果該特定特征是帶有Y染色體的精細(xì)胞，可以純化未施用的細(xì)胞從而其含有至少約85%帶有Y染色體的精細(xì)胞；優(yōu)選至少約90%帶有Y染色體的精細(xì)胞；更優(yōu)選至少約95%帶有Y染色體的精細(xì)胞；甚至更優(yōu)選至少約97%帶有Y染色體的精細(xì)胞；和最優(yōu)選至少約99%帶有Y染色體的精細(xì)胞。備選地，如果該特定的期望特征是帶有X染色體的精細(xì)胞，可以純化未施用的細(xì)胞從而其含有至少約85 %帶有X染色體的精細(xì)胞；優(yōu)選至少約90 %帶有X染色體的精細(xì)胞；更優(yōu)選至少約95%帶有X染色體的精細(xì)胞；甚至更優(yōu)選至少約97%帶有X染色體的精細(xì)胞；和最優(yōu)選至少約99%帶有X染色體的精細(xì)胞。
可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法的任意一種實(shí)現(xiàn)從施用的分散體(即從包含施用細(xì)胞和未施用細(xì)胞的更大的精細(xì)胞群)移去施用細(xì)胞或未施用細(xì)胞。這類方法包括，例如旋轉(zhuǎn)下整個(gè)分散體(例如通過離心)，并接著移去或通過燈芯效應(yīng)除去含有施用細(xì)胞的上清液。另ー方法包括向分散體加入高密度的介質(zhì)?？梢约尤敕稚Ⅲw的高密度介質(zhì)包括，例如Pereoll 和Isolate 。一般而言，在高密度分離中，活細(xì)胞(即本申請的未施用細(xì)胞)能夠游動(dòng)至高密度介質(zhì)的上層并且可以在其后被從介質(zhì)上層撇取，而受損細(xì)胞或死細(xì)胞(即施用細(xì)胞)將保持分散在高密度介質(zhì)內(nèi)，通常在體相之中。使用這類介質(zhì)的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。
最好標(biāo)記細(xì)胞的分散體可以含有使用不同標(biāo)記物標(biāo)記的細(xì)胞亞群。每種標(biāo)記物可以鑒定分散體中精細(xì)胞亞群的不同的遺傳、蛋白質(zhì)組、結(jié)構(gòu)或功能特征。此外，當(dāng)結(jié)合于精細(xì)胞時(shí)，可以分別地檢測每種標(biāo)記物，即能夠分別地檢測不同標(biāo)記物。例如，標(biāo)記物可以在不同波長各自發(fā)出熒光。
可以向標(biāo)記混合物或標(biāo)記細(xì)胞的分散體加入不同的標(biāo)記物。備選地，可以在細(xì)胞的檢測、測定或施用步驟的任一步驟之后加入不同的標(biāo)記物。然而，優(yōu)選在分散體的施用之后加入不同的標(biāo)記物。例如，一旦已經(jīng)向精細(xì)胞的亞群成員施用，被施用的分散體(包括施用細(xì)胞和未施用細(xì)胞)或純化的施用分散體(僅包括未施用細(xì)胞)可以被再次標(biāo)記，但是要使用不同的標(biāo)記物，并且通常如上文公開的，可以基于與精細(xì)胞結(jié)合的不同標(biāo)記物的缺少或數(shù)量重復(fù)細(xì)胞的檢測、測定和施用。
一般而言，可以使用不同標(biāo)記物鑒定未施用細(xì)胞的其它遺傳、蛋白質(zhì)組、結(jié)構(gòu)或功能特征，所述特征可以不同于先前鑒定向其遞送能量劑量的亞群成員所用的特征(即不同于先前確定是施用或未施用細(xì)胞所用的特征)。這提供了進(jìn)ー步富集已富集的細(xì)胞群的途徑。
例如，使用熒光DNA選擇性染料可以形成標(biāo)記細(xì)胞的分散體?？梢越又鈱W(xué)檢測該分散體以鑒定帶有X染色體的精細(xì)胞個(gè)體?？梢岳^之確定帶有X染色體的精細(xì)胞的位置，并接著將能量劑量遞送至一個(gè)或更多帶有X染色體的細(xì)胞，由此獲得富集的帶有Y染色體的活細(xì)胞群。其后，可以使用表明頂體完整性的另ー標(biāo)記物標(biāo)記施用的分散體(包括施用的(帶有X染色體的)和未施用的(帶有Y染色體的)細(xì)胞)或純化的被施用分散體(僅包括未施用細(xì)胞)，例如藻紅蛋白綴合的花生凝集素(PE-PNA)，當(dāng)其與具有反應(yīng)或受損頂體的細(xì)胞接觸時(shí)，誘導(dǎo)細(xì)胞熒光，特別是頂體的熒光。可以接著進(jìn)行光學(xué)鑒定和確定PE-PNA熒光發(fā)生細(xì)胞位置的步驟，井向那些細(xì)胞施以能量。產(chǎn)生帶有Y染色體和具有未反應(yīng)和未損傷(即完整的)頂體的未被施用細(xì)胞的亞群。見，例如Nagy等人，Biol Reprod,68 :1828-1835(2003)。
細(xì)胞的冷凍延長(cryoextension)
一旦使用能源向亞群的成員細(xì)胞施用之后，整個(gè)精細(xì)胞群(被施用的和未被施用的細(xì)胞)或該群的子集(僅未被施用的細(xì)胞)可以被冷卻或冷凍以備后用(例如在受精操作中)。在這種情況下，加入冷凍延長劑以最小化冷卻或冷凍對存活力或解凍后運(yùn)動(dòng)性的影響，對未被施用的精細(xì)胞是有益的。
一般而言，冷凍延長劑可包含蛋白質(zhì)源、冷凍保護(hù)劑和運(yùn)動(dòng)性抑制劑。若含有蛋白質(zhì)源，可將其加入以提供細(xì)胞支持。蛋白質(zhì)源可為任何不會(huì)干擾未施用精細(xì)胞存活力并與運(yùn)動(dòng)性抑制劑相容的蛋白質(zhì)源。常用蛋白質(zhì)源的實(shí)例包括乳(包括熱勻漿和脫脂乳)、乳提取物、卵黃、卵黃提取物、大豆蛋白和大豆蛋白提取物。此類蛋白質(zhì)的使用濃度可為約10%(v/v)至約 30% (v/v)，優(yōu)選約 10% (v/v)至約 20% (v/v)，更優(yōu)選約 20% (v/v)。[0086]冷凍延長劑中優(yōu)選含有冷凍保護(hù)劑，以減輕或避免冷凍休克或保持未被施用的精細(xì)胞的生育力。本領(lǐng)域已知眾多冷凍保護(hù)劑。適于與給定的延長劑共同使用的冷凍保護(hù)劑可有多種選擇，取決于待冷凍精子來源的物種。適宜冷凍保護(hù)劑的實(shí)例包括如，甘油、ニ甲基亞砜、こニ醇、丙ニ醇、海藻糖、Triladyl 以及它們的組合。若含有冷凍保護(hù)劑，則其在冷凍延長劑中的量一般為約1% (v/v)至約15% (v/v)，優(yōu)選其量為約5% (v/v)至約10%(v/v),更優(yōu)選其量為約7% (v/v)，最優(yōu)選量為約6% (v/v) O
此外，冷凍延長劑可以含有如上文細(xì)胞樣品收集中討論過的運(yùn)動(dòng)性抑制劑?？梢該?jù)其向冷凍延長劑加入運(yùn)動(dòng)性抑制劑。
在ー個(gè)具體實(shí)施方案中，冷凍延長劑包含運(yùn)動(dòng)性抑制劑、水、Triladyl 、卵黃和丙酮酸。而在另ー個(gè)實(shí)施方案中，冷凍延長劑包含0.09711101/1似!10)3、0.17311101/1 KHC03、
O.090mol/L C6H8O7 · H2O 的水溶液和于每 75ml 水中含有 25g Triladyl 、25g 卵黃和 IOmM
丙酮酸。在另一具體實(shí)施方案中，冷凍延長劑包含運(yùn)動(dòng)性抑制劑、水、Triladyl 、和卵黃。而在另一具體實(shí)施方案中，冷凍延長劑包含O. 097mol/L NaHC03>0. 173mol/L KHCO3>
O.090mol/L C6H8O7 · H2O的水溶液和于每75ml水中含有25g Triladyl 和25g卵黃。
冷凍延長劑中也可任選地含有如上文細(xì)胞樣品收集中討論過的抗生素或調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)和/或細(xì)胞外氧化/還原反應(yīng)的組合物?？蓳?jù)此將每種添加劑加入冷凍延長劑中。
整個(gè)精子群的冷藏(即經(jīng)施用分散體的冷藏)使形成具有兩個(gè)亞群的冷凍分散體，每ー亞群實(shí)質(zhì)上彼此不同。然而，每ー亞群由基本同質(zhì)的細(xì)胞組成。也就是說，每ー亞群由細(xì)胞組成，單ー亞群的每ー個(gè)體細(xì)胞具有與相同亞群中每ー其它細(xì)胞共同的特征。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過純化分散體在冷藏之前進(jìn)ー步富集分散體，所述純化是根據(jù)上述方法基于存在或缺少共同的特征進(jìn)行。
因此，例如，可以使用本方法形成冷凍精子分散體，所述分散體包含被施用的細(xì)胞亞群(其中施用的亞群的全部細(xì)胞是帶有X染色體的細(xì)胞)，和未施用的細(xì)胞亞群(其中未施用的亞群的全部細(xì)胞是帶有Y染色體的細(xì)胞)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，未接受能量劑量的細(xì)胞(即，未經(jīng)施用的帶有Y染色體的細(xì)胞)包含至少約85%的帶有Y染色體的精細(xì)胞；優(yōu)選至少約90%帶有Y染色體的精細(xì)胞；更優(yōu)選至少約95%帶有Y染色體的精細(xì)胞；甚至更優(yōu)選至少約97%帶有Y染色體的精細(xì)胞；最優(yōu)選至少約99%帶有Y染色體的精細(xì)胞。
備選地，可以使用本發(fā)明的方法形成冷凍精子分散體，所述分散體包含經(jīng)施用的細(xì)胞亞群(其中施用的亞群的全部細(xì)胞是帶有Y染色體的細(xì)胞)，和未施用的細(xì)胞亞群(其 中未施用的亞群的全部細(xì)胞是帶有X染色體的細(xì)胞)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，未施用的帶有X染色體的細(xì)胞會(huì)包含至少約85%的帶有X染色體的精細(xì)胞；優(yōu)選至少約90%帶有X染色體的精細(xì)胞；更優(yōu)選至少約95%帶有X染色體的精細(xì)胞；甚至更優(yōu)選至少約97%帶有X染色體的精細(xì)胞；最優(yōu)選至少約99%帶有X染色體的精細(xì)胞。
受精
本發(fā)明還提供使卵受精或授精雌性哺乳動(dòng)物的新方法，通常使用該新方法選擇性降低在如上所述的細(xì)胞分散體中精細(xì)胞亞群的生存力。
一旦向標(biāo)記細(xì)胞的分散體施用，可以將經(jīng)施用的分散體(包含經(jīng)施用的和未經(jīng)施用的細(xì)胞)用于使雌性哺乳動(dòng)物受精?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的多種方法中的任意一種進(jìn)行受精。這些方法包括，例如，顯微注射、人工授精和其它本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法。例如，可以將包含施用和未施用細(xì)胞的經(jīng)施用分散體、僅包含未施用細(xì)胞的純化的分散體或兩者中任意一種的衍生物用于授精雌性哺乳動(dòng)物(例如通過人工授精)。
備選地，一旦完成標(biāo)記細(xì)胞分散體的施用，可以使用該分散體使卵受精，更具體而言為體外的卵。然后可通過多種本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知方法中的任意ー種，將受精卵導(dǎo)入雌性哺乳動(dòng)物的子宮內(nèi)，例如通過胚胎移植。例如，可以將施用的分散體、純化的分散體或兩者中任意一種的衍生物用于體外卵受精。接著可以將受精卵導(dǎo)入雌性哺乳動(dòng)物的子宮內(nèi)。
可以在完成分散體的施用之后不久，例如在約7天之內(nèi)，優(yōu)選在約5天之內(nèi)，更優(yōu)選在約3天之內(nèi)，還更優(yōu)選在約2天之內(nèi)，和在具體的實(shí)施方案中，在完成分散體的施用約I天之內(nèi)進(jìn)行雌性哺乳動(dòng)物受精或卵的體外受精。在這類情況下，通常該分散體在受精雌性哺乳動(dòng)物或體外受精卵之前可以未經(jīng)冷凍保藏(即，該分散體是新鮮的或包含新鮮的精細(xì)胞)；作為代替它可以已經(jīng)保持在運(yùn)動(dòng)性抑制劑中和/或冷藏于約2°C至約7°C，更優(yōu)選約3°C至約5°C，和最優(yōu)選約4°C的溫度。備選地，可以冷凍保藏分散體并繼之在受精雌性哺乳動(dòng)物或體外受精卵之前解凍(即，該分散體被冷凍/解凍或包含冷凍/解凍的精細(xì)胞)。一般而言，在這類情況下，可以在雌性哺乳動(dòng)物受精或卵的體外受精之前即刻解凍冷藏的分散體。
上文已經(jīng)詳細(xì)描述了本發(fā)明，顯而易見的是，在不脫離所附權(quán)利要求
定義的發(fā)明范圍內(nèi)可對其進(jìn)行修飾和改變。
權(quán)利要求
1.選擇性降低精細(xì)胞分散體中精細(xì)胞亞群使卵受精的能力的方法，該方法包括 a)用DNA選擇性熒光染料標(biāo)記精細(xì)胞樣品以形成經(jīng)標(biāo)記的精細(xì)胞的分散體，其中與精細(xì)胞結(jié)合的DNA選擇性熒光染料的數(shù)量表明帶有X染色體的精細(xì)胞和帶有Y染色體的精子; b)任選地檢測分散體以鑒定個(gè)體精細(xì)胞為亞群成員； c)遞送能量劑量至分散體以選擇性降低亞群成員使卵受精的能力；和 d)從分散體除去被施用的細(xì)胞或未被施用的細(xì)胞。
2.權(quán)利要求
I的方法，其中所述DNA選擇性熒光染料是Hoechst33342、Hoechst33258或 SYBR-H0
3.權(quán)利要求
I的方法，其中能量劑量選自輻射束、激光束、平行的非激光光、聚焦的非激光光和聚焦的超聲能。
4.權(quán)利要求
I的方法，其中所述方法還包括純化未接受能量劑量的精細(xì)胞。
5.權(quán)利要求
4的方法，其中純化未被施用的細(xì)胞包括使分散體與高密度介質(zhì)接觸。
6.權(quán)利要求
4的方法，其中純化未被施用的細(xì)胞包括離心分散體并移去被施用的細(xì)胞。
7.權(quán)利要求
1-6中任ー項(xiàng)的方法，其中與未接受能量劑量的精細(xì)胞的生存力相比，所述能量劑量足以降低亞群成員的生存力。
8.權(quán)利要求
1-6中任ー項(xiàng)的方法，其中所述能量劑量足以引起亞群成員的死亡。
9.權(quán)利要求
1-6中任ー項(xiàng)的方法，其中所述方法還包括在遞送能量劑量之后冷藏分散體。
10.權(quán)利要求
1-6中任ー項(xiàng)的方法，其中未接受能量劑量的精細(xì)胞包含至少85%的帶有X染色體的精細(xì)胞。
11.權(quán)利要求
1-6中任ー項(xiàng)的方法，其中未接受能量劑量的精細(xì)胞包含至少85%的帶有Y染色體的精細(xì)胞。
12.權(quán)利要求
1-6中任ー項(xiàng)的方法，其中未接受能量劑量的精細(xì)胞包含至少90%的帶有X染色體的精細(xì)胞。
13.權(quán)利要求
1-6中任ー項(xiàng)的方法，其中未接受能量劑量的精細(xì)胞包含至少90%的帶有Y染色體的精細(xì)胞。
14.權(quán)利要求
1-6中任ー項(xiàng)的方法，其中未接受能量劑量的精細(xì)胞包含至少95%的帶有X染色體的精細(xì)胞。
15.權(quán)利要求
1-6中任ー項(xiàng)的方法，其中未接受能量劑量的精細(xì)胞包含至少95%的帶有Y染色體的精細(xì)胞。
16.權(quán)利要求
1-6中任ー項(xiàng)的方法，其中未接受能量劑量的精細(xì)胞包含至少97%的帶有X染色體的精細(xì)胞。
17.權(quán)利要求
1-6中任ー項(xiàng)的方法，其中未接受能量劑量的精細(xì)胞包含至少97%的帶有Y染色體的精細(xì)胞。
專利摘要
本發(fā)明公開了不使用物理分選細(xì)胞對一種特征選擇性富集活精細(xì)胞群的方法。在這樣富集的群體中含有的細(xì)胞得益于未經(jīng)歷分選方法的優(yōu)勢。還公開了利用選擇性富集活精細(xì)胞群的方法授精雌性哺乳動(dòng)物的方法以及形成精子分散體的方法。
文檔編號(hào)C12N5/076GKCN102643780SQ201210128480
公開日2012年8月22日 申請日期2005年7月22日
發(fā)明者J·A·格雷厄姆 申請人:英格朗公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan