專利名稱:一種高純度胰激肽原酶的制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高純度胰激肽原酶的制備工藝。
背景技術(shù)：
胰激肽原酶是一種具有擴(kuò)張血管改善微循環(huán)作用的周圍血管擴(kuò)張藥，胰激肽原酶在體內(nèi)作用于激肽原釋放出激肽，直接作用于小血管和毛細(xì)血管，從而產(chǎn)生一系列的藥理效應(yīng)，如舒張毛細(xì)血管、擴(kuò)張小動(dòng)脈等，在擴(kuò)張血管的同時(shí)改善血管的通透性和血液流量；有調(diào)節(jié)血壓作用，降低心肌耗氧量；還可促進(jìn)前列腺的分泌，改善各器官血流。胰激肽原酶作為一種國際公認(rèn)的微循環(huán)改善劑，是一種療效確切、不良反應(yīng)輕微的酶類藥物，適宜于長期服用，適用于各種微血管循環(huán)障礙疾病的治療。胰激肽原酶對(duì)早期腎病的治療效果顯著，能有效地改善腎臟的微循環(huán)，與其它藥物配合治療，能降低腎小球入球動(dòng)脈壓，具有促使腎小球基底膜早期損傷修復(fù)等作用，該產(chǎn)品的市場(chǎng)前景十分廣闊?！?br>胰激肽原酶是從哺乳動(dòng)物的胰臟中經(jīng)提取純化而得到的，即從胰臟本身、胰酶粉以及胰激肽原酶粗品(中間體)中提取，并通過純化而制得?，F(xiàn)有胰激肽原酶的純化方法包括使用多糖非樹脂物料進(jìn)行純化，例如使粗的胰激肽原酶吸附到一種弱堿性陰離子交換纖維素上并分離(見日本專利發(fā)行No. 11697/62);或者將一種鋁鹽或者鋅鹽加入含有胰激肽原酶的水溶液中，將產(chǎn)生的胰激肽原酶的沉淀吸附到弱堿性的陰離子交換纖維素上或交聯(lián)葡聚糖(Sephadex)上,并分離之(見日本公開專利發(fā)行No. 56886/73);另一種已知的純化方法是使用離子交換樹脂，即加入一種蛋白質(zhì)沉淀劑到胰臟提取液中，產(chǎn)生的胰激肽原酶吸附到大孔強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂，并分離之(見日本公開專利No. 103715/73)。然而，利用上述多糖型非樹脂物料進(jìn)行吸附的方法缺點(diǎn)是離子交換物料的物理強(qiáng)度不夠，不能進(jìn)行大規(guī)模制備。而離子交換樹脂法不能使產(chǎn)品在洗脫時(shí)除去不需要的雜質(zhì)。因此，上述方法得到廣品的純度還有待于進(jìn)一步提聞。
公開號(hào)為CN101073666的中國發(fā)明專利公開了一種制備高純度胰激肽原酶原料藥的方法，其采用QAE-Sepharose Fast Flow離子柱層析純化制得胰激肽原酶的原料藥,其純度高達(dá)75%以上，效價(jià)增加55單位/mg以上，比活達(dá)到350單位/mg蛋白以上。但其存在以下缺陷比活達(dá)不到600單位/mg蛋白，純度達(dá)不到90%，不能做為注射劑的原料藥進(jìn)行應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了一種高純度胰激肽原酶的制備工藝，該制備工藝包括產(chǎn)品粗提純、溶液配制、親和柱層析、超濾脫鹽、無菌過濾、凍干、包裝等工序，產(chǎn)品經(jīng)過HS-Sepharose親和柱層析分離純化后,成品的純度高達(dá)95%以上,效價(jià)增加70單位/mg以上，比活達(dá)到600單位/mg蛋白以上。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
—種高純度胰激肽原酶的制備工藝，步驟如下[0008]( I)粗提純
①取胰臟粉或胰臟，加10 30倍量(重量倍數(shù))純化水溶解提取，攪拌均勻后加入氯化鈣至濃度為5 8% (g/ml)，調(diào)整pH為6. O 8. 0，冷凍靜置沉淀，離心收集沉淀；
②將上述沉淀加入到事先配制好的2 4% (g/ml)的草酸鹽溶液(沉淀g與草酸鹽溶液ml的比例為Ig :4 8ml)中，充分?jǐn)嚢?5 35分鐘溶解，靜置沉淀進(jìn)行粗提純，虹吸上清液得粗品液。
上述步驟①中，pH調(diào)整采用氨水調(diào)節(jié)，冷凍靜置沉淀溫度為零下20°C以下，離心轉(zhuǎn)速為大于3000轉(zhuǎn)/分。
上述步驟②中，2 4% (g/ml)的草酸鹽溶液的組成為每IOOml草酸鹽溶液中含I 2g的草酸銨，I 2g的草酸鉀。
(2)溶液配制配制濃度為20 40% (g/ml)的無機(jī)鹽平衡液,調(diào)整pH為4. O ;配·制濃度為20 40% (g/ml)的無機(jī)鹽洗脫液，調(diào)整pH為6. 0，檢測(cè)溶液的電導(dǎo)值。
所述無機(jī)鹽選自硫酸鈉、硫酸銨、硫酸鉀，硫酸鎂、氯化鈉或氯化銨中的一種或多種。
(3)親和柱層析
①平衡將裝有HS-Sepharose親和層析填料的層析柱,用上述配制的pH4. O、濃度20 40% (g/ml)的無機(jī)鹽平衡液平衡，直至進(jìn)出層析柱的溶液pH值與電導(dǎo)值相同時(shí)平衡完畢；
②進(jìn)樣調(diào)整上述制備的含胰激肽原酶的粗品液的pH值與無機(jī)鹽平衡液一致，粗品液電導(dǎo)值等于平衡液電導(dǎo)值(以無機(jī)鹽或水調(diào)整電導(dǎo)值)，根據(jù)每升填料最大親和量3000萬單位進(jìn)行上樣；
③洗滌用上述配制的pH4. O、濃度20 40% (g/ml)的無機(jī)鹽平衡液沖洗一個(gè)柱體積；
④洗脫用上述配制的pH6. O、濃度20 40% (g/ml)的無機(jī)鹽洗脫液沖洗柱子，同時(shí)用754分光光度計(jì)跟蹤檢測(cè)流出液在254nm處的吸收值，收集洗脫液，得收集液。
上述步驟(2) (3)中調(diào)整pH均采用6mol/L氫氧化鈉溶液或鹽酸溶液調(diào)整。
上述親和柱層析步驟中，所用層析柱直徑為φ 40cm,體積為50L ;以洗脫液效價(jià)大于30單位/cm時(shí)為洗脫收集起點(diǎn)，以洗脫液效價(jià)小于20單位/cm時(shí)為洗脫收集終點(diǎn)，收集峰液體積約為30 50L。
(4)超濾脫鹽將上述收集液加注射用水超濾脫鹽濃縮，當(dāng)溶液電導(dǎo)值小于1000 μ s/cm時(shí)，停止加注射用水，繼續(xù)濃縮，得濃縮液。
所述超濾脫鹽的截留分子量為I萬道爾頓，當(dāng)濃縮至液體體積為1/3 1/5時(shí)，關(guān)閉超濾機(jī)，用注射用水沖洗，至超濾機(jī)回管中效價(jià)低于30單位/ml時(shí)，得濃縮液，取樣檢測(cè)效價(jià)。
(5)除菌上述濃縮液用微孔濾膜進(jìn)行除菌過濾，得無菌濾液。
所述微孔濾膜為O. 22 μ m的微孔濾膜。
(6)凍干加入輔料進(jìn)行凍干，即得胰激肽原酶，純度95%以上，效價(jià)65單位/mg以上，比活600單位/mg蛋白以上。
所述加輔料凍干的具體步驟如下輔料用注射用水加熱溶解后過O. 22 μ m微孔濾膜，冷卻后加入到無菌濾液中，控制無菌濾液的效價(jià)在70單位/mg以上，混合均勻后放入凍干箱中凍干。
所述凍干的工藝條件如下將產(chǎn)品在零下20 50°C溫度下預(yù)凍3 5小時(shí)(視盤中液量而定)，將導(dǎo)熱油以10°c /小時(shí)的速度升至35°C，真空度前箱保持小于15Pa，使制品升華，當(dāng)制品溫度達(dá)到30°C時(shí)，保溫3小時(shí)直至完全干燥。
所述輔料選自乳糖、甘露醇、明膠或右旋糖苷中的一種或多種。
(7)包裝將所得胰激肽原酶粉碎后，過80目篩，裝入密閉容器中，加蓋密封。
本發(fā)明的高純度胰激肽原酶的制備工藝制備得到的胰激肽原酶，純度高達(dá)95%以上，效價(jià)增加65單位/mg以上，比活達(dá)到600單位/mg蛋白以上，可以做為注射劑的原料藥進(jìn)行應(yīng)用。
具體實(shí)施方式
·
實(shí)施例I
I、粗提純
( I)胰臟粉或胰臟加10倍量純化水溶解提取，攪拌均勻后加入氯化鈣至濃度為8%(g/ml )，用氨水調(diào)整pH為6. (Γ8. 0，零下20°C以下冷凍靜置沉淀，轉(zhuǎn)速3000轉(zhuǎn)/分以上離心收集沉淀。
(2)將上述沉淀加入到配制好的2% (g/ml)的草酸鹽溶液(每IOOml中含Ig的草酸銨，Ig的草酸鉀，胰臟粉或胰臟與草酸鹽溶液的比例為I :6)中，充分?jǐn)嚢?0分鐘溶解，靜置沉淀進(jìn)行粗提純，虹吸上清液得粗品液。
2、配制平衡液及洗脫液配制25% (g/ml)濃度的硫酸銨平衡液，調(diào)整pH為4. O和20% (g/ml)濃度的氯化銨的洗脫液，調(diào)整pH6. 0，并檢測(cè)溶液的電導(dǎo)值。
3、層析
(I)平衡將HS-S^harose裝入直徑為φ 40cm,體積為50L的層析柱中，用ρΗ4· O、25% (g/ml)濃度的硫酸銨平衡液平衡，直至進(jìn)出層析柱的溶液pH值與電導(dǎo)值相同時(shí)平衡完畢。
(2)進(jìn)樣調(diào)整胰激肽原酶粗品的pH值與硫酸銨平衡液一致，粗品液電導(dǎo)值略低于硫酸銨平衡液電導(dǎo)值(以無機(jī)鹽或水調(diào)整電導(dǎo)值)，根據(jù)每升填料最大親和量3000萬單位計(jì)算上樣量，將樣品液進(jìn)行上柱。
(3)洗滌用pH4. O、25% (g/ml)濃度的硫酸銨平衡液沖洗一個(gè)柱體積。
(4)洗脫用ρΗ6· 0,20% (g/ml)濃度的氯化銨洗脫液沖洗柱子，同時(shí)用754分光光度計(jì)跟蹤檢測(cè)流出液在254nm處的吸收值，收集洗脫液，得收集液。以洗脫液效價(jià)大于30單位/cm時(shí)為洗脫收集起點(diǎn)，以洗脫液效價(jià)小于20單位/cm時(shí)為洗脫收集終點(diǎn)，收集濃液體積約為30 50L。
上述步驟(2) (3)中調(diào)整pH均采用6mol/L氫氧化鈉溶液或鹽酸溶液調(diào)整。
4、超濾脫鹽將收集液加注射用水超濾脫鹽濃縮，超濾脫鹽的截留分子量為I萬道爾頓，當(dāng)超出液電導(dǎo)值小于1000 μ s/cm時(shí)，停止加注射用水繼續(xù)濃縮，濃縮至液體體積至IOL時(shí)，關(guān)閉超濾機(jī)，用注射用水沖洗，至超濾機(jī)回管中效價(jià)低于30單位/ml時(shí)，得濃縮液，取樣檢測(cè)效價(jià)。[0044]5、除菌將濃縮液用O. 22 μ m微孔濾膜的過濾器進(jìn)行除菌過濾，得無菌濾液。
6、凍干根據(jù)濃縮液的效價(jià)加入輔料明膠，控制成品的效價(jià)在70單位/mg以上，計(jì)算輔料明膠的用量，分別用注射用水加熱溶解后過O. 22 μ m微孔濾膜，冷卻后加入到無菌濾液中，混合均勻后放入凍干箱中凍干。
凍干工藝條件如下將產(chǎn)品在零下2(T50°C溫度下預(yù)凍3飛小時(shí)(視盤中液量)，將導(dǎo)熱油以10°c /小時(shí)的速度升至35°c，真空度前箱保持小于15Pa，使制品升華。當(dāng)制品溫度達(dá)到30°C時(shí)，保溫3小時(shí)直至完全干燥。即得胰激肽原酶，純度94. 78%，效價(jià)78單位/mg以上，比活621單位/mg蛋白。
7、包裝將凍干好的成品混合均勻后粉碎，并過80目篩裝入密閉容器中，加蓋密封即得。
實(shí)施例2·[0049]I、粗提純
( I)胰臟粉或胰臟加30倍量純化水溶解提取，攪拌均勻后加入氯化鈣至濃度為7%(g/ml )，用氨水調(diào)整pH為6. (Γ8. 0，零下20°C以下冷凍靜置沉淀，轉(zhuǎn)速3000轉(zhuǎn)/分以上離心收集沉淀。
(2)將上述沉淀加入到配制好的2% (g/ml)的草酸鹽溶液(每IOOml中含Ig的草酸銨，Ig的草酸鉀，胰臟粉或胰臟與草酸鹽溶液的比例為I :5)中，充分?jǐn)嚢?0分鐘溶解，靜置沉淀進(jìn)行粗提純，虹吸上清液得粗品液。
2、配制平衡液及洗脫液配制30% (g/ml)濃度的硫酸銨平衡液，調(diào)整pH為4. O和20% (g/ml)濃度的氯化鈉的洗脫液，調(diào)整pH6. 0，并檢測(cè)溶液的電導(dǎo)值。
3、層析
(I)平衡將HS-S^harose裝入直徑為φ 40cm，體積為50L的層析柱中，用ρΗ4· O、30% (g/ml)濃度的硫酸銨平衡液平衡，直至進(jìn)出層析柱的溶液pH值與電導(dǎo)值相同時(shí)平衡完畢。
(2)進(jìn)樣調(diào)整胰激肽原酶粗品的pH值與硫酸銨平衡液一致，粗品液電導(dǎo)值略低于硫酸銨平衡液電導(dǎo)值(以無機(jī)鹽或水調(diào)整電導(dǎo)值)，根據(jù)每升填料最大親和量3000萬單位計(jì)算上樣量，將樣品液進(jìn)行上柱。
(3)洗滌用pH4. O、30% (g/ml)濃度的硫酸銨平衡液沖洗一個(gè)柱體積。
(4)洗脫用ρΗ6· 0,20% (g/ml)濃度的氯化鈉洗脫液沖洗柱子，同時(shí)用754分光光度計(jì)跟蹤檢測(cè)流出液在254nm處的吸收值，收集洗脫液，得收集液。以洗脫液效價(jià)大于30單位/cm時(shí)為洗脫收集起點(diǎn)，以洗脫液效價(jià)小于20單位/cm時(shí)為洗脫收集終點(diǎn)，收集濃液體積約為30 50L。
上述步驟(2) (3)中調(diào)整pH均采用6mol/L氫氧化鈉溶液或鹽酸溶液調(diào)整。
4、超濾脫鹽將收集液加注射用水超濾脫鹽濃縮，超濾脫鹽的截留分子量為I萬道爾頓，當(dāng)超出液電導(dǎo)值小于1000 μ s/cm時(shí)，停止加注射用水繼續(xù)濃縮，濃縮至液體體積至IOL時(shí)，關(guān)閉超濾機(jī)，用注射用水沖洗，至超濾機(jī)回管中效價(jià)低于30單位/ml時(shí)，得濃縮液，取樣檢測(cè)效價(jià)。
5、除菌將濃縮液用O. 22 μ m微孔濾膜的過濾器進(jìn)行除菌過濾，得無菌濾液。
6、凍干根據(jù)濃縮液的效價(jià)加入輔料乳糖，控制成品的效價(jià)在70單位/mg以上，計(jì)算輔料乳糖的用量，分別用注射用水加熱溶解后過O. 22 μ m微孔濾膜，冷卻后加入到無菌濾液中，混合均勻后放入凍干箱中凍干。
凍干工藝條件如下將產(chǎn)品在零下2(T50°C溫度下預(yù)凍3飛小時(shí)(視盤中液量)，將導(dǎo)熱油以10°c /小時(shí)的速度升至35°c，真空度前箱保持小于15Pa，使制品升華。當(dāng)制品溫度達(dá)到30°C時(shí)，保溫3小時(shí)直至完全干燥。即得胰激肽原酶，純度95. 73%，效價(jià)70單位/mg,比活630單位/mg蛋白。
7、包裝將凍干好的成品混合均勻后粉碎，并過80目篩裝入密閉容器中，加蓋密封即得。
實(shí)施例3
I、粗提純
(I)胰臟粉或胰臟加28倍量純化水溶解提取，攪拌均勻后加入氯化鈣至濃度為·6. 5% (g/ml)，用氨水調(diào)整pH為6. 0 8. 0，零下20°C以下冷凍靜置沉淀，轉(zhuǎn)速3000轉(zhuǎn)/分以上離心收集沉淀。
(2)將上述沉淀加入到配制好的2% (g/ml)的草酸鹽溶液(每IOOml中含Ig的草酸銨，Ig的草酸鉀，胰臟粉或胰臟與草酸鹽溶液的比例為I :8)中，充分?jǐn)嚢?0分鐘溶解，靜置沉淀進(jìn)行粗提純，虹吸上清液得粗品液。
2、配制平衡液及洗脫液配制20% (g/ml)濃度的硫酸銨平衡液，調(diào)整pH為4. O和30%濃度的氯化鈉的洗脫液，調(diào)整pH6. 0，并檢測(cè)溶液的電導(dǎo)值。
3、層析
(I)平衡將HS-S印harose裝入直徑為φ 40cm,體積為50L的層析柱中，用ρΗ4· O、20% (g/ml)濃度的硫酸銨平衡液平衡，直至進(jìn)出層析柱的溶液pH值與電導(dǎo)值相同時(shí)平衡完畢。
(2)進(jìn)樣調(diào)整胰激肽原酶粗品的pH值與硫酸銨平衡液一致，粗品液電導(dǎo)值略低于硫酸銨平衡液電導(dǎo)值(以無機(jī)鹽或水調(diào)整電導(dǎo)值)，根據(jù)每升填料最大親和量3000萬單位計(jì)算上樣量，將樣品液進(jìn)行上柱。
(3)洗滌用ρΗ4· O、20% (g/ml)濃度的硫酸銨平衡液沖洗一個(gè)柱體積。
(4)洗脫用ρΗ6· 0,30% (g/ml)濃度的氯化鈉洗脫液沖洗柱子，同時(shí)用754分光光度計(jì)跟蹤檢測(cè)流出液在254nm處的吸收值，收集洗脫液，得收集液。以洗脫液效價(jià)大于30單位/cm時(shí)為洗脫收集起點(diǎn)，以洗脫液效價(jià)小于20單位/cm時(shí)為洗脫收集終點(diǎn)，收集濃液體積約為30 50L。
上述步驟(2) (3)中調(diào)整pH均采用6mol/L氫氧化鈉溶液或鹽酸溶液調(diào)整。
4、超濾脫鹽將收集液加注射用水超濾脫鹽濃縮，超濾脫鹽的截留分子量為I萬道爾頓，當(dāng)超出液電導(dǎo)值小于1000 μ s/cm時(shí)，停止加注射用水繼續(xù)濃縮，濃縮至液體體積至IOL時(shí)，關(guān)閉超濾機(jī)，用注射用水沖洗，至超濾機(jī)回管中效價(jià)低于30單位/ml時(shí)，得濃縮液，取樣檢測(cè)效價(jià)。
5、除菌將濃縮液用O. 22 μ m微孔濾膜的過濾器進(jìn)行除菌過濾，得無菌濾液。
6、凍干根據(jù)濃縮液的效價(jià)加入輔料乳糖，控制成品的效價(jià)在70單位/mg以上，計(jì)算輔料乳糖的用量，分別用注射用水加熱溶解后過O. 22 μ m微孔濾膜，冷卻后加入到無菌濾液中，混合均勻后放入凍干箱中凍干。[0078]凍干工藝條件如下將產(chǎn)品在零下2(T50°C溫度下預(yù)凍3飛小時(shí)(視盤中液量)，將導(dǎo)熱油以10°c /小時(shí)的速度升至35°c，真空度前箱保持小于15Pa，使制品升華。當(dāng)制品溫度達(dá)到30°C時(shí)，保溫3小時(shí)直至完全干燥。即得胰激肽原酶，純度95. 62%，效價(jià)75單位/mg,比活677單位/mg蛋白。
7、包裝將凍干好的成品混合均勻后粉碎，并過80目篩裝入密閉容器中，加蓋密封即得。
實(shí)施例4
I、粗提純
( I)胰臟粉或胰臟加20倍量純化水溶解提取，攪拌均勻后加入氯化鈣至濃度為5%(g/ml )，用氨水調(diào)整pH為6. (Γ8. 0，零下20°C以下冷凍靜置沉淀，轉(zhuǎn)速3000轉(zhuǎn)/分以上離心收集沉淀。
·[0083](2)將上述沉淀加入到配制好的4% (g/ml)的草酸鹽溶液(每IOOml中含2g的草酸銨，2g的草酸鉀，胰臟粉或胰臟與草酸鹽溶液的比例為I :4)中，充分?jǐn)嚢?0分鐘溶解，靜置沉淀進(jìn)行粗提純，虹吸上清液得粗品液。
2、配制平衡液及洗脫液配制20% (g/ml)濃度的硫酸鈉平衡液，調(diào)整pH為4. O和30% (g/ml)濃度的氯化鈉的洗脫液，調(diào)整pH6. 0，并檢測(cè)溶液的電導(dǎo)值。
3、層析
(I)平衡將HS-Sepharose裝入直徑為φ 40cm，體積為50L的層析柱中，用ρΗ4· O、20% (g/ml)濃度的硫酸鈉平衡液平衡，直至進(jìn)出層析柱的溶液pH值與電導(dǎo)值相同時(shí)平衡完畢。
(2)進(jìn)樣調(diào)整胰激肽原酶粗品的pH值與硫酸鈉平衡液一致，粗品液電導(dǎo)值略低于硫酸鈉平衡液電導(dǎo)值(以無機(jī)鹽或水調(diào)整電導(dǎo)值)，根據(jù)每升填料最大親和量3000萬單位計(jì)算上樣量，將樣品液進(jìn)行上柱。
(3)洗滌用pH4. O、20% (g/ml)濃度的硫酸鈉平衡液沖洗一個(gè)柱體積。
(4)洗脫用ρΗ6· 0,30% (g/ml)濃度的氯化鈉洗脫液沖洗柱子，同時(shí)用754分光光度計(jì)跟蹤檢測(cè)流出液在254nm處的吸收值，收集洗脫液，得收集液。以洗脫液效價(jià)大于30單位/cm時(shí)為洗脫收集起點(diǎn)，以洗脫液效價(jià)小于20單位/cm時(shí)為洗脫收集終點(diǎn)，收集濃液體積約為30 50L。
上述步驟(2) (3)中調(diào)整pH均采用6mol/L氫氧化鈉溶液或鹽酸溶液調(diào)整。
4、超濾脫鹽將收集液加注射用水超濾脫鹽濃縮，超濾脫鹽的截留分子量為I萬道爾頓，當(dāng)超出液電導(dǎo)值小于1000 μ s/cm時(shí)，停止加注射用水繼續(xù)濃縮，濃縮至液體體積至IOL時(shí)，關(guān)閉超濾機(jī)，用注射用水沖洗，至超濾機(jī)回管中效價(jià)低于30單位/ml時(shí)，得濃縮液，取樣檢測(cè)效價(jià)。
5、除菌將濃縮液用O. 22 μ m微孔濾膜的過濾器進(jìn)行除菌過濾，得無菌濾液。
6、凍干根據(jù)濃縮液的效價(jià)加入輔料甘露醇，控制成品的效價(jià)在70單位/mg以上，計(jì)算輔料甘露醇的用量，分別用注射用水加熱溶解后過O. 22 μ m微孔濾膜，冷卻后加入到無菌濾液中，混合均勻后放入凍干箱中凍干。
凍干工藝條件如下將產(chǎn)品在零下2(T50°C溫度下預(yù)凍3飛小時(shí)(視盤中液量)，將導(dǎo)熱油以10°c /小時(shí)的速度升至35°c，真空度前箱保持小于15Pa，使制品升華。當(dāng)制品溫度達(dá)到30°C時(shí)，保溫3小時(shí)直至完全干燥。即得胰激肽原酶，純度95. 0%，效價(jià)70單位/mg，比活600單位/mg蛋白。
7、包裝將凍干好的成品混合均勻后粉碎，并過80目篩裝入密閉容器中，加蓋密封即得。
實(shí)施例5
I、粗提純
( I)胰臟粉或胰臟加15倍量純化水溶解提取，攪拌均勻后加入氯化鈣至濃度為6%(g/ml )，用氨水調(diào)整pH為6. (Γ8. 0，零下20°C以下冷凍靜置沉淀，轉(zhuǎn)速3000轉(zhuǎn)/分以上離心收集沉淀。
(2)將上述沉淀加入到配制好的4% (g/ml)的草酸鹽溶液(每IOOml中含2g的草·酸銨，2g的草酸鉀，胰臟粉或胰臟與草酸鹽溶液的比例為I :7)中，充分?jǐn)嚢?0分鐘溶解，靜置沉淀進(jìn)行粗提純，虹吸上清液得粗品液。
2、配制平衡液及洗脫液配制30% (g/ml)濃度的硫酸鈉平衡液，調(diào)整pH為4. O和40% (g/ml)濃度的氯化銨的洗脫液，調(diào)整pH6. 0，并檢測(cè)溶液的電導(dǎo)值。
3、層析
(I)平衡將HS-S印harose裝入直徑為φ 40cm,體積為50L的層析柱中，用ρΗ4· O、30% (g/ml)濃度的硫酸鈉平衡液平衡，直至進(jìn)出層析柱的溶液pH值與電導(dǎo)值相同時(shí)平衡完畢。
(2)進(jìn)樣調(diào)整胰激肽原酶粗品的pH值與硫酸鈉平衡液一致，粗品液電導(dǎo)值略低于硫酸鈉平衡液電導(dǎo)值(以無機(jī)鹽或水調(diào)整電導(dǎo)值)，根據(jù)每升填料最大親和量3000萬單位計(jì)算上樣量，將樣品液進(jìn)行上柱。
(3)洗滌用pH4. O、30% (g/ml)濃度的硫酸鈉平衡液沖洗一個(gè)柱體積。
(4)洗脫用pH6. 0,40% (g/ml)濃度的氯化銨洗脫液沖洗柱子，同時(shí)用754分光光度計(jì)跟蹤檢測(cè)流出液在254nm處的吸收值，收集洗脫液，得收集液。以洗脫液效價(jià)大于30單位/cm時(shí)為洗脫收集起點(diǎn)，以洗脫液效價(jià)小于20單位/cm時(shí)為洗脫收集終點(diǎn)，收集濃液體積約為30 50L。
上述步驟(2) (3)中調(diào)整pH均采用6mol/L氫氧化鈉溶液或鹽酸溶液調(diào)整。
4、超濾脫鹽將收集液加注射用水超濾脫鹽濃縮，超濾脫鹽的截留分子量為I萬道爾頓，當(dāng)超出液電導(dǎo)值小于1000 μ s/cm時(shí)，停止加注射用水繼續(xù)濃縮，濃縮至液體體積至IOL時(shí)，關(guān)閉超濾機(jī)，用注射用水沖洗，至超濾機(jī)回管中效價(jià)低于30單位/ml時(shí)，得濃縮液，取樣檢測(cè)效價(jià)。
5、除菌將濃縮液用O. 22 μ m微孔濾膜的過濾器進(jìn)行除菌過濾，得無菌濾液。
6、凍干根據(jù)濃縮液的效價(jià)加入輔料甘露醇，控制成品的效價(jià)在70單位/mg以上，計(jì)算輔料甘露醇的用量，分別用注射用水加熱溶解后過O. 22 μ m微孔濾膜，冷卻后加入到無菌濾液中，混合均勻后放入凍干箱中凍干。
凍干工藝條件如下將產(chǎn)品在零下2(T50°C溫度下預(yù)凍3飛小時(shí)(視盤中液量)，將導(dǎo)熱油以10°c /小時(shí)的速度升至35°c，真空度前箱保持小于15Pa，使制品升華。當(dāng)制品溫度達(dá)到30°C時(shí)，保溫3小時(shí)直至完全干燥。即得胰激肽原酶，純度95. 01%,效價(jià)70單位/mg,比活602單位/mg蛋白。[0111]7、包裝將凍干好的成品混合均勻后粉碎，并過80目篩裝入密閉容器中，加蓋密封即得。
上述實(shí)施例制備得到的胰激肽原酶，與公開號(hào)為CN101073666的中國發(fā)明專利中公開的方法制備得到的胰激肽原酶，進(jìn)行比較，結(jié)果如表I、表2所示。
表I
I批號(hào)I純度I比活效價(jià)結(jié)i侖
實(shí)施例I 94.78%62178合格
實(shí)施例2 95.73%63070合格·本發(fā)明制備的胰-----
實(shí)施例3 95.62%67775合格
激肽原酶-----
實(shí)施例4 95.0%60070合格
實(shí)施例5 95.01 60270 合格
平均 95.228% 60672.6 合格
表2
Si 本發(fā)明制備的胰激肽原酶CN101073666制備的胰激

肽原酶
純度(％) 95.228%85%
比活(單位/mg蛋白) 606350
效價(jià)增加量 72.6單位/mg55單位/mg
pH 5.5-7.55.8-7.2
干燥失重(％) 不超過4%不超過4%
結(jié)論本發(fā)明的工藝制備得到的胰激肽原酶純度非常高，且各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于CNlO 1073666的各項(xiàng)指標(biāo)。
權(quán)利要求
1.一種高純度胰激肽原酶的制備工藝，其特征在于步驟如下 (1)粗提純 ①取胰臟粉或胰臟，加10 30倍量純化水溶解提取，攪拌均勻后加入氯化鈣至濃度為.5 8%，調(diào)整pH為6. O 8. 0，冷凍靜置沉淀，離心收集沉淀； ②將上述沉淀加入到事先配制好的2 4%的草酸鹽溶液中，充分?jǐn)嚢?5 35分鐘溶解，靜置沉淀進(jìn)行粗提純，虹吸上清液得粗品液； (2)溶液配制配制濃度為20 40%的無機(jī)鹽平衡液，調(diào)整pH為4.0;配制濃度為20 .40%的無機(jī)鹽洗脫液，調(diào)整pH為6. O ; (3)親和柱層析 ①平衡將裝有HS-Sepharose親和層析填料的層析柱，用上述配制的pH4.O、濃度.20 40%的無機(jī)鹽平衡液平衡，直至進(jìn)出層析柱的溶液pH值與電導(dǎo)值相同時(shí)平衡完畢； ②進(jìn)樣調(diào)整上述制備的含胰激肽原酶的粗品液的PH值與無機(jī)鹽平衡液一致，粗品液電導(dǎo)值等于平衡液電導(dǎo)值，根據(jù)每升填料最大親和量3000萬單位進(jìn)行上樣；③洗滌用上述配制的PH4.O、濃度20 40%的無機(jī)鹽平衡液沖洗一個(gè)柱體積； ④洗脫用上述配制的PH6.O、濃度20 40%的無機(jī)鹽洗脫液沖洗柱子，同時(shí)用754分光光度計(jì)跟蹤檢測(cè)流出液在254nm處的吸收值，收集洗脫液，得收集液； (4)超濾脫鹽將上述收集液加注射用水超濾脫鹽濃縮，當(dāng)溶液電導(dǎo)值小于1000μ s/cm時(shí)，停止加注射用水，繼續(xù)濃縮，得濃縮液； (5)除菌上述濃縮液用微孔濾膜進(jìn)行除菌過濾，得無菌濾液； (6)凍干加入輔料進(jìn)行凍干，即得胰激肽原酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的一種高純度胰激肽原酶的制備工藝，其特征在于所述步驟(I)①中，PH調(diào)整采用氨水調(diào)節(jié)，冷凍靜置沉淀溫度為零下20°C以下，離心轉(zhuǎn)速為大于3000轉(zhuǎn)/分。
3.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的一種高純度胰激肽原酶的制備工藝，其特征在于所述步驟(1)②中，2 4%的草酸鹽溶液的組成為每IOOml草酸鹽溶液中含I 2g的草酸銨，I 2g的草酸鉀。
4.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的一種高純度胰激肽原酶的制備工藝，其特征在于所述步驟(2)中，無機(jī)鹽選自硫酸鈉、硫酸銨、硫酸鉀，硫酸鎂、氯化鈉或氯化銨中的一種或多種。
5.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的一種高純度胰激肽原酶的制備工藝，其特征在于所述步驟(3)中，所用層析柱直徑為φ40cm，體積為50L ;以洗脫液效價(jià)大于30單位/cm時(shí)為洗脫收集起點(diǎn)，以洗脫液效價(jià)小于20單位/cm時(shí)為洗脫收集終點(diǎn)。
6.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的一種高純度胰激肽原酶的制備工藝，其特征在于所述步驟(4)中，超濾脫鹽的截留分子量為I萬道爾頓，當(dāng)濃縮至液體體積為1/3 1/5時(shí)，關(guān)閉超濾機(jī)，用注射用水沖洗，至超濾機(jī)回管中效價(jià)低于30單位/ml時(shí)，得濃縮液。
7.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的一種高純度胰激肽原酶的制備工藝，其特征在于所述步驟(5)中，微孔濾膜為O.22 μ m的微孔濾膜。
8.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的一種高純度胰激肽原酶的制備工藝，其特征在于所述步驟(6)中，加入輔料進(jìn)行凍干的具體步驟如下輔料用注射用水加熱溶解后過O.22μπι微孔濾膜，冷卻后加入到無菌濾液中，控制無菌濾液的效價(jià)在70單位/mg以上，混合均勻后放入凍干箱中凍干。
9.根據(jù)權(quán)利要求
8所述的一種高純度胰激肽原酶的制備工藝，其特征在于所述凍干的工藝條件如下將產(chǎn)品在零下20 50°C溫度下預(yù)凍3 5小時(shí)，將導(dǎo)熱油以10°C /小時(shí)的速度升至35°C，真空度前箱保持小于15Pa，使制品升華，當(dāng)制品溫度達(dá)到30°C時(shí)，保溫3小時(shí)直至完全干燥。
10.根據(jù)權(quán)利要求
8所述的一種高純度胰激肽原酶的制備工藝，其特征在于所述輔料選自乳糖、甘露醇、明膠或右旋糖苷中的一種或多種。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種高純度胰激肽原酶的制備工藝，該制備工藝包括產(chǎn)品粗提純、溶液配制、親和柱層析、超濾脫鹽、無菌過濾、凍干、包裝等工序，所得到的產(chǎn)品純度高達(dá)95%以上，效價(jià)增加70單位/mg以上，比活達(dá)到600單位/mg蛋白以上，可以做為注射劑的原料藥進(jìn)行應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N9/64GKCN102787111SQ201210258712
公開日2012年11月21日 申請(qǐng)日期2012年7月24日
發(fā)明者劉盛儒, 孫巖, 張梅村, 王基偉, 王增鑫, 遲創(chuàng)成, 隗青 申請(qǐng)人:濟(jì)南維爾康生化制藥有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan