專利名稱:一株棘孢木霉菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物病害的生物防治領(lǐng)域，尤其涉及一株棘孢木霉菌株及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
辣椒疫病俗稱“死秧病”,是由辣椒疫霉(Phytophthora capsici)引起的一種土傳病害。該病原菌的細(xì)胞壁的主要成份是纖維素，而不同于常見的真菌病原菌(如子囊菌和擔(dān)子菌)細(xì)胞壁的主要成份是幾丁質(zhì)。辣椒疫病是我國辣椒上的一種毀滅性病害，可造成嚴(yán)重產(chǎn)量損失。由于該病害是一種土傳病害，病原菌可長期存活在土壤中，該病害也是生產(chǎn)上最難防治的一種病害。尤其該病原菌生物學(xué)特征的獨(dú)特性，病害防治的方法和技術(shù)也明顯不同與其它病害的防治。
該病害目前主要采用化學(xué)農(nóng)藥防治，這些常規(guī)防控技術(shù)已難以有效控制，且易引起生態(tài)、環(huán)境問題。而生防制劑在該病害的應(yīng)用更是罕見。雖然木霉菌是目前為止研究最多的生防真菌，其分布很廣，生存于多種生態(tài)環(huán)境中。據(jù)不完全資料統(tǒng)計(jì)，木霉至少對18個(gè)屬29種病原真菌在體外或體內(nèi)表現(xiàn)有拮抗作用。木霉容易分離和培養(yǎng)，可在多種基質(zhì)上生長，具有對一定逆境條件的忍耐能力，這些特點(diǎn)決定了木霉菌在植病生防中的重要地位。其作用機(jī)制一般認(rèn)為有4種，競爭作用，重寄生作用，酶的溶菌作用和抗菌素類的產(chǎn)生。從致病的植株生境中分離生防菌是一種常用的得到生防微生物的做法。然而，研究木霉菌防治辣椒疫病的機(jī)制幾乎未見。
公開號CN101485336B的發(fā)明專利公開了一種防治作物土傳病害的木霉菌制劑及其制備方法。該制劑的組成是，在載體中含有有效量的哈茨木霉(Trichoderma Harzianum)菌株TH-192CGMCC NO. 2634。制備方法包括菌株TH-192的擴(kuò)大培養(yǎng)、液體和固體發(fā)酵培養(yǎng)及添加促進(jìn)劑等步驟。該制劑對根腐病、白絹病、立枯病、菌核病等作物土傳病害具有一定的防治作用，但其未公開對辣椒疫病的防治情況。
公開號CN102428966A的發(fā)明專利申請公開了一種作物病害防治復(fù)合生物制劑。其原料組成為擬康氏木霉發(fā)酵液、枯草芽孢桿菌發(fā)酵液、水溶性甲殼糖、味精殘液、黃腐酸鉀。其中，擬康氏木霉和枯草芽孢桿菌是經(jīng)過篩選和誘變處理獲得的高效菌株，并通過液體深層發(fā)酵技術(shù)獲得擬康氏木霉和枯草芽孢桿菌發(fā)酵液，再組合制成作物病害防治復(fù)合生物制劑，特別地，對枯萎病和黃萎病具有較明顯的防治效果。但該復(fù)合生物制劑需要多種菌株和原料，且配制過程較繁瑣，不利于大規(guī)模推廣應(yīng)用。
這些木霉菌防治的病原菌都是由子囊菌和擔(dān)子菌引起的，與生防辣椒疫病的機(jī)制完全不同。我們篩選的生防菌是針對具有纖維素細(xì)胞壁的辣椒疫霉菌，不同于這些研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一株棘孢木霉菌株，具有較強(qiáng)的重寄生作用，能有效降解辣椒疫霉菌的菌絲體，具有較好的辣椒疫病生防潛力。
3[0008]一株棘孢木霉菌株,命名為棘孢木霉(Trichoderma asperellum)Thz01,保藏號為CGMCC No. 6422。所述的棘孢木霉菌株已保藏，保藏單位位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期2012年8月13號，保藏號=CGMCC No. 6422。依據(jù)形態(tài)學(xué)特征和分子數(shù)據(jù)分析，該菌株的分類命名為棘孢木霉(Trichoderma asperellum)。所述的棘孢木霉ThzOl菌株是從臨安高山蔬菜園發(fā)病的辣椒根圍土土壤中采集得到的，該菌株的生物學(xué)特性為菌落在PDA固體培養(yǎng)基上25°C下培養(yǎng)，3-4天擴(kuò)展為9cm,初期白色稀疏，菌絲沿培養(yǎng)基表面匍匐生長，后形成綠色產(chǎn)孢區(qū)，反面白色，菌絲具隔；分生孢子球形，近球形，單個(gè)近無色，聚集時(shí)呈淡黃綠色，壁光滑。瓶梗直、安瓶形，寬度
3.0-5. 6 μ m。CMD上分生孢子球形至亞球形，3. 8-5. 9X2. 8-4. 8 μ m。形態(tài)學(xué)特征符合棘孢木霉菌特征。依據(jù)ITS rDNA (SEQ ID NO. I)和轉(zhuǎn)錄因子la(tef I-a)序列分析,與GenBank中的模式和證實(shí)的棘孢木霉菌序列最一致。這些證實(shí)該菌株為棘孢木霉(Trichodermaasperellum)。
本發(fā)明提供了上述棘孢木霉菌株在抑制辣椒疫霉生長中的應(yīng)用。該菌株在與辣椒疫霉對峙培養(yǎng)時(shí)，生長迅速，能有效覆蓋辣椒疫霉的菌落，明顯重寄生于辣椒疫霉菌，并將其菌絲體完全降解，已顯示是一個(gè)具有較好生防潛力的微生物資源。
本發(fā)明還提供了一種防治辣椒疫病的生防制劑的制備方法，包括將棘孢木霉ThzOl種子液接種到煮熟滅菌的麥粒中，培養(yǎng)12-20天，培養(yǎng)期間及時(shí)翻動(dòng)，制得生防制劑。
所述的棘孢木霉ThzOl種子液可以通過如下方法制備將棘孢木霉ThzOl接種到PDA培養(yǎng)基中，于23-28°C下培養(yǎng)5_6天；培養(yǎng)完成后，將孢子刮入滅菌水中，配制得到棘孢木霉ThzOl種子液。
所述的棘孢木霉ThzOl種子液的活菌濃度優(yōu)選為IO7-IO8個(gè)/mL。
所述的麥粒是適合棘孢木霉ThzOl生長的基質(zhì)。
棘孢木霉ThzOl種子液接入麥粒后的培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選為15天，便于菌種充分生長。
培養(yǎng)期間及時(shí)翻動(dòng)可以使麥粒上充分長上棘孢木霉ThzOl孢子。
以每千克麥粒計(jì)，所述的棘孢木霉ThzOl種子液的用量優(yōu)選為2_4mL。
本發(fā)明還提供了一種采用上述制備方法制得的生防制劑，該生防制劑為顆粒狀，含有棘孢木霉ThzOl。
本發(fā)明還提供了一種防治辣椒疫病的方法，包括將上述生防制劑與辣椒種子混合，然后進(jìn)行接種、栽培；
或者，在辣椒苗移植后，將上述生防制劑施加于辣椒苗根部，然后進(jìn)行栽培。
為了獲得更好的生防效果，所述的生防制劑的用量優(yōu)選為I. 0-1. 5g/株辣椒，約為20-30粒/株辣椒。
本發(fā)明提供的棘孢木霉ThzOl是從辣椒生境中分離出來的，對辣椒疫霉菌具有顯著的拮抗作用，明顯重寄生于辣椒疫霉菌，在培養(yǎng)基上能完全降解辣椒疫霉菌的菌絲體；用該菌株制備得到的生防制劑，可有效防治辣椒疫病。


圖I為棘孢木霉ThzOl與辣椒疫霉對峙培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中，I號為對照；2、3、4號皿左邊的菌碟為辣椒疫霉，右邊的菌碟為棘孢木霉ThzOI。
圖2為本發(fā)明實(shí)施例3中制得的生防制劑。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例I菌株的分離、純化、鑒定和保藏
I、木霉菌的分離、純化
將從發(fā)病的辣椒根圍土采集的土壤充分混勻后，去少量土粒放于含有氯霉素的PDA平板上，每個(gè)平板4個(gè)土粒，重復(fù)三次。置于25°C下黑暗培養(yǎng)。等到木霉產(chǎn)孢后，及時(shí)挑出到新的PDA平板上。
短期保存的菌種于PDA斜面試管中，保存于4°C冰箱中。長期保存的木霉菌在_20°C的冰箱中(孢子+17%脫脂奶粉+硅膠顆粒)。
2、木霉囷的種類鑒定
該菌株的生物學(xué)特性為菌落在PDA固體培養(yǎng)基上25°C下培養(yǎng)，3-4天擴(kuò)展為9cm，初期白色稀疏，菌絲沿培養(yǎng)基表面匍匐生長，后形成綠色產(chǎn)孢區(qū)，反面白色，菌絲具隔；分生孢子球形，近球形，單個(gè)近無色，聚集時(shí)呈淡黃綠色，壁光滑。瓶梗直、安瓶形，寬度
3.0-5. 6μπι。CMD上分生孢子球形至亞球形，3. 8-5. 9X2. 8-4. 8 μ m。形態(tài)學(xué)特征符合棘孢木霉菌特征。
對該菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定
(I)真菌基因組的提取采用CTAB法提取真菌基因組。
(2)基因片段的擴(kuò)增1TS rDNA、tef I-a的PCR擴(kuò)增
ITS1-5. 8S-ITS2片段采用真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)通用引物ITS6(5’ -GAAGGTGAAGTCGTAACAAGG-3，)和 ITS4 (5，-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3，)擴(kuò)增 ITS 和 5. 8S rDNA (Cooke& Duncan 1997)。
建立PCR反應(yīng)體系，按如下反應(yīng)體系(50 μ I)順序加樣
ddH2036.5 μ
MgC12 (25 niM)3 μ
I Oxbuffer5 μ
dNTP(2.5 mM)I μ
Pri merl (20 μ Μ)Iul
Primer2(20 μΜ)I μ
DNA(IOOngzjil)2 μ
Taq-DNA polymerase(5U4il) 0.5 μ,ITotal50 μ
PCR 反應(yīng)條件94°C預(yù)變性 3min ;94°C變性 lmin，51°C退火 30sec，72°C延伸 Imin共31個(gè)循環(huán)；72°C延伸7min。4°C停止反應(yīng)。取8μ I擴(kuò)增產(chǎn)物在I. 2%瓊脂糖電泳檢測，并在凝膠成像系統(tǒng)(Gel DoclOOO)進(jìn)行拍照、分析。
Tef Ι-a 基因采用通用引物 Ef728M (Carbone and Kohn 1999)和tefIR(KulInig-Gradinger et al. 2002)。
在50ul反應(yīng)體系中，加入
ddH2036.5 μ
MgC12 (25 mM)3 μ
IOxbuffer5 μ I
dNTP(2.5 mM)I μ
Primer I (20 μΜ)Iul
Primer2(20 μΜ)I μ
DNA(100 ng/μ )2 μ
Taq-DNA polyinerase(5U4il) 0.5 μ Total50 μ]
PCR 反應(yīng)條件94°C預(yù)變性 5min ;94°C變性 45s，63°C退火 45s，72°C延伸 lmin 共35個(gè)循環(huán)；72°C延伸7min。4°C停止反應(yīng)。取8 μ I擴(kuò)增產(chǎn)物在I. 2%瓊脂糖電泳檢測，并在凝膠成像系統(tǒng)(Gel DoclOOO)進(jìn)行拍照、分析。
(3) PCR產(chǎn)物序列測序
PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行雙向測序，ITS、tef I-a擴(kuò)增產(chǎn)物分別用擴(kuò)增引物測序。
(4)序列分析
測序后的序列用Clustal X程序進(jìn)行rDNA序列的聯(lián)配(alignment)比較、編輯,然后提交Gen Bank0將序列與Gen Bank中的木霉的ITS1、ITS2和5. 8S rDNA序列進(jìn)行同源性比較。
用引物ITS4、ITS6測序拼接后得到的序列如SEQ ID NO. I所示。
用引物Ef728M和tef IR測序拼接后得到的序列如SEQ ID NO. 2所示。
將序列與Gene Bank上的序列進(jìn)行比對,可確定該菌株為棘孢木霉(Trichodermaasperellum)，命名為棘孢木霉ThzOl。
3、木霉菌的保藏
將棘孢木霉ThzOl保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期:2012年8月13號，保藏號=CGMCC No. 6422。
實(shí)施例2對峙培養(yǎng)法
將棘孢木霉ThzOl和辣椒疫霉菌株轉(zhuǎn)接在PDA培養(yǎng)基上活化，辣椒疫霉生長48h后，用直徑0. 5cm打孔器在菌落邊緣切成菌餅，將菌餅接種到培養(yǎng)皿的一端，25°C培養(yǎng)48h后，將打好孔的木霉菌株接種到培養(yǎng)皿另一端，每個(gè)木霉菌株處理三次，同時(shí)以只接疫霉菌做空白對照，培養(yǎng)7天后觀察是否有拮抗作用，并拍照記錄。
棘孢木霉ThzOl菌株與辣椒疫霉菌株對峙培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖I。I號為對照，2、3、4號皿左邊的菌碟為辣椒疫霉，右邊的菌碟為棘孢木霉ThzOl，可見棘孢木霉ThzOl完全覆蓋辣椒疫霉的菌絲，并將其菌絲消解，使其無法侵染辣椒，說明該棘孢木霉能夠抑制辣椒疫病的發(fā)生。
實(shí)施例3防治辣椒疫病
生防制劑的制備利用飼料小麥粒作為基質(zhì)，將棘孢木霉ThzOl制成生防制劑。具體步驟為
(I)菌株活化將棘孢木霉ThzOl接種到PDA培養(yǎng)基中，于25°C下培養(yǎng)5天；
(2)制備種子液菌株活化后，將孢子刮下來，刮入滅菌水中配制成活菌濃度為IO7個(gè)/mL的孢子懸浮液，即為種子液；
(3)將種子液接種到煮熟滅菌的麥粒中，培養(yǎng)15天，培養(yǎng)期間及時(shí)翻動(dòng)，使麥粒上充分長上棘孢木霉ThzOl孢子，制得生防制劑；其中，以每千克麥粒計(jì)，種子液的用量為3mL。
所制得的生防制劑產(chǎn)品見圖2。
生防實(shí)驗(yàn)
(I)辣椒定殖(即移苗)期間，在根際周圍施用生防制劑，每株施用25-30粒(約I. 25-1. 5g)。
(2) 一個(gè)月后，用灌根接種方法接種疫霉菌孢子懸浮液，懸浮液濃度為IO7個(gè)/ml，每株辣椒接種3mL。每個(gè)處理15株，設(shè)計(jì)3個(gè)重復(fù)。
(3)接種病原菌后，每天記錄發(fā)病情況，并計(jì)算發(fā)病率和病情。
經(jīng)分析，接種生防制劑的防治效果達(dá)到了 65% -72%。
權(quán)利要求
1.一株棘孢木霉菌株，其特征在于，命名為棘孢木霉(Trichoderma asperellum)ThzOl，保藏號為 CGMCC No. 6422。
2.如權(quán)利要求
I所述的棘孢木霉菌株在抑制辣椒疫霉生長中的應(yīng)用。
3.一種防治辣椒疫病的生防制劑的制備方法，其特征在于，包括將棘孢木霉ThzOl種子液接種到煮熟滅菌的麥粒中，培養(yǎng)12-20天，培養(yǎng)期間及時(shí)翻動(dòng)，制得生防制劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求
3所述的制備方法，其特征在于，所述的棘孢木霉ThzOl種子液的活菌濃度為IO7-IO8個(gè)/mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求
3所述的制備方法，其特征在于，以每千克麥粒計(jì)，所述的棘孢木霉ThzOl種子液的用量為2-4mL。
6.采用如權(quán)利要求
3-5任一所述的制備方法制得的生防制劑。
7.一種防治辣椒疫病的方法，其特征在于，包括將如權(quán)利要求
6所述的生防制劑與辣椒種子混合，然后進(jìn)行接種、栽培；或者，在辣椒苗移植后，將如權(quán)利要求
6所述的生防制劑施加于辣椒苗根部，然后進(jìn)行栽培。
8.根據(jù)權(quán)利要求
7所述的方法，其特征在于，所述的生防制劑的用量為I.0-1. 5g/株辣椒。
專利摘要
本發(fā)明公開了一株棘孢木霉菌株及其應(yīng)用，該棘孢木霉菌株命名為棘孢木霉(Trichoderma asperellum)Thz01，保藏號為CGMCC No.6422。本發(fā)明的棘孢木霉菌株是從辣椒生境中分離出來的，對辣椒疫霉菌具有顯著的拮抗作用，明顯重寄生于辣椒疫霉菌，能有效降解辣椒疫霉菌的菌絲體；用該菌株制備得到的生防制劑，可有效防治辣椒疫病。
文檔編號A01N63/04GKCN102911878SQ201210365179
公開日2013年2月6日 申請日期2012年9月27日
發(fā)明者張敬澤, 蔣恒, 蕭芳 申請人:浙江大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan