專利名稱:產(chǎn)丁二酸的菌株及其生產(chǎn)丁二酸的方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體而言，涉及一株產(chǎn)丁二酸的菌株及其生產(chǎn)丁二酸的方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
丁二酸(又名琥珀酸)，是一種常見的天然有機(jī)酸，廣泛存在于人體、動物、植物和微生物中。丁二酸作為一種重要的化工原料，在醫(yī)藥、食品以及表面活性劑等行業(yè)有著廣泛的用途。近年來，隨著化石資源的日益枯竭和環(huán)境問題的日益嚴(yán)重，采用生物合成法代替?zhèn)鹘y(tǒng)的化學(xué)合成法制備丁二酸備受矚目，美國能源部將丁二酸列為未來12種最有價值的生物煉制產(chǎn)品之一。
生物合成丁二酸，是利用細(xì)菌，真菌等各種微生物，以葡萄糖或其他各種水解液為碳源，經(jīng)微生物發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸。利用微生物發(fā)酵法轉(zhuǎn)化可再生資源(葡萄糖、木糖等)，由于原料來源廣泛且價格低廉，污染小，環(huán)境友好，且在發(fā)酵過程中可以吸收固定CO2，能有效緩解溫室效應(yīng)，故成為近年來研究的熱點(diǎn)。
發(fā)酵菌株是丁二酸生物合成的關(guān)鍵點(diǎn)之一，但大部分菌株只能產(chǎn)生較低濃度的丁二酸。提高丁二酸的發(fā)酵產(chǎn)酸能力有很多的方法，然而迄今為止，在純厭氧條件下，高效利用葡萄糖為單一性碳源并高產(chǎn)丁二酸的菌株卻鮮有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一株能夠在純厭氧條件下，高效利用葡萄糖為單一性碳源并高產(chǎn)丁二酸的菌株，以及其產(chǎn)生丁二酸的方法和應(yīng)用。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)目的，本發(fā)明提供了一株產(chǎn)丁二酸的菌株，其分類命名為大腸埃希氏菌co7i) BER208，其保藏編號為CCTCC Ν0:Μ 2012351。
本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)丁二酸的方法，包括如下步驟發(fā)酵上述提及的大腸埃 MiEscherichia coli) BER208 CCTCC Ν0:Μ 2012351，得到丁二酸。
進(jìn)一步地，所述方法包括將固體平板培養(yǎng)基培養(yǎng)的大腸埃希氏菌BER208接種于種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到種子液；然后將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中以得到丁二酸。
優(yōu)選地，所述方法為將經(jīng)固體平板培養(yǎng)基37攝氏度，厭氧條件培養(yǎng)24小時的大腸埃希氏菌BER208接種于種子培養(yǎng)基，充二氧化碳，在37攝氏度，200轉(zhuǎn)/分鐘的條件下厭氧培養(yǎng)12小時得到種子液；
將所述種子液按照2%的接種量接種于所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，充二氧化碳，并在37攝氏度厭氧培養(yǎng)48小時以得到丁二酸。
優(yōu)選地，所述充二氧化碳均為充二氧化碳2分鐘，以保存培養(yǎng)時的厭氧環(huán)境。
優(yōu)選地，所述固體平板培養(yǎng)基的配方為梓檬酸3 g ·ΙΛ Na2HPO4 · 12H20 4 g · ΛKH2PO4 8 g · ΙΛ (NH4)2HPO4 8 g · Λ NH4Cl O. 2 g · Λ (NH4)2SO4 O. 75 g · Λ MgSO4 · 7Η20I g · ΙΛ CaCl2 · 2Η20 10. O mg · Λ ZnSO4 · 7Η20 O. 5 mg · Λ CuCl2 · 2Η20 O. 25 mg · ΛMnSO4 · H2O 2· 5 mg · Λ CoCl2 · 6Η20 I. 75 mg · Λ H3BO3 O. 12 mg · Λ Al2 (S04 )3 I. 77mg ·L-1, Na2MoO4 ·2Η20 O. 5 mg .L-1,朽1 檬酸鐵 16. I mg .L-1,瓊脂 15_20g/L,葡萄糖 10_15g/L0
優(yōu)選地,所述種子培養(yǎng)基的配方為蛋白胨10g/L,酵母粉5g/L, NaCl 5g/L,葡萄糖 10-15g/L。
優(yōu)選地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為:檸檬酸3 g · L-1，Na2HPO4 · 12H20 4 g · L-1，KH2PO4 8 g · ΙΛ (NH4)2HPO4 8 g · Λ NH4Cl O. 2 g · Λ (NH4)2SO4 O. 75 g · Λ MgSO4 · 7Η20I g · ΙΛ CaCl2 · 2Η20 10. O mg · Λ ZnSO4 · 7Η20 O. 5 mg · Λ CuCl2 · 2Η20 O. 25 mg · ΛMnSO4 · H2O 2· 5 mg · Λ CoCl2 · 6Η20 I. 75 mg · Λ H3BO3 O. 12 mg · Λ Al2 (S04 )3 I. 77mg · L-1, Na2MoO4 · 2Η20 O. 5 mg · Ι71，朽1 檬酸鐵 16. I mg · I71，堿式碳酸鎂 24_42g/L,葡萄糖30-40g/L。
本發(fā)明還提供了大腸埃希氏菌{Escherichia coli) BER208在發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸中的應(yīng)用。
本發(fā)明的產(chǎn)丁二酸的菌株，與現(xiàn)有的產(chǎn)丁二酸的菌株相比，其有益效果在于 本發(fā)明大腸埃希氏菌co7i)BER208 CCTCC Ν0:Μ 2012351菌株可以在發(fā)
酵培養(yǎng)基中，以葡萄糖為單一性碳源在純厭氧條件下快速生長，并高產(chǎn)丁二酸在厭氧搖瓶中其48小時菌體密度可達(dá)到0D_=6. 87，丁二酸產(chǎn)量達(dá)到10. 5g/L，而現(xiàn)有的出發(fā)菌株大腸埃希氏菌co7i)BER108 CCTCC Ν0:Μ 2012068在相同的條件下，生長速度緩慢，48小時菌體密度僅為0D_=3. 7，丁二酸產(chǎn)量僅為4. 8g/L，相對于出發(fā)菌株，本發(fā)明生長速度快且丁二酸產(chǎn)量提高了 2倍多，因此本發(fā)明菌株具有重大的社會意義和經(jīng)濟(jì)價值。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明的生物材料大腸埃希氏菌co7i)BER208的保藏日期為2012年09月14日，保藏單位全稱為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡稱CCTCC，地址為中國.武漢.武漢大學(xué)，其保藏編號為CCTCC NO: M 2012351。
本發(fā)明所述的出發(fā)菌株大腸埃希氏菌coli) BER108的保藏單位全稱為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡稱CCTCC，地址為中國.武漢.武漢大學(xué)，其保藏編號為CCTCC NO: M 2012068，其公開來源是申請?zhí)枮?01210138292. 6，
公開日為2012年8月22日，公開號為CN102643770A的中國專利申請。
本發(fā)明的大腸埃希氏菌coli) BER208為高產(chǎn)丁二酸的菌株。本發(fā)明的大腸埃希氏菌coli、BER208菌落為圓形邊緣整齊，表面光滑，半透明，小凸起。
本發(fā)明的大腸埃希氏菌{Escherichia coli ) BER208是將出發(fā)菌株大腸埃希氏菌{Escherichia co7i )BER108 (CCTCC NO M 2012068)經(jīng)連續(xù)馴化培養(yǎng)后，利用以葡萄糖為單一性碳源的固體培養(yǎng)基平板，在純厭氧條件下篩選得到可以快速生長的菌株，再經(jīng)過厭氧搖瓶發(fā)酵篩選獲得可以高產(chǎn)丁二酸的菌株為目標(biāo)菌株，所述篩選方法可以包括如下步驟 I)種子培養(yǎng)基培養(yǎng)將出發(fā)菌株大腸埃希氏菌co7i)BER108 (CCTCCNO M 2012068)利用種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，37°C，200r/min，在裝液量為IOmL的血清瓶中培養(yǎng)12h得到對數(shù)生長期的菌液；2)連續(xù)培養(yǎng)馴化誘變將步驟I)中所述的對數(shù)生長期的菌液以10%(v/v)的接種量接種到裝有300mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL連續(xù)培養(yǎng)裝置中，37°C水浴加熱，通入過濾除菌的CO2維持厭氧環(huán)境，并以I. 5mL/h的速率向培養(yǎng)裝置中流加新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基。定時取樣檢測培養(yǎng)裝置中菌體的密度，當(dāng)反應(yīng)器中菌體密度達(dá)到0D_=2 3，并保持48h無較大變化，說明表示菌體在該流加速度下生長穩(wěn)定，此時馴化過程完成一個循環(huán)。將新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基的流加速度加倍，進(jìn)行下一個循環(huán)的連續(xù)培養(yǎng)。直至發(fā)酵培養(yǎng)基的流加速度達(dá)到12mL/h，菌體生長性能在該條件下維持穩(wěn)定；
3)固體平板初篩在無菌操作條件下，從步驟2)連續(xù)培養(yǎng)裝置中取出2 4mL菌液，用無菌水稀釋I X IO4倍，取100 μ L涂布在固體平板上，37°C厭氧培養(yǎng)24h，挑選生長較大，較為飽滿的菌落；
4)固體平板復(fù)篩將步驟3)中篩選到的菌株在固體平板上反復(fù)轉(zhuǎn)點(diǎn)培養(yǎng)，37°C厭氧培養(yǎng)12h，挑選生長較大，較為飽滿的菌落；
5)厭氧搖瓶發(fā)酵篩選將步驟4)中篩選出的菌株接種到種子培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，37°C，200r/min，培養(yǎng)12h，然后在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，接種量為2% (v/v), 37°C, 200r/min,培養(yǎng)48h ;考察步驟4)中篩選出的菌落中篩選出生長速度快，產(chǎn)酸量高的菌株。
其中，所述種子培養(yǎng)基的配方為蛋白胨10g/L,酵母粉5g/L, NaCl 5g/L,葡萄糖10-20g/L。
其中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為梓檬酸3 g ·ΙΛ Na2HPO4 · 12H20 4 g · Λ KH2PO48 g · ΙΛ (NH4)2HPO4 8 g · ΙΛ NH4Cl O. 2 g · Λ (NH4)2SO4 O. 75 g · Λ MgSO4 · 7Η20 Ig · ΙΛ CaCl2 · 2Η20 10. O mg · Λ ZnSO4 · 7Η20 O. 5 mg · Λ CuCl2 · 2Η20 O. 25 mg · ΛMnSO4 · H2O 2· 5 mg · Λ CoCl2 · 6Η20 I. 75 mg · Λ H3BO3 O. 12 mg · Λ Al2 (S04 )3 I. 77mg · L-1, Na2MoO4 · 2Η20 O. 5 mg · Ι71，朽1 檬酸鐵 16. I mg · I71，堿式碳酸鎂 24_42g/L,葡萄糖30-40g/L。
其中，固體平板培養(yǎng)基的配方為梓檬酸3 g -T1jNa2HPO4 · 12H20 4 g · Λ KH2PO48 g · ΙΛ (NH4)2HPO4 8 g · ΙΛ NH4Cl O. 2 g · Λ (NH4)2SO4 O. 75 g · Λ MgSO4 · 7Η20 Ig · ΙΛ CaCl2 · 2Η20 10. O mg · Λ ZnSO4 · 7Η20 O. 5 mg · Λ CuCl2 · 2Η20 O. 25 mg · ΛMnSO4 · H2O 2· 5 mg · Λ CoCl2 · 6Η20 I. 75 mg · Λ H3BO3 O. 12 mg · Λ Al2 (S04 )3 I. 77mg ·L-1, Na2MoO4 ·2Η20 O. 5 mg .L-1,朽1 檬酸鐵 16. I mg .L-1,瓊脂 15_20g/L,葡萄糖 10_15g/L0
根據(jù)以下實(shí)施例，可以更好的理解本發(fā)明。實(shí)施案例中所描述的具體的物料配比，工藝條件及其結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求
書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。
實(shí)施例I
本實(shí)施例說明將大腸埃希氏菌coli) BER108 (CCTCC M 2012068)進(jìn)行第一步連續(xù)培養(yǎng)馴化的方法。
大腸桿菌原始菌株進(jìn)行第一步連續(xù) 培養(yǎng)馴化的方法如下
將凍存管中的大腸埃希氏菌co7i)BER108 (CCTCC M 2012068)作為出發(fā)菌株，在裝液量為IOmL種子培養(yǎng)基中的25mL血清瓶中培養(yǎng)，37°C，200r/min培養(yǎng)12h得到對數(shù)生長期的菌液；將對數(shù)生長期的菌液以10% (v/v)的接種量接種到裝有300mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL連續(xù)培養(yǎng)裝置中，37°C水浴加熱，通入過濾除菌的CO2維持厭氧環(huán)境，并以
1.5mL/h的速率向培養(yǎng)裝置中流加新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基。定時取樣檢測培養(yǎng)裝置中菌體的密度，當(dāng)反應(yīng)器中菌體密度達(dá)到0D_=2 3，并保持48h無較大變化，說明表示菌體在該流加速度下生長穩(wěn)定，此時馴化過程完成一個循環(huán)。將新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基的流加速度加倍，進(jìn)行下一個循環(huán)的連續(xù)培養(yǎng)。直至發(fā)酵培養(yǎng)基的流加速度達(dá)到12mL/h，菌體生長性能在該條件下維持穩(wěn)定，準(zhǔn)備實(shí)施例2的篩選步驟。 其中，所述的種子培養(yǎng)基的配方為蛋白胨IOg/L,酵母粉 5g/L, NaCl 5g/L,葡萄糖 10_20g/L。
所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為梓檬酸3 g · ΙΛ Na2HPO4 · 12H20 4 g · Λ KH2PO4 8g.L-1，(NH4)2HPO4 8 g·!/1，NH4Cl 0.2 g · Λ (NH4)2SO4 0. 75 g · Λ MgSO4 · 7H20 I g · ΛCaCl2 · 2H20 10. 0 mg · Λ ZnSO4 · 7H20 0. 5 mg · Λ CuCl2 · 2H20 0. 25 mg · Λ MnSO4 · H2O
2.5 mg · ΙΛ CoCl2 · 6H20 I. 75 mg · Λ H3BO3 0. 12 mg · Λ Al2(S04 )3 I. 77 mg · ΛNa2MoO4 · 2H20 0. 5 mg .171,朽1 檬酸鐵 16. I mg .171,堿式碳酸鎂 24_42g/L,葡萄糖 30_40g/ L0
實(shí)施例2
本實(shí)施例說明篩選得到優(yōu)良大腸埃希氏菌co7i)BER208的方法。
篩選步驟
I、固體平板初篩
在無菌操作條件下，從連續(xù)培養(yǎng)裝置中取出2-4mL菌液，用無菌水稀釋I X IO4倍，取100 μ L涂布在固體平板上，37°C厭氧培養(yǎng)24h，挑選出挑選生長速度快，較為飽滿的菌落。
2、固體平板復(fù)篩
將篩選到的菌株在平板上反復(fù)轉(zhuǎn)點(diǎn)培養(yǎng)，最終得到了菌株BER10806、BER208，BER10811和BER10814顯示了較強(qiáng)的生長速率和生長穩(wěn)定性。
3、搖瓶發(fā)酵篩選
將菌株BER108、BER10806、BER208、BER10811和BER10814接入種子培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，充二氧化碳2min，37°C，200r/min，培養(yǎng)12h。然后接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，IOOmL厭氧血清瓶裝液量 30mL，接種量 2% (v/v),充二氧化碳 2min，37°C，200r/min,培養(yǎng) 48h。
其中，所使用的培養(yǎng)基配方如下
固體平板培養(yǎng)基檸檬酸 3 g .IANa2HPO4.12H20 4 g · L—1，KH2PO4 8 g Γ1, (NH4)2HPO48 g· IANH4Cl O. 2 g.L-1，(NH4)2SO4 O. 75 g · Λ MgSO4 · 7H20 I g · L-1，CaCl2 · 2Η20 10. 0mg · ΙΛ ZnSO4 · 7H20 0. 5 mg · Λ CuCl2 · 2H20 0. 25 mg · Λ MnSO4 · H2O 2. 5 mg · ΛCoCl2 ·6Η20 I. 75 mg ·ΙΛΗ3Β03 0· 12 mg · Λ Al2 (S04 )3 I. 77 mg · Λ Na2MoO4 · 2H20 0.5mg · I71，朽1 檬酸鐵 16. I mg · I71,瓊脂 15_20g/L,葡萄糖 10_15g/L。
種子培養(yǎng)基蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L，葡萄糖10_20g/L。
發(fā)酵培養(yǎng)基:檸檬酸3 g · I/1，Na2HPO4 · 12H20 4 g · Γ1，KH2PO4 8 g · Γ1，(NH4) 2ΗΡ048 g· IANH4Cl O. 2 g.L-1，(NH4)2SO4 O. 75 g · Λ MgSO4 · 7Η20 I g · Γ1，CaCl2 · 2Η20 10. Omg · ΙΛ ZnSO4 · 7Η20 O. 5 mg · Λ CuCl2 · 2Η20 O. 25 mg · Λ MnSO4 · H2O 2. 5 mg · ΛCoCl2 ·6Η20 I. 75 mg ·ΙΛ H3BO3 O. 12 mg · Λ Al2 (S04 )3 I. 77 mg · Λ Na2MoO4 · 2Η20 O. 5mg · L_/朽1檬酸鐵16. I mg · L_S堿式碳酸鎂24_42g/L,葡萄糖30_40g/L。
檢測各個菌株菌體密度和丁二酸產(chǎn)量如表I所示表I篩選得到的優(yōu)良菌株和出發(fā)菌株的生長及產(chǎn)酸比較
權(quán)利要求
1.一株產(chǎn)丁二酸的菌株，其分類命名為大腸埃希氏菌co7i ) BER208，其保藏編號為CCTCC NO:M 2012351。
2.一種生產(chǎn)丁二酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟發(fā)酵權(quán)利要求
I所述的大腸埃希氏菌{Escherichia coli) BER208,得到丁二酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的方法，其特征在于，所述方法包括將固體平板培養(yǎng)基培養(yǎng)的大腸埃希氏菌BER208接種于種 子培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到種子液；然后將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中以得到丁二酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求
2或3任一所述的方法，其特征在于，所述方法為將經(jīng)固體平板培養(yǎng)基37攝氏度，厭氧條件培養(yǎng)24小時的大腸埃希氏菌BER208接種于種子培養(yǎng)基，充二氧化碳，在37攝氏度，200轉(zhuǎn)/分鐘的條件下厭氧培養(yǎng)12小時得到種子液； 將所述種子液按照2%的接種量接種于所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，充二氧化碳，并在37攝氏度厭氧培養(yǎng)48小時以得到丁二酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求
4所述的方法，其特征在于，所述充二氧化碳均為充二氧化碳2分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求
3所述的方法，其特征在于，所述固體平板培養(yǎng)基的配方為檸檬酸3g · ΙΛ Na2HPO4 · 12H20 4 g · Λ KH2PO4 8 g · Λ (NH4)2HPO4 8 g · Λ NH4Cl O. 2 g · Λ(NH4)2SO4 O. 75 g · ΙΛ MgSO4 · 7Η20 I g · Λ CaCl2 · 2Η20 10. O mg · Λ ZnSO4 · 7Η20 O. 5mg · ΙΛ CuCl2 · 2Η20 O. 25 mg · Λ MnSO4 · H2O 2. 5 mg · Λ CoCl2 · 6Η20 I. 75 mg · ΛH3BO3 O. 12 mg · Λ Al2 (S04 )3 I. 77 mg · Λ Na2MoO4 · 2Η20 O. 5 mg · Λ 檸檬酸鐵 16. Img · L—1,瓊脂 15-20g/L,葡萄糖 10_15g/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求
3所述的方法，其特征在于，所述種子培養(yǎng)基的配方為蛋白胨IOg/L，酵母粉 5g/L, NaCl 5g/L，葡萄糖 10_15g/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求
3所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為檸檬酸3g< · ΙΛ Na2HPO4 · 12H20 4 g · Λ KH2PO4 8 g · Λ (NH4)2HPO4 8 g · Λ NH4Cl O. 2 g · Λ(NH4)2SO4 O. 75 g · ΙΛ MgSO4 · 7Η20 I g · Λ CaCl2 · 2Η20 10. O mg · Λ ZnSO4 · 7Η20 O. 5mg · ΙΛ CuCl2 · 2Η20 O. 25 mg · Λ MnSO4 · H2O 2. 5 mg · Λ CoCl2 · 6Η20 I. 75 mg · ΛH3BO3 O. 12 mg · Λ Al2 (S04 )3 I. 77 mg · Λ Na2MoO4 · 2Η20 O. 5 mg · Λ 檸檬酸鐵 16. Img · L—1，堿式碳酸鎂 24-42g/L，葡萄糖 30_40g/L。
9.權(quán)利要求
I所述的大腸埃希氏菌co7i)BER208在發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸中的應(yīng)用。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種產(chǎn)丁二酸的菌株及其生產(chǎn)丁二酸的方法和應(yīng)用。其中，所述菌株的分類命名為大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)BER208，其保藏編號為CCTCCNOM2012351。所述菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中，以葡萄糖為單一性碳源在厭氧條件下快速生長，并能高產(chǎn)丁二酸，該菌株發(fā)酵48小時，OD600達(dá)到了6.87，丁二酸產(chǎn)量達(dá)到10.5g/L，相對于出發(fā)菌株，丁二酸產(chǎn)量提高了2倍多。
文檔編號C12N1/20GKCN102864113SQ201210392035
公開日2013年1月9日 申請日期2012年10月16日
發(fā)明者姜岷, 萬青, 張常青, 梁麗亞, 陳旭, 茍冬梅, 劉嶸明, 馬江鋒 申請人:南京工業(yè)大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan