專利名稱:一種制備高純度β-聚蘋果酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于高分子聚合物制備領(lǐng)域，本發(fā)明涉及一種制備β-聚蘋果酸的方法，特別是涉及一種制備高純度β-聚蘋果酸的方法。
背景技術(shù)：
β-聚蘋果酸(β-PMLA)是一種以蘋果酸為單體的高分子聚合物，因其具有良好的水溶性、可化學(xué)衍生性、可降解性、可再生性、生物安全性等特點(diǎn)而受到研究者的重視?？善诖诨瘖y品、藥物、包裝材料等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。
聚蘋果酸的生產(chǎn)主要有化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法兩種，化學(xué)合成的方法較多，主要分為直接聚合法、交酯開環(huán)法和內(nèi)酯開環(huán)法，可分別得到Y(jié)型、α型和β型，由于在生物體內(nèi)天然存在的是β型PMLA，故開發(fā)β型PMLA的合成方法便成為研究的熱點(diǎn)。而化學(xué)法合成β — PMLA，只有內(nèi)酯開環(huán)法一種，該方法形成內(nèi)酯的步驟較多、產(chǎn)率低、反應(yīng)溫度高、中間產(chǎn)物分離提純繁瑣，制約了該方法的發(fā)展。
1969年，Shimada等發(fā)現(xiàn)一種由蘋果酸組成的高分子化合物能夠抑制圓弧青霉的酸性蛋白，后來被證實(shí)為聚蘋果酸。到目前為止，國內(nèi)外專家已經(jīng)對聚蘋果酸的生物發(fā)酵法進(jìn)行了深入的研究，并獲得了高產(chǎn)量的菌株及其生產(chǎn)工藝。但對生物發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸的提取工藝的研究尚不是太多，國內(nèi)外的論文和專利也很少，大多數(shù)專利和論文著重介紹的都是聚蘋果酸菌株的培養(yǎng)方法，及簡單的提取方法，例如:1995年公開的日本專利“生產(chǎn)蘋果酸聚合微生物的培養(yǎng)方法(見7308188八2)”、1992年公開的日本專利“微生物合成L-蘋果酸聚合物(JP42111385A2)”。中國專利“同時獲得副產(chǎn)物普魯蘭多糖的聚蘋果酸的制備方法(公開號為CN101100687A)”中，介紹的方法是同時獲得聚蘋果酸和普魯蘭多糖兩種產(chǎn)物，并除去里面的黑色素，但沒有具體提到通過這種方法得到的聚蘋果酸達(dá)到多少純度?！?β -聚蘋果酸及其鹽 的制備方法(公開號為CN101487034A)”中介紹了在發(fā)酵的同時，通過膜技術(shù)回流發(fā)酵液以分離高分子量的聚蘋果酸，并將低分子量的蘋果酸回流到發(fā)酵液中繼續(xù)發(fā)酵，并采用膜分離的方法對樣品做進(jìn)一步的純化，通過這種方法可以得到高分子量的聚蘋果酸，但沒有說得到的聚蘋果酸的純度，而且醫(yī)用的聚蘋果酸并不需要太高的分子量。而且這種方法操作復(fù)雜，可行性比較差，而且成本較高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的技術(shù)問題是:
采用醇沉的方法將發(fā)酵液中的大部分普魯蘭多糖除去，使β_聚蘋果酸提升到一定濃度。采用普魯蘭酶將存在于樣品中的一些很難除去的多糖去除，采用離子交換的方法將聚蘋果酸鹽轉(zhuǎn)變?yōu)榫厶O果酸。凍干得到純度達(dá)80%以上的β-聚蘋果酸。
本發(fā)明解決技術(shù)問題時所采用的技術(shù)方案如下:
1、菌種活化
將甘油管保存的出芽短梗霉接種到活化培養(yǎng)基上，在23_25°C培養(yǎng)2-3d。[0010]2、種子培養(yǎng)
將培養(yǎng)好的斜面種子，采用洗菌的方法接種到種子培養(yǎng)基中，25-28°C，150-200r/min條件下振蕩培養(yǎng)3d，制得種子液。
3、發(fā)酵培養(yǎng)
將2中得到的種子培養(yǎng)物以5%_10%的接種量，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，25_28°C，150-200r/min條件下振蕩培養(yǎng)7_10d。
4、分離純化
a、普蘭多糖的去除:在發(fā)酵培養(yǎng)后，離心除去菌體，邊攪拌邊加入甲醇或乙醇，力口入量占加入后總液體體積的25%，用玻璃棒攪拌，玻璃棒上纏繞的絮狀物即為普魯蘭多糖，將其移除；
b、聚蘋果酸粗品的提取:向a得到的液體中邊攪拌邊繼續(xù)添加甲醇，使甲醇的總含量達(dá)到總液體體積的60%，將上清液移除，向沉淀中再加入甲醇洗滌沉淀1-3次；離心后將沉淀收集，冷凍干燥得白色樣品；
C、樣品中難分離多糖的去除:將b中得到的白色樣品再次溶解，加入2-10% (v/v)的普魯蘭酶，60°C反應(yīng)30-60min，冷卻，加入甲醇，使甲醇的總含量達(dá)到總液體體積的60%，進(jìn)行醇沉；離心收集沉淀物，冷凍干燥，即可得到純度為80%以上的β -聚蘋果酸鹽白色粉末；
d、將c中得到的白色粉末再次溶到水中，以2Bv/h過強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂，得到含有聚蘋果酸的溶液，將其凍干即得到純度為80%以上的β-聚蘋果酸。
5、本發(fā)明技 術(shù)方案中所用到的培養(yǎng)基為:
(I)活化培養(yǎng)基:即馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA):馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂 20g/L, pH6.0,121°C高壓蒸汽滅菌 20min ；
(2 )種子培養(yǎng)基:葡萄糖 80g/L, 丁二酸銨 3g/L，丁二酸 2g/L，K2CO30.4g/L，KH2PO41g/L, MgSO4.7H201g/L, ZnSO4.7H205ppm,玉米浸出液 10g/L，CaC0320g/L, pH4.0-5.0，12111C高壓蒸汽滅菌20min ；
(3)發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖 100g/L，硝酸鈉 20g/L，KH2PO41 g/L, MgSO4.7H200.5g/L，蛋白胨20g/L, pH4.0-4.5,121°C高壓蒸汽滅菌20min, CaC0320g/L,單獨(dú)滅菌，121°C高壓蒸汽滅菌20min。
本發(fā)明中使用菌種為常見產(chǎn)生β_聚蘋果酸的出芽短梗霉及出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)ΤΚΡΜ00006, CGMCC3337,見天津科技大學(xué)申請專利，申請?zhí)枮镃N200910071018，發(fā)明名稱為一種大量產(chǎn)生β -聚蘋果酸的誘變菌株出芽短梗霉ΤΚΡΜ00006及其培養(yǎng)方法，
公開日期是2011.02.23。該專利中公開了本發(fā)明用出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans) TKPM00006，CGMCC3337，2009 年 10.14 日保藏，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
有益效果
本發(fā)明與現(xiàn)有發(fā)明相比，有益效果是:①得到較高純度樣品的方法較為簡單，設(shè)備投入較少，生產(chǎn)成本較低得到純度較高的樣品，為后續(xù)的應(yīng)用打下了一定的基礎(chǔ)。
具體實(shí)施方式
[0026]下面通過具體的實(shí)施方案敘述本發(fā)明中β_聚蘋果酸的生產(chǎn)方法。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實(shí)施方案應(yīng)理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求
書所限定。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的前提下，對這些實(shí)施方案中的物料成分和用量進(jìn)行的各種改變或改動也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實(shí)施例1
按如下步驟制備β -聚蘋果酸:
1、培養(yǎng)基的制備
(I)活化培養(yǎng)基:即馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA):馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂 20g/L, pH6.0,121 °C高壓蒸汽滅菌 20min。
(2)種子培養(yǎng)基:葡萄糖 80g/L, 丁二酸銨 3g/L，丁二酸 2g/L，K2CO30.4g/L，KH2PO41 g/L, MgSO4.7H201g/L, ZnSO4.7H205ppm,玉米浸出液 10g/L，CaC0320g/L, pH4.0-5.0，121°C高壓蒸汽滅菌20min。
(3)發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖 100g/L，硝酸鈉 20g/L，KH2PO41 g/L, MgSO4.7H200.5g/L，蛋白胨20g/L, pH4.0-4.5,121°C高壓蒸汽滅菌20min, CaC0320g/L,單獨(dú)滅菌，121°C高壓蒸汽滅菌20min。
2、菌種活化
將甘油管保存 的出芽短梗霉TKPM00006接種到活化培養(yǎng)基上，在25°C培養(yǎng)2d。
3、種子培養(yǎng)
將培養(yǎng)好的斜面種子，采用洗菌的方法接種到種子培養(yǎng)基中，250C，200r/min振蕩培養(yǎng)3d。
4、接種發(fā)酵
將3中得到的種子培養(yǎng)物以5%的接種量，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，250C，200r/min振蕩培養(yǎng)10d。
5、分離純化
a、普蘭多糖的去除:在第四步發(fā)酵后，離心除去菌體。邊攪拌邊加入甲醇，使甲醇加入后，甲醇占總液體體積的25%。用玻璃棒攪拌，可發(fā)現(xiàn)玻璃棒上纏繞很多絮狀物即為普魯蘭多糖，將其移除。
b、聚蘋果酸粗品的提取:向a得到的液體中邊攪拌邊繼續(xù)添加甲醇，使甲醇的總含量達(dá)到60%，這時會有大量白色的物質(zhì)沉淀出來。將上清移除，再加入兩倍體積的甲醇洗滌沉淀3次。離心將沉淀收集，冷凍干燥。
C、樣品中難分離多糖的去除:將b中得到的白色樣品再次溶解，加入5%的普魯蘭酶,60°C反應(yīng)60min，冷卻，加入甲醇，使甲醇總含量達(dá)到總液體體積的60%，進(jìn)行醇沉。離心收集沉淀物，冷凍干燥。即可得到純度為80%以上的聚蘋果酸鹽白色粉末。
d、將c中得到的白色粉末再次溶到水中，以2Bv/h的流速過001*7樹脂，得到含有β -聚蘋果酸的溶液，將其凍干即可得到純度為80%以上的β -聚蘋果酸。
實(shí)施例2
按如下步驟制備β -聚蘋果酸
1、培養(yǎng)基的制備[0047](1)活化培養(yǎng)基:即馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA):馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂 20g/L, pH6.0,121 °C高壓蒸汽滅菌 20min。
(2 )種子培養(yǎng)基:葡萄糖 80g/L, 丁二酸銨 3g/L，丁二酸 2g/L，K2CO30.4g/L，KH2PO41 g/L, MgSO4.7H201g/L, ZnSO4.7H205ppm,玉米浸出液 10g/L，CaC0320g/L, pH4.0-5.0，121°C高壓蒸汽滅菌20min。
(3)發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖 100g/L，硝酸鈉 20g/L，KH2PO41 g/L, MgSO4.7H200.5g/L，蛋白胨20g/L, pH4.0-4.5,121°C高壓蒸汽滅菌20min, CaC0320g/L,單獨(dú)滅菌，121°C高壓蒸汽滅菌20min。
2、菌種活化
將甘油管保存的出芽短梗霉TKPM00006接種到活化培養(yǎng)基上，在23°C培養(yǎng)3d。
3、種子培養(yǎng)
將培養(yǎng)好的斜面種子，采用洗菌的方法接種到種子培養(yǎng)基中，28°C，150r/min振蕩培養(yǎng)3d。
4、接種發(fā)酵
將第三步得到的種子培養(yǎng)物以10%的接種量，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，28°C，150r/min振蕩培養(yǎng)7d。
5、分離純化
a、普蘭多糖的去除:在第四步發(fā)酵后，離心除去菌體。邊攪拌邊加入甲醇，使甲醇加入后，甲醇占總液體體積的25%。用玻璃棒攪拌，可發(fā)現(xiàn)玻璃棒上纏繞很多絮狀物即為普魯蘭多糖，將其移除。
b、聚蘋果酸粗品的提取:向a得到的液體中邊攪拌邊繼續(xù)添加甲醇，使甲醇的總含量達(dá)到60%，這時會有大量白色的物質(zhì)沉淀出來。將上清移除，再加入3倍體積的甲醇洗滌沉淀I次。離心將沉淀收集，冷凍干燥。
C、樣品中難分離多糖的去除:將b中得到的白色樣品再次溶解，加入2.5%(v/v)的普魯蘭酶，60°C反應(yīng)40min，冷卻，加入甲醇，使甲醇總含量達(dá)到總液體體積的60%，進(jìn)行醇沉。離心收集沉淀物，冷凍干燥。即可得到純度為80%以上的聚蘋果酸鹽白色粉末。
d、將c中得到的白色粉末再次溶到水中，以2Bv/h的流速過001*1樹脂，得到含有β -聚蘋果酸的溶液，將其凍干即可得到純度為80%以上的β -聚蘋果酸。
實(shí)施例3
按如下步驟制備β -聚蘋果酸:
1、培養(yǎng)基的制備
(1)活化培養(yǎng)基:即馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA):馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂 20g/L, pH6.0,121 °C高壓蒸汽滅菌 20min。
(2)種子培養(yǎng)基:葡萄糖 80g/L, 丁二酸銨 3g/L, 丁二酸 2g/L, K2CO30.4g/L,KH2PO41 g/L, MgSO4.7H201g/L, ZnSO4.7H205ppm,玉米浸出液 10g/L，CaC0320g/L, pH4.0-5.0，121°C高壓蒸汽滅菌20min。
(3)發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖 100g/L，硝酸鈉 20g/L，KH2PO41 g/L, MgSO4.7H200.5g/L，蛋白胨20g/L, pH4.0-4.5,121°C高壓蒸汽滅菌20min, CaC0320g/L,單獨(dú)滅菌，121°C高壓蒸汽滅菌20min。[0067]2、菌種活化
將甘油管保存的出芽短梗霉TKPM00006接種到活化培養(yǎng)基上，在25°C培養(yǎng)2d。
3、種子培養(yǎng)
將培養(yǎng)好的斜面種子，采用洗菌的方法接種到種子培養(yǎng)基中，250C，200r/min振蕩培養(yǎng)2d。
4、接種發(fā)酵
將第三步得到的種子培養(yǎng)物以8%的接種量，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，25°C，200r/min振蕩培養(yǎng)10d。
5、分離純化
a、普蘭多糖的去除:在第四步發(fā)酵后，離心除去菌體。邊攪拌邊加入甲醇，使乙醇加入后，乙醇占總液體體積的25%。用玻璃棒攪拌，可發(fā)現(xiàn)玻璃棒上纏繞很多絮狀物即為普魯蘭多糖，將其移除。
b、聚蘋果酸粗品的提取:向a得到的液體中邊攪拌邊繼續(xù)添加甲醇，使甲醇的總含量達(dá)到60%，這時會有大量白色的物質(zhì)沉淀出來。將上清移除，再加入2倍體積的甲醇洗滌沉淀2次。離心將沉淀收集，冷凍干燥。
C、樣品中難分離多糖的去除:將b中得到的白色樣品再次溶解，加入10%的普魯蘭酶,60°C反應(yīng)40min，冷卻，加入甲醇，使甲醇總含量達(dá)到總液體體積的60%，進(jìn)行醇沉。離心收集沉淀物，冷凍干燥。即可得到純度為80%以上的聚蘋果酸鹽白色粉末。
d、將c中得到 的白色粉末再次溶到水中，以2Bv/h的流速過001*7樹脂，得到含有β -聚蘋果酸的溶液，將其凍干即可得到純度為80%以上的β -聚蘋果酸。
實(shí)施例4
按如下步驟制備聚蘋果酸
1、培養(yǎng)基的制備
(I)活化培養(yǎng)基:即馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA):馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂 20g/L, pH6.0,121 °C高壓蒸汽滅菌 20min。
(2)種子培養(yǎng)基:葡萄糖 80g/L, 丁二酸銨 3g/L，丁二酸 2g/L，K2CO30.4g/L，KH2PO41 g/L, MgSO4.7H201g/L, ZnSO4.7H205ppm,玉米浸出液 10g/L，CaC0320g/L, pH4.0-5.0，121°C高壓蒸汽滅菌20min。
(3)發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖 100g/L，硝酸鈉 20g/L，KH2PO41 g/L, MgSO4.7H200.5g/L，蛋白胨20g/L, pH4.0-4.5,121°C高壓蒸汽滅菌20min, CaC0320g/L,單獨(dú)滅菌，121°C高壓蒸汽滅菌20min。
2、菌種活化
將甘油管保存的出芽短梗霉TKPM00006接種到活化培養(yǎng)基上，在23°C培養(yǎng)3d。
3、種子培養(yǎng)
將培養(yǎng)好的斜面種子，采用洗菌的方法接種到種子培養(yǎng)基中，28°C，150r/min振蕩培養(yǎng)3d。
4、接種發(fā)酵
將第三步得到的種子培養(yǎng)物以10%的接種量，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，28°C，150r/min振蕩培養(yǎng)7d。[0090]5、分離純化
a、普蘭多糖的去除:在第四步發(fā)酵后，離心除去菌體。邊攪拌邊加入乙醇，使乙醇加入后，乙醇占總液體體積的25%。用玻璃棒攪拌，可發(fā)現(xiàn)玻璃棒上纏繞很多絮狀物即為普魯蘭多糖，將其移除。
b、聚蘋果酸粗品的提取:向a得到的液體中邊攪拌邊繼續(xù)添加甲醇，使甲醇的總含量達(dá)到60%，這時會有大量白色的物質(zhì)沉淀出來。將上清移除，再加入3倍體積的甲醇洗滌沉淀I次。離心將沉淀收集，冷凍干燥。
C、樣品中難分離多糖的去除:將b中得到的白色樣品再次溶解，加入10%的普魯蘭酶,60°C反應(yīng)40min，冷卻，加入甲醇，使甲醇總含量達(dá)到總液體體積的60%，進(jìn)行醇沉。離心收集沉淀物，冷凍干燥。即可得到純度為80%以上的聚蘋果酸鹽白色粉末。
d、將c中得到的白色粉末再次溶到水中，以2Bv/h的流速過001*1樹脂，得到含有β-聚蘋果酸 的溶液，將其凍干即可得到純度為80%以上的β-聚蘋果酸。
權(quán)利要求
1.一種制備高純度β-聚蘋果酸的方法，包括菌種活化、種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)及分離純化，其特征在于，所述分離純化方法如下: a、普蘭多糖的去除:將出芽短梗霉發(fā)酵培養(yǎng)后，離心除去菌體，加入甲醇或乙醇，加入量占加入后總液體體積的25%，用玻璃棒攪拌，玻璃棒上纏繞的絮狀物即為普魯蘭多糖，將其移除； b、聚蘋果酸粗品的提取:向a得到的液體中繼續(xù)添加甲醇，使甲醇的總含量達(dá)到總液體體積的60%，將上清液移除，向沉淀中再加入甲醇，洗滌沉淀，離心后將沉淀物收集，冷凍干燥得白色樣品； C、樣品中難分離多糖的去除:將b中得到的白色樣品加水溶解，加入2-10% (v/v)的普魯蘭酶，60 V反應(yīng)30-60min，冷卻，加入甲醇，使甲醇的總含量達(dá)到總液體體積的60 %，進(jìn)行醇沉；離心收集沉淀物，冷凍干燥，即可得到純度為80%以上的β-聚蘋果酸鹽白色粉末； d、將c中得到的白色粉末再次溶到水中，以2Bv/h的流速過強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂，得到含有聚蘋果酸的溶液，將其凍干即得到純度為80%以上的β-聚蘋果酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種制備高純度β_聚蘋果酸的方法，其特征在于，洗滌沉淀時所述甲醇的加入量為沉淀體積的2 3倍，洗滌次數(shù)為I 3次。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種制備高純度β_聚蘋果酸的方法，其特征在于，所述分離純化方法如下: a、普蘭多糖的去除:將出芽短梗霉TKPM00006發(fā)酵培養(yǎng)后，離心除去菌體，加入甲醇，加入量占總液體體積的25%，用玻璃棒攪拌，玻璃棒上纏繞的絮狀物即為普魯蘭多糖，將其移除； b、聚蘋果酸粗品的提取:向a得到的液體中繼續(xù)添加甲醇，使甲醇的總含量達(dá)到總液體體積的60%，將上清液移除，向沉淀中再加入2倍體積的甲醇洗滌沉淀3次，離心收集沉淀，冷凍干燥得白色樣品； C、樣品中難分離多糖的去除:將b中得到的白色樣品加水溶解，加入5%的普魯蘭酶，60°C反應(yīng)60min，冷卻，加入甲醇，使甲醇總含量達(dá)到總液體體積的60%，進(jìn)行醇沉；離心收集沉淀物，冷凍干燥，即可得到純度為80%以上的β -聚蘋果酸鹽白色粉末； d、將c中得到的白色粉末再次溶到水中，以2Bv/h的流速過001*7樹脂，得到含有β -聚蘋果酸的溶液，將其凍干即可得到純度為80%以上的β -聚蘋果酸。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種制備高純度β-聚蘋果酸的方法，屬于高分子聚合物制備領(lǐng)域，涉及一種制備β-聚蘋果酸的方法，特別是一種高純度β-聚蘋果酸的方法。本發(fā)明所述制備高純度β-聚蘋果酸的方法，主要步驟包括菌種活化、種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)及分離純化，其特征在于，所述分離純化方法如下普蘭多糖的去除，聚蘋果酸粗品的提取，樣品中難分離多糖的去除，離心收集沉淀物，冷凍干燥。本發(fā)明與現(xiàn)有發(fā)明相比，有益效果是①應(yīng)用較為簡單的方法即可得到較高純度樣品，設(shè)備投入較少，生產(chǎn)成本較低；②得到的樣品純度很高，可為后續(xù)的應(yīng)用打下一定的基礎(chǔ)。
文檔編號C12P7/62GKCN103103225SQ201210592448
公開日2013年5月15日 申請日期2012年12月31日
發(fā)明者喬長晟, 姜少麗, 馬正旺, 李政, 李振海, 鐘海蛟 申請人:天津北洋百川生物技術(shù)有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan