專利名稱:用于治療病毒感染的dsRNA的制作方法
用于治療病毒感染的dsRNA[0001]本申請(qǐng)是中國專利申請(qǐng)200880023497.1的分案申請(qǐng)，原申請(qǐng)的申請(qǐng)日是2008年7月4日，發(fā)明名稱是“用于治療病毒感染的dsRNA”。發(fā)明領(lǐng)域[0002]本發(fā)明涉及靶向人磷脂酰肌醇4-激酶的雙鏈核糖核酸(dsRNA)，尤其涉及靶向人磷脂酰肌醇4-激酶催化性β多肽(PIK4CB ；ΝΜ_002651)和/或人磷脂酰肌醇4-激酶α多肽(PIK4CA ;ΝΜ_002650)的雙鏈核糖核酸，并涉及其在治療由正鏈RNA病毒如丙型肝炎病毒(HCV)感染介導(dǎo)的病理過程中的用途。發(fā)明背景[0003]RNA依賴的RNA聚合酶正鏈RNA病毒形成了由許多不同亞家族組成的大的病毒超家族。這些病毒涵蓋植物界和動(dòng)物界兩界，引起的病理學(xué)范圍從輕微的表型到嚴(yán)重的衰弱疾病。正鏈RNA病毒聚合酶超群的構(gòu)成如下。1.小RNA病毒組(HAV、脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇病毒)、諾達(dá)病毒(nodaviruses)、紅豆花葉病毒屬(comoviruses)、線蟲傳多面體病毒組(nepoviruses)、馬鈴薯Y病毒組(potyviruses)、大麥花葉病毒組(bymoviruses)、南方菜豆花葉病毒組(sobemoviruses)和黃癥病毒組(Luteoviruses)(黃化病毒、黃矮病毒和卷葉病毒)。I1.香石竹斑駁病毒組(Carmoviruses)、番爺叢矮病毒組(tombusviruses)、香石竹環(huán)斑病毒組(dianthoviruses)、痕病毒屬(pestiviruses)、披膜病毒(togaviruses)、伊科病毒(echoviruses)、登革病毒、丙型肝炎病毒、黃病毒屬(flaviviruses)。II1.煙草花葉病毒組(Tobamoviruses)、煙草脆裂病毒組(tobraviruses)、大麥病毒組(hordeiviruses)、tricornaviruses> 甲病毒、風(fēng)疫病毒屬(rubiviruses)、真菌傳桿狀病毒組(furoviruses)、戍型肝炎病毒、馬鈴薯X病毒組(potexviruses)、香石竹潛病毒組(carlaviruses)、蕪菁黃花葉病毒組(tymoviruses)和蘋果褪綠葉斑病毒。正鏈RNA病毒的基因組編碼RNA依賴的RNA聚合酶，所述RNA聚合酶是唯一含有這類病毒中保守基序的病毒蛋白。由于這類病毒含有顯著的系統(tǒng)發(fā)育變異性，所以該保守性是意義重大的，人們預(yù)計(jì)存在病毒感染細(xì)胞和維持穩(wěn)定復(fù)制的多種方式。除許多不同之外，該類中的所有病毒都依賴RNA依賴的正鏈RNA轉(zhuǎn)錄這一單個(gè)基本步驟。由于該步驟對(duì)病毒生活周期是必需的，所以病毒使用許多宿主蛋白質(zhì)來啟動(dòng)和維持RNA依賴的RNA聚合酶活性。不與宿主因子相互作用，則病毒不能存活。因此，可用于抑制病毒感染的治療介入將是阻斷病毒宿主的相互作用。如果宿主因子對(duì)病毒是必需的，但對(duì)宿主不是必需的，那么可操縱這些宿主因子，便可實(shí)現(xiàn)阻斷病毒感染的能力。已經(jīng)證實(shí)，靶向宿主蛋白質(zhì)是干擾HIV、HCV、天花病毒等病毒感染和復(fù)制的有效方法。[0004]正鏈RNA病毒的重要性是對(duì)人類健康和生存力的影響。幾種正鏈RNA病毒感染人類，并在許多情況下導(dǎo)致使人虛弱的疾病和/或病態(tài)。幾種對(duì)人類健康造成特別的負(fù)擔(dān)的病毒是登革病毒(出血熱)、HCV (慢性肝病、肝功能衰竭、纖維樣變性和癌)和HEV (暴發(fā)性肝功能衰竭)。由這 些病毒引起的肝臟和血液疾病導(dǎo)致全世界數(shù)以百萬的死亡，并且花費(fèi)醫(yī)療工業(yè)數(shù)十億美元用于肝臟相關(guān)的疾病。找到控制病毒感染的治療方法的意義重大，并且可改善全世界人類健康。[0005]因此，存在有效治療由HCV和其它正鏈RNA病毒(以上所列)引起的感染這一未滿足的需求。[0006]該說明書也涉及雙鏈RNA分子(dsRNA)。已經(jīng)表明，dsRNA以已知為RNA干擾(RNAi)的高度保守性調(diào)節(jié)機(jī)制來阻斷基因的表達(dá)。W099/32619 (Fire等人)公開了至少長(zhǎng)25個(gè)核苷酸的dsRNA在秀麗線蟲(C.elegans)中抑制基因表達(dá)的用途。也已經(jīng)表明，dsRNA在其它生物體包括植物(參見例如W099/53050, Waterhouse等人；和W099/61631, Heifetz等人)、果蠅(參見例如Yang, D等人，Curr.Biol.(2000) 10:1191-1200)和哺乳動(dòng)物(參見W000/44895, Limmer ;和 DE10100586.5, Kreutzer 等人)中降解祀 RNA。現(xiàn)在，這種天然機(jī)制已經(jīng)成為研發(fā)治療由于基因異?；虿幌胍恼{(diào)節(jié)引起的病癥的新型藥劑的焦點(diǎn)。[0007]PCT 公開號(hào) W02003016572、W02003070750 和 W02005028650 中公開了先前研發(fā)治療由HCV感染引發(fā)的疾病的、基于核酸的RNAi藥物的努力。PCT公開號(hào)W02006074346中公開了使用RNAi藥物治療RSV感染的先前的努力。[0008]盡管在RNAi領(lǐng)域有顯著進(jìn)步，并且在治療由病毒感染介導(dǎo)的病理過程中有進(jìn)展，但仍然需要能夠抑制病毒感染進(jìn)程、并且能夠治療與病毒感染相關(guān)的疾病的藥劑。本發(fā)明公開了滿足這種需要的化合物、組合物和方法，并提供了其它益處。[0009]發(fā)明概述[0010]本發(fā)明提供了用于治療正鏈RNA病毒(如HCV、HPV、登革病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒)感染的組合物和方法，所述組合物和方法通過降低細(xì)胞中(其中這類病毒可復(fù)制，如肝臟)人宿主因子磷脂酰肌醇4-激酶催化性β多肽(PIK4CB;NM_002651)和/或磷脂酰肌醇4-激酶催化性α多肽(PIK4CA;NM_002650)的活性的水平。[0011]本文公開了正鏈RNA病毒的增殖可通過使用雙鏈核糖核酸(dsRNA)來抑制，從而沉默對(duì)病毒增殖必需的人宿主細(xì)胞基因PIK4CB和/或PIK4CA的表達(dá)。[0012]本發(fā)明提供了多種實(shí)施方案，尤其包括:[0013]用于抑制細(xì)胞中磷脂酰肌醇4-激酶(PI4K)水平表達(dá)或活性的雙鏈核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包含至少兩個(gè)彼此互補(bǔ)的序列，且其中有義鏈包含第一序列和反義鏈包含第二序列，所述第二序 列包含基本互補(bǔ)于編碼PI4K的至少部分mRNA的互補(bǔ)區(qū)域，并且其中所述互補(bǔ)區(qū)域長(zhǎng)度低于30個(gè)核苷酸和其中所述dsRNA與表達(dá)所述PI4K基因的細(xì)胞接觸后，抑制所述PI4K基因表達(dá)。這些dsRNA可具有化學(xué)修飾，且可與其它部分綴合。此夕卜，這些dsRNA可提供于藥物組合物中。[0014]一個(gè)實(shí)施方案方法是用于抑制細(xì)胞中磷脂酰肌醇4-激酶催化性β多肽(PIK4CB)基因或磷脂酰肌醇4-激酶催化性α多肽(PIK4CA)基因的方法，所述方法包括下列步驟:[0015](a)向細(xì)胞中引入雙鏈核糖核酸(dsRNA),其中所述dsRNA包含至少兩個(gè)彼此互補(bǔ)的序列，且其中有義鏈包含第一序列和反義鏈包含第二序列，所述第二序列包含基本互補(bǔ)于編碼PIK4CB或PIK4CA的至少部分mRNA的互補(bǔ)區(qū)域，并且其中所述互補(bǔ)區(qū)域長(zhǎng)度低于30個(gè)核苷酸；和[0016](b)將步驟(a)中產(chǎn)生的細(xì)胞維持足夠時(shí)間以獲得PIK4CB基因(或PIK4CA，根據(jù)選擇)的mRNA轉(zhuǎn)錄物的降解，從而抑制PIK4CB基因(或PIK4CA，根據(jù)選擇)在細(xì)胞中的表達(dá)或活性。[0017]備選地，本發(fā)明涉及治療由正鏈RNA病毒感染介導(dǎo)的病理學(xué)過程的方法，所述方法包括向需要此種治療的患者施用本發(fā)明的dsRNA。正鏈RNA病毒可選自丙型肝炎病毒(HCV)、人乳頭瘤病毒(HPV)和登革病毒。[0018]備選的實(shí)施方案包括用于抑制PIK4CB或PIK4CA在細(xì)胞中表達(dá)的載體；和包含這類載體的細(xì)胞。[0019]一個(gè)備選的實(shí)施方案包括治療HCV感染的方法，所述方法包括向需要此種治療的患者施用治療有效量的包含本發(fā)明dsRNA的藥物組合物。[0020]附圖簡(jiǎn)述[0021]
圖1.HCV構(gòu)建體的結(jié)構(gòu)。A.完整的HCV基因組。B.亞基因組HCV復(fù)制子，用于克隆A (亞基因組復(fù)制子)細(xì)胞。將結(jié)構(gòu)蛋白用5’UTR下游的新霉素抗性基因和螢火蟲螢光素酶報(bào)告基因替代。C.移除了 HCV蛋白質(zhì)的報(bào)告構(gòu)建體用于克隆Ar細(xì)胞(缺少亞基因組復(fù)制子的細(xì)胞)。[0022]圖2.命中目標(biāo)的SiRNA的表型確認(rèn)。重新分析來自大規(guī)模激酶組siRNA篩選的命中目標(biāo)的siRNA。A.測(cè)試dsRNA為分別的雙鏈體PIK4CA1-PIK4CA4 (柱1-4)、為PIK4CASmart Pool (柱 5)、為分別的雙鏈體 PIK4CB1_PIK4CB4(柱 6-9)或?yàn)?PIK4CB Smart Pool(柱10)的結(jié)果。結(jié)果相對(duì)于GAPDH (對(duì)照；柱11)來測(cè)量。使用每孔25nM的dsRNA、用克隆A細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定；Bright-Glo活性在轉(zhuǎn)染后72小時(shí)進(jìn)行測(cè)量。靶向GAPDH的dsRNA (柱11)用作陰性對(duì)照，且靶向PGL2的dsRNA (柱12)是陽性對(duì)照。[0023]圖3.PIK4CA和PIK4CB的RTPCR。使用siRNA轉(zhuǎn)染Huh7復(fù)制子細(xì)胞72小時(shí)，分離mRNA并用Taqman進(jìn)行RTPCR分析。結(jié)果歸一化為GAPDH轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。A.PIK4CA siRNA的轉(zhuǎn)染，使用 PIK4CA 引物的 Taqman RTPCR0 B.PIK4CA siRNA 的轉(zhuǎn)染，使用 PIK4CB 引物的 TaqmanRTPCR0 C.PIK4CB siRNA 的轉(zhuǎn)染，使用 PIK4CB 引物的 Taqman RTPCR0 D.PIK4CB siRNA 的轉(zhuǎn)染，使用 PIK4CA 引物的 Taqman RTPCR0 GOI=目的基因。PIK4CAsp=PIK4CA Smart Pool ；PIK4CBsp=PIK4CB Smart Pool。[0024]圖4.A)由所示的靶向PIK4CA siRNA (25nM)處理后的PIK4CA (淺條)或PIK4CB(黑條)的mRNA表達(dá)。B)通過所示的靶向PIK4CB siRNA (25nM)處理后的PIK4CA (淺條)或PIK4CB (黑條)的mRNA表 達(dá)。[0025]圖5.蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示PI4KA siRNA(行1-行3分別對(duì)應(yīng)于表2中的PI4KA1 ；PIK4A2 和 PIK4A3)或 PI4KB siRNA (行 4-行 6 分別對(duì)應(yīng)于表 I 中的 PI4KB1 ；PIK4B2 和PIK4B3)處理后PI4KB、NS3或肌動(dòng)蛋白(如所標(biāo)示)的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。GAPDH siRNA處理顯示為對(duì)照。[0026]圖6.靶向PIK4CA和PIK4CB的shRNA序列。A)使用所示的shRNA構(gòu)建體處理克隆A細(xì)胞的結(jié)果。淺條表示螢光素酶活性；黑條表示細(xì)胞生存力。所有結(jié)果都與對(duì)照GAPDH處理的細(xì)胞比較；B)使用所示的shRNA處理對(duì)PI4KA表達(dá)的影響(GFP歸一化的);C)使用所示的shRNA處理對(duì)PI4KB表達(dá)的影響(GFP歸一化的);D)蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示經(jīng)靶向PI4KA的shRNA (行1-行5分別對(duì)應(yīng)shAl-shA5)或靶向PI4KB的shRNA (行6-行10分別對(duì)應(yīng)shBl-shB5)處理后PI4KB、NS3或肌動(dòng)蛋白(如所標(biāo)示)的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。GFP shRNA處理顯示為對(duì)照，所有結(jié)果獲取于經(jīng)所示shRNA處理后96小時(shí)；E)蛋白質(zhì)印跡測(cè)量shA2和shBl對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，shRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)后3周(GFP對(duì)照)。[0027]圖7.HCV復(fù)制的抑制(活病毒)。用所示的siRNA處理時(shí)，HCV復(fù)制的劑量依賴。細(xì)胞在HCV感染前用針對(duì)PIK4CA或PIK4CB的所示siRNA處理。A) 25nM (灰條；);1.5nM (白條);0.1nM (黑條)。結(jié)果歸一化為GAPDH siRNA處理時(shí)的HCV復(fù)制。海腎(Renilla) siRNA是陽性對(duì)照。B)在感染細(xì)胞中靶mRNA的表達(dá)。[0028]圖8.HCV復(fù)制的抑制(活病毒)。用所示的siRNA處理時(shí)，HCV復(fù)制的劑量依賴。細(xì)胞在HCV感染后用針對(duì)PIK4CA或PIK4CB的所示siRNA處理。A)用所示的siRNA (25nM)處理后24小時(shí)對(duì)病毒復(fù)制的影響。黑條一病毒螢光素酶(活性);淺條一細(xì)胞生存力。結(jié)果歸一化為GAPDH siRNA處理時(shí)的HCV復(fù)制。海腎siRNA是陽性對(duì)照。B)用所示的siRNA處理后HCV復(fù)制的時(shí)間依賴。黑(第一)條一24小時(shí)；淺(第二)條一48小時(shí)；白(第二)條一72小時(shí);灰(第四)條一96小時(shí)。[0029]發(fā)明詳述[0030]本發(fā)明提供了治療與受正鏈RNA病毒(如HCV、HPV、登革病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒)感染相關(guān)的疾病這一問題的解決方案，所述解決方案通過降低這類病毒可復(fù)制的細(xì)胞中人宿主因子磷脂酰肌醇4-激酶催化性β多肽(PIK4CB;NM_002651)和/或磷脂酰肌醇4-激酶催化性α多肽(PIK4CA;NM_002650)的水平。本文公開了可通過使用雙鏈核糖核酸(dsRNA)沉默人宿主細(xì)胞基因PIK4CB和/或PIK4CA的表達(dá)來抑制正鏈RNA病毒的增殖，其中所述人宿主細(xì)胞基因PIK4CB和/或PIK4CA對(duì)正鏈RNA病毒的增殖是必需的。[0031]此外，本文首次公開了對(duì)這些dsRNA的所選化學(xué)修飾是高度優(yōu)選的實(shí)施方案，所述實(shí)施方案提供了驚人的降低的毒性、降低的免疫原性、改善的藥學(xué)特性和其它益處。[0032]本發(fā)明提供了雙鏈核糖核酸(dsRNA)、以及在細(xì)胞或哺乳動(dòng)物中使用所述dsRNA抑制正鏈RNA病毒繁殖的組合物、藥物組合物和方法。本發(fā)明也提供了用于在哺乳動(dòng)物中使用dsRNA治療由正鏈RNA病毒感染所引起的病理學(xué)病癥和疾病的組合物和方法。[0033]本發(fā)明的 dsRNA包含具有這樣的區(qū)域的RNA鏈(反義鏈)，所述區(qū)域長(zhǎng)度低于30個(gè)核苷酸、通常長(zhǎng)19-24個(gè)核苷酸、并且基本互補(bǔ)于人磷脂酰肌醇4-激酶催化性β亞基多肽(PIK4CB;NM_002651)和/或人磷脂酰肌醇4-激酶催化性α多肽(PIK4CA;NM_002650)的至少部分的基因產(chǎn)物(前mRNA或成熟mRNA)轉(zhuǎn)錄物。這些dsRNA的使用使得參與哺乳動(dòng)物中正鏈RNA感染的復(fù)制和/或維持的基因的mRNA靶向降解或失活。使用基于細(xì)胞的測(cè)試法和動(dòng)物測(cè)試法，本發(fā)明人證實(shí)，非常低劑量的這些dsRNA就可以特異并且有效地介導(dǎo)RNAi，導(dǎo)致復(fù)制和感染的顯著抑制。因此，包含這些dsRNA的本發(fā)明方法和組合物能用于治療由正鏈RNA病毒感染介導(dǎo)的病理過程。[0034]人磷脂酰肌醇4-激酶催化性β亞基多肽(PIK4CB ；ΝΜ_002651 ;有時(shí)也稱為ΡΙ4ΚΒ ；PIK4B ；pi4K92 ；ΡΙ4Κβ ；ΡΙ4Κ-β ；ΡΙ4ΚΙΙΙ β )，和人磷脂酰肌醇 4-激酶催化性 α 多肽(PIK4CA;NM_002650 ;有時(shí)也稱為 PI4KA ；PIK4A ；pi4K230 ；FLJ16556 ;和 ΡΙ4Κ_α )是磷脂酰肌醇4-激酶。在文獻(xiàn)中磷脂酰肌醇4-激酶?jìng)溥x地稱為PI4K、PI4-激酶或PIK4。除非文中指出特定選擇，本說明書可交換地使用這類術(shù)語。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中存在4種ΡΙ4Κ酶，所述ΡΙ4Κ酶分成兩類。第一類是從酵母到人都保守的III型PI4Ks，包括PIK4CA和PIK4CB。酵母直向同源物Stt4p和Piklp分別都是具有無重疊功能的必需基因。II型PI4Ks(PI4K II α和ΡΙ4Κ II β )區(qū)別于III類酶，也具有作為非必需基因的酵母同源物L(fēng)SB6。PIK4CB是已最佳表征的哺乳動(dòng)物基因，所述PIK4CB定位于高爾基體、在與小GTP酶腺苷二磷酸-核糖基化因子(ARF)形成的復(fù)合體中發(fā)揮功能、并且認(rèn)為能調(diào)節(jié)高爾基體到質(zhì)膜的分泌。已經(jīng)表明，II類α和β酶參與高爾基體/反面高爾基體運(yùn)輸。III類α同工型似乎在質(zhì)膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)而不是高爾基體中發(fā)揮作用。[0035]除了 PI4Ks的亞細(xì)胞定位之外，還有就是在各自區(qū)室中酶的獨(dú)特功能。PIK4CB參與磷脂酰肌醇4磷酸(PtdIns4P)和磷脂酰肌醇4，5 二磷酸(Ptdlns4，5P2)庫的產(chǎn)生，參與神經(jīng)酰胺從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的調(diào)節(jié)性運(yùn)輸，所述調(diào)節(jié)性運(yùn)輸導(dǎo)致鞘磷脂的合成，并且通過維持允許AP-1結(jié)構(gòu)體停靠的富含磷脂酰肌醇4磷酸(PI (4) P)結(jié)構(gòu)域而參與高爾基體的結(jié)構(gòu)完整性。PIK4CB的破壞造成高爾基復(fù)合體結(jié)構(gòu)的改變，造成極化細(xì)胞的分泌缺陷，并抑制蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到質(zhì)膜。[0036]II類和III類ΡΙ4Κα和β酶產(chǎn)生憐脂酸肌醇4憐酸(PtdIns4_phosphate),所述磷脂酰肌醇4磷酸是幾種調(diào)節(jié)性磷酸肌醇的前體。這些磷酸肌醇通過招募調(diào)節(jié)性蛋白質(zhì)到有組織的信號(hào)復(fù)合體中來控制多種細(xì)胞信號(hào)和運(yùn)輸過程。磷脂酰肌醇4磷酸[PtdIns4P]產(chǎn)生自磷脂酰肌醇(Ptdlns)，第一步是磷脂酰肌醇4，5 二磷酸和磷脂酰肌醇3，4，5三磷酸(PtdIns (3，4，5) P3)的形成。磷脂酰肌醇4，5 二磷酸是磷脂酶C (PLC)酶類主要的底物，所述磷脂酰肌醇4，5 二磷酸在磷脂酶C的作用下產(chǎn)生肌醇1，4，5-三磷酸[Ins(l，4，5)P3]和參與Ca2+信號(hào)傳導(dǎo)的二酰甘油(DAG)。磷脂酰肌醇4，5 二磷酸也控制幾種類型的離子通道和酶類如磷脂酶D (PLD)，并同連接膜至肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架蛋白3和5的蛋白質(zhì)相互作用。通過I類磷脂酰肌醇3激酶的作用產(chǎn)生自磷脂酰肌醇4，5 二磷酸的磷脂酰肌醇3，4，5三磷酸調(diào)節(jié)一系列的過程，例如調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝和通過絲氨酸/蘇氨酸激酶Akt調(diào)節(jié)抗凋亡途徑，并且也調(diào)控酪氨酸激酶例如Btk和用于小GTP結(jié)合蛋白質(zhì)的鳥嘌呤交換因子。這些傳導(dǎo)信號(hào)的磷酸肌醇的產(chǎn)生依賴于其合成酶的活性和其前體供給這二者，因此，磷脂酰肌醇4激酶在細(xì)胞調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。[0037]認(rèn)為依賴于人PIK4CB和PIK4CA來復(fù)制的正鏈RNA病毒包括:1.小RNA病毒組(HAV、脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇病毒)、諾達(dá)病毒、豇豆花葉病毒屬、線蟲傳多面體病毒組、馬鈴薯Y病毒組、大麥花葉病毒組、南方菜豆花葉病毒組和黃癥病毒組(黃化病毒、黃矮病毒和卷葉病毒)。I1.香石竹斑駁病毒組、番爺叢矮病毒組、香石竹環(huán)斑病毒組、痕病毒屬、披膜病毒、伊科病毒、登 革病毒、丙型肝炎病毒、黃病毒屬。II1.煙草花葉病毒組、煙草脆裂病毒組、大麥病毒組、tricornaviruses,甲病毒、風(fēng)疹病毒屬、真菌傳桿狀病毒組、戊型肝炎病毒、馬鈴薯X病毒組、香石竹潛病毒組、蕪菁黃花葉病毒組和蘋果褪綠葉斑病毒。[0038]下列詳細(xì)描述公開了如何制備和使用dsRNA以及含有dsRNA的組合物來抑制正鏈RNA病毒的表達(dá)，以及治療由正鏈RNA病毒感染引發(fā)的疾病和病癥例如肝臟疾病、肝功能衰竭、纖維樣變性、癌、肺疾病和它的并發(fā)癥的組合物和方法(下文進(jìn)一步描述)。本發(fā)明的藥物組合物包含具有反義鏈的dsRNA和可藥用載體，其中所述的反義鏈包含長(zhǎng)度低于30個(gè)核苷酸、通常長(zhǎng)19-24個(gè)核苷酸、并且基本互補(bǔ)于PIK4CB和/或PIK4CA的至少部分RNA轉(zhuǎn)錄物的互補(bǔ)區(qū)域。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案采用在藥物制劑中組合的多于一種的任選地靶向PIK4CB RNA轉(zhuǎn)錄物和/或PIK4CA RNA轉(zhuǎn)錄物的不同區(qū)段的dsRNA。[0039]因此，本發(fā)明的某些方面提供了包含本發(fā)明的dsRNA和可藥用載體的藥物組合物，提供了使用組合物來抑制PIK4CB和/或PIK4CA的表達(dá)的方法，和提供了使用藥物組合物來治療由正鏈RNA病毒感染引起的疾病的方法。[0040]定義[0041]為了方便，下文提供說明書、實(shí)施例和所附權(quán)利要求
中使用的一些術(shù)語和短語的含義。如果術(shù)語在本說明書其它部分的用法與其在本部分提供的定義之間存在明顯差異，那么以本部分的定義為準(zhǔn)。[0042]“ G ”、“ C ”、“ A ”和“ U ”各自通常分別代表含有鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶作為堿基的核苷酸。然而，應(yīng)當(dāng)理解，術(shù)語“核糖核苷酸”或“核苷酸”也指如下文進(jìn)一步詳述的經(jīng)修飾的核苷酸、或者替代的置換部分。技術(shù)人員熟知，鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶可以用其它部分進(jìn)行置換而基本不會(huì)改變寡核苷酸的堿基配對(duì)特性，其中所述的寡核苷酸包含具有此種置換部分的核苷酸。例如，不作限制地，包含肌苷作為其堿基的核苷酸可以與含有腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸形成堿基對(duì)。因此，含有尿嘧啶、鳥嘌呤或腺嘌呤的核苷酸在本發(fā)明的核苷酸序列中可以用含有例如肌苷的核苷酸替換。包含此類置換部分的序列為本發(fā)明的實(shí)施方案。[0043]如本文所用，“靶序列”指在PIK4CB的轉(zhuǎn)錄期間形成的mRNA分子的核苷酸序列的連續(xù)部分，包括為初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的RNA加工產(chǎn)物的mRNA。[0044]如本文所用，術(shù)語“包含序列的鏈”指的是包含一連串核苷酸的寡核苷酸，其中所述的一連串核苷酸通過使用標(biāo)準(zhǔn)核苷酸命名法指代的序列進(jìn)行描述。[0045]如本文所用，并且除非另外說明，否則術(shù)語“互補(bǔ)的”當(dāng)用于相對(duì)于第二核苷酸序列描述第一核苷酸序列時(shí)，其指的是包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在一定條件下與包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或者多核苷酸雜交、并形成雙鏈體結(jié)構(gòu)的能力，這一點(diǎn)為技術(shù)人員所理解。此類條件可以是例如嚴(yán)格條件，其中所述的嚴(yán)格條件可以包括:400mM NaCl、40mM PIPES pH6.4、lmM EDTA50°C或 70°C 12-16 小時(shí)，然后洗滌。也可以應(yīng)用其它條件，例如在生物體內(nèi)可能遇到的生理相關(guān)條件。技術(shù)人員能夠根據(jù)雜交核苷酸的最終應(yīng)用來確定最適合兩個(gè)序列互補(bǔ)性測(cè)試的條件設(shè)置。[0046]這包括包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸與包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在全長(zhǎng)的第一和第二核苷酸序列上的堿基配對(duì)。在本文，此類序列可以稱為彼此“完全互補(bǔ)的”。然而，在本文，當(dāng)其中第一序列稱為與第二序列“基本互補(bǔ)的”時(shí)，這兩個(gè)序列可以完全互補(bǔ)，或者它們于與其最終應(yīng)用最相關(guān)的條件下保留雜交能力的同時(shí)，可以在雜交后形成一個(gè)或 多個(gè)，但通常不多于4個(gè)、3個(gè)或2個(gè)錯(cuò)配堿基對(duì)。然而，在將兩條寡核苷酸設(shè)計(jì)為在雜交后形成一個(gè)或多個(gè)單鏈突出時(shí)，根據(jù)互補(bǔ)性的測(cè)定，此類突出并不視為錯(cuò)配。例如，包含一條長(zhǎng)21個(gè)核苷酸的寡核苷酸和另一長(zhǎng)23個(gè)核苷酸的寡核苷酸的dsRNA，其中較長(zhǎng)的寡核苷酸包含與較短寡核苷酸完全互補(bǔ)的21個(gè)核苷酸的序列，對(duì)于本發(fā)明的目的，仍可以稱為“完全互補(bǔ)的”。[0047]如本文所用，“互補(bǔ)的”序列也可包括非Watson-Crick堿基對(duì)、和/或由非天然和經(jīng)修飾的核苷酸形成的堿基對(duì)，或者完全由上述堿基對(duì)形成，只要所述序列實(shí)現(xiàn)其對(duì)雜交能力的上述需求。[0048]在本文，術(shù)語“互補(bǔ)的”、“完全互補(bǔ)的”和“基本互補(bǔ)的”可以用于dsRNA有義鏈和反義鏈之間、或者dsRNA反義鏈和靶序列之間的堿基配對(duì)，正如其在本文的用途所理解的。[0049]如本文所用，與信使RNA (mRNA)的“至少部分基本互補(bǔ)”的多核苷酸指的是與目的mRNA (例如PIK4CB的mRNA或PIK4CA的mRNA)的連續(xù)部分基本互補(bǔ)的多核苷酸。例如，如果寡核苷酸序列與編碼PIK4CB的mRNA的非間斷部分基本互補(bǔ)，那么寡核苷酸至少與部分PIK4CB mRNA互補(bǔ)。同樣地，如果寡核苷酸序列與編碼PIK4CA的mRNA的非間斷部分基本互補(bǔ)，那么寡核苷酸至少與部分PIK4CA mRNA互補(bǔ)。[0050]如本文所用，術(shù)語“雙鏈RNA”或“dsRNA”指的是具有包含兩條反向平行、并且基本互補(bǔ)(如上文定義)的核酸鏈的雙鏈體結(jié)構(gòu)的核糖核酸分子復(fù)合體。形成雙鏈體結(jié)構(gòu)的兩條鏈可以是一個(gè)較大RNA分子的不同部分，或者是分開的RNA分子。當(dāng)為分開的RNA分子時(shí)，此類dsRNA在文獻(xiàn)中通常稱為siRNA( “短干擾RNA”)。當(dāng)兩條鏈?zhǔn)且粋€(gè)較大分子的部分、并因此通過形成雙鏈體結(jié)構(gòu)的一條鏈的3’末端和另一鏈的5’末端之間不間斷的一連串核苷酸連接，連接的RNA鏈稱為“發(fā)夾環(huán)”、“短發(fā)夾RNA”或“shRNA”。當(dāng)兩條鏈不是通過形成雙鏈體結(jié)構(gòu)的一條鏈的3’末端和另一鏈的5’末端之間不間斷的一連串核苷酸而共價(jià)連接時(shí)，連接結(jié)構(gòu)稱為“接頭”。RNA鏈可以具有相同或不同數(shù)量的核苷酸。堿基對(duì)的最大數(shù)目為減去了雙鏈體結(jié)構(gòu)中存在的任意突出的最短dsRNA鏈的核苷酸數(shù)目。除了雙鏈體結(jié)構(gòu)外，dsRNA可以包含一個(gè)或多個(gè)核苷酸突出。此外，如本說明書所用，“dsRNA”可以包括對(duì)核糖核苷酸、核苷間鍵合、末端基團(tuán)、帽以及綴合部分的化學(xué)修飾，其中包括在多個(gè)核苷酸處的實(shí)質(zhì)修飾、并且包括本文公開或本領(lǐng)域已知的所有類型的修飾。為了本說明書和權(quán)利要求
的目的，“dsRNA”包含任何在siRNA類型的分子中使用的此類修飾。[0051]如本文所用，“核苷酸突出”指的是當(dāng)dsRNA —條鏈的3’末端延伸至超出另一條鏈的5’末端時(shí)從dsRNA的雙 鏈體結(jié)構(gòu)突出的未配對(duì)的核苷酸，或者反之亦然?！捌降摹被颉捌蕉恕北硎驹赿sRNA的所述末端沒有不配對(duì)的核苷酸，即沒有核苷酸突出。“平末端的”dsRNA為在其全長(zhǎng)上均是雙鏈的dsRNA，即在分子的兩末端都沒有核苷酸突出。應(yīng)當(dāng)清楚，在測(cè)定siRNA是否具有突出或者是否為平末端時(shí)，不考慮結(jié)合siRNA3’末端或5’末端連接的化學(xué)帽或者非核苷酸的化學(xué)部分。[0052]術(shù)語“反義鏈”指的是dsRNA的包括與靶序列基本互補(bǔ)的區(qū)域的鏈。該鏈也稱為“指導(dǎo)”序列，并用于在功能RISC復(fù)合物中指導(dǎo)該復(fù)合物對(duì)正確的mRNA進(jìn)行切割。如本文所用，術(shù)語“互補(bǔ)的區(qū)域”指的是反義鏈上與序列例如本文定義的靶序列基本互補(bǔ)的區(qū)域。當(dāng)互補(bǔ)區(qū)域與靶序列不完全互補(bǔ)時(shí)，最耐受在末端區(qū)域的錯(cuò)配，并且如果存在的話，通常在末端區(qū)域或者例如在5’和/或3’末端的6、5、4、3或2個(gè)核苷酸內(nèi)的區(qū)域中。由于“反義”的使用與RNA復(fù)合物有關(guān)，所以“反義”的使用不同于反義DNA化合物，其中所述的反義DNA化合物在核酸治療的相關(guān)領(lǐng)域中是不同的。[0053]如本文所用，術(shù)語“有義鏈”指的是dsRNA的包括與反義鏈的區(qū)域基本互補(bǔ)的區(qū)域的鏈。該鏈也稱為“反指導(dǎo)”序列，因?yàn)樗信c靶序列相同的核苷酸序列，且因此特異地與指導(dǎo)序列結(jié)合。[0054]如本領(lǐng)域技術(shù)人員理解地，當(dāng)談及dsRNA時(shí),“向細(xì)胞中引入”表示促進(jìn)細(xì)胞攝取或吸收。dsRNA的吸收或攝取可以通過自主擴(kuò)散或主動(dòng)的細(xì)胞過程、或者通過輔助性試劑或裝置來進(jìn)行。這個(gè)術(shù)語的含義不限于體外的細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞為活的生物體的部分時(shí)，dsRNA也可以“引入細(xì)胞”。在該情況中，向細(xì)胞的引入包括向生物體的遞送。例如，可以將dsRNA注射入組織部位或者全身施用來進(jìn)行體內(nèi)遞送。在體外向細(xì)胞的引入包括本領(lǐng)域已知的方法例如電穿孔法和脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法。[0055]在本文，只要術(shù)語“沉默”和“抑制表達(dá)”涉及PIK4CB或PIK4CA，那么其指的是在用靶向PIK4CB或PIK4CA的dsRNA處理的細(xì)胞中，至少部分抑制PIK4CB或PIK4CA的表達(dá)，這通過與正常(未處理)細(xì)胞比較，轉(zhuǎn)錄的或可得到的mRNA量的減少來顯示。該測(cè)量法可通過比較處理細(xì)胞(其可從進(jìn)行了處理使PIK4CB或PIK4CA的表達(dá)受到抑制的第一細(xì)胞或第一組細(xì)胞分離)中的mRNA水平來檢測(cè)，并且其中所述的mRNA量減少為和與第一細(xì)胞或第一組細(xì)胞基本相同、但未進(jìn)行如此治療的第二細(xì)胞或第二組細(xì)胞(對(duì)照細(xì)胞)相比較的結(jié)果。抑制程度通常以下列方式表示:[0056]
權(quán)利要求
1.用于在細(xì)胞中抑制磷脂酰肌醇4-激酶表達(dá)的雙鏈核糖核酸，所述雙鏈核糖核酸的縮寫是dsRNA，其中第一鏈和第二鏈的序列是PIK4CB1的第一鏈和第二鏈的序列，分別由SEQ ID NO: 210和314組成，并且其中所述dsRNA與表達(dá)所述磷脂酰肌醇4-激酶基因的細(xì)胞接觸后，抑制所述磷脂酰肌醇4-激酶基因的表達(dá)。
2.權(quán)利要求
1所述的dsRNA，其中所述的接觸至少40%降低磷脂酰肌醇4-激酶催化性β多肽的表達(dá)水平。
3.權(quán)利要求
1或2所述的dsRNA，其中所述的接觸在體外以30nM或更低進(jìn)行。
4.包含權(quán)利要求
1至3任一項(xiàng)所述dsRNA的人肝癌細(xì)胞。
5.用于治療由丙型肝炎病毒感染介導(dǎo)的病理過程的藥物組合物，其包含權(quán)利要求
1至3任一項(xiàng)所述的dsRNA和可藥用載體。
6.權(quán)利要求
5所述的藥物組合物，其包含完全包封的脂質(zhì)體、脂類復(fù)合體、和/或多聚體。
7.權(quán)利要求
1至3任一項(xiàng)所述的dsRNA的用途，用于制備在細(xì)胞中抑制磷脂酰肌醇4-激酶催化性β多肽基因的表達(dá)的藥物組合物。
8.權(quán)利要求
7所述的用途，其中所述藥物組合物用于治療由正鏈RNA病毒感染介導(dǎo)的病理過程，所述正鏈RNA病毒是丙型肝炎病毒。
9.抑制磷脂酰肌醇4-激酶催化性β多肽基因在細(xì)胞中表達(dá)的載體，所述載體包含有效連接至編碼權(quán)利要求
1至3任一項(xiàng)所述的dsRNA的至少一條鏈的核苷酸序列的調(diào)節(jié)序列。
10.包含權(quán)利 要求9所述載體的人肝癌細(xì)胞。
專利摘要
本發(fā)明是用于治療病毒感染的dsRNA。涉及靶向磷脂酰肌醇4-激酶(PI4K)的基因表達(dá)的雙鏈核糖核酸(dsRNAs)，尤其涉及靶向人磷脂酰肌醇4-激酶催化性β多肽(PIK4CB)或人磷脂酰肌醇4-激酶催化性α多肽(PIK4CA)的雙鏈核糖核酸(dsRNAs)，并涉及它們用于治療由正鏈RNA病毒如丙型肝炎病毒(HCV)所致感染的用途。每一dsRNA包含具有這樣的核苷酸序列的反義鏈，所述核苷酸序列長(zhǎng)度短于30個(gè)核苷酸、通常長(zhǎng)19-25個(gè)核苷酸，并且基本互補(bǔ)于PIK4CB靶mRNA或PIK4CA靶mRNA的至少一部分。許多這樣的dsRNA可用于提供治療益處。本發(fā)明也涉及包含dsRNA和可藥用載體的藥物組合物，并且包括遞送形式如完全包封的脂質(zhì)體或脂類復(fù)合體。
文檔編號(hào)A61K48/00GKCN103215269SQ201310098336
公開日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2008年7月4日
發(fā)明者M·A·拉博, L·A·該賽, J·博勞斯基 申請(qǐng)人:諾瓦提斯公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan