專利名稱:富含糖苷配基異黃酮植物蛋白濃縮物及其制備方法
此發(fā)明涉及糖苷配基異黃酮富含植物蛋白濃縮物的生產(chǎn)。通過洗滌植物蛋白物質(zhì)產(chǎn)生植物蛋白濃縮物，利用一種或幾種β-葡糖苷酶大多數(shù)葡糖苷配基異黃酮轉(zhuǎn)化成可保留在富含蛋白濃縮物中的糖苷配基異黃酮。此項專利申請是1993.10.12提交的美國專利申請序號No.08/135,194，的部分繼續(xù)申請。
異黃酮存在于包括植物蛋白物質(zhì)例如大豆的各種豆科植物中，這些化合物包括黃豆苷，6″-OAc黃豆苷，6″-OMal黃豆苷，黃豆苷原，染料木苷，6″-OAc染料木苷，6″-OMal染料木苷，染料木苷原，大豆異黃酮，6″-OAc大豆異黃酮，6″-OMal大豆異黃酮，大豆異黃酮原，鷹嘴豆芽素A7-羥基-4’-甲氧異黃酮和擬雌內(nèi)酯。通常上述化合物天然存在于苦味的大豆，及商業(yè)產(chǎn)品的生產(chǎn)過程中(如分離或濃縮)。問題焦點是除去這些物質(zhì)。例如在傳統(tǒng)的制備大豆蛋白分離方法中，豆片在堿性水溶液介質(zhì)中被萃取，大部分異黃酮溶于萃取液，而其余溶于乳清中，乳清經(jīng)蛋白酸沉淀形成分離體。留在于酸性蛋白沉淀分離體中的殘余異黃酮經(jīng)徹底沖洗而分離。
近期發(fā)現(xiàn)在植物蛋白(如大豆)中的異黃酮可抑制人體癌細(xì)胞的生長，例如胸腺及前列腺的癌細(xì)胞，其記載在如下文獻(xiàn)中″Genistein Inhibition of the Growth of Human Breast Cancer Cells，Independencefrom Estrogen Receptors and the Multi-Drug Resistance Gene″by Peterson andBarnes，Biochemical and Biophvsical Research.Communications，Vol.179，No.1，pp.661-667，August 30.1991；″Genistein and Biochanin A Inhibit theGrowth of Human Prostate Cancer Cells but not Epidermal Growth FactorReceptor Tyrosine Auto-phosphorylation″by Peterson and Barnes.The Protate.Vol.22，pp.335-345(1993)；and ″Soybeans Inhibit Mammary Tumors in Modelsof Breast Cancer″ by Barnes，et al. Mutagens and Carcinogens in the Diet.pp.239-253(1990).
上述異黃酮是以在下式7位上連帶有葡萄糖分子的葡糖苷或糖苷形式存在的。一些葡糖苷，如6″-OAc染料木苷含一個與葡萄糖分子六位相連的乙酸酯基。而包括葡糖苷所有異黃酮苷令人感覺趣之處是其醫(yī)藥價值，最有價值的異黃酮是不帶葡萄糖分子的糖苷配基。這些異黃酮的水溶性與糖苷或葡糖苷不同。從分類上看這些異黃酮是黃豆苷原，染料木苷原，大豆異黃酮原。這些糖苷配基具有如下通式
其中R1，R2，R3和R4選自H，OH和OCH3。因此本發(fā)明涉及的是含有這些物質(zhì)的糖苷配基物和植物蛋白濃縮物。
在本領(lǐng)域中已有許多將葡糖苷異黃酮轉(zhuǎn)化成糖苷配基異黃酮的方法，例如日本專利申請258,669，Obata et al中記載該方法僅能達(dá)到中等轉(zhuǎn)化，因而不十分理想，特別是在大規(guī)模商業(yè)生產(chǎn)中。另外，許多已知方法(如669申請)只講到了如何從蛋白物質(zhì)中除去異黃酮類物質(zhì)，而未描述如何制備糖苷配基異黃酮富含蛋白濃縮物。因此需要一種方法使絕大多數(shù)葡糖苷異黃酮并優(yōu)選實質(zhì)上將所有葡糖苷異黃酮轉(zhuǎn)化成糖苷配基異黃酮，并生產(chǎn)一糖苷配基異黃酮富含植物蛋白濃縮物。
因此發(fā)明的目的在于提供一種糖苷配基異黃酮富含植物蛋白濃縮物及其生產(chǎn)過程。本發(fā)明其它的目的如下詳述。
本發(fā)明提供了一種富含糖苷配基異黃酮植物蛋白濃縮物及其生產(chǎn)方法。該方法包括用在植物蛋白等電位點的PH水溶液中洗滌含有葡糖苷的植物蛋白物質(zhì)，從而產(chǎn)生植物蛋白濃縮物。該濃縮物與足夠量的一種或多種β-葡糖苷酶，在足夠的時間、溫度、PH值下反應(yīng)，使?jié)饪s物中的至少大部分葡糖苷配轉(zhuǎn)化為糖苷配基異黃酮，從而產(chǎn)生一種富含糖苷配基異黃酮蛋白濃縮物。本發(fā)明也提供了生產(chǎn)該濃縮物的方法，其中在洗滌或濃縮中補加β-葡糖苷酶。所得富含糖苷配基濃縮物然后可分離并脫水。另外，本發(fā)明也提供了以相對高的比例從植物蛋白物質(zhì)回收蛋白濃縮物中異黃酮類物質(zhì)的方法。
雖然本發(fā)明是針對大豆產(chǎn)品且方法具體適用于生產(chǎn)富含糖苷配基異黃酮濃縮大豆物料，但是對于含有異黃酮的各類植物蛋白資源都可利用此方法。例如適宜的蛋白材料是豆類物質(zhì)，大豆物質(zhì)或含大豆的植物蛋白物質(zhì)。術(shù)語“大豆物質(zhì)”在這里指大豆類及大豆類衍生物。
按優(yōu)選具體實施的濃縮物，起始物是大豆片，其油已通過萃取去掉。豆蛋白濃縮物典型是用PH44至46這一蛋白等電位點的水溶性溶劑洗滌大豆片而制備的。一種可食酸加入水中提供豆蛋白物質(zhì)的等電位洗滌。等電位洗滌去除了大量溶于水的碳水化合物及其它成份，但不去除蛋白質(zhì)，由此得到了蛋白濃縮物，其通常是干品重量時的60-75％。在植物蛋白或豆類物質(zhì)中的葡糖苷異黃酮通過等電位洗滌而去除。但在PH值相對較低時，所除去的量少于高PH值萃取時的量。因此從優(yōu)選實施方案和最大限度回收異黃酮目的出發(fā)，優(yōu)選等電點洗滌限定在一步或最多加一步額外洗滌。還優(yōu)選洗滌蛋白物質(zhì)的水性溶劑與蛋白物質(zhì)的重量比大約是5∶1至10∶1。
所得濃縮物以約10-約15重量％的固體濃度懸浮于水中，然后與一種或多種β-葡糖苷酶反應(yīng)，使?jié)饪s物中至少大部分并優(yōu)選實質(zhì)上全部葡糖苷異黃酮轉(zhuǎn)化成糖苷配基異黃酮。β-葡糖苷酶的最佳PH值范圍依賴于具體使用的β-葡糖苷酶，通常為4至8這間。萃取時的PH一般被調(diào)節(jié)到這樣的PH范圍，即在與酶反應(yīng)前，所用的具體酶活性最大。該PH一般通過加可食用酸來調(diào)節(jié)，如醋酸、硫酸、磷酸，鹽酸或任何其它適用的試劑。
β-葡糖苷酶可天然存在于大豆類物質(zhì)或微生物生長過程中，這里稱為“殘留”酶，或被加到濃縮物之中。加入的酶，在這指“補充酶”。一般情況下如果濃縮物中“殘留”酶的量不足以使異黃酮的葡糖苷轉(zhuǎn)化成糖苷配基。則應(yīng)加入補充酶。異黃酮轉(zhuǎn)化所需酶的量是由多種因素決定的，其包括酶的種類、酶濃度分布、PH值系統(tǒng)及酶的活性。只要足夠濃度的酶存在，無論是“殘留酶”還是“補充酶”或二者兼有，濃縮物在足夠時間溫度及PH條件下與β-葡糖苷酶反應(yīng)都可使大多數(shù)并優(yōu)選實質(zhì)上全部葡糖苷異黃酮轉(zhuǎn)化成糖苷配基異黃酮。
較好的“補充酶”(β-葡糖苷酶類)包括生物果膠酶100L和300L，生物果膠酶OK70L，乳糖酶F，內(nèi)酯酶。乳糖酶F可由Amano Intemational Enzyme Co.，Inc，P.O.Box 1000，Troy，UA22974提供，其最佳的PH范圍為4-6；內(nèi)酯酶(Lctozyme)可由Novo Industries，Enzyme division，Novo Alle，DK-2880Bagsvaerd.，Denmart提供，其最佳的PH為7左右。生物果膠酶100L和300L以及OK70L可由Quest International SarasotaFlorda提供。補充酶的足量加入可使大部分并優(yōu)選實質(zhì)上全部葡糖苷異黃酮轉(zhuǎn)化成糖苷異黃酮。因此加入“補充酶”是十分必要的，其加入量應(yīng)為干品蛋白濃縮物重量的0.5％至5％。
另一類可作為“補充酶”的是酯酶，這些酯酶適于這里所述的優(yōu)選實施方法，它通過從異黃酮共軛體中除去乙酸酯基和丙二酸酯基團(tuán)使乙酸酯和丙二酸酯的共軛體轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸擒张涮腔慄S酮。大多數(shù)優(yōu)選具體實施方案中，使用這兩種酶，即β-葡糖苷酶和酯酶。
較好的具體方法是一步法并具有非常高的轉(zhuǎn)化率(從葡糖苷異黃酮轉(zhuǎn)化成糖苷配基異黃酮)，且用時短并操作容易，經(jīng)濟易行。術(shù)語“一步”在此表示在反應(yīng)過程中的參數(shù)保持不變，這些參數(shù)包括PH值和溫度。
非常高的轉(zhuǎn)化率是指蛋白濃縮物中至少大部分并優(yōu)選實質(zhì)上全部的葡糖苷異黃酮轉(zhuǎn)化成糖苷配基異黃酮。術(shù)語“大部分”指轉(zhuǎn)化率至少為50％，術(shù)語“實質(zhì)上全部”指至少為80％，最好的指至少90％。
雖然不洗滌可能受到特殊理論的束縛，但它確實表明這里所述的令人驚奇且出人意料的高轉(zhuǎn)化率來自一步反應(yīng)過程中所用的參數(shù)組合。優(yōu)選反應(yīng)系統(tǒng)的PH值保持穩(wěn)定且大約從4至8。最優(yōu)選的PH值是在一步法中，與異黃酮共軛體反應(yīng)前，酶最具活性時PH值。優(yōu)選在一步法中反應(yīng)系統(tǒng)的溫度保持穩(wěn)定，大約從40度到60度，最佳溫度為60度。一般通過一步法將實質(zhì)上所有葡糖苷異黃酮轉(zhuǎn)成糖苷配基物所需的反應(yīng)時間大約從2小時到24小時。
提供富含糖苷配基濃縮物的另一替代步驟是將等電點洗滌和與β-葡糖苷酶的反應(yīng)結(jié)合到單一步驟中，其中豆類起始物質(zhì)懸浮于等電點洗滌液中，并將在該等電點具有最佳PH的一種或幾種β-葡糖苷酶如乳糖酶下直接加入到漿液中。然后反應(yīng)按上述反應(yīng)條件進(jìn)行，從而將至少大部分和優(yōu)選實質(zhì)上全部葡糖苷異黃酮轉(zhuǎn)化為糖苷配基物。這一步驟代表了優(yōu)選且簡單的方法，并不必首先在等電點洗滌物質(zhì)以去除可溶性碳水化合物，從而避免了通過洗滌使異黃酮損失的可能性。
蛋白濃縮物可利用常規(guī)的方法脫水、包括離心與干燥技術(shù)從而得到染料木苷原濃度為1.0至2.0毫克/克(干品)，黃豆苷原為0.7至1.5毫克/克(干品)的濃縮物。
本發(fā)明還提供了以非常高比例，從植物蛋白材料如大豆材料回收蛋白濃縮物中黃酮的方法?；谥参锏鞍灼鹗嘉镏懈黝惍慄S酮總量，通過這里所述方法得到的回收率至少為50％，較好為65％，最好為80％。雖然不希望受具體理論的束縛，但確信由這里所述反應(yīng)得到的高回收率與所述各種加工手段有關(guān)。在具體階段，通過將相對可溶的葡糖苷異黃酮轉(zhuǎn)化為不溶的糖苷配基異黃酮，可從進(jìn)料物質(zhì)中將高百分比異黃酮回收在所得產(chǎn)物中。
下列實例將進(jìn)一步論述，但其對于本發(fā)明具有非限制性。
實例取15克大豆粉加入150克水混合，調(diào)節(jié)PH為7。往該混合物中加入1.5g生物果膠酶100L。混合物在60℃培養(yǎng)2小時同時調(diào)節(jié)PH至4.5。加入1.0g生物果膠酶100L，再培養(yǎng)2小時。養(yǎng)完畢后，回收所得富含糖苷配基異黃酮蛋白/纖維濃縮物。蛋白/纖維濃縮物中的異黃酮回收率如表1所示
表
<p>這些數(shù)據(jù)表明在“殘留”酶與“補充酯”的共同作用下得到的轉(zhuǎn)化率。異黃酮共軛體發(fā)生了向轉(zhuǎn)糖苷配基物的明顯轉(zhuǎn)化，特別是染料木苷原和黃豆苷原。各類異黃酮的含量是基于異黃酮類的所有形式的總量。
在另一系列實驗中研究了來自大豆的蛋白濃縮物中的染料木苷原和黃豆苷原的回收百分比。通過測定分離物中染料木苷原(或黃豆苷原)的量得到回收百分比，其以所含大豆起始物中染料木苷原(或黃豆苷原)的所有形式的總量的百分比來表示。100g去脂豆粉加到1600克用鹽酸調(diào)節(jié)PH至4.5的水中，所得漿狀物，被加熱到50℃，加入2％凝乳狀，具有β-葡糖苷酶活性的乳糖酶F。該漿狀物在50℃反應(yīng)16小時，以保證葡糖苷異黃酮完全轉(zhuǎn)化成糖苷配基異黃酮。蛋白濃縮物通過離心從水溶性溶劑中分離，并形成富含糖苷配基濃縮體，略去了洗滌步驟。分離體中染料木苷原的含量為起始大豆物料(脫脂豆粉)中染料木苷原和染料木苷所有形式的總量的82％。類似地，分離液中黃豆苷原回收率為64％。
定量分析豆類產(chǎn)物中異黃酮的方法如下通過將0.75g樣品(噴霧干燥或碾成細(xì)粉)與50ml 80/20甲醇/水溶劑混合提取異黃酮，在室溫下用軌道振蕩器振搖2小時，進(jìn)行萃取。2小時后，余下未溶的物料用Whatman No.42濾紙過濾除去。5ml濾液用4ml水和1ml甲醇稀釋。
通過高效液相色譜用Beckman C18反相柱對異黃酮類化合物進(jìn)行分離。將異黃酮注射到該柱上，用溶劑，梯度洗脫，起始甲醇88％，水10％，冰乙酸2％結(jié)束甲醇98％，冰乙酸2％。流速0.4毫升/分鐘，紫外吸收峰為262nm，清楚地拆分出黃豆苷，6″-氧-乙酰黃豆苷，6″-氧-丙二酰黃豆苷，黃豆苷原，染料木苷，6″-氧-乙酰染料木苷，6″-氧-丙二酰染料木苷，染料木苷原，大豆異黃酮及其衍生物和大豆異黃酮原。峰的鑒定由質(zhì)譜完成。
定量分析由標(biāo)準(zhǔn)品與樣品對照完成。標(biāo)準(zhǔn)品(染料木苷，染料木苷原，黃豆苷，黃豆苷原)由InaofineChemical.Company，Sommerville，NJ.購買。計算每個上述化合物的響應(yīng)因子(積分面積/濃度)，并用于未知樣品的定量，對于無標(biāo)準(zhǔn)品提供的共軛體型化合物，其響應(yīng)因子是由其母體分子的響應(yīng)因子并根據(jù)共軛體的分子量修正而得出的。如大豆異黃酮的響應(yīng)因子是由染料木苷的響應(yīng)因子與大豆異黃酮的分子量修正而得出。
此方法提供了每個異黃酮類物質(zhì)的定量方法。為計算方便，如果所有的共軛形式轉(zhuǎn)化為其對應(yīng)的非共軛形式，一般依據(jù)上述數(shù)據(jù)和這些化合的聚集重量，分別計算得出染料木苷原，黃豆苷原，大豆異黃酮原的總含量，其總含量也可直接用酸水解轉(zhuǎn)化成共軛形式的方法計算。
當(dāng)然前述僅是本發(fā)明的具體優(yōu)選方案且在不背離該發(fā)明所附權(quán)利要求
書的精神和范圍下可做各種變化與替代。該權(quán)利要求
書遵循專利法的原則包括相應(yīng)的條例逐一論述。
權(quán)利要求
1.從植物蛋白物質(zhì)生產(chǎn)富含糖苷配基異黃酮蛋白濃縮物的方法，其包括(a)用具有植物蛋白物質(zhì)等電位總的PH值的水性溶劑洗滌含有葡糖苷異黃酮的植物蛋白物質(zhì)，產(chǎn)生含有葡糖苷異黃酮的植物蛋白濃縮物；和(b)葡糖苷異黃酮與足量的酶在足夠的時間，溫度和PH下反應(yīng)，該酶至少是一種β-葡糖苷酶和酯酶，從而將濃縮物中的至少大部分葡糖苷異黃酮轉(zhuǎn)化成糖苷配基異黃酮，從而生成富含糖苷配基異黃酮的蛋白濃縮物。
2.從權(quán)利要求
1的方法，其包括(a)用具有植物蛋白物質(zhì)等電點的PH值的水性溶劑洗滌含有葡糖苷異黃酮類物質(zhì)和足量殘留酶的植物蛋白物質(zhì)，殘留酶為至少一種β-葡糖苷酶或酯酶，從而生成含葡糖苷配糖基異黃酮的植物蛋白濃縮物；和(b)葡糖苷異黃酮與殘留酶在足夠的時間，溫度和PH下反應(yīng)，將濃縮物至少大部分葡糖苷異黃酮轉(zhuǎn)化成糖苷配基異黃酮，從而制備出富含糖苷配基異黃酮蛋白濃縮物。
3.從植物蛋白物質(zhì)制備富含糖苷配基異黃酮蛋白濃縮物的方法，其包括(a)用具有植物蛋白物質(zhì)等電位點PH值的水性溶劑洗滌含有葡糖苷異黃酮的植物蛋白物質(zhì)，生成含有葡糖苷異黃酮的植物蛋白濃縮物；(b)加入“補充酶”至濃縮物，該酶為至少一種β-葡糖苷酶和酯酶，使?jié)饪s物中酶的總含量充足，以便濃縮物中至少大部分葡糖苷異黃酮被轉(zhuǎn)化為糖苷配基物；和(c)葡糖苷異黃酮與酶在足夠時間，溫度和PH下反應(yīng)，使?jié)饪s物中的至少大部分葡糖苷異黃酮轉(zhuǎn)化為糖苷配基異黃酮，從而制備出富含糖配基異黃酮濃縮物。
4.權(quán)利要求
1，2或3的方法，其中所述的時間范圍為大約2小時至24小時。
5.權(quán)利要求
4的方法，其中所述的時間范圍大約24小時。
6.權(quán)利要求
1，2或3的方法，其中所述的溫度為大約40℃至60℃。
7.權(quán)利要求
6的方法，其中所述的溫度為60℃。
8.權(quán)利要求
1，2或3的方法，其中所述的PH值大約從4至8。
9.權(quán)利要求
8的方法，其中所述的PH值大約是4.5。
10.權(quán)利要求
1，2或3的方法，其中所述的時間范圍大約為24小時，溫度為大約60℃，PH值大約為4.5。
11.權(quán)利要求
1，2或3的方法，其中所述的洗滌植物蛋白物質(zhì)和葡糖苷異黃酮與β-葡糖苷酶的反應(yīng)步驟是一次操作完成的。
12.權(quán)利要求
1，2或3的方法，其中所述的糖苷配基異黃酮蛋白濃縮物是由大豆制備的。
13.權(quán)利要求
1，2或3的方法，其中所述的植物蛋白物質(zhì)包括大豆類物質(zhì)。
14.權(quán)利要求
1，2或3的方法，其中實質(zhì)上上所有葡糖苷異黃酮類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為糖苷配基異黃酮。
15.權(quán)利要求
1的方法，其中所述的PH值是使酶或殘余酶或補充酶先與異黃酮類物質(zhì)反應(yīng)前具有最強活性的PH值。
16.由權(quán)利要求
1，2或3方法制備富含糖苷配基異黃酮蛋白濃縮物。
17.富含糖苷配基異黃酮強化濃物中染料木苷原的干品含量是1.0至2.0毫克/克，黃豆苷原的含量是0.7至1.5毫克/克。
18.回收至少植物蛋白材料中50％異黃酮的蛋白濃縮物方法，其包括(a)用具有植物蛋白物質(zhì)等電位點PH值的水性溶劑洗滌含有異黃酮類物質(zhì)的植物蛋白物質(zhì)，并制備出含有異黃酮類物質(zhì)的植物蛋白濃縮物，(b)在足夠的時間，溫度和PH下，異黃酮與足量的酶充分反應(yīng)，使?jié)饪s物中至少大部分異黃酮類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為水解性較弱的異黃酮類物質(zhì)，從而制備出富含異黃酮蛋白濃縮物，其中異黃酮的含量應(yīng)至少為植物蛋白物質(zhì)中異黃酮含量的50％。
19.權(quán)利要求
18的方法，其中所述濃縮物中異黃酮的含量應(yīng)至少為植物蛋白物質(zhì)中異黃酮含量的65％。
20.權(quán)利要求
18的方法，其中所述濃縮物中異黃酮的含量應(yīng)至少為植物蛋白物質(zhì)中異黃酮含量的80％。
21.權(quán)利要求
18所述植物蛋白物質(zhì)包括大豆類作物。
22.權(quán)利要求
18的方法，其中所述的酶選自β-葡糖苷酶和酯酶類。
23.濃縮物由權(quán)利要求
18，19或20的方法制備。
專利摘要
本文揭示了富含糖苷配基異黃酮強化蛋白濃縮物及其生產(chǎn)方法和其回收。該方法包括等電位下洗滌植物蛋白物質(zhì)使之形成蛋白濃縮物，將其勻漿并與足量的β-葡糖苷酶或酯酶在足夠時間范圍、溫度、pH值下充分反應(yīng)，使?jié)饪s物中至少大部分葡糖苷配糖基異黃酮轉(zhuǎn)化為糖苷配基異黃酮。
文檔編號A23J3/14GKCN1055931SQ94194200
公開日2000年8月30日 申請日期1994年9月21日
發(fā)明者J·L·申, B·A·布里安 申請人:蛋白質(zhì)技術(shù)國際公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan