專利名稱:使用釩溴過氧化物酶作為產(chǎn)生信號之酶測定特異性結(jié)合配體的分析元件和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分析元件和分析方法，所述元件和方法用于檢測液體樣品中的特異性結(jié)合配體。更具體地說，本發(fā)明涉及使用釩溴過氧化物酶作為該分析元件中產(chǎn)生信號之酶。
最近幾十年來，已開發(fā)出很多不同分析方法來檢測上述物質(zhì)。這些方法已很可靠，且在某情況下適宜于自動化，以及適宜于以配套形式使用。這些方法大部分依賴于本技術(shù)領(lǐng)域：
所謂的“特異性結(jié)合反應(yīng)”，即欲檢測之物質(zhì)(本文中稱之為“特異性結(jié)合配體”或“配體”)和對該配體能特異性識別并與之反應(yīng)的相應(yīng)受體之間的“特異性結(jié)合反應(yīng)”。大部分已知特異性結(jié)合反應(yīng)是免疫反應(yīng)物之間(免疫測試中)的反應(yīng)，例如抗體與抗原，或抗體與半抗原，但其它的，例如抗生物素蛋白與生物素也是已知的。
總的來說，免疫測試可以提供是否存在(或存在多少)特異性抗原、抗體、或抗原-抗體復(fù)合物的定性和/或定量測定。一種稱之為“競爭結(jié)合免疫測試”的免疫測試形式中，將欲測定的配體經(jīng)標(biāo)記的類似物，置于與固定量適當(dāng)抗體的競爭之中(所述抗體與配體和配體類似物均能反應(yīng))。該類似物上的標(biāo)記，可以其游離形式或配合物形式(即反應(yīng)過了)被恰當(dāng)?shù)貦z測出，這樣該檢測結(jié)果將告知使用者被檢樣品中有多少配體。在另一種被稱之為“夾層式”免疫測試或免疫度量測試的免疫測試方式中，配體與兩個或多個受體分子接觸，這些受體在不同表位與該配體結(jié)合。一個受體被適當(dāng)標(biāo)記，而其余的或者是被固定于固體基質(zhì)上的，或者是易于固定于其上的。配體之量與配體和兩受體中所結(jié)合的配合物量成正比。
免疫測試傳統(tǒng)上在溶液中進(jìn)行，或在試驗(yàn)裝置中進(jìn)行，所述裝置中的液體以某種方式從參與測試的試劑中除去。雖然溶液技術(shù)在該領(lǐng)域中被廣泛接受，但它們一般需要使用帶來復(fù)雜溶液處理和運(yùn)輸能力問題的分析裝置，即此種檢測所用的分析裝置要涉及復(fù)雜的液體處理，為避免樣品之間的污染，操作和精心清洗時均需要熟練技術(shù)人員。
代替溶液化學(xué)的是采用于性分析元件。應(yīng)明確，不是所有含水溶液均可采用干性分析元件，因?yàn)橐褂檬顾鲈３纸Y(jié)構(gòu)完整必要的涂料、粘結(jié)劑及其它試劑，由此造成某些影響。另外，學(xué)科的多樣性通常要求良好的元件構(gòu)成。而且干性分析元件必需使用隔間分隔不相容成分，這不像溶液化學(xué)一樣，后者液體貯液是分離開的，可采用連續(xù)液體加入方式。
很多文獻(xiàn)中已介紹過干性分析元件，及其在免疫測試中的應(yīng)用，包括Pierce等人的美國專利No.4,258,001，F(xiàn)rickey等人的美國專利No.4,670,381，WO 82/2601(1982年8月5日公開)、歐洲專利申請No.051,183(1982年5月12日公開)和歐洲專利申請No.066,648(1982年12月15日公開)。
改進(jìn)的干性分析元件及其在免疫測試中的應(yīng)用，在未決的共同轉(zhuǎn)讓美國申請流水號938,460(1992年8月31日遞交，Belly等人)中有所介紹，其中采用酶標(biāo)記來檢測。該Belly等人的申請中公開優(yōu)選辣根過氧化物酶作為酶標(biāo)記。使用特定清洗技術(shù)將已結(jié)合(或配合)的免疫反應(yīng)劑與未結(jié)合的反應(yīng)劑分開，此種元件可以用來測定濃度很低的分析物。
使用以過氧化物酶作為標(biāo)記的干性分析元件進(jìn)行免疫測試時，該過氧化物酶的穩(wěn)定性是非常重要的，因?yàn)槠錆舛鹊娜魏巫兓瘜?yán)重影響測試靈敏度。Friedman等人的美國專利No.5,372,932所述測試中，使用4′-羥基或4′-烷氧基芳基乙酰胺作為干性分析元件中增進(jìn)酶或酶標(biāo)記穩(wěn)定性的試劑。雖然這些試劑有改善穩(wěn)定性的效果，但發(fā)現(xiàn)該過氧化物酶標(biāo)記的穩(wěn)定性仍然小于干性分析元件中所期望的程度。
目前，Butler和Walker介紹過從水生藻和海藻中提取的，以及來自陸生苔蘚及真菌的釩溴過氧化物酶(VBrPO)族，在有過氧化氫和溴陰離子存在時能催化產(chǎn)生活性溴，所述活性溴是強(qiáng)氧化劑(見Butler等人Chem.Revs.，93，pp.1937-1944，1993，引入本文中作為參考)。
而問題之一是大多數(shù)鹵素過氧化物酶其最佳pH值范圍較低，即3-5。這對于依賴于過氧化陰離子的現(xiàn)有技術(shù)分析元件來說是個難題，過氧化物的pKa一般為約11.5。而釩溴過氧化物酶在pH值為約6-10時工作仍有效。
雖然公開于現(xiàn)有技術(shù)中的分析元件和方法顯示出測試靈敏度及穩(wěn)定性均提高了，但該領(lǐng)域仍需要進(jìn)一步改進(jìn)。例如，需要提供較簡單的分析元件。該元件不要求如Friedman等人在美國專利No.5,372,932中所述的穩(wěn)定試劑。同時，仍需要提供比已知現(xiàn)有技術(shù)系統(tǒng)有改善的酶穩(wěn)定性和更高靈敏度的元件。
本發(fā)明涉及一種測定特異性結(jié)合配體的分析元件，所述元件包含(i)多孔展開區(qū)帶；和(ii)與所述多孔展開區(qū)帶處于流體接觸狀態(tài)的至少一個附加區(qū)帶，其中所述元件的至少一個區(qū)帶中含有釩溴過氧化物酶標(biāo)記的免疫反應(yīng)劑，該免疫反應(yīng)劑能與所研究的特異性結(jié)合配體之受體特異性結(jié)合。
更具體地說，本發(fā)明涉及用于測定特異性結(jié)合配體的分析元件，該元件包含(i)一種多孔的展開區(qū)帶，(ii)一個或多個附加區(qū)帶，它與所述多孔展開區(qū)帶處于流體相接觸狀態(tài)，以及(iii)任意含一種吸收性材料，與上述區(qū)帶處于流體接觸狀態(tài)。
其中所述元件的至少一個區(qū)帶含有釩溴過氧化物酶標(biāo)記的免疫反應(yīng)劑，該免疫反應(yīng)劑能特異性地與所研究的特異性結(jié)合配體或其受體反應(yīng)。
本發(fā)明也提供使用上述免疫測試分析元件測定特異性結(jié)合配體的方法，包括(A)將假定含有所述特異性結(jié)合配體的液體樣品與所述分析元件接觸，(B)將所述分析元件與一種洗滌組合物接觸，所述組合物包含(a)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號的試劑，該試劑提供應(yīng)答釩溴過氧化物酶的催化活性之信號，所述產(chǎn)生信號試劑是2，3-二氫-2，3-二氮雜萘-1，4-二酮衍生物；
(b)鹵素、假鹵素、產(chǎn)生鹵素的原料或產(chǎn)生假鹵素的原料；和(c)過氧化物或產(chǎn)生過氧化物的試劑組合物；(C)檢測未反應(yīng)的，或已反應(yīng)的釩溴過氧化物酶標(biāo)記的免疫反應(yīng)劑，作為研究的所述特異性結(jié)合配體的度量。
本發(fā)明提供一種用于干性分析元件的高靈敏度和穩(wěn)定的組合物。本發(fā)明的元件可廣泛用于各種特異性結(jié)合配體的測定，但對測定低濃度配體特別有用。通過加入釩溴過氧化物酶標(biāo)記的免疫反應(yīng)劑到該元件中，達(dá)到酶穩(wěn)定及增強(qiáng)檢測之優(yōu)點(diǎn)。
圖2是使用本發(fā)明含產(chǎn)生信號的釩溴過氧化物酶作為其一種組分的元件所獲得的信噪應(yīng)答，和如Friedman等人的美國專利No.5,372,931實(shí)施例1所述，含辣根過氧化物酶(HRP)作為產(chǎn)生信號之酶，并含3′-氯-4′-羥基-N-乙酰苯胺在洗滌組合物中作為增強(qiáng)劑的對照元件所獲得的信噪應(yīng)答之圖解。
圖3是使用本發(fā)明含產(chǎn)生信號的釩溴過氧化物酶的元件進(jìn)行印跡酶測試的穩(wěn)定性，和含辣根過氧化物酶作為產(chǎn)生信號之酶的對照元件所得結(jié)果的圖解。
圖4(a)和4(b)表示使用本發(fā)明產(chǎn)生信號的含釩溴過氧化物酶的元件，在室溫下貯存不同時間后，其保留的化學(xué)發(fā)光信號百分比，和含辣根過氧化物酶作為產(chǎn)生信號之酶的對照元件所得該百分比的柱狀圖。
本發(fā)明的方法是一種特異性結(jié)合測試法，例如免疫測試，它可以是競爭式結(jié)合，或者作為本領(lǐng)域熟知項目的免疫度量。要測定的所研究的分析物是特異性結(jié)合配體、標(biāo)記配體、標(biāo)記配體類似物或其受體。本發(fā)明對于測定各種含水液體中的低濃度配體很有利，例如測定人和動物的生物學(xué)體液、食物、城市污水，以及以這種方式普通試驗(yàn)的其它液體?？梢栽囼?yàn)的生物學(xué)體液包括(但不限于)全血、血清、血漿、尿、脊髓液、淚水、滑膜液、淋巴液、組織或蝕斑懸浮液、齦液、陰道液、顱液，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它液體。
可以測定的配體包括(但不限于)肽、多肽、蛋白(例如酶、抗體、脂蛋白和糖蛋白)、藥物、麻醉物、甾類化合物、毒素和糖類(例如多糖)。具體研究的特異性結(jié)合配體包括異羥基毛地黃毒苷、二苯乙內(nèi)酰脲、苯巴比妥、茶堿、C-反應(yīng)性蛋白、人絨毛膜促性腺激素、刺激甲狀腺激素、甲狀腺原氨酸衍生物(例如甲狀腺素和三碘甲狀腺原氨酸)、肌酸激酶-MB、氨甲酰氮、慶大霉素、妥布霉素或萬古霉素。本發(fā)明在測定異羥基毛地黃毒苷、二苯乙內(nèi)酰胺、苯巴比妥和C-反應(yīng)性蛋白方面最為有效。
本發(fā)明使用一種含多孔展開區(qū)帶的分析元件進(jìn)行，通常有帶適當(dāng)孔度(以容納試驗(yàn)樣品)，比如1-50μl的涂層，在稀釋或未加稀釋條件下進(jìn)行。本發(fā)明元件可用本領(lǐng)域已知技術(shù)裝配。優(yōu)選多孔展開區(qū)帶是各向同性孔，其性質(zhì)由該區(qū)帶的顆粒、纖維或其它物理成分中相互連接空間所提供。所述多向同性孔意味著液體可均勻地通過該區(qū)帶展開。此種區(qū)帶所用材料是不溶于水的，在測試期間能保持其結(jié)構(gòu)完整。常用材料及裝配該元件的方法在下述文獻(xiàn)中有所介紹，例如Przybylowicz等人的美國專利No.3,993,158，Pierce等人的美國專利No.4,258,001，Kitazima等人的美國專利No.4,292,272和koyama等人的美國專利No.4,430,436，這些內(nèi)容均列入本文作為參考。優(yōu)選的多孔展開區(qū)帶由有機(jī)高聚物顆粒及高聚物粘膠制備成凝固的三維結(jié)構(gòu)，如Pierce等人的美國專利No.4,258,001所述。
該元件中有一個或多個附加區(qū)帶，所有的均與多孔展開區(qū)帶處于流體相接觸狀態(tài)。應(yīng)明確所謂“流體相接觸”是指流體可以很容易地由一個區(qū)帶移到另一區(qū)帶。所述附加區(qū)帶(優(yōu)選涂有高聚物涂層)包括膠層、試劑、和射線阻隔區(qū)帶，并包含一種或多種本領(lǐng)域已知的親水粘合材料，例如明膠、丙酰胺高聚物及乙烯吡咯烷酮高聚物。有些可以是不溶于水的，而另一些可能是水溶性的。
本發(fā)明元件的區(qū)帶可以是自載的，但優(yōu)選配置在適當(dāng)尺寸穩(wěn)定的化學(xué)惰性載體上。優(yōu)選所述載體是無孔并能透過電磁輻射的。所選擇的載體應(yīng)當(dāng)與欲采用的檢測模式相容(例如透射或反射分光儀)。有用的載體包括(但不限于)紙、金屬薄膜、聚苯乙烯、聚酯、聚碳酸酯及纖維素酯。
該元件還可任意包含一種吸收材料，該材料與本發(fā)明元件之區(qū)帶處于流體相接觸狀態(tài)。本發(fā)明所用吸收材料對所述元件提供全部附加液體容量，為本發(fā)明方法所用洗滌液體提供容器。適宜的吸收材料包括(但不限于)玻璃微纖維、紙、海綿、織物、塑料等，只要該材料能吸收液體即可。
一個優(yōu)選方案中，吸收材料的環(huán)狀斷面置于展開區(qū)帶之上，使展開區(qū)帶接近樣品并洗滌。
本發(fā)明元件至少一個區(qū)帶是釩溴過氧化物酶標(biāo)記的免疫反應(yīng)劑，它能夠與所研究的特異性結(jié)合配體或其受體特異性反應(yīng)。在競爭結(jié)合免疫測試中，該標(biāo)記的免疫反應(yīng)劑通常是特異性結(jié)合配體的標(biāo)記類似物。在夾層測試中，該標(biāo)記的免疫反應(yīng)劑，可以是配體的標(biāo)記受體，或者是與受體特異性結(jié)合的標(biāo)記分子(例如標(biāo)記的抗抗體)。
使用許多已知方法之任一種均可制備此種標(biāo)記的免疫反應(yīng)劑，包括由Yoshitake等人在“歐洲生化雜志”(Eur.J.Biochem)101，395(1979)，和Kondo等人在美國專利No.5,106,732中所介紹的。
如本文所述所謂“釩溴過氧化物酶”意指能催化物質(zhì)(如魯米諾)的氧化反應(yīng)，產(chǎn)生適當(dāng)化學(xué)發(fā)光信號的任何釩溴過氧化物質(zhì)(酶催化物或其它的)。本發(fā)明可用的蛋白質(zhì)釩溴過氧化物酶源，在Butler等人，于“化學(xué)綜述”(Chem.Revs.)，93，pp，1937-1944(1993)的文章中能找到，包括(但不限于)從泡葉藻、仙菜、糖海帶、墨角對葉藻(Fucus distichus)、小珊瑚藻、珊瑚藻、巨藻等。分離釩溴過氧化物酶的方法，可在前述Butler等人的文獻(xiàn)中找到。這些蛋白質(zhì)釩溴過氧化物酶源中泡葉藻是特別優(yōu)選的。
如本文上面所述，通過將釩溴過氧化物酶加入干性分析元件中，使本發(fā)明的元件表現(xiàn)出意想不到的酶穩(wěn)定性，并且無需加入增強(qiáng)劑而提高檢測能力，例如Friedman等人的美國專利No.5,372,931所介紹的。
由于反應(yīng)中所用其它成分之量，及試驗(yàn)樣品中預(yù)計的分析物之量不同，所以釩溴過氧化物酶標(biāo)記的免疫反應(yīng)劑之量可以在很寬范圍內(nèi)變動。元件中存在量一般為至少約0.01μg/m2，其優(yōu)選范圍是約0.1至約100μg/m2。
本發(fā)明的元件還可以含有能與所研究的特異性結(jié)合配體，或與其受體發(fā)生特異性反應(yīng)的未標(biāo)記免疫反應(yīng)劑。在競爭式結(jié)合免疫測試中，所述免疫反應(yīng)劑一般是該配體之受體(例如抗體)。在夾層式免疫測試中，所述未標(biāo)記免疫反應(yīng)劑可以是該配體之受體，或者是該受體的結(jié)合分子。優(yōu)選方案中，該免疫反應(yīng)劑是對該配體特異性的抗體。
如果存在的話，所述未標(biāo)記的免疫反應(yīng)劑，除了一般不處于釩溴過氧化物酶標(biāo)記的免疫反應(yīng)劑同一區(qū)帶之外，可以位于該元件的任何區(qū)帶。因此，元件該兩成分以某種方式維持分離狀態(tài)，直至測試開始。所述兩成分通過處于元件的不同區(qū)帶而相分離，或者它們可以位于同一區(qū)帶，但其一種以某種材料包裹，當(dāng)檢測開始時再釋放出來。優(yōu)選所述免疫反應(yīng)劑維持在不同的區(qū)帶或?qū)又小?br> 也優(yōu)選未標(biāo)記的免疫反應(yīng)劑被固定于適當(dāng)顆粒上，所述顆粒分散于元件整個區(qū)帶。此種顆?？梢杂扇魏芜m宜材料組成，包括(但不限于)玻璃、氧化鐵、陶瓷、有機(jī)合成或天然高聚物，其平均粒度為約0.01至約10μm。優(yōu)選該顆粒從合成高聚物制備，有適當(dāng)?shù)谋砻婊鶊F(tuán)能吸附免疫反應(yīng)劑分子，或與之共價連接。這些材料各種不同類別是本領(lǐng)域已知的，如下述文獻(xiàn)所述U.S.Patent No.4,828,978 to Warren et al.，U.S.PatentNo.4,997,772 to Sutton et al.，U.S.Patent No.5,147,777 toSutton et al.或U.S.Patent No.5,177,023 to Sutton et al.，以及它們所列參考文獻(xiàn)。
特別有用的高聚物顆粒是由烯烴不飽和可聚合單體制備的，所述單體還帶有活性羧基、2-取代的乙基磺?；蛞蚁┗酋；?，具體如本文前述Sutton等人專利所介紹的。
本發(fā)明還涉及一種測定特異性結(jié)合配體的多層分析元件，其中所述元件包括無孔載體，其上有下述各層處于流體接觸狀態(tài)(i)第一試劑層或緩沖層；(ii)含有未標(biāo)記免疫反應(yīng)劑的膠層，所述未標(biāo)記免疫反應(yīng)劑與所研究的特異性結(jié)合配體特異性結(jié)合；以及(iii)含釩溴過氧化物酶標(biāo)記的免疫反應(yīng)劑的多孔展開層。
本發(fā)明優(yōu)選方案中，提供測定特異性結(jié)合配體的多層分析元件。特別是含有無孔載體的多層元件，該載體上有下述處于流體接觸狀態(tài)的各層第一試劑或緩沖層，含有能與所研究的特異性結(jié)合配體，或其受體反應(yīng)的未標(biāo)記免疫反應(yīng)劑的膠層，含有均勻分布的釩溴過氧化物酶標(biāo)記的免疫反應(yīng)劑的多孔展開層，所述免疫反應(yīng)劑能與所研究的特異性結(jié)合配體或其受體反應(yīng)。
本發(fā)明的多層元件還任意含有與前述各區(qū)帶之一處于流體接觸狀態(tài)的吸收材料。
更優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用某些制造技術(shù)，例如(但不只限這些)噴墨沉積、噴涂沉積和印刷沉積等本領(lǐng)域公知的技術(shù)，使釩溴過氧化物酶標(biāo)記的免疫反應(yīng)劑位于多孔展開層頂部。
正如本領(lǐng)域已知的，本發(fā)明的元件可以在適當(dāng)區(qū)帶包括各種添加劑，有助于加工制造、流體擴(kuò)展、吸收不需要的射線，以及受體穩(wěn)定性等。
本發(fā)明的元件可以使用常規(guī)涂覆技術(shù)和設(shè)備來制造，正如現(xiàn)有技術(shù)所介紹的(包括印刷術(shù)、屏蔽術(shù)、漏斗注入及其它涂覆技術(shù))。本發(fā)明元件可構(gòu)成各式各樣的構(gòu)型，包括任意寬度的細(xì)長帶子、薄片、載片或碎片。本發(fā)明的方法可使用適當(dāng)分析儀器及方法手動或自動進(jìn)行。一般是通過將試驗(yàn)樣品(例如1-50μl)印跡于多孔展開區(qū)帶上，本發(fā)明方法包括在該元件中試劑相互接觸。元件中液體的運(yùn)動，使試劑有效混合，從而發(fā)生反應(yīng)。
施樣以后，使該元件處于某些條件下，例如保溫、加熱或其它可望在該元件的各區(qū)帶中快速(或有助于)形成適當(dāng)特異性結(jié)合的配位體之條件。雖然在某些情況下，不需將釩溴過氧化物酶標(biāo)記的免疫反應(yīng)劑的反應(yīng)型和未反應(yīng)型分離開，便可獲得適宜的信號，但優(yōu)選將該元件區(qū)帶中的所述兩種形式分開，正如一般在稱之為異源免疫檢測法中所作的一樣。這樣在該區(qū)帶的規(guī)定區(qū)域內(nèi)可以較好地讀出信號。
對該元件施用洗滌溶液(約5至200μl)是有效完成所述分離的優(yōu)選方法。可用本領(lǐng)域任何適宜之方式施用所述洗滌溶液，但優(yōu)選以連續(xù)計量速度施用，例如最高達(dá)10μl/秒，最優(yōu)選約1μl/秒。不過洗滌溶液的任何施加速度和方式均可使用，只要施用期間多孔展開區(qū)帶容易吸收液體即可，所述液體是該元件中使用前述吸收材料容易提供的。
所述洗滌溶液可以包括按順序施用的多種液體組合物，但至少其中一種液體必需含本文下述產(chǎn)生信號的組合物，此外還可加入表面活性劑于任何洗滌溶液中。
本發(fā)明方法中所采用的洗滌溶液，是pH值約6.5至約10的能提供化學(xué)發(fā)光信號的分析組合物，所述組合物包含(a)一種產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號的試劑，該試劑產(chǎn)生應(yīng)答釩溴過氧化物酶的催化活性之信號，其中所述產(chǎn)生信號試劑是2，3-二氫-2，3-二氮雜萘-1，4-二酮衍生物；(b)一種鹵素、假鹵素、產(chǎn)生鹵素的原料或產(chǎn)生假鹵素的原料；以及(c)一種過氧化物或產(chǎn)生過氧化物的試劑組合物。
正如上述，本發(fā)明所用的產(chǎn)生信號的組合物包含2，3-二氫-2，3-二氮雜萘-1，4-二酮衍生物(本文中稱為“DPD”)作為其組分之一。任何在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中可轉(zhuǎn)化為激發(fā)態(tài)，而其后回復(fù)到非激發(fā)態(tài)，同時發(fā)出光的游離DPD或共軛DPD均可用于本發(fā)明之實(shí)踐，很多這類化合物是本領(lǐng)域公知的，包括Kricka等人的美國專利No.4,598,044，和Grundermann等人的Chemiluminescence in Organic Chemistry(Springer-Verlag，Berlin，1987，第204～207頁)一書中所介紹的那些化合物。
此類化合物總的稱之為“魯米諾型酰肼”，包括苯二甲酰肼、苯-1，2-二甲酰肼、蒽-2，3-二甲酰肼、菲-1，2-二甲酰肼、芴-1，2-二甲酰肼、苯并〔g，h，i〕苝-1，2-二甲酰肼、蔻-1，2-二甲酰肼，以及其它對本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員來說顯而易見的該類化合物。
具體來說，可以用于本發(fā)明的DPD類化合物由下面結(jié)構(gòu)式定義 其中Z1、Z2、Z3和Z4各自為氫；含約1至約6個碳原子的烷基，例如甲基、乙基、異丙基、叔丁基、仲戊基和己基；含約2至約6個碳原子的鏈烯基，例如乙烯基、1-丙烯基、異丁烯基、2-(N，N-二異丙氨基)乙烯基、2-(N，N-二異丁氨基)乙烯基、2-(N，N-二異戊氨基)乙烯基和2-己烯基；羥基；含約1至約6個碳原子的烷氧基，例如甲氧基、乙氧基、異丙氧基、叔丁氧基和己氧基；羧基；氨基，包括烷基或烷酰基取代的氨基，例如甲氨基、乙氨基；酰氨基(例如乙酰氨基和己酰氨基)；二甲氨基、二乙氨基和二異丁氨基；共軛氨烯基(例如下面定義的)；或氨芳基，包括取代氨芳基，例如對-(N，N-二甲氨基)苯基、對-(N，N-二乙氨基)苯基，和5-氨基-2，3-二氫-2，3-二氮雜萘-1，4-二酮-8-基(稱之為魯米基，即luminyl)。
Z1和Z2至少一個是氨基(包括取代氨基，如上面所定義的)、共軛氨基鏈烯基(包括如上定義的氨基鏈烯基)，或氨芳基，例如對-(N，N-二甲氨基)-苯基，對-(N，N-二乙氨基)苯基和5-氨基-2，3-二氫-2，3-二氮雜萘-1，4-二酮-8-基。本文中所謂“共軛氨基鏈烯基”，指能夠從氨基通過鏈烯基與其取代的2，3-二氮雜萘二酮芳環(huán)產(chǎn)生電子共振的單價基團(tuán)，例如包括2-(N，N-二異丙氨基)乙烯基、2-(N，N-二異丁氨基)乙烯基和2-(N，N-二異戊氨基)乙烯基之類的二烷氨基乙烯基，以及4-(N，N-二乙氨基)-1，3-丁二烯-1-基之類的二烷氨基丁二烯基。
此外，Z1、Z2、Z3和Z4的任何相鄰兩個、三個或所有的(即二個或三個，甚至四個全部結(jié)合)可結(jié)合在一起形成含一個或多個芳環(huán)的稠合環(huán)系。該稠環(huán)可以由一個或多個羥基、氨基(如上所述取代或未取代的)，或具約1-約4個碳原子的烷氧基(例如甲氧基、乙氧基或異丙氧基)取代。優(yōu)選由一個或多個伯胺、仲胺或叔胺、羥基或上面所述烷氧基取代的此種稠環(huán)。
代表性的有用DPD化合物包括(但不限于)魯米諾、異魯米諾、N(4-氨丁基)-N-乙基異魯米諾半琥珀酰亞胺、N-(6-氨己基)-N-乙基異魯米諾、N-乙基異魯米諾、和7-二甲氨基萘-1，2-二甲酰肼。魯米諾(5-氨基-2，3-二氫-2，3-二氮雜萘-1，4-二酮)和異魯米諾(6-氨基-2，3-二氫-2，3-二氮雜萘-1，4-二酮)是優(yōu)選的，而最優(yōu)選魯米諾。
其它有用的DPD化合物是上面引用的Gundermann等人公開文獻(xiàn)中所介紹的，包括取代或未取代的鄰苯二甲酰肼、蒽-2，3-二甲酰肼、菲二甲酰肼、芴-1，2-二甲酰肼、苯并〔g，h，i〕苝-1，2-二甲酰肼和蔻-1，2-二甲酰肼，例如下述結(jié)構(gòu)式所表示的化合物 其它本發(fā)明使用的，由本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員確認(rèn)的其它2，3-二氮雜萘二酮類似物，包括Masuya等人的歐洲專利申請No.91310875.9和Yamaguchi的美國專利No.5,324,835，其內(nèi)容引入本文作為參考。
上面所認(rèn)定的化合物可從市場購得，或用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)原料和方法制得。
本發(fā)明中采用的第二種洗滌組合物組分是鹵素、假鹵素、提供鹵素的原料、或提供假鹵素的原料。本文中所謂“鹵素或提供鹵素的原料”，指加入到本發(fā)明洗滌組合物中，能提供鹵陰離子(即氟、氯、溴或碘陰離子)的任何物質(zhì)。這包括氯、溴或碘之類鹵素。提供鹵素的源可以包括金屬或非金屬鹵素鹽。非金屬鹽包括(但不限于)銨鹽、烷基銨鹽、取代烷基銨鹽、芳基銨鹽、取代芳基銨鹽、鹽、氧鎓鹽、鎓鹽、锍鎓鹽等等。提供鹵素的原料還可以是包括均聚物或共聚物的高聚物材料，所述均聚或共聚物含有上述鹵素作為反離子的陽離子物種的結(jié)合。此種物質(zhì)的例子是NH4Br。一般來說，提供鹵素的原料作為IA族金屬鹽加入到組合物中。除含IA族金屬外其它的金屬鹽也包括在本文中。本發(fā)明極優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供鹵素的原料是NaBr。
本文中所謂“假鹵素或提供假鹵素的原料”指加入本發(fā)明所用組合物中，能提供與鹵素相近的高電子親和力之陰離子的任何物質(zhì)。業(yè)已報道過提供假鹵素的原料一般是(但不限于)IA族金屬化合物。假鹵素或提供假鹵素的原料可以是上面有關(guān)提供鹵素的原料所介紹的那些金屬或非金屬化合物，例如銨鹽、烷基銨等等，及其高聚物?？梢源嬖谟谔峁┓治鲂盘柦M合物中的適宜假鹵素包括(但不限于)CN-、SCN-、OCN-、疊氮化合物、異腈等。假鹵素中SCN-是特別優(yōu)選的。本發(fā)明采用的優(yōu)選提供假鹵素原料是NaSCN。
本發(fā)明所采用的洗滌組合物中第三種成分是過氧化物或產(chǎn)生過氧化物的試劑組合物。所謂“過氧化物”包括一般現(xiàn)有技術(shù)所采用的無機(jī)或有機(jī)過氧化物。至于產(chǎn)生過氧化物的試劑組合物，意指加入到本發(fā)明所用產(chǎn)生信號組合物中時，能產(chǎn)生過氧化物的任何試劑組合物。此類產(chǎn)生過氧化物的試劑組合物對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的，它們包括(但不限于)過硼酸鹽、過乙酸鹽、過氧化脲、和有機(jī)過氧化物，例如過酸、過苯甲酸和過硫酸氫鉀制劑，以及氫過氧化物。
采用pKa值約6.0至約8.0的適宜生物學(xué)緩沖液將本發(fā)明所用洗滌組合物一般緩沖至pH約6.5至約10，更優(yōu)選約6.8至約8.0。這些緩沖液是本領(lǐng)域已知的。此類緩沖液有代表性的例子包括(但不限于)三(羥甲基)氨基甲烷-HCl(Tris-HCl)；2-〔N-嗎啉代〕乙磺酸(MES)；哌嗪-N，N′-二〔2-乙磺酸〕(PIPES)；3-〔N嗎啉代〕-2-羥基丙磺酸(MOPSO)，磷酸鹽緩沖液等。上述生物學(xué)緩沖液中，特別優(yōu)選Tris-HCl。
本發(fā)明采用的洗滌組合物中，每種成分之量，根據(jù)其使用傾向，試劑的具體敏感度，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其它因素，而有所不同。因此，下面的一般范圍意在為專業(yè)人員提供指南，而并不限制本發(fā)明的實(shí)踐。
具體地說，本發(fā)明采用的緩沖液之量對本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員是顯而易見的，因?yàn)樵鯓訙y定為維持所需pH值所必需的緩沖液之量是周知的。
產(chǎn)生信號的化合物DPD之量一般至少約0.01毫摩爾，而約0.1至約10)毫摩爾范圍為優(yōu)選。
有關(guān)第二組分，即鹵素、假鹵素、產(chǎn)生鹵素的原料或產(chǎn)生假鹵素的原料，一般加入量至少約0.1毫摩爾。更優(yōu)選鹵素、假鹵素、產(chǎn)生鹵素的原料，或產(chǎn)生假鹵素的原料在產(chǎn)生信號的組合物中之量是約50至約100毫摩爾。
有關(guān)第三種成分，即過氧化物或產(chǎn)生過氧化物的試劑組合物，在洗滌組合物中的量至少為約0.02毫摩爾。更優(yōu)選過氧化物或產(chǎn)生過氧化物的試劑組合物之量為約0.5毫摩爾到約1.0毫摩爾。
本發(fā)明的元件可用于各種檢測方式，以提供化學(xué)發(fā)光信號，應(yīng)答反應(yīng)型或未反應(yīng)型釩溴過氧化物酶標(biāo)記的免疫反應(yīng)劑。
下面給出實(shí)施例舉例說明本發(fā)明的范圍。因?yàn)檫@些實(shí)施例只為說明之目的而給出，而不能以此對本發(fā)明加以限制。
除有專門指出的地方外，所有的試劑和裝置均從伊斯曼柯達(dá)公司或其它商業(yè)途徑獲得。
產(chǎn)生信號的組合物從兩份混合物配制。第一份含1mM魯米諾鈉，而第二份含1mM H2O2，二者均從上面緩沖液配制。該兩份在臨使用前合并。
貯存于4℃的釩溴過氧化物酶(獲自泡葉藻)貯液，在0.05MTris-HCl，pH8和0.01％牛血清白蛋白(BSA)中系列稀釋，提供已知濃度范圍10至50000×10-18摩爾的釩溴過氧化物酶。
制備含有下列試劑基質(zhì)組合物的涂層元件珠粒展開層 0.1M Tris pH8.0高聚物珠粒(VtE)粘結(jié)劑(MaWnaMt)0.5g/m2TSH Ab珠粒DTPA (10-4M)膠填料 明膠0.2M Tris pH8.0DTPA (10-4M)TX-100
堅膜劑 (BVSME)載體 7mil Estar(聚對苯二甲酸乙二醇酯)上面的試劑基質(zhì)中所用試劑名稱定義如下Tris三(羥甲基)氨基甲烷緩沖液。
高聚物珠粒聚(乙烯基甲苯-共-甲基丙烯酸珠粒)。
粘合劑聚(丙烯酸甲酯-共-2-丙烯酰氨鈉-2-甲基-丙磺酸酯-共-甲基丙烯酸2-乙酰乙酰氧乙酯)。
TSH珠粒共價連接抗甲狀腺刺激激素(TSH)抗體的聚(苯乙烯-共-3-(對乙烯基苯甲硫基)丙酸)。
TX-100即Triton X-100，一種由Rohm和Haas Co.出售的辛基苯氧基多乙氧基乙醇表面活性劑。
BVSME二(乙烯基磺?；?甲基醚MaWnaMt＝聚(丙烯酸甲酯-共-2-丙烯酰-2-甲基丙磺酸，鈉鹽-共-甲基丙烯酸乙酰乙酰氧乙酯)(90/4/6)。評估釩溴過氧化物酶在靈敏檢測免疫試驗(yàn)涂層上的化學(xué)發(fā)光信號上面配制的產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號的組合物，和釩溴過氧化物酶緩沖溶液使用如下載片形狀的元件，由按上面制備的涂層取16mm2切片置于EKTACHEM(商標(biāo))C-載片基底上組裝而成(如Belly等人美國專利申請流水號938,460所述)。將具有10mm直徑中心孔洞(能供施樣用)的Whatman GF/B吸收微纖玻璃材料(Whatman SpecialtyProducts Division，Product No.PD 008-12A-100)放于該涂層上。然后將防滲漏環(huán)狀塑料頂片放于所述吸收層上，將整個裝配件用膠帶密封上(詳見Belly等人的美國申請流水號938,460
圖1和圖2所示)。
然后用100μl上述產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號的組合物以1μl/秒的速度沖洗。隨著洗滌溶液的施用，5μl產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號的組合物中的上述釩溴過氧化物酶的適當(dāng)稀釋液在所述涂層上形成印跡。立即將該元件卸下，用TURNER(商標(biāo))TD-20e光度計，于室溫下測量涂層的化學(xué)發(fā)光信號。采用一種適配器修正該光度計使之能適應(yīng)卸下的16mm2涂層，由此可讀出該涂層10mm直徑中心部分的數(shù)據(jù)。
圖1表示在上述條件下該測試得出的化學(xué)發(fā)光輸出值(置于修正的光度計之后t＝4分鐘時的10秒積分)。更具體地說，圖1表示本發(fā)明的元件能產(chǎn)生像現(xiàn)有技術(shù)元件一樣容易檢測的絕對信號。
圖1中，對照元件含辣根過氧化物酶作為產(chǎn)生信號之酶，而3′-氯-4′-羥基-N-乙酰苯胺在洗滌組合物中作為增強(qiáng)劑，如Friedman等人的美國專利No.5,372,931所述，其中洗滌組合物作如下修改除了該文中所述成分外，還加有0.05M Tris-HCl，pH8.0，0.1％十六烷基三甲基氯化銨(CTAC)，150μM 3′-氯-4′-羥基-N-乙酰苯胺。
圖2表示信噪比，一種本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的體系靈敏度識別度量。圖2中的數(shù)據(jù)使用本發(fā)明元件和含辣根過氧化物酶作為產(chǎn)生信號之酶的對照元件獲得。HRP對照物的洗滌組合物包括3′-氯-4′-羥基-N-乙酰苯胺作為增強(qiáng)劑，如Friedman等人的美國專利No.5,372,931所述，其修改如下除該文中所述成分外，還加有0.05M Tris-HCl，pH8.0，0.1％十六烷基三甲基氯化銨(CTAC)，150μM 3′-氯-4′-羥基-N-乙酰苯胺。該圖表明本發(fā)明元件比對照元件提供了較高靈敏度。
實(shí)施例2元件穩(wěn)定性比較本例是干性元件中釩溴過氧化物酶的穩(wěn)定性與干性元件中HRP的穩(wěn)定性之比較。將下列試劑基質(zhì)組合物涂復(fù)于7mil Estar(聚對苯二甲酸乙二醇酯)載體上制備基礎(chǔ)涂層元件
提示VtE＝聚(乙烯基甲苯-共-甲基丙烯酸)(98/2)MaWnaMt＝聚(丙烯酸甲酯-共-2-丙烯酰氨-2-甲基丙磺酸，鈉鹽-共-甲基丙烯酸乙酰乙酰氧乙酯)(90/4/6)TES＝N-〔2-羥基-1，1-二(羥甲基)乙基〕?；撬酈VSME＝二(乙烯基磺?；?甲基醚IMnAg＝聚(N-異丙基丙烯酰胺-共-2-羥基乙基甲基丙烯酸酯-共-亞甲基二丙烯酰胺)(85/5/10)。
除了將釩溴過氧化物酶和HRP貯液在10mM磷酸鹽緩沖液中(pH7.0)稀釋至10-8M外，本例采用與實(shí)施例1相同的用于釩溴過氧化物酶貯液的試劑。
除了吸收材料不包括在載片組裝件上外，兩元件均采用實(shí)施例1所述程序組裝。然后使上述釩溴過氧化物酶或上述HRP貯液在元件上形成印跡。
然后將各元件在室溫下黑暗中陳化30分鐘、2小時、4小時、6小時、24小時和48小時。每一時間間隔后，切割該元件，取出涂層材料，然后在含磷酸鹽(pH7.0)，0.15M NaCl和0.1％BSA的1ml緩沖液中提取。然后將提取材料離心約2分鐘，分離顆粒和固體物質(zhì)。
在10μl提取上清液中加入適當(dāng)?shù)漠a(chǎn)生信號溶液200μl進(jìn)行酶活性測定。對釩溴過氧化物酶來說，使用本發(fā)明產(chǎn)生信號的洗滌組合物，對于HRP來說，使用Friedman等人的美國專利No.5,372,931實(shí)施例1所公開的試劑組合物。在37℃使用DYNATECH(商標(biāo))ML 3000光度計測定化學(xué)發(fā)光信號。
這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果在圖3中作圖表示(對每一時間間隔點(diǎn)在t＝5分鐘時1.0秒積分)。圖4(a)和(b)是由圖3描繪的(a)HRP和(b)釩溴過氧化物酶保留活性的百分比數(shù)據(jù)作圖。具體地說，這些圖很清楚地表明，在很長時間內(nèi)(直至48小時)含釩溴過氧化物酶的元件的穩(wěn)定性基本保持恒定。相反，清楚地表明含HRP的元件穩(wěn)定性卻急劇降低。
上面給出的實(shí)驗(yàn)和實(shí)施例舉例說明了本發(fā)明的精神和范圍。這些實(shí)施方案和實(shí)施例使得其它方案和例子對本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員說來變得顯而易見。這些其它的方案和例子落入本發(fā)明范圍之內(nèi)，因此，本發(fā)明只能由其所附權(quán)利要求
書來加以限制。
權(quán)利要求
1.一種測定特異性結(jié)合配體的分析元件，所述元件包含(i)多孔展開區(qū)帶；和(ii)與所述多孔展開區(qū)帶處于流體接觸狀態(tài)的至少一個附加區(qū)帶，其中所述元件的至少一個區(qū)帶中含有釩溴過氧化物酶標(biāo)記的免疫反應(yīng)劑，該免疫反應(yīng)劑能與所研究的特異性結(jié)合配體之受體特異性結(jié)合。
2.權(quán)利要求
1的元件，其中所述釩溴過氧化物酶獲自泡葉藻、仙菜、糖海帶、墨角對葉藻(Fucus distichus)、小珊瑚藻、珊瑚藻或巨藻。
3.權(quán)利要求
2的元件，其中所述釩溴過氧化物酶獲自泡葉藻。
4.權(quán)利要求
1的元件，其中還含有(iii)與一個或多個所述區(qū)帶處于流體接觸狀態(tài)的吸收材料。
5.一種測定特異性結(jié)合配體的多層分析元件，其中所述元件包括無孔載體，其上有下述各層處于流體接觸狀態(tài)(i)第一試劑層或緩沖層；(ii)含有未標(biāo)記免疫反應(yīng)劑的膠層，所述未標(biāo)記免疫反應(yīng)劑與所研究的特異性結(jié)合配體特異性結(jié)合；以及(iii)含釩溴過氧化物酶標(biāo)記的免疫反應(yīng)劑的多孔展開層。
6.權(quán)利要求
5的多層元件，其中所述釩溴過氧化物酶獲自泡葉藻、仙菜、糖海帶、墨角對葉藻(Fucus distichus)、小珊瑚藻、珊瑚藻或巨藻。
7.權(quán)利要求
6的多層元件，其中所述釩溴過氧化物酶獲自泡葉藻。
8.權(quán)利要求
5的多層元件，其中所述多孔展開層是粒狀展開層。
9.權(quán)利要求
5的多層元件，還含有(iv)與所述一個或多個區(qū)帶處于流體接觸狀態(tài)的吸附材料。
10.測定特異性結(jié)合配體的方法，包括(A)將假定含有所述特異性結(jié)合配體的液體樣品與一種分析元件接觸，所述分析元件含有(i) 多孔展開區(qū)帶；和(ii)與該多孔展開區(qū)帶處于流體接觸狀態(tài)的至少一個附加區(qū)帶，所述元件的至少一個所述區(qū)帶中含有能特異性結(jié)合所述配體的釩溴過氧化物酶標(biāo)記的免疫反應(yīng)劑，(B)給所述元件施加洗滌溶液，欲使未反應(yīng)型所述釩溴過氧化物酶標(biāo)記的免疫反應(yīng)劑，與反應(yīng)型所述釩溴過氧化物酶標(biāo)記的免疫反應(yīng)劑分離開，所述洗滌溶液含有pH值約6.5至約10的組合物，而所述組合物含有(a)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號的試劑，該試劑提供信號，以應(yīng)答所述釩溴過氧化物酶的催化活性，其中所述產(chǎn)生信號試劑是2，3-二氫-2，3-二氮雜萘-1，4-二酮衍生物；(b)鹵素、假鹵素、提供鹵素的原料或提供假鹵素的原料；和(c)過氧化物或產(chǎn)生過氧化物的試劑組合物；以及(C)檢測所述未反應(yīng)型或反應(yīng)型釩溴過氧化物酶，作為所述特異性結(jié)合配體之度量。
專利摘要
可用于以競爭式檢測或夾層式檢測方式，靈敏而快速檢測很廣范圍內(nèi)各種各樣的特異性結(jié)合配體的分析元件。該檢測使用釩溴過氧化物酶標(biāo)記的免疫反應(yīng)劑，和產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號的洗滌組合物，所述組合物含有2，3-二氫-2，3-二氮雜萘-1，4-二酮衍生物；鹵素、假鹵素、提供鹵素的原料或提供假鹵素的原料；并含過氧化物或產(chǎn)生過氧化物的試劑組合物。
文檔編號G01N33/543GKCN1113105SQ96197973
公開日2003年7月2日 申請日期1996年8月16日
發(fā)明者A·E·弗里德曼, T·R·基瑟爾, S·F·格勞克斯, M·M·科思恩斯基 申請人:奧索臨床診斷有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan