專利名稱:用于培養(yǎng)人細胞的裝置和方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于培養(yǎng)人細胞尤其是造血細胞的裝置和方法。
背景技術：
造血細胞在骨髓中由全能干細胞產(chǎn)生，全能干細胞能夠復制其自身并且產(chǎn)生所有其它的造血細胞。這種干細胞產(chǎn)生祖細胞，例如紅細胞樣祖細胞和髓細胞樣祖細胞，這些細胞定向分化成專門的細胞類型。祖細胞產(chǎn)生分化的具有有限的增殖能力或不能增殖的細胞。在人中，干細胞和祖細胞表達CD34抗原，而更為分化的造血細胞則不表達該抗原。
造血細胞衍生自患者或合適供者的骨髓、外周血或臍帶血。當患者的凝血和抗感染功能由于(例如)化療而受到削弱時，這些細胞可用于重建患者的這些功能。
無關供者的臍帶血正越來越多地被用作骨髓清除性(myeloablative)治療后進行同種異體移植時的造血細胞來源。雖然利用臍帶血有幾種優(yōu)勢，但是與可從骨髓或外周血中獲得的細胞相比，對臍帶血的利用受到有限的細胞數(shù)目的限制。
希望提供一種增加臍帶血細胞數(shù)目的方法，從而這些臍帶血細胞可用于治療成年患者。美國專利號5,635,387描述了培養(yǎng)造血細胞的方法?！?87專利描述了在沒有基質(zhì)細胞層或基質(zhì)細胞條件培養(yǎng)基的條件下培養(yǎng)造血細胞的方法，據(jù)信該方法在該領域最初的發(fā)展中起到了重要作用。當前的擴增方法在細胞擴增室或細胞擴增袋中進行，這些細胞擴增室或細胞擴增袋并非專用于該目的。沒有使用專用系統(tǒng)造成幾個問題。例如，大多數(shù)系統(tǒng)不是封閉的系統(tǒng)，這意味著人干細胞的擴增需要熟練的操作人員和昂貴的設備以進行成功的擴增。即使是熟練的人員和設備非常好的實驗室使用，這種開放的流程也不能保證終產(chǎn)物的無菌，不能達到現(xiàn)有管理推薦和/或指導中所提供的無菌操作要求。現(xiàn)有的封閉循環(huán)系統(tǒng)提供并非為人干細胞擴增專門設計的非專用系統(tǒng)；而且，這種系統(tǒng)需要復雜、昂貴的設備才能操作。
大多數(shù)干細胞擴增方法現(xiàn)在利用含有來自動物的產(chǎn)品的試劑進行操作。使用來自動物的產(chǎn)品使得這些擴增的細胞群不能在臨床上使用。當前，用并非為造血干細胞擴增而特別設計的不同的培養(yǎng)基來進行造血干細胞的擴增。具體地說，所用試劑不是由確定的培養(yǎng)基和專用于造血干細胞擴增的生長因子混合物組成。當前所用的培養(yǎng)基具有不同的濃度和生長因子組合，常常不能滿足特定的調(diào)節(jié)需要如apirogenicity，不具有使用者友好性，并且沒有昂貴的設備和熟練的人員就難以使用。
本領域仍然需要用于培養(yǎng)人造血干細胞的改進的裝置和方法，這些裝置和方法能夠?qū)崿F(xiàn)這些細胞數(shù)目的擴增，獲得良好的細胞回收，同時又保持無菌和不損害細胞存活力。
本文所述的發(fā)明提供了可用于培養(yǎng)人造血干細胞的裝置。然而，該裝置也可用于培養(yǎng)人的其它細胞，包括其它類型的人類干細胞、人肌肉細胞、人皮膚細胞等。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種生物反應器，其包括反應室；第一端口，適于引入細胞；第二端口，適于氣體交換，所述第二端口包括濾器；第三端口，適于引入細胞培養(yǎng)基；第四端口，適于細胞取樣；以及第五端口，適于在細胞培養(yǎng)后將其收獲。
本發(fā)明提供一種體外增加人造血細胞數(shù)目的方法，該方法包括提供上述的生物反應器；將人造血細胞引入所述第一端口；通過第三端口引入培養(yǎng)基；和在足以增加細胞數(shù)目的條件和時間下培養(yǎng)細胞。
本發(fā)明提供一種體外增加人CD34陽性造血細胞數(shù)目的方法，該方法包括提供CD34陽性人造血細胞；以1×104-5×106細胞/毫升的初始濃度將CD34陽性細胞接種到含有培養(yǎng)基的生物反應器中，所述培養(yǎng)基含有有效擴增CD34陽性細胞的生長因子和營養(yǎng)培養(yǎng)基，其中所述生長因子包括Flt-3L、血小板生成素、白介素-3和干細胞因子；以及在足以增加CD34陽性細胞數(shù)目的條件和時間下培養(yǎng)CD34陽性細胞。
以下將描述本發(fā)明的其它特點和優(yōu)勢，其中部分可從這些描述顯而易見地得知。通過在書面說明書和權(quán)利要求
書中具體描述的用于培養(yǎng)人細胞的裝置和方法，可實現(xiàn)和獲得本發(fā)明的目的和其它優(yōu)點。
應理解，前面的一般性描述和下面的詳述都是示范性和闡釋性的，意在提供如權(quán)利要求
所要求的本發(fā)明的進一步解釋。
附圖簡述圖1所示為本發(fā)明生物反應器的透視圖。
圖2所示為圖1生物反應器的頂視圖。
圖3所示為可與本發(fā)明生物反應器一起使用的管道和無菌袋的頂視圖。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了一種生物反應器，其包括反應室；第一端口，適于引入細胞；第二端口，適于氣體交換，所述第二端口包括濾器；第三端口，適于引入細胞培養(yǎng)基；第四端口，適于細胞取樣；以及第五端口，適于在細胞培養(yǎng)后將其收獲。在本發(fā)明的一個實施方式中，第二端口的濾器是氣體可透過性膜濾器。在本發(fā)明的另一個實施方式中，第三端口包括濾器。在本發(fā)明的又一個實施方式中，所述生物反應器還包括適于引入培養(yǎng)基的第六端口，所述第六端口包括濾器。
在本發(fā)明的一個實施方式中，第一端口包括可刺穿的帽。在本發(fā)明的另一個實施方式中，第四端口包括可刺穿的帽。在本發(fā)明的一個實施方式中，該生物反應器適于在細胞培養(yǎng)后通過將細胞導出第五端口來收獲細胞。
在本發(fā)明的一個實施方式中，所述反應室具有25cm2-600cm2的擴增表面積。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述反應室具有150cm2-250cm2的擴增表面積。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述反應室由光潔的(clear)、組織培養(yǎng)處理的塑料制成。
在本發(fā)明的一個實施方式中，該生物反應器包括第一端口附近的標簽，該標簽說明可通過第一端口引入細胞。在本發(fā)明另一個實施方式中，該生物反應器包括第二端口附近的標簽，該標簽說明可通過第二端口交換氣體。在本發(fā)明又一個實施方式中，該生物反應器包括第三端口附近的標簽，該標簽說明可通過第三端口引入培養(yǎng)基。在本發(fā)明一個實施方式中，該生物反應器包括第四端口附近的標簽，該標簽說明可通過第四端口對反應室中的內(nèi)容物取樣。在本發(fā)明另一個實施方式中，該生物反應器包括(i)第三端口附近的標簽，該標簽說明可在第0天通過第三端口引入培養(yǎng)基，和(ii)第六端口附近的標簽，該標簽說明可在第7天通過第六端口引入培養(yǎng)基。所有的標簽都可以附在所述生物反應器上或者澆鑄到生物反應器上。
所述生物反應器可用于培養(yǎng)人細胞，包括人造血干細胞、其它類型的人干細胞、人肌肉細胞、人皮膚細胞等。
本發(fā)明提供一種試劑盒，其包括本發(fā)明所述的生物反應器和連接于第五端口的管道。在本發(fā)明一個實施方式中，所述試劑盒包括另外的管道以及一個或多個無菌袋。在本發(fā)明另一個實施方式中，所述試劑盒還包括第一容器中的營養(yǎng)培養(yǎng)基，以及第二容器中的生長因子Flt-3L、血小板生成素、白介素-3和干細胞因子。在本發(fā)明另一個實施方式中，生長因子存在的濃度為Flt-3L，1.9微克/毫升；血小板生成素，1.9微克/毫升；白介素-3，0.17微克/毫升；以及干細胞因子，1微克/毫升。
本發(fā)明提供一種體外增加人造血細胞數(shù)目的方法，該方法包括提供本文所述的生物反應器；將人造血細胞引入第一端口；通過第三端口引入培養(yǎng)基；和在足以增加細胞數(shù)目的條件和時間下培養(yǎng)細胞。在本發(fā)明一個實施方式中，細胞經(jīng)培養(yǎng)之后，通過第五端口收獲細胞。在本發(fā)明另一個實施方式中，該生物反應器還包括適于引入培養(yǎng)基的第六端口，所述第六端口包括濾器，通過第三端口引入培養(yǎng)基之后7天，通過第六端口引入培養(yǎng)基。
在本發(fā)明一個實施方式中，所述人造血細胞是CD34-陽性。在本發(fā)明另一個實施方式中，所述培養(yǎng)基含有可有效擴增人造血細胞的生長因子和營養(yǎng)培養(yǎng)基，其中所述生長因子包括Flt-3L、血小板生成素、白介素-3和干細胞因子。在本發(fā)明的實施方式中，所述人造血細胞衍生自人臍帶血、人骨髓或人外周血。
本發(fā)明提供一種體外增加人造血細胞數(shù)目的方法，該方法包括提供CD34-陽性的人造血細胞；以1×104-5×106細胞/毫升的初始濃度將CD34-陽性細胞接種到含有培養(yǎng)基的生物反應器中，所述培養(yǎng)基含有可有效擴增CD34-陽性細胞的生長因子和營養(yǎng)培養(yǎng)基，其中所述生長因子包括Flt-3L、血小板生成素、白介素-3和干細胞因子；和在足以增加CD34-陽性細胞數(shù)目的條件和時間下培養(yǎng)CD34-陽性細胞。在本發(fā)明一個實施方式中，所述CD34-陽性細胞衍生自人臍帶血、人骨髓或人外周血。在另一個實施方式中，以初始細胞數(shù)目為5×105-1.5×106個細胞將CD34-陽性細胞接種到生物反應器中。在另一個實施方式中，所述生物反應器的擴增表面積是25cm2-600cm2。
在本發(fā)明一個實施方式中，CD34-陽性人造血細胞的數(shù)目增長至少3倍。在另一個實施方式中，所述造血生長因子基本上由Flt-3L、血小板生成素、白介素-3和干細胞因子組成。在另一個實施方式中，在培養(yǎng)步驟之后，從培養(yǎng)基中收獲人造血細胞。在本發(fā)明實施方式中，培養(yǎng)CD34-陽性細胞4-20天。在另一個實施方式中，培養(yǎng)CD34-陽性細胞7天，然后在第7天，加入另外的營養(yǎng)培養(yǎng)基和生長因子，再培養(yǎng)CD34-陽性細胞5天，然后收獲。
在本發(fā)明一個實施方式中，所述生長因子基本上由Flt-3L、血小板生成素、白介素-3和干細胞因子組成。在培養(yǎng)步驟開始時，這些生長因子以下面的濃度存在Flt-3L，0.01-0.1微克/毫升；血小板生成素，0.01-0.1微克/毫升；白介素-3，0.001-0.01微克/毫升；以及干細胞因子，0.01-0.1微克/毫升。在另一個實施方式中，所述生長因子基本上由Flt-3L、血小板生成素、白介素-3和干細胞因子組成。在培養(yǎng)步驟開始時，這些生長因子以下面的濃度存在Flt-3L，0.05微克/毫升；血小板生成素，0.05微克/毫升；白介素-3，0.0043微克/毫升；以及干細胞因子，0.025微克/毫升。在另一個實施方式中，所述培養(yǎng)基和生物反應器不包括基質(zhì)細胞或基質(zhì)細胞條件培養(yǎng)基。
本發(fā)明提供一種試劑，所述試劑基本上由生長因子Flt-3L、血小板生成素、白介素-3和干細胞因子組成，這些生長因子以下面的濃度存在Flt-3L，1.9微克/毫升；血小板生成素，1.9微克/毫升；白介素-3，0.17微克/毫升；和干細胞因子，1微克/毫升。
本發(fā)明提供一種試劑盒，其包括生物反應器、第一容器中的營養(yǎng)培養(yǎng)基、以及第二容器中的生長因子Flt-3L、血小板生成素、白介素-3和干細胞因子。在一個實施方式中，所述試劑盒包括一個或多個注射器。在另一個實施方式中，所述試劑盒還包括管道和一個或多個無菌袋。在試劑盒的另一個實施方式中，所述生長因子以下面的濃度存在Flt-3L，1.9微克/毫升；血小板生成素，1.9微克/毫升；白介素-3，0.17微克/毫升；以及干細胞因子，1微克/毫升。
在本發(fā)明一個實施方式中，人細胞在生物反應器中從臍帶血開始培養(yǎng)。在營養(yǎng)和生長培養(yǎng)基中孵育一段合適的時間后，收集細胞，洗滌以除去殘留試劑，然后使其即可使用。
用于產(chǎn)生造血細胞的培養(yǎng)基含有營養(yǎng)培養(yǎng)基和生長因子(細胞因子)。各種營養(yǎng)培養(yǎng)基和生長因子都可用于培養(yǎng)造血細胞?？捎糜诒景l(fā)明的合適營養(yǎng)培養(yǎng)基包括X-VIVO 20(可購自Cambrex，East Rutherford，美國新澤西州)，或其它無血清培養(yǎng)基?？稍跔I養(yǎng)培養(yǎng)基中補充加入1-20％的自體血漿或異源血漿。
可包括在營養(yǎng)培養(yǎng)基中的生長因子或細胞因子包括人Flt-3L、血小板生成素(TPO)、白介素3(IL-3)、干細胞因子(SCF)、人GM-CSF(粒細胞巨噬細胞集落刺激因子)和G-CSF(粒細胞集落刺激因子)、白介素1、2和4-7，以及促紅細胞生成素。
圖1和2說明了本發(fā)明的一種實施方式，其中生物反應器10包括反應室15。該室具有允許培養(yǎng)基分布并促進細胞生長的合適形狀。該室包含與生物材料相容或已經(jīng)處理成與生物材料相容的透明聚合材料。
生物反應器15有5個端口(20，21，22，24，26)。端口20(有標簽40“細胞(Cells)”)具有可刺穿的帽以注射細胞。端口21(有標簽42“氣體(Gas)”)具有與外部環(huán)境進行氣體交換的濾器。端口22(有標簽44“第0天(Day 0)”)具有用于在操作流程開始時注射培養(yǎng)基和生長因子的濾器。端口24(有標簽46“第7天(Day 7)”)具有用于在以后的時間中如第7天注射培養(yǎng)基和生長因子的濾器。端口26(有標簽48“取樣(Sampling)”)具有可刺穿的膜以進行細胞取樣。
通過端口22和24，用注射器遞送培養(yǎng)基，通過端口21交換氣體。交換的氣體包括氧氣和二氧化碳(CO2)。優(yōu)選地，將CO2含量控制在所需水平，例如5％。用生理溫度孵育生物反應器的內(nèi)容物，即優(yōu)選37℃，雖然溫度可在25℃-37℃之間。濕度優(yōu)選保持在約100％。一旦完成孵育，造血細胞通過管道線31經(jīng)出口28脫離生物反應器，所述出口28可通過管道31利用常規(guī)的無菌對接系統(tǒng)與收集袋7相連。生物反應器15向端口28傾斜，細胞流入收集袋7(如圖3所示)。在優(yōu)選實施方式中，培養(yǎng)時間為10-14天。預先與收集袋7相連的袋8可通過線9裝入洗滌鹽水溶液?？赏ㄟ^線12將洗滌溶液引入收集袋7。用無菌濾器11保證洗滌液體的無菌性。
在本發(fā)明一個實施方式中，造血細胞通過以下方式產(chǎn)生首先通過端口22將X-VIVO 20營養(yǎng)培養(yǎng)基和生長因子引入反應器。所述生長因子包括IL3、TPO、SCF和Flt3-L。將所選擇的CD34+細胞通過端口20注射入反應室，將生物反應器放置在處于生理溫度和控制的氣氛中的培養(yǎng)箱中。孵育所需的一段時間后，通過端口24加入另外的X-VIVO 20營養(yǎng)培養(yǎng)基和生長因子(如上所述)。
然后將生物反應器返回到培養(yǎng)箱中。在第二次孵育時間結(jié)束時，將生物反應器從培養(yǎng)箱中取出，將細胞收集在收集袋中。
本發(fā)明所用試劑通常保存于4℃。優(yōu)選地，提供的試劑為兩個細胞因子混合物小瓶(細胞因子混合物A和細胞因子混合物B)和兩個培養(yǎng)基小瓶(培養(yǎng)基A和培養(yǎng)基B)?！癆”瓶的內(nèi)容物在第0天加入到反應室中，“B”瓶的內(nèi)容物在第7天加入反應室。用注射器將試劑引入反應器。
實施例用可通過商業(yè)途徑獲得的聚苯乙烯組織培養(yǎng)瓶(例如可從Becton DickinsonLabware，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ，USA購得的貨號35-3028)來制備生物反應器，所述生物反應器具有以下裝備(1)在培養(yǎng)瓶的上部提供5個端口。兩個端口有聚醚砜(PES)0.2微米濾器。兩個端口有可穿孔的連接體；一個端口有氣體可透過性濾膜；(2)第六端口將所述組織培養(yǎng)瓶連接到用于在培養(yǎng)階段結(jié)束時收集細胞的500ml無菌袋。所述生物反應器的擴增表面積是約175cm2的組織培養(yǎng)處理的聚苯乙烯。
在第0天，用無菌注射器通過具有0.2微米(μm)無菌濾器的端口引入營養(yǎng)培養(yǎng)基和生長因子的混合物。所述營養(yǎng)培養(yǎng)基和生長因子的混合物通過以下方式制備混合細胞因子組合物(細胞因子混合物A)和60ml X-VIVO 20培養(yǎng)基(培養(yǎng)基A)，所述細胞因子組合物(細胞因子混合物A)含有懸浮在1560微升營養(yǎng)培養(yǎng)基中的0.270μg(微克)IL3、3.0μg TPO、1.5μg SCF和3.0μg Flt3-L。在第0天加入營養(yǎng)培養(yǎng)基和生長因子之后，用另一個專用端口將所選的CD34+細胞接種到生物反應器中。例如，將1.2×106個所選的細胞接種到61.5毫升營養(yǎng)培養(yǎng)基中(起始細胞濃度約為20,000細胞/毫升)。所述CD34+細胞的最小存活力為80％，最小純度為70％。
在37℃、約100％濕度、含有約5％CO2的空氣氣氛中孵育生物反應器內(nèi)容物。培養(yǎng)或孵育一周后(即第7天)，用無菌注射器通過另一個具有0.2微米(μm)無菌濾器的專用端口引入營養(yǎng)培養(yǎng)基和生長因子的混合物。通過以下方式制備營養(yǎng)培養(yǎng)基和生長因子的混合物混合細胞因子組合物(細胞因子混合物B)和30ml X-VIVO 20培養(yǎng)基(培養(yǎng)基B)，所述細胞因子組合物(細胞因子混合物B)含有懸浮在776微升營養(yǎng)培養(yǎng)基中的0.135μg(微克)IL3、1.5μg TPO、0.75μgSCF和1.5μg Flt3-L。
在培養(yǎng)階段結(jié)束時，通過專用的端口將生物反應器的內(nèi)容物導出生物反應器并流入無菌袋中。用標準方法洗滌細胞以除去殘留的細胞因子。
該方法通常產(chǎn)生3-40倍的CD34+細胞擴增，總細胞數(shù)目擴增30-300倍，平均約200倍。細胞存活力大于80％。
提供上面的說明書和附圖是出于描述本發(fā)明實施方式的目的，而非以任何方式限制本發(fā)明。對本領域一般技術人員顯而易見的是，可對本發(fā)明培養(yǎng)細胞的裝置和方法進行各種改動和變化而不脫離本發(fā)明的精神或范圍。因此，只要這些改動和變化落在所附權(quán)利要求
及其等價形式的范圍內(nèi)，則本發(fā)明包括這些改動和變化。
權(quán)利要求
1.一種生物反應器，包括反應室；第一端口，適于引入人細胞；第二端口，適于氣體交換，所述第二端口包括濾器；第三端口，適于引入培養(yǎng)基；第四端口，適于細胞取樣；和第五端口，適于在細胞培養(yǎng)后將其收獲。
2.如權(quán)利要求
1所述的生物反應器，其特征在于，所述第二端口的濾器是氣體可透過性膜濾器。
3.如權(quán)利要求
1和2中的一項所述的生物反應器，其特征在于，所述第三端口包括濾器。
4.如權(quán)利要求
1-3中的一項所述的生物反應器，其特征在于，所述生物反應器還包括適于引入培養(yǎng)基的第六端口，所述第六端口包括濾器。
5.如權(quán)利要求
1-4中的一項所述的生物反應器，其特征在于，所述第一端口包括可刺穿的帽。
6.如權(quán)利要求
1-5中的一項所述的生物反應器，其特征在于，所述第四端口包括可刺穿的帽。
7.如權(quán)利要求
1-6中的一項所述的生物反應器，其特征在于，所述生物反應器適于在細胞培養(yǎng)后將細胞導出所述第五端口而收獲人細胞。
8.如權(quán)利要求
1-7中的一項所述的生物反應器，其特征在于，所述反應室具有25cm2-600cm2的擴增表面積。
9.如權(quán)利要求
1-8中的一項所述的生物反應器，其特征在于，所述反應室具有150cm2-250cm2的擴增表面積。
10.如權(quán)利要求
1-9中的一項所述的生物反應器，其特征在于，所述反應室由光潔的組織培養(yǎng)處理的塑料制成。
11.如權(quán)利要求
1-10中的一項所述的生物反應器，其特征在于，所述生物反應器包括所述第一端口附近的標簽，該標簽說明可通過所述第一端口導入細胞。
12.如權(quán)利要求
1-11中的一項所述的生物反應器，其特征在于，所述生物反應器包括所述第二端口附近的標簽，該標簽說明可通過所述第二端口交換氣體。
13.如權(quán)利要求
1-12中的一項所述的生物反應器，其特征在于，所述生物反應器包括所述第三端口附近的標簽，該標簽說明可通過所述第三端口引入培養(yǎng)基。
14.如權(quán)利要求
1-13中的一項所述的生物反應器，其特征在于，所述生物反應器包括所述第四端口附近的標簽，該標簽說明可通過所述第四端口對反應室的內(nèi)容物取樣。
15.如權(quán)利要求
4所述的生物反應器，其特征在于，所述生物反應器包括(i)第三端口附近的標簽，該標簽說明可在第0天通過第三端口引入培養(yǎng)基，和(ii)第六端口附近的標簽，該標簽說明可在第7天通過第六端口引入培養(yǎng)基。
16.如權(quán)利要求
11所述的生物反應器，其特征在于，所述標簽附在生物反應器上或澆鑄到生物反應器上。
17.一種試劑盒，包括權(quán)利要求
1-16中的一項所述的生物反應器和連接第五端口的管道。
18.如權(quán)利要求
17所述的試劑盒，還包括另外的管道和一個或多個無菌袋。
19.如權(quán)利要求
17和18中的一項所述的試劑盒，還包括第一容器中的營養(yǎng)培養(yǎng)基，和第二容器中的生長因子Flt-3L、血小板生成素、白介素-3和干細胞因子。
20.如權(quán)利要求
19所述的試劑盒，其特征在于，所述生長因子以以下濃度存在Flt-3L 1.9微克/毫升；血小板生成素 1.9微克/毫升；白介素-3 0.17微克/毫升；和干細胞因子 1微克/毫升。
21.一種體外增加人造血細胞數(shù)目的方法，包括提供權(quán)利要求
1-16中的一項所述的生物反應器；將人造血細胞導入第一端口；通過第三端口導入培養(yǎng)基；和在足以增加細胞數(shù)目的條件和時間下培養(yǎng)所述細胞。
22.如權(quán)利要求
21所述的方法，其特征在于，在培養(yǎng)所述細胞后，通過第五端口收獲所述細胞。
23.如權(quán)利要求
21和22中的一項所述的方法，其特征在于，所述生物反應器還包括適于引入培養(yǎng)基的第六端口，所述第六端口包括濾器，在通過第三端口引入培養(yǎng)基之后7天，通過第六端口引入培養(yǎng)基。
24.如權(quán)利要求
21-23中的一項所述的方法，其特征在于，所述人造血細胞為CD34-陽性。
25.如權(quán)利要求
21-24中的一項所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基含有可有效擴增人造血細胞的生長因子和營養(yǎng)培養(yǎng)基，其中所述生長因子包括Flt-3L、血小板生成素、白介素-3和干細胞因子。
26.如權(quán)利要求
21-25中的一項所述的方法，其特征在于，所述人造血細胞衍生自人臍帶血。
27.如權(quán)利要求
21-25中的一項所述的方法，其特征在于，所述人造血細胞衍生自人骨髓。
28.如權(quán)利要求
21-25中的一項所述的方法，其特征在于，所述人造血細胞衍生自人外周血。
29.一種體外增加人造血細胞數(shù)目的方法，包括提供CD34-陽性的人造血細胞；以1×104-5×106細胞/毫升的初始濃度將所述CD34-陽性細胞接種到含有培養(yǎng)基的生物反應器中，所述培養(yǎng)基含有可有效擴增CD34-陽性細胞的生長因子和營養(yǎng)培養(yǎng)基，其中所述生長因子包括Flt-3L、血小板生成素、白介素-3和干細胞因子；和在足以增加所述CD34-陽性細胞數(shù)目的條件和時間下培養(yǎng)所述CD34-陽性細胞。
30.如權(quán)利要求
29所述的方法，其特征在于，所述CD34-陽性細胞衍生自人臍帶血。
31.如權(quán)利要求
29所述的方法，其特征在于，所述CD34-陽性細胞衍生自人骨髓。
32.如權(quán)利要求
29所述的方法，其特征在于，所述CD34-陽性細胞衍生自人外周血。
33.如權(quán)利要求
29-32中的一項所述的方法，其特征在于，以1×104-5×106細胞/毫升的起始濃度將所述CD34-陽性細胞接種到所述生物反應器中。
34.如權(quán)利要求
29-33中的一項所述的方法，其特征在于，所述生物反應器具有25cm2-600cm2的擴增表面積。
35.如權(quán)利要求
29-34中的一項所述的方法，其特征在于，所述CD34-陽性人造血細胞的數(shù)目至少增加3倍。
36.如權(quán)利要求
29-35中的一項所述的方法，其特征在于，所述CD34-陽性人造血細胞的數(shù)目至少增加5倍。
37.如權(quán)利要求
29-36中的一項所述的方法，其特征在于，所述生長因子基本由Flt-3L、血小板生成素、白介素-3和干細胞因子組成。
38.如權(quán)利要求
29-37中的一項所述的方法，還包括，在培養(yǎng)步驟之后，從培養(yǎng)基中收獲人造血細胞。
39.如權(quán)利要求
29-38中的一項所述的方法，其特征在于，培養(yǎng)所述CD34-陽性細胞4-20天。
40.權(quán)利要求
29-39中的一項所述的方法，其特征在于，培養(yǎng)所述CD34-陽性細胞7天，然后在第7天，加入另外的營養(yǎng)培養(yǎng)基和生長因子，再培養(yǎng)所述CD34-陽性細胞5天，然后收獲。
41.如權(quán)利要求
29-40中的一項所述的方法，其特征在于，所述生長因子基本由Flt-3L、血小板生成素、白介素-3和干細胞因子組成，且在培養(yǎng)步驟開始時，這些生長因子以以下濃度存在Flt-3L 0.01-0.1微克/毫升；血小板生成素 0.01-0.1微克/毫升；白介素-3 0.001-0.01微克/毫升；和干細胞因子 0.01-0.1微克/毫升。
42.如權(quán)利要求
29-41中的一項所述的方法，其特征在于，所述生長因子基本由Flt-3L、血小板生成素、白介素-3和干細胞因子組成，且在培養(yǎng)步驟開始時，這些生長因子以以下濃度存在Flt-3L 0.05微克/毫升；血小板生成素 0.05微克/毫升；白介素-3 0.0043微克/毫升；和干細胞因子 0.025微克/毫升。
43.如權(quán)利要求
29-42中的一項所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基和生物反應器不含有基質(zhì)細胞或基質(zhì)細胞條件培養(yǎng)基。
44.一種試劑，所述試劑基本上由生長因子Flt-3L、血小板生成素、白介素-3和干細胞因子組成，且這些生長因子以以下濃度存在Flt-3L 1.9微克/毫升；血小板生成素 1.9微克/毫升；白介素-3 0.17微克/毫升；和干細胞因子 1微克/毫升。
45.一種試劑盒，包括生物反應器、第一容器中的營養(yǎng)培養(yǎng)基和第二容器中的生長因子Flt-3L、血小板生成素、白介素-3和干細胞因子。
46.如權(quán)利要求
45所述的試劑盒，還包括管道和一個或多個無菌袋。
47.如權(quán)利要求
45和46中的一項所述的試劑盒，其特征在于，所述生長因子以以下濃度存在Flt-3L 1.9微克/毫升；血小板生成素 1.9微克/毫升；白介素-3 0.17微克/毫升；和干細胞因子 1微克/毫升。
專利摘要
一種生物反應器(15)，其具有反應室；第一端口(20)，適于引入人細胞；第二端口(21)，適于氣體交換，所述第二端口包括濾器；第三端口(22)，適于引入細胞培養(yǎng)基；第四端口(26)，適于細胞取樣；以及第五端口(28)，適于在人細胞經(jīng)培養(yǎng)后將其收獲。
文檔編號C12M3/00GK1993460SQ200480043519
公開日2007年7月4日 申請日期2004年7月12日
發(fā)明者G·曼布瑞尼, G·阿斯托瑞, I·潘扎尼, L·比吉, V·阿達米, W·馬蘭戈納, E·法拉斯卡 申請人:索林集團意大利有限公司, Crb荷蘭有限公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan