專利名稱:活性羧肽酶b的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種活性羧肽酶B的制備方法。
背景技術(shù)：
羧肽酶B(carboxypeptidase B，簡稱CPB，)是一種含鋅的胰外肽酶。CPB含307個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量35ku。由于CPB特異的水解肽鏈C端的堿性氨基酸(精氨酸，賴氨酸或鳥氨酸)，所以其可用于蛋白質(zhì)和多肽的序列分析，特別是用來確定羧基端氨基酸。此外，目前CPB的主要商業(yè)用途是作為工業(yè)用酶應(yīng)用于胰島素的工業(yè)生產(chǎn)。
目前制備活性CPB的方法可分為三類，其一是，從動(dòng)物的胰腺中提取及活化獲得。該法的缺陷在于，由于所獲得的CPB可能含有感染其它物質(zhì)(如病毒或其它有害的生物活性組分)而限制了CPB的應(yīng)用；其二是，經(jīng)原或真核[如巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)]表達(dá)得不具活性的羧肽酶原B(procarboxypeptidase B，簡稱proCPB)，再將proCPB經(jīng)胰蛋白酶酶解得到活性CPB(WO 0151624，DE 19915938和WO 9623064)。該法的不足在于，由于表達(dá)所得的proCPB須經(jīng)胰蛋白酶“激活”才能獲得活性CPB，且還須再經(jīng)去除胰蛋白酶和活性肽部分的純化步驟；其三是，在細(xì)菌或酵母中以融合蛋白形式表達(dá)(如β-辦乳糖苷酶-proCPB融合蛋白形式表達(dá))，但其仍須去除融合蛋白才能獲得活性CPB。
鑒于此，如何避免為得到活性CPB而需先表達(dá)proCPB，然后經(jīng)胰蛋白酶酶切激活proCPB，再去除胰蛋白酶和前肽等繁瑣步驟是本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的在于，提供一種通過直接表達(dá)CPB來制備活性CPB的方法，以此克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的步驟繁瑣之缺陷。
本發(fā)明所說的活性羧肽酶B(CPB)的制備方法，其主要步驟為首先經(jīng)上清表達(dá)或包涵體表達(dá)帶CPB的DNA的重組菌株，然后經(jīng)分離得到活性CPB，其特征在于，所述重組菌株的質(zhì)粒為pT7-473-CPB，宿主為E coli BL21(DE3)(BL21(DE3)F-，ompT，HsdSB，(rB-，mB-)，dcm，gal，λ(DE3)購自invitrogen公司。
本發(fā)明所說的質(zhì)粒(pT7-473-CPB)的構(gòu)建在pT7-473(來源于pET-21a(invitrogen出品)，增加多克隆位點(diǎn)后命名，增加多克隆位點(diǎn)的方法(參照Molecular CloningA LaboratoryManual 2nded(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)的多克隆位點(diǎn)NdeI和HindIII之間插入CPB的編碼DNA片段，該質(zhì)粒為T7啟動(dòng)子，含Lac調(diào)節(jié)元件，氨芐抗性。其結(jié)構(gòu)如圖2所示。
其中CPB的DNA片段來源于已構(gòu)建的質(zhì)粒pT7-473-proCPB，proCPB核苷酸序列來源于RT-PCR技術(shù)獲得的大鼠胰腺proCPB RNA序列(Su-Xia Li等，Protein and Peptide Letters2003，10(6)1-10)。
圖1.重組克隆質(zhì)粒pMD-T-CPB鑒定的DNA電泳圖，其中1-酶切前重組質(zhì)粒T-CPB；2-HindIII單酶切；3-HindIII酶切后加入NdeI酶切2min；4-HindIII酶切后加入NdeI酶切5min；5-HindIII酶切后加入NdeI酶切10min；6-HindIII酶切后加入NdeI酶切8min；7-HindIII酶切后加入NdeI酶切30min；8-DNA分子量Marker(分子量標(biāo)記在右側(cè)，單位kb)。
圖2重組克隆質(zhì)粒pMD-T-CPB及重組表達(dá)質(zhì)粒pT7-473-CPB的結(jié)構(gòu)示意圖，其中2a-重組克隆質(zhì)粒pMD-T-CPB的結(jié)構(gòu)示意圖，2b-質(zhì)粒TpT7-473-CPB的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖3為SDS-PAGE分析重組菌在不同溫度下的誘導(dǎo)表達(dá)蛋白質(zhì)情況其中M-蛋白質(zhì)分子量Marker(分子量標(biāo)記在圖左側(cè))；1-20℃IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)菌體超聲破碎離心后的沉淀；2-20℃IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)菌體超聲破碎離心后的上清；3-20℃IPTG誘導(dǎo)前菌體超聲前樣品；4-20℃IPTG誘導(dǎo)后菌體超聲前樣品；5-15℃IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)菌體超聲破碎離心后的沉淀；6-15℃IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)菌體超聲破碎離心后的上清。
圖4.SDS-PAGE分析37℃誘導(dǎo)表達(dá)CPB情況及包涵體洗滌前后CPB純度其中M-蛋白質(zhì)分子量Marker(分子量標(biāo)記在圖左側(cè))，1-IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)菌體超聲破碎離心后的上清；2-IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)菌體超聲破碎離心后的沉淀；3-包涵體用0.5％Triton-X100洗滌離心后上清；4-包涵體用0.5％Triton-X 100洗滌后沉淀。
具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述I質(zhì)粒pT7-473-CPB的構(gòu)建及重組菌株的制備(1)CPB基因來源于已構(gòu)建好含有羧肽酶原B基因的質(zhì)粒pT7-473-proCPB，該基因?yàn)橥ㄟ^RT-PCR的方法從Wistar大鼠的胰腺獲得(參見Su-Xia Li等，Protein and Peptide Letters2003，10(6)1-10)。PCR擴(kuò)增的CPB基因，以5’-GCG CAT ATG GCA ACG GGA CAC AGCTAC ACC AAG TAC-3’；3’-TTA ATA CAG GCT CTT CTA GAT ATA ATC ACT TTC AAGGGC-5’為引物，PCR擴(kuò)增條件如下3’端引物 1μg5’端引物 1μg模板pT7-473-pCPB(10倍稀釋后) 5μl10×buffer 5μl10mM dNTPs 1μl50mM MgSO42μlTaq聚合酶I 1.5u滅菌雙蒸水ddH2O 加至50μl94℃×2min；92℃×1.5min，53℃×1.5min，72℃×1.5min，40循環(huán)；72℃×15min，反應(yīng)完成后，4℃保存。PCR產(chǎn)物用1％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收930bp左右處的條帶，連接入通用載體pMD-T(購自Takara公司)，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E Coli DH5α80dlacZΔM15，recA1，endA1，gyrA96，thi-1，hsdR17(rk-，mk+)，supE4，relA1，deoR，Δ(lacZYA-argF)U169(購自invitrogen公司)，質(zhì)粒小量抽提，測序，測序結(jié)果用BLAST程序與模板上proCPB DNA序列對(duì)照證實(shí)(參見Su-Xia Li等，Protein and Peptide Letters 2003，10(6)1-10)；(2)參見圖1，限制性內(nèi)切酶NdeI和HindIII雙酶切已鑒定的質(zhì)粒pMD-T-CPB，電泳鑒定，回收940bp CPB雙酶切片段，由于CPB基因內(nèi)部含有一個(gè)NdeI的酶切位點(diǎn)，所以進(jìn)行兩步的限制性酶切，先用HindIII進(jìn)行徹底酶切后，再用NdeI不同時(shí)間酶切，回收940bp的酶切片段，設(shè)計(jì)與同樣酶切的pT7-473連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E coli DH5α(購自invitrogen公司)，篩選陽性克隆，質(zhì)粒小量抽提，NdeI和HindIII雙酶切鑒定，得重組質(zhì)粒pT7-473-CPB，其結(jié)構(gòu)如圖2所示。將質(zhì)粒pT7-473-CPB轉(zhuǎn)入宿主(E coli BL21(DE3)中即得帶CPB的DNA的重組菌株(參照Molecular CloningA Laboratory Manual 2nded(ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)。
II帶CPB的DNA的重組菌株的上清表達(dá)及CPB的活性測定(1)組菌株(含有重組表達(dá)質(zhì)粒pT7-473-CPB，宿主為E coli BL21(DE3))接種一級(jí)瓶，37℃搖床過夜培養(yǎng)，按照1％接種至二級(jí)瓶，37℃培養(yǎng)至OD600為0.3～0.7，0.1mmol/L～1mmol/L IPTG誘導(dǎo)，降溫至12-20℃，繼續(xù)培養(yǎng)3～5h后，收獲菌體，離心棄上清，菌體沉淀用5～100mmol/L pH7.0-8.5的TE緩沖液懸浮，超聲破碎菌體，離心，分別取上清和沉淀，SDS-PAGE分析CPB在上清和不溶物形式的表達(dá)情況，結(jié)果參見圖3；可見降溫至培養(yǎng)溫度可得到CPB的上清表達(dá)。
(2)上清表達(dá)的CPB活性測定直接測定上清中CPB的活性，活性為0.15u/ml，加入不同濃度的Zn2+，如0.1mmol/L～0.001mmol/L ZnCl2或ZnSO4可幫助CPB活性提高，可使CPB的活性提高10倍以上，比如20倍，達(dá)到0.2～2.6u/ml。
活性測定方法參照Folk(Folk et al，J.Biol.Chem.1960)的方法，以含0.1M NaCl的0.01mmol/L～1mmol/L馬尿酰-L-賴氨酸(或馬尿酰-L-精氨酸)為底物測定，25℃測定?；盍Χx為25℃時(shí)，每分鐘催化水解1μmol馬尿酰-L-精氨酸(或馬尿酰-L-賴氨酸)底物，導(dǎo)致254nm處1cm路徑長的光吸收增加0.12的酶量定義為一個(gè)酶活單位。
III帶CPB的DNA的重組菌株的包涵體形式表達(dá)及其CPB的變性與復(fù)性(1)重組菌接種一級(jí)瓶，37℃搖床過夜培養(yǎng)，按照1％接種至二級(jí)瓶，37℃培養(yǎng)至OD6000.3～0.7，0.1mmol/L～1mmol/L IPTG誘導(dǎo)，37℃繼續(xù)培養(yǎng)3～5h后，收獲菌體，離心棄上清，菌體沉淀用5～100mmol/L pH7.0-8.5的TE緩沖液懸浮，超聲破碎菌體，離心，分別取上清和沉淀，SDS-PAGE分析表達(dá)情況。
(2)包涵體的洗滌與變性將大腸桿菌裂解后，離心，收集沉淀，經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定表明沉淀為CPB的包涵體表達(dá)部分，將包涵體收集，用0.2％～2％ Triton-X 100懸浮，充分洗滌，離心，然后用不含的Triton-X 100的Tris-HCl緩沖液充分洗滌以徹底去除Triton-X100。將充分洗滌的包涵體離心收集后，用4mmol/L～8mmol/L尿素充分溶解，離心，取上清，即為變性CPB。
(3)包涵體的復(fù)性分別配制不同pH7.5～pH11的20mmol/L～100mmol/L的Tris-HCl或甘氨酸-NaOH緩沖液，將CPB變性液緩慢加入，放置室溫復(fù)性10h～24h測定活性，結(jié)果表明復(fù)性pH以pH9.0-pH10.5為最佳。
向復(fù)性緩沖液中添加不同比例的氧化還原對(duì)還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)，GSH∶GSSG比(摩爾比)分別為1∶10～10∶1，將CPB變性液緩慢加入，放置室溫復(fù)性10h～24h測定活性，結(jié)果表明GSH∶GSSG的摩爾比為10∶1～2∶1的復(fù)性效果較好。
將CPB在室溫條件下的復(fù)性液中放置24h～60h，無沉淀產(chǎn)生，也無活力下降現(xiàn)象。
本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了通過直接表達(dá)CPB來制備活性CPB的目的，克服了現(xiàn)有技術(shù)中存在的步驟冗雜之缺陷。
下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，其目的僅在于更好理解本發(fā)明的內(nèi)容而非限制本發(fā)明的保護(hù)范圍
實(shí)施例1從LB固體培養(yǎng)平板(LB培養(yǎng)液，加瓊脂粉至濃度為1.5(wt％))上挑取重組單菌落于含100μg/ml氨芐的5ml LB液體培養(yǎng)液(1％(wt％)tryptone，0.5％(wt％)yeast extract，0.5％(wt％)NaCl，pH7.0)中，37℃，搖菌過夜；過夜菌按1％(v/v)接種于含250ml LB含100μg/ml氨芐抗性培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)至OD600為0.5，0.5mmol/L IPTG誘導(dǎo)，降溫至18℃，繼續(xù)培養(yǎng)5h后，收獲菌體，離心棄上清，菌體沉淀用5～100mmol/L pH8.0的TE緩沖液懸浮，超聲破碎菌體，離心取上清，測定上清中的酶活性，活性為0.15u/ml，加入ZnCl2于上清中使其終濃度為0.01mmol/L，輕搖混勻，放置30min后，測定CPB的活性，為2.6u/ml。
上清上陰離子交換柱DEAE-FF(購自Pharmacia公司)，DEAE-FF事先用20mmol/LTris-HCl緩沖液(含有0.1mmol/L ZnCl2)，pH8.0平衡，樣品上柱后，用20mmol/L Tris-HCl(含有0.1mmol/L ZnCl2)，pH8.0緩沖液平衡至基線，然后用含80mmol/L的NaCl的20mmol/LTris-HCl(含有0.1mmol/L ZnCl2)，pH8.0洗脫，分部收集，測各收集管的OD280nm及活性。合并含有CPB活性的收集管，即為純化的CPB，活性檢測為56u/mg蛋白。
實(shí)施例2從LB固體培養(yǎng)平板(LB培養(yǎng)液，加瓊脂粉至濃度為1.5(wt％))上挑取重組單菌落于含100μg/ml氨芐5ml LB液體培養(yǎng)液(1％(wt％)tryptone，0.5％(wt％)yeast extract，0.5％(wt％)NaCl，pH7.0)中，37℃，搖菌過夜；過夜菌按1％(v/v)接種于含250ml LB含100μg/ml氨芐抗性培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)至OD600為0.5，0.5mmol/L IPTG誘導(dǎo)，1mmol/L IPTG誘導(dǎo)，37℃繼續(xù)培養(yǎng)3h后，收獲菌體，離心棄上清，菌體沉淀用20mmol/L pH8.0的TE緩沖液懸浮，超聲破碎菌體，離心，收集沉淀，經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定表明沉淀為CPB的包涵體表達(dá)部分，將包涵體收集，用1％(v/v)Triton-X 100懸浮，充分洗滌，離心，然后用不含的Triton-X 100的Tris-HCl緩沖液充分洗滌以徹底去除Triton-X 100。將充分洗滌的包涵體離心收集后，用8mmol/L尿素充分溶解，離心，取上清，即為變性CPB。測定變性液中蛋白質(zhì)濃度(Bradford方法，Bradford MM，Anal Biochem.1976，7(72)248-254))。將CPB變性液緩慢加入到pH10.0的20mmol/L甘氨酸-NaOH緩沖液中(含有1mmol/L還原型谷胱甘肽和0.5mmol/L氧化型谷胱甘肽，1mmol/L ZnCl2)，使復(fù)性液中的蛋白含量為100μg/ml，放置室溫復(fù)性24h，測定復(fù)性液中CPB活性。CPB活性為1.5u/ml復(fù)性液。
權(quán)利要求
1.一種活性羧肽酶B(carboxypeptidase B)的制備方法，其主要步驟為首先經(jīng)上清表達(dá)或包涵體表達(dá)帶羧肽酶B的DNA的重組菌株，然后經(jīng)分離得到活性羧肽酶B，其特征在于，所述重組菌株的質(zhì)粒為pT7-473-CPB，宿主為E.coli BL21(DE3)。
2.如權(quán)利要求
1所述的制備方法，其特征在于，所述制備方法的主要為將所說的重組菌株經(jīng)上清表達(dá)和分離得到活性羧肽酶B，其中表達(dá)溫度為12～20℃。
3.如權(quán)利要求
2所述的制備方法，其特征在于，在分離得的上清液中加入ZnCl2或ZnSO4，使Zn2+的濃度為0.001mmol/L～0.1mmol/L。
4.如權(quán)利要求
1所述的制備方法，其特征在于，所述制備方法的主要為將所說的重組菌株經(jīng)包涵體表達(dá)、變性、復(fù)性和分離得到活性羧肽酶B，其中表達(dá)溫度為37℃。
5.如權(quán)利要求
4所述的制備方法，其特征在于，其中所說的變性是將經(jīng)洗滌的包涵體表達(dá)物用4mmol/L～8mmol/L尿素充分溶解。
6.如權(quán)利要求
4所述的制備方法，其特征在于，其中復(fù)性所用的緩沖液為pH＝7.5～11的20mmol/L～100mmol/L的Tris-HCl或甘氨酸-NaOH緩沖液。
7.如權(quán)利要求
6所述的制備方法，其特征在于，其中pH＝9.0～10.5。
8.如權(quán)利要求
6或7所述的制備方法，其特征在于，其中在復(fù)性所用的緩沖液中加入還原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽，還原型谷胱甘肽與氧化型谷胱甘肽的摩爾比為(10～2)∶1。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種活性羧肽酶B的制備方法，其主要步驟為首先經(jīng)上清表達(dá)或包涵體表達(dá)帶CPB的DNA的重組菌株，然后經(jīng)分離得到活性CPB，其特征在于，所述重組菌株的質(zhì)粒為pT7－473－CPB，宿主為E coli BL21(DE3)。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了通過直接表達(dá)CPB來制備活性CPB的目的，克服了現(xiàn)有技術(shù)中存在的步驟冗雜之缺陷。
文檔編號(hào)C12N1/21GK1990861SQ200510112348
公開日2007年7月4日 申請(qǐng)日期2005年12月29日
發(fā)明者李素霞, 袁勤生 申請(qǐng)人:西藏金稞科技有限公司, 華東理工大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan